CN105980564A - 一种提高生物质合成能力的改良微生物以及一种相关制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提高生物质合成能力的改良微生物。本发明还提供一种提高生物质合成能力的改良微生物的制造方法。生物质合成能力提高是过度表达可诱导DNA修复的基因的结果。在DNA受损最严重并且需要DNA修复机制时，表达负责DNA修复的基因。

Description

一种提高生物质合成能力的改良微生物以及一种相关制备方法
技术领域
本发明涉及一种提高生物质合成能力的改良微生物，以及一种用于制造改良微生物的方法。
背景技术
藻类等微生物在寿命期内始终接触恶劣环境条件。恶劣环境条件包括紫外线辐射(UV)、盐分、光照、不利温度、碱性、营养不足、氧化应激、老化、硫不足、碳不足、氮利用效率低等非生物性应激。生物性应激包括病毒、细菌、真菌或其他产生应激的病原体。这些条件对微生物的DNA完整性造成持续威胁，并导致其DNA损伤，如修改碱基、受损碱基、链内交联、链间交联、嘧啶二聚体、单链断裂和双链断裂(DSB)。DNA的破坏进一步导致细胞死亡，从而使微生物无法在恶劣环境中生存。要克服应激，这些微生物需要在生理上适应恶劣环境条件。这样将失去生物引人关注的独有特性。微生物的低存活率和失去引人关注的独有特性是将其能力用于工业用途的主要困难。
DNA双链断裂(DSB)的修复对维持基因组完整性至关重要。未修复或未正确修复DNA损伤可导致基因组不稳定，甚至细胞死亡。
此类DNA DSB修复需要多种蛋白质。其中一种重要蛋白质是Rad52蛋白，它对于准确修复DSB必不可少，并且在动物、真菌和酵母等真核生物中高度保守。它还对Rad51蛋白作用中的复制蛋白A(RPA)起到辅助作用。此外，Rad52蛋白还具有退火作用，促进超螺旋DNA中形成D-环。
RAD52基因被破坏可导致严重重组表型，包括极端X射线敏感度、染色体丢失增加和无法产生可存活孢子。对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Rad52突变体研究表明，Rad52蛋白对双链断裂修复和减数分裂具有至关重要的作用。研究证明，在酿酒酵母中，同源重组为消除离子辐射诱导的或与DNA复制叉受损有关的DNA双链断裂提供主要机制；并且Rad52蛋白对同源重组途径和DNA双链断裂修复起到重要作用。
WO2003089573提出一种方法，用于确定诱导DNA修复途径和/或抑制逆转录cDNA合成到宿主基因组中的化合物。
US20040111764提出一种表达框架，包括一个对编码重组DNA修复多肽或其片段的多核苷酸具有关联性的减数活跃启动子，能够模拟表达为RNA和/或所述多肽时的植物减数分裂重组。
但是，这些传统方法通常无法提高微生物的存活能力和生物质合成能力，同时有效高效维持基因组完整性，实现确定的稳定转基因合成。此外，一些传统方法使用大量和/或多种化学品促进提高生物质合成能力。
因此，需要开发一种提高微生物生物质合成能力的有效高效方法。
发明目的
本发明的一些目的如下，并通过以下至少一种具体实施方式满足：
本发明的一个目的是提供一种提高生物质合成能力的改良微生物。
本发明的另一个目的是提供一种提高生物质合成能力的改良微生物的制造方法。
本发明的另一个目的是提供一种提高DNA修复能力以应对实现生物质增加应激的改良微生物的制造方法。
本发明的另一个目的是提供一种在微生物中过度表达酵母RAD52基因以在微生物中有效诱导DNA修复的方法。
本发明的另一个目的是提供一种表达载体，由一个酵母RAD52基因和一个能够促进上述基因在DNA受损条件中表达的启动子组成。
以下描述中，本发明的其他目的和优势将得以进一步明确，但这些描述并不意图限制本发明的范围。
总结
在本发明的一个方面，提供一种莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的改良菌株CC125-45-03，该菌株可提高生物质合成能力。
