CN102796186A - 一种与dna损伤修复相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与DNA损伤修复相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与DNA损伤修复相关的蛋白具体为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与DNA损伤修复相关的由序列3衍生的蛋白质。本发明提供的蛋白HbRad6具有DNA损伤修复的功能，转入微生物中具有DNA损伤修复活性，HbRad6转入酵母rad6突变体菌株中可部分恢复其对UV辐射敏感的表型。

Description

一种与DNA损伤修复相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种与DNA损伤修复相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

天然橡胶是重要的战略物资和工业原料。约99%以上的天然橡胶来自一个热带树种—巴西橡胶树。近年来，随着我国经济发展，国内天然橡胶自给率严重不足，而我国植胶区域有限，广泛开展天然橡胶产量相关基因的研究，通过生物技术手段实现橡胶树品种的快速改良，提高天然橡胶单产是橡胶树研究的一项重要任务。

泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）广泛存在于真核生物中，在维持细胞功能以及细胞周期运转，抵御环境胁迫，胚胎发育，激素响应和衰老等方面发挥着重要的作用。在泛素化过程中，关键酶主要包括泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素-蛋白连接酶(E3)，对维持细胞内蛋白质的产生和降解的平衡及细胞的稳态和正常功能方面起着重要作用。

RAD6是酵母中的一种E2蛋白，其功能丧失突变体对紫外光敏感。拟南芥中与酵母RAD6同源的基因是AtUBC2和AtUBC1，这两个基因都能恢复酵母rad6突变体对紫外光敏感的表型（Zwirn P，Stary S,Luschnig C,Bachmair A.1997.Arabidopsis thalianaRAD6 homolog AtUBC2 complements UV sensitivity，but not N-end rule degradationdeficiency，of Saccharomyces cerevisiae rad6 mutants.Curr Genet 32:309-14.）。此外，AtUBC2和AtUBC1均能调控组蛋白H2B的单泛素化，上调拟南芥抑制开花的基因(FLC)及其同功能基因的表达，从而抑制开花（Gu X,Jiang D,Wang Y，Bachmair A,He Y.2009.Repression of the floral transition via histone H2B monoubiquitination.Plant J 57:522-533）。单突变体Atubc1和Atubc2表现出很弱的表型，与野生型的表型差别不大，但Atubc1和Atubc2双突变体则表现出明显的突变表型，包括急剧减少拟南芥莲座叶和明显提前花期，说明AtUBC1和AtUBC2在功能上存在冗余性（Xu L，Ménard R,BerrA,Fuchs J,Cognat V，Meyer D,Shen WH.2009.The E2 ubiquitin-conjugating enzymes,AtUBC1 and AtUBC2,play redundant roles and are involved in activation of FLCexpression and repression of flowering in Arabidopsis thaliana.The Plant Journal 57:279-288）。水稻中与酵母RAD6同源的基因为OsRad6，利用酵母双杂交方法研究发现，OsRad6与OsSgt1存在互作，且两者在生长旺盛的组织中（如茎尖分生组织）以及UV辐射或者DNA损伤诱导剂（如MMS或者H₂O₂）处理后明显上调表达，以上研究结果说明OsRad6不仅参与了DNA的损伤修复过程，还在蛋白酶体降解系统中发挥作用，这两个过程可能都需要泛素连接酶Sgt1的协同作用（Yamamoto T,Mori Y，Ishibashi T,Uchiyama Y，Sakaguchi N,Furukawa T,Hashimoto J,Kimura S,Sakaguchi K.2004.Characterization of Rad6 from a higher plant,rice(Oryza sativa L.)and its interaction withSgt1,a subunit of the SCF ubiquitin ligase complex.Biochem Biophys Res Commun 314:434-439.）。大豆中与RAD6同源的基因是GmUBC2，在拟南芥中过表达该基因发现，GmUBC2能够明显提高拟南芥对干旱和高盐胁迫的抗性（Zhou GA,Chang RZ,Qiu LJ.2010.Overexpression of soybean ubiquitin-conjugating enzyme gene GmUBC2 confersenhanced drought and salt tolerance through modulating abiotic stress-responsive geneexpression in Arabidopsis.Plant Mol Biol 72:357-367）。由此可见，RAD6在植物DNA损伤修复，生长发育以及胁迫反应等方面具有重要作用。但目前尚未有在橡胶树中研究RAD6蛋白功能的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种与DNA损伤修复相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为HbRad6，来源于大戟科橡胶属巴西橡胶树（Heveabrasiliensis），是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与DNA损伤修复相关的由序列3衍生的蛋白质。