在本发明的另一个方面，提供一种提高微生物中生物质合成能力的方法，该方法包括以下步骤：合成一种基因，该基因编码可诱导DNA修复的蛋白质；在表达载体中克隆所述获得的基因，以及能够在DNA受损条件中调制所述基因表达的启动子；将所述基因和所述启动子组成的所述表达载体引入微生物；在含有选择剂的介质中培养所述微生物；将所述微生物暴露在应激下以促进所述基因的过度表达，从而获得生物质合成能力提高的微生物。
附图简要说明
下面将借助附图说明本发明的方法，其中：
图1是说明RAD52在本发明方法中功能的流程图；
图2说明RAD52的密码子优化序列；
图3说明pChlamy_1载体，在Not1酶切位点包含克隆的RAD52基因，并包含Hsp70A-RbcS2启动子；
图4说明pChlamy_1载体，在Not1酶切位点包含克隆的RAD52基因，并包含高光诱导(Hli)启动子；
图5说明不进行紫外线处理的野生型生长和转化体；
图6说明进行紫外线处理后的野生型生长和转化体。
详细描述
在微生物中诱导DNA修复的传统方法无法有效提高微生物的生物质合成能力以及DNA修复能力。具体来说，传统方法无法延长微生物在恶劣环境条件下存活时间，环境条件包括非生物性应激和生物性应激，对DNA完整性造成主要威胁，并导致DNA损伤，从而使细胞死亡。为了克服此类条件带来的应激，微生物细胞必须在生理上适应恶劣环境条件，这样可能导致失去微生物引人关注的独有特性。如果不适应，细胞可能完全无法耐受应激。
因此，本发明提供一种提高生物质合成能力的改良微生物的制造方法。生物质合成能力提高是过度表达可诱导DNA修复的基因的结果。
在本发明的改良微生物中，DNA修复过程先溶核处理DNA片段末端以产生3’ssDNA尾端，然后在重组因子的约束下形成核蛋白复合体。该核蛋白复合体进行搜索，定位未受损的DNA同源染色体，然后借助同源染色体形成DNA连接，称为D-环。RAD52组的进化保守性基因编码的蛋白质催化同源重组反应。
相应地，获得本发明中可诱导DNA修复的蛋白质编码基因。图1以流程图的形式说明本方法中RAD52的功能。在本发明的一个具体实施方式中，基因为编码Rad52蛋白的酵母RAD52基因。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是本发明的一个酵母示例。
按照本发明的一个具体实施方式，基因为天然酵母RAD52基因。天然酵母RAD52基因表达由合适的启动子调制。按照本发明的一个具体实施方式，启动子为组成型启动子。或者，本发明使用诱导型启动子。诱导型启动子可促进RAD52基因在DNA受损条件下的表达。
按照本发明的一个具体实施方式，启动子为非酵母光诱导启动子(LIP)。启动子为杜氏藻(Dunaliella)、嗜热蓝藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942和rbcS启动子组成的组中选择的至少一种光诱导启动子。
按照本发明的另一个具体实施方式，基因为重组酵母RAD52基因。
合成RAD52(重组体)基因的DNA序列包含针对在非同源染色体宿主中过度表达所述基因优化的密码子。图2说明具有序列ID 1的密码子优化RAD52基因序列。然后在表达载体中克隆合成的基因。表达载体包括但不局限于环状质粒。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Rad52基因在pChlamy_1的Not1酶切位点克隆。图3和图4说明包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Rad52基因的pChlamy_1载体。
按照本发明的一个具体实施方式，提供由Hsp70A-RbcS2启动子(如图3所示)或高光诱导(Hli)启动子(如图4所示)驱动的酵母RAD52基因组成的表达载体。
含有RAD52基因的载体还包含可选标记。可选标记由抗性剂组成，对从以下组选择的至少一种化合物具有抗性，包括但不局限于抗菌化合物、抗真菌化合物和有毒化合物。
然后用含有RAD52基因的表达载体转化未转化的微生物细胞，获得改良微生物。通过从以下组选择的至少一种方法用表达载体转化未转化的微生物细胞，包括但不局限于基因枪、土壤杆菌介导基因转化和电穿孔，建议采用电穿孔方法。
按照本发明，微生物为包括但不局限于细菌的原核微生物。生物为包括但不局限于植物的真核生物。生物为包括但不局限于植物和藻类的光合作用生物。
在本发明的一个首选具体实施方式中，微生物为藻类。按照本发明使用的藻类从以下组中选择，包括但不局限于杜氏藻(Dunaliella)、小球藻(Chlorella)、微拟球藻(Nannochloropsis)和衣藻(Chlamydomonas)。
在含有至少一种选择剂的介质上培养改良微生物。选择剂是从以下组中选择的至少一种化合物，包括抗菌化合物、抗真菌化合物和有毒化合物。选择剂是从以下组中选择的至少一种抗菌化合物，包括但不局限于博莱霉素、卡那霉素、氯霉素和潮霉素，建议潮霉素。在本发明的一个首选具体实施方式中，介质中的潮霉素量为60mg/L。
建议在放入含有可选标记的介质前，培养转化后的改良微生物10到48小时。
根据可选标记表达，选择和隔离改良微生物。通过分子分析筛选改良微生物，隔离对可选标记具有抗性的微生物。
按照本发明的另一个具体实施方式，制造提高生物质合成能力以应对应激的改良微生物的制造方法包括以下步骤：
隔离12到24小时后，在含有潮霉素的选择介质中培养隔离的改良微生物15到20天。
然后隔离改良微生物的后代，获得改良微生物，其基因可在DNA受损条件下诱导微生物DNA修复。使用以下至少一种方法分析改良微生物的后代以稳定合成酵母RAD52基因，包括但不局限于聚合酶链式反应、Southern印迹杂交和Northern杂交。然后隔离含有RAD52基因的改良微生物。
通过本发明方法获得的改良微生物含有RAD52基因，该基因过度表达以在DNA受损条件下诱导微生物DNA修复，从而通过可诱导DNA修复机制的基因过度表达，提供一种提高生物质合成能力的改良微生物。在DNA受损最严重并且需要DNA修复机制时，表达RAD52基因。
按照本发明的另一个方面，提供原核生物和/或真核生物的改良菌株，尤其是生物质合成能力提高的藻类和/或蓝藻细菌的改良菌株，具体来说，按照本发明的改良菌株可以是Culture Collection of Algae and Protozoa(CCAP),SAMS Limited,Scottish Marine Institute,Dunbeg,Oban,Argyll,PA37 1QA,UK的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC125-45-03，CCAP加入编号11/172。
按照本发明制造的改良微生物具有调制RAD52表达的特定启动子；凭借该启动子过度表达RAD52，从而通过增强改良微生物中的DNA修复提高生物质合成能力。改良微生物存活率可提高至原来的5倍。对本发明的转化体(过度表达RAD52基因以诱导DNA修复)和野生型进行紫外线处理并允许其生长。可以观察到由于DNA受损，最初生长率下降，但750nm下的OD测量结果表明，转化体的恢复速度明显高于野生型。DNA修复能力增强由RAD52基因过度表达导致。
下面将在以下非限定性具体实施方式中讨论本发明：
实施例1使用电穿孔方法对衣藻(Chlamydomonas)进行转化
衣藻(Chlamydomonas)细胞(Invitrogen)在温度20℃的磷酸三甲酯(TAP)介质(Invitrogen)中培养4到6天。完成培养后，将10％Tween 20加入4╳108衣藻(Chlamydomonas)细胞。在200rpm温度4℃条件下，对细胞离心处理5分钟。然后在含有40mM蔗糖溶液的冰点4ml TAP介质中对细胞进行再悬浮处理。采用限制性酶切反应对含有Rad52基因以及高光诱导(Hli)启动子的2.5微克pChlamy_1质粒(Invitrogen)进行线性化，然后将质粒DNA溶解在含有40mM蔗糖溶液的30μl TAP介质中。将溶解在5μl水中的50μg鲑鱼精DNA(10μg/μl)作为载体，在95℃下加热变性。对鲑鱼精DNA水溶液加入细胞悬浮物，然后在细胞悬浮物上方加入上述制备的质粒DNA。在4mm试管中取得由细胞悬浮物、质粒DNA和载体鲑鱼精组成的250微升上述混合物，使用720-920伏10微法电容和Biorad电穿孔仪进行电穿孔。电穿孔后，将细胞置于25℃水浴中12小时。然后将细胞涂抹在含有40mM蔗糖溶液的TAP介质上。将0.5％琼脂糖、1ml 20％玉米淀粉、0.4％聚乙二醇和10μg/ml潮霉素加入含有40mM蔗糖溶液的TAP介质。获得转化体，然后在含有潮霉素的介质上重新划线以进一步确认。