上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

序列表中序列3由152个氨基酸残基组成。

为了便于HbRad6蛋白的纯化，可在由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（a）中的HbRad6蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的HbRad6蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。

编码所述HbRad6蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述HbRad6蛋白的基因（命名为HbRad6）；所述HbRad6基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述HbRad6蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述HbRad6蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列1由459个核苷酸组成，序列2由929个核苷酸组成；序列1（序列2的第246-704位）即为所述HbRad6基因的编码序列，编码序列表中序列3所示的蛋白质。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。

在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述HbRad6基因转录的启动子具体为如下两种中的任一种：

（1）URA3启动子；

（2）T7启动子。

更为具体的，所述重组表达载体可为如下两种中的任一种：

（1）在YCp50载体的多克隆位点处插入所述HbRad6基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为EcoR I和Hind III。

（2）将所述HbRad6基因与pEASY-E1载体直接相连得到的重组质粒。

所述表达盒由能够启动所述HbRad6基因表达的启动子，所述HbRad6基因，以及转录终止序列组成。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为携带有所述HbRad6基因的重组酵母；所述酵母具体可为酵母rad6突变菌株。

所述HbRad6蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）-a4）中的应用也属于本发明的保护范围：

a1）调控生物的抗紫外线能力；

a2）调控生物DNA损伤修复功能；

a3）选育抗紫外线生物品种；

a4）选育具有DNA损伤修复功能的生物品种。

在本发明的一个实施例中，所述调控生物的抗紫外线能力具体为提高生物的抗紫外线能力；所述调控生物DNA损伤修复功能具体为提高生物DNA损伤修复功能。

所述选育抗紫外线生物品种的方法，具体可包括将所述HbRad6蛋白表达量较高的生物作为亲本进行繁殖的步骤；所述选育具有DNA损伤修复功能的生物品种的方法，具体可包括将所述HbRad6蛋白表达量较高的生物作为亲本进行繁殖的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗紫外线能力提高的转基因生物的方法。

该方法包括将编码所述HbRad6蛋白的基因导入目的生物中得到转基因生物的步骤；所述转基因生物与所述目的生物相比，抗紫外线能力提高。

本发明的还一个目的是提供一种培育DNA损伤修复能力提高的转基因生物的方法。

该方法包括将编码所述HbRad6蛋白的基因导入目的生物中得到转基因生物的步骤；所述转基因生物与所述目的生物相比，DNA损伤修复能力提高。

在上述两种方法中，所述HbRad6蛋白在所述转基因生物中的表达量高于所述目的生物；编码所述HbRad6蛋白的基因（即HbRad6基因）是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述HbRad6蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述HbRad6蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65°℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

所述HbRad6基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的生物中，得到所述转基因生物。

在本发明中，上述所有生物均可为植物、动物或微生物。

在本发明的一个实施例中，所述生物为微生物，具体为酵母，如酵母rad6突变菌株。

扩增所述HbRad6基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明提供的HbRad6具有DNA损伤修复的功能，转入微生物中具有DNA损伤修复活性，HbRad6转入的酵母rad6突变体中可部分恢复其对UV辐射敏感的表型。

附图说明

图1为HbRad6基因的原核表达分析，箭头所示条带为受IPTG诱导后所产生的特异表达的目标蛋白。其中，泳道1表示未加IPTG诱导；泳道2-5分别表示IPTG终浓度分别为1mM、1.5mM、2mM和3mM；泳道M为蛋白分子量。

图2为HbRad6基因对酵母rad6突变体的DNA损伤修复活性分析结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）热研7-33-97：是中国热带农业科学院橡胶研究所品种，由中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种植资源圃提供。

pMD18-T载体：来自宝生物工程（大连）有限公司产品，目录号：D101A。

pEASY-E1载体：来自pEASY-E1 Expression Kit，TransGen Biotech公司产品，目录号：CE101。

E.coli BL21(DE3)：来自pEASY-E1 Expression Kit，TransGen Biotech公司产品，目录号：CD601。

pR67质粒：参考文献Morrison A,Miller EJ,Prakash L.1988.Domain structure andfunctional analysis of the carboxyl-terminal polyacidic sequence of the RAD6 protein ofSaccharomyces cerevisiae.Molecular and Cellular Biology8(3):1179-1185

YCp50载体：参考文献Morrison A,Miller EJ,Prakash L.1988.Domain structure andfunctional analysis of the carboxyl-terminal polyacidic sequence of the RAD6 protein ofSaccharomyces cerevisiae.Molecular and Cellular Biology8(3):1179-1185。

酵母rad6突变菌株WXY376（his3-1 leu 2-3,-112 trp1-289 ura3-52rad6△::LEU2）：参考文献Xiao W，Chow BL,Broomfield S,Hanna M.2000.The Saccharomyces cerevisiaeRAD6 group is composed of an error-prone and two error-free postreplication repairpathways.Genetics 155:1633-1641。该菌株是RAD6基因缺失突变菌株，同时还有组氨酸（his3-1），色氨酸（trp1-289）和尿嘧啶（ura3-52）突变位点，具有较强的UV敏感性，不能在缺失组氨酸、色氨酸或者尿嘧啶的缺陷培养基中生长。

YPD液体培养基：含1%（1g/100ml）酵母提取物，2%（2g/100ml）蛋白胨和2%（2g/100ml）葡萄糖，115℃高压蒸汽灭菌15min。

YPD固定平板：含1%（1g/100ml）酵母提取物，2%（2g/100ml）蛋白胨，2%（2g/100ml）葡萄糖和2%（2g/100ml）琼脂粉，115℃高压蒸汽灭菌15min。

实施例1、HbRad6基因的获得及其蛋白的表达

一、HbRad6基因的获得

1、HbRad6全长基因的获得

在发明人建立的巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）热研7-33-97的树皮转录组数据库中，发现一个与水稻OsRad6基因同源性较高的基因序列，该基因序列包含完整阅读框（ORF）的序列，同时该序列还包括了基因的5′非翻译区（5′-UTR）序列和3′非翻译区（3′-UTR），且3′末端有27个A组成的Poly(A)尾巴，表明该序列是一个完整基因的全长序列。因此，在这个序列5′-UTR开始和3′-UTR结尾的位置分别设计如下引物1F（正义链引物）和1R（反义链引物）：

1F：5′-CCCAACTGCGATTCCCTTCTTTAAT-3′（序列2的第1-25位）；

1R：5′-GAAAAGAAAATTATGTCCTCTCTT-3′（序列2的第906-929位的反向互补序列）。

以巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）热研7-33-97为实验材料，提取其叶片总RNA，将其反转录为cDNA，以此cDNA为模板，以1F和1R作为引物，进行PCR扩增，得到该基因的全长cDNA序列。反应体系（50μl）：模板（反转录的cDNA）4μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，Taq酶（5U/μl）0.25μl，1F引物（10mM）1μl，1R引物（10mM）1μl，ddH₂O 34.75μl。PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，53℃退火50s，72℃延2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明获得约1000bp左右的条带。切下该目的条带，纯化回收后将PCR产物连接到pMD18-T载体上，将获得重组表达载体送样测序，测序结果表明，PCR产物为929bp，将该929bp的基因命名HbRad6，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，包含一个459bp的开放阅读框（ORF，自序列2的5′端第246-704位核苷酸序列，即序列表中序列1）、一个245bp的5′UTR（自序列2的5′端第1-245位核苷酸序列）和一个225bp的3′UTR（自序列2的5′端第705-929位核苷酸序列）。序列表中序列1和序列2编码序列表中序列3所示的蛋白质（命名为HbRad6）。HbRad6蛋白由152个氨基酸组成，预计其分子量为17.31KDa的蛋白，等电点为5.37。同时，将连接了HbRad6基因的pMD18-T载体，命名为pMD18-T-HbRad6。

2、HbRad6编码区基因的获得

以巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）热研7-33-97为实验材料，提取叶片基因组DNA，以此基因组DNA为模板，以根据HbRad6基因的ORF序列设计的引物2F（正义链引物）和2R（反义链引物）进行PCR扩增。反应体系（50μl）：模板（基因组DNA）4μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，Taq酶（5U/μl）0.25μl，2F引物（10mM）1μl，2R引物（10mM）1μl，ddH₂O 34.75μl。PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52℃退火50s，72℃延2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