实施例2比较转化的衣藻(Chlamydomonas)和对照样本的应激应对
在3ml磷酸三甲酯(TAP)介质(Invitrogen)中，培养通过实施例1方法获得的107转化衣藻(Chlamydomonas)细胞和没有Hli-Rad52的对照样本3天。完成培养后，将转化衣藻(Chlamydomonas)和对照样本进行100,000lux处理3小时。3小时后，允许细胞在10,000lux光照强度的正常条件下生长。
3到4天后，对照培养菌由于漂白作用/细胞死亡，颜色从绿色变为白色。对照培养菌无法适应应激，3到4天后无法存活。相比之下，转化衣藻(Chlamydomonas)培养菌保持绿色，说明其能够适应应激并存活。转化衣藻(Chlamydomonas)细胞能够存活15到20天，说明转化衣藻(Chlamydomonas)的存活能力提高至原来的约5倍。
实施例3：比较野生型(WT)和转化衣藻(Chlamydomonas)对紫外线处理的应激
对本研究，取实施例1方法获得的5个衣藻(Chlamydomonas)转化体和没有Rad52的WT培养菌。在20ml TAP介质(Invitrogen)中培养5个转化体和WT培养菌，在持续光照条件下培育直到达到106个/ml的细胞密度(750nm下约0.1OD)。完成培养后，将转化体和WT培养菌转移至具有6层的多层培养板。对转化体和WT培养菌进行2500μJoules·m-2·s-1紫外线光照处理。接受紫外线光照后，将转化体和WT培养菌在黑暗中培养24小时。然后在温度25℃光照强度100μE·m-2·s-1下，以光照12小时然后黑暗12小时循环培养转化体和WT培养菌。
对转化体和WT培养菌的类似培养板进行无紫外线处理培养。进行多次实验，取平均值绘制图形。图5表示在温度25℃光照强度100μE·m-2·s-1下，以光照12小时然后黑暗12小时循环培养的无紫外线处理的野生型和转化体生长。如图5所示，WT和转化体在8天内表现出类似生长速度。
图6表示接受紫外线处理(2500μJoules·m-2·s-1)，然后在温度25℃光照条件100μE·m-2·s-1下，以光照12小时然后黑暗12小时培养的野生型和转化体生长。如图6所示，观察到WT和转化体OD最初(第4天)下降。4天后，培养菌开始恢复并生长，OD增加。下面的表1给出WT和三个转化体的OD数值。从图6和表1可以明显看出，三个转化体RAD_02、RAD_03和RAD_05相比野生型OD增加，说明转化体相比野生型的生物质合成能力提高。如图6所示，转化体相比野生型的恢复速度更快。
表1图6中的OD数值
第7天的OD@750nm 相比WT的OD值增加百分比
WT 0.116 不适用
RAD52_02 0.137 18％
RAD52_03 0.176 51％
RAD52_05 0.129 11％
可以理解，具有本领域普通技术的人员对本发明方法执行合适改动，仍能实现本发明方法实现的结果。此类改动的性质仍属于本发明范围。此处提供的方法仅供示意，不排除此类改动。
经济意义和技术优势
本发明提供的技术优势如下：
·本发明提供一种提高生物质合成能力的改良微生物。
·本发明提供一种提高生物质合成能力的改良微生物的制造方法。
·本发明的方法使用的化学品更少(相比一些传统方法)，并且使用具有更高生物质合成能力的构造高效菌株，因此本方法简单、高效且经济。
虽然已将相当多的重点放在首选实施方式中，但应理解为，在不偏离本发明原则的前提下，可以有多种实施方式，并且可以对优选实施方式做出许多更改。根据本发明内容，本领域的技术人员将很容易地对本发明的优选实施方式及其它实施方式的所做出的这些及其它变化，由此可以清楚地了解以上实施方式的描述仅仅为本发明内容的说明性描述，而非限制性描述。
贯穿本说明书中的单词“包括”，或其变形都被理解为意指包含一种所述要素、整数或步骤、或一组要素、整数或步骤，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤组。