2F：5′-ATGTCAACCCCAGCAAAGAAGAGAC-3′（序列1的第1-25位）；

2R：5′-CTAGTCAGCAGTCCAACTCTGCTCA-3′（序列1的第435-459位的反向互补序列）。

对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明获得约450bp左右的条带。对该PCR产物进行测序，测序表明，PCR产物大小为459bp，该459bp的核苷酸片段即为HbRad6基因的编码区序列，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。HbRad6的基因组（序列1）与cDNA序列（序列2）比较发现，该基因的基因组序列与ORF序列100%一致，没有内含子。

二、HbRad6蛋白的原核表达

1、含巴西橡胶树HbRad6基因编码区重组表达载体的获得

利用原核表达载体试剂盒pEASY-E1 Expression Kit（TransGen Biotech）构建HbRad6基因的原核表达载体，方法流程按照试剂盒说明书进行，具体方法如下：

根据HbRad6的ORF序列（序列1）去除终止密码子后设计引物3F（正义链引物）和3R（反义链引物）：

3F：5′-ATGTCAACCCCAGCAAAGAAGAGAC-3′（序列1的第1-25位）；

3R：5′-GTCAGCAGTCCAACTCTGCTCAACA-3′（序列1的第432-456位的反向互补序列）。

以步骤一构建得到的pMD18-T-HbRad6质粒为模板，利用引物3F和3R进行PCR扩增。反应体系（50μl）：模板（pMD18-T-HbRad6质粒）4μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，Taq酶（5U/μl）0.25μl，3F引物（10mM）1μl，3R引物（10mM）1μl，ddH₂O 34.75μl。PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，57℃退火50s，72℃延1min，共32个循环；最后72℃延伸10min。

对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段回收后直接连接到pEASY-E1载体上，并经过测序确定扩增序列的正确性，将鉴定表明正确的含有序列表序列2的第246-701位核苷酸序列的重组载体命名为pEASY-E1-HbRad6。在重组表达载体pEASY-E1-HbRad6中启动HbRad6基因转录的启动子为T7启动子。

2、HbRad6蛋白的原核表达

将步骤1获得的重组表达载体pEASY-E1-HbRad6导入E.coli BL21(DE3)表达菌株中，得到重组表达菌，对重组表达菌进行菌液PCR检测，所用引物为3F和T7 terminator引物（该引物是根据pEASY-E1载体上的T7 terminator终止信号序列设计，引物序列为：5′-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′）。将验证正确的重组菌（目的条带大小约为450bp）在含50μg/mL氨苄的LB培养基中培养至OD600=0.4~0.6，添加IPTG至不同的终浓度（1mM，1.5mM，2mM，3mM），37℃下诱导培养4小时，以未加IPTG的培养基培养的同样重组菌为对照，离心收集菌体，提取菌体总蛋白，并进行12%SDS-PAGE电泳检测。

结果表明，在IPTG诱导下HbRad6基因实现了高效异源表达，不同浓度的IPTG诱导效果差异不大，融合表达蛋白的分子量大约为23KDa，因为pEASY-E1载体上带的表达标签大约为6KDa（基因插入位点之前有18个氨基酸，基因插入位点之后还有27个氨基酸，总共45个氨基酸），表明该目标基因的表达蛋白的表观分子量与理论分子量相近，大约为17KDa（图1）。

实施例2、HbRad6对酵母rad6突变体的DNA损伤修复活性分析

利用酵母/大肠杆菌穿梭载体YCp50和酵母rad6突变菌株分析巴西橡胶树HbRad6是否具有DNA损伤修复的功能，方法参考文献（Xiao W，Chow BL,Broomfield S,HannaM.2000.The Saccharomyces cerevisiae RAD6 group is composed of an error-prone andtwo error-free postreplication repair pathways.Genetics 155:1633-1641）进行，具体方法如下：

1、含有巴西橡胶树HbRad6基因编码区重组表达载体YCp50-HbRad6的构建

通过Genetyx软件分析HbRad6基因的编码区限制性内切酶酶切位点，确定两个HbRad6基因编码区修饰用的限制性内切酶（EcoR I和Hind III）。设计HbRad6基因编码区引物4F（正义链引物）和4R（反义链引物）：

4F：5′-CGGAATTCATGTCAACCCCAGCAA-3′（下划线处为EcoR I的识别序列，其后的序列为序列1的第1-16位）；

4R：5′-CCCAAGCTTCTAGTCAGCAGTCCAA-3′（下划线处为Hind III的识别序列，其后的序列为序列1的第444-459位的反向互补序列）。