“至少”或“至少一种”表达方式表明使用一个或多个要素、成分或数量，本发明的具体实施方式中的使用是为实现一个或多个预期的目的或结果。
本说明书中包含的任何关于文件、条例、材料等的讨论仅用于构成本发明内容的目的。这并不意味着承认了这些资料的部分或全部就构成了在此项专利申请之前就已存在于任何国家相关领域的常识。
提到的各种物理参数、尺寸或数量的数值仅为近似值，应理解为高于/低于分配给这些参数、尺寸或数量的数值的值也属于本发明的范围内，除非本说明书中有具体的相反声明。

Claims (14)

1.一种用于提高微生物生物质合成能力的方法，所述方法具有以下步骤：
a.合成一种基因，该基因编码可诱导DNA修复的蛋白质；
b.在表达载体中克隆所述获得的合成基因，以及能够在DNA受损条件中调制所述基因表达的启动子；
c.将所述基因和所述启动子组成的所述表达载体引入微生物；
d.在含有选择剂的介质中培养所述微生物；
e.将所述微生物暴露在应激下以促进所述基因的过度表达，从而获得生物质合成能力提高的微生物。
2.权利要求1中的方法，其中所述基因为编码RAD52蛋白质的Rad52基因，从天然酵母RAD52基因和重组酵母RAD52基因组成的组中选择。
3.权利要求2中的方法，其中所述酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，所述RAD52基因为具有序列ID 1的密码子优化基因。
4.权利要求1中的方法，其中步骤(c)的所述微生物从原核生物和真核生物组成的组中选择，建议光合作用微生物。
5.权利要求1中的方法，其中所述微生物为藻类，从杜氏藻(Dunaliella)、小球藻(Chlorella)、微拟球藻(Nannochloropsis)和衣藻(Chlamydomonas)组成的组中选择。
6.权利要求1中的方法，其中所述启动子为杜氏藻(Dunaliella)、嗜热蓝藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942和rbcS启动子组成的组中选择的至少一种光诱导启动子。
7.权利要求1中的方法，其中所述表达载体为pChlamy_1。
8.权利要求1中的方法，其中介质中的所述选择剂是从抗菌化合物、抗真菌化合物和有毒化合物组成的组中选择的至少一种化合物。
9.权利要求8中的方法，其中所述抗菌化合物为博莱霉素、卡那霉素、氯霉素和潮霉素组成的组中选择的至少一种，建议潮霉素。
10.权利要求1中的方法，其中在步骤(e)中，所述微生物接受紫外线辐射(UV)、盐分、光照、不利温度、碱性、营养不足、氧化应激、老化、硫不足、碳不足、氮利用效率低、病毒、细菌和真菌组成的组中选择的至少一种应激。
11.一种提高生物质合成能力的改良微生物的制造方法；所述方法包括以下步骤：
a.合成一种基因，该基因编码可诱导DNA修复的蛋白质；
b.在表达载体中克隆所述获得的合成基因，以及能够在DNA受损条件中调制所述基因表达的启动子；
c.将所述基因和所述启动子组成的所述表达载体引入微生物；
d.在含有选择剂的介质中培养所述微生物；
e.将所述微生物暴露在应激下以促进所述基因的过度表达，从而获得生物质合成能力提高的改良微生物，其中，改良微生物合成的生物质相比未改良微生物增加。
12.一种用于增加藻类生物质的方法；所述方法具有以下步骤：
a.合成一种基因，该基因编码可诱导DNA修复的蛋白质；
b.在表达载体中克隆所述获得的合成基因，以及能够在DNA受损条件中调制所述基因表达的启动子；
c.将所述基因和所述启动子组成的所述表达载体引入藻类
d.在含有选择剂的介质中培养所述藻类；
e.将所述藻类暴露在应激下以促进所述基因的过度表达，从而获得更多藻类生物质。
13.一种按照权利要求11所述方法制造的改良微生物。
14.一种莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC125-45-03改良菌株，CCAP加入编号11/172。
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