以pMD18-T-HbRad6质粒为模板，利用引物4F和4R进行PCR扩增。反应体系（50μl）：模板（pMD18-T-HbRad6质粒）4μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，Taq酶（5U/μl）0.25μl，4F引物（10mM）1μl，4R引物（10mM）1μl，ddH₂O 34.75μl。PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，57℃退火50s，72℃延1min，共32个循环；最后72℃延伸10min。

对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增得到450bp左右的片段，扩增片段回收后连接到pMD18-T载体上，获得重组质粒进行测序验证，测序结果表明该片段具有序列表序列2的第246-704位核苷酸序列（即序列1）。将该重组质粒命名为pMD18-T-HbRad6-EH。

在37℃水浴中，用EcoR I和Hind III双酶切重组质粒pMD18-T-HbRad6-EH，电泳回收450bp左右的目标片段。将该片段与经同样双酶切的YCp50质粒的骨架片段相连，得到重组载体。将重组载体进行EcoR I和Hind III双酶切鉴定，将经酶切鉴定正确的重组载体（目的条带大小约为450bp）送样测序，将测序表明含有序列表序列2的第246-704位核苷酸序列（即序列1）的重组表达载体命名为YCp50-HbRad6。在重组表达载体YCp50-HbRad6中，启动HbRad6基因转录的启动子具体为URA3启动子。

2、巴西橡胶树HbRad6对酵母rad6突变菌株的功能互补分析

将步骤1获得的重组表达载体YCp50-HbRad6导入酵母rad6突变菌株WXY376（his3-1 leu 2-3,-112 trp1-289 ura3-52rad6△::LEU2）得到重组表达菌，提取质粒，以4F和4R作为引物进行PCR检测。将验证正确的重组菌（目的条带大小约为450bp）命名为WXY376/HbRad6，用于UV辐射诱导实验。具体方法参照文献（Xiao W，ChowBL,Broomfield S,Hanna M.2000.The Saccharomyces cerevisiae RAD6 group iscomposed of an error-prone and two error-free postreplication repair pathways.Genetics155:1633-1641）进行：挑取单克隆于YPD液体培养基中30℃200rpm培养过夜（16小时），将过夜培养的菌液以体积比1：10的比例转接到新鲜的YPD液体培养基中30℃继续培养4~6小时，稀释适当倍数后涂布YPD固定平板，将平板于254nm的UV灯下进行不同辐射剂量处理（0J/m²,5J/m²,10J/m²,15J/m²,20J/m²,30J/m²）后，于30℃培养箱中黑暗培养3天后统计存活率。同时将含有酵母野生型基因RAD6的重组质粒pR67（含完整的RAD6基因ORF）导入酵母rad6突变菌株WXY376中（命名为WXY376/pR67）作为阳性对照；将YCp50空载体导入酵母rad6突变菌株WXY376中作为空载体对照（命名为WXY376/YCp50）。同时设置未导入载体的酵母rad6突变菌株WXY376作为空白对照。实验重复3次，结果取平均值。

结果显示，UV辐射剂量为5J/m²时，空载体对照-重组菌株WXY376/YCp50的存活率急剧下降，辐射剂量为30J/m²时已经没有存活的菌株，但是导入重组表达载体YCp50-HbRad6的菌株WXY376/HbRad6以及阳性对照—转化pR67的重组菌株WXY376/pR67则仍保持有一定的存活率（图2和表1）。空白对照组与空载体对照组结果无显著差异。以上结果表明所表达的重组蛋白HbRad6具有明显的DNA损伤修复活性，因此实施例所克隆得到的HbRad6基因编码功能性的DNA损伤修复蛋白。

表1 UV辐射后各组菌株存活率统计的三次重复结果  单位：%

Claims (10)

1.蛋白质，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与DNA损伤修复相关的由序列3衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为如下两种中的任一种：

（1）URA3启动子；

（2）T7启动子。

7.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5或6所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）-a4）任一中的应用：

a1）调控生物的抗紫外线能力；

a2）调控生物DNA损伤修复功能；

a3）选育抗紫外线生物品种；

a4）选育具有DNA损伤修复功能的生物品种。

8.一种培育抗紫外性能力提高的转基因生物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的生物中得到转基因生物的步骤；所述转基因生物与所述目的生物相比，抗紫外线能力提高。

9.一种培育DNA损伤修复能力提高的转基因生物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的生物中得到转基因生物的步骤；所述转基因生物与所述目的生物相比，DNA损伤修复能力提高。

10.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述生物为微生物；所述微生物具体为酵母。

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