CN114774435B

CN114774435B - OsRAD23d基因及其在提高水稻产量和耐盐性方面的应用

Info

Publication number: CN114774435B
Application number: CN202210559059.9A
Authority: CN
Inventors: 王娟; 李晓影; 秦华; 权瑞党; 黄荣峰
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2022-05-22
Filing date: 2022-05-22
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-05-22
Also published as: CN114774435A

Abstract

本发明公开了OsRAD23d基因及其在提高水稻产量和耐盐性方面的应用。所述OsRAD23d基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了泛素受体蛋白OsRAD23d在提高水稻二级枝梗数等产量性状中的应用，本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐盐机制的研究，以及提高植物的耐盐性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

OsRAD23d基因及其在提高水稻产量和耐盐性方面的应用

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，具体涉及OsRAD23d基因及其在提高水稻产量和耐盐性方面的应用。

背景技术

随着全球人口的增加、气候变化以及耕地的不合理使用，土壤盐渍化已成为土壤退化的核心问题，导致单位面积产量下降，严重威胁全世界粮食生产安全。此外，我国还有大量的可利用的盐碱地，开发潜力巨大，是我国重要的潜在耕地资源。这些盐碱地主要分布在东北、华北、西北内陆地区以及长江以北沿海地区。通过培育耐盐碱作物品种和科学改良盐碱地是开发利用这些土地资源的重要前提，对于保障国家粮食安全具有重要意义。

水稻是我国重要的粮食作物之一，对盐胁迫高度敏感（Munns and Tester,2008），在盐胁迫条件下水稻的生长发育和产量均会受到严重限制。水稻在不同生长发育阶段对盐胁迫的敏感性不同，与营养生长时期相比，水稻一般在苗期早期和生殖期对盐分更为敏感（Ismail and Horie, 2017; Moradi and Ismail, 2007）。在苗期早期，保持地上部低钠浓度是水稻保持生长和提高成活率的最重要的生长条件之一，但是苗期耐盐性强的水稻品种在生殖发育时期不一定表现出较高耐性（Rahman et al., 2016）。盐胁迫下，水稻叶片因积累较高浓度钠离子，生长发育受到明显抑制，叶片表现为变短、变小，甚至会出现萎蔫直至枯死，叶色也随之变浅，植株的高度与鲜重也会出现明显下降（Zhang et al.,2021）。还有研究表明，盐胁迫通过影响光合产物的产生及其向穗部的运转等过程导致水稻产量显著下降，水稻的茎秆和花序的长度在孕穗期严重缩短，有效穗数、千粒重和分蘖数等产量构成指标均显著降低（Hakim et al., 2014; Mitsuya et al., 2019; Sangwongchaiet al., 2022）。

水稻在我国粮食生产及消费中处于主导地位，并且可以作为沿海滩涂等水量丰富的盐碱地改良的首选粮食作物（王才林，2019）。开展提高水稻耐盐性的研究对我国绿色农业发展具有重要意义。水稻耐盐性是一个极其复杂的受多位点调控的数量性状，鉴于单个耐盐基因的微效性，即单一的耐盐基因对作物耐盐性的提高很有限（Rozema and Flowers,2008），因此，进一步挖掘协同改良产量和耐盐性的关键基因，可加速作物耐盐性遗传改良。

发明内容

本发明的目的在于提供可提高水稻产量和耐盐性的水稻泛素受体蛋白OsRAD23d及其在提高水稻产量和耐盐性方面的应用。

一种OsRAD23d基因，所述OsRAD23d基因的多核苷酸为（a）、（b）、（c）或（d）所示：

（a）如序列表SEQ ID No：1 所示的多核苷酸；或

（b）与SEQ ID No：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有增产和耐盐的功能；

（c）与SEQ ID No：1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或

（d）在SEQ ID No：1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入得到的多核苷酸突变体，且该多核苷酸突变体所编码的蛋白仍具有增产和耐盐的活性。

所述水稻泛素受体蛋白OsRAD23d与表1标签融合表达的蛋白。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag Ⅱ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

OsRAD23d蛋白含有一个类泛素（UBL）结构域，为第1到79氨基酸残基；两个泛素结合（UBA）结构域，为第163到206氨基酸残基和第364到405氨基酸残基。

一种OsRAD23d蛋白，所述OsRAD23d蛋白的氨基酸序列为（a）、（b）或（c）所示：

（a）如序列表SEQ ID No：2 所示的氨基酸序列；或

（b）与SEQ ID No：2所示的氨基酸至少有90%或以上同源性的氨基酸；或

（c）在SEQ ID No：2所示的蛋白基础上进行一个或多个氨基酸的缺失、取代或插入得到的蛋白突变体，且该蛋白仍具有增产和耐盐的活性。

包含所述OsRAD23d基因的载体。

包含所述OsRAD23d基因的载体的工程菌。

检测所述OsRAD23d基因任一片段的引物。

所述OsRAD23d基因在培育耐盐水稻品种中的应用。

所述OsRAD23d基因在培育增产水稻品种中的应用。

一种提高水稻耐盐性的方法，提高OsRAD23d蛋白在水稻中的表达水平。

所述方法包括用上述DNA分子或上述多肽转化水稻细胞或者沉默目的水稻中所含有的上述DNA分子或上述多肽，再将转化后的水稻细胞培育成植株，得到产量和耐盐性改变的转基因水稻，其中产量和耐盐性可以是提高或降低的。

本发明的有益效果：本发明首次鉴定到提高水稻泛素受体蛋白OsRAD23d基因表达能同时明显地提高水稻产量和幼苗对盐胁迫的耐性，使植物在正常条件下穗粒数增加；而当遇到盐等非生物胁迫时，过表达转基因株系相对于野生型，经过一段时间胁迫处理后，生长受抑制的程度减弱。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及改良植物的耐逆性及农作物产量性状具有重要的理论及实际意义，将在作物遗传育种中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1所示为OsRAD23d泛素结合特性验证。

图2所示为OsRAD23d相关T-DNA插入突变体、CRISPR/CAS9基因编辑突变体和过表达转基因植株产量性状统计。

图3所示为OsRAD23d相关T-DNA插入突变体、CRISPR/CAS9基因编辑突变体和过表达转基因植株盐胁迫处理表型。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：OsRAD23d体外泛素结合特性分析

1、利用水稻品种DJ的cDNA，以特异引物对X-F和X-R进行PCR反应，PCR产物经电泳分离回收后，克隆到pEASY-Blunt（北京全式金生物技术有限公司），命名为pEASY-Blunt-OsRAD23d，进行测序。

特异引物对X-F和X-R如下：

X-F：5’-GGATCCATGAAGCTGTTCGTGAAGACCCT-3’；

X-R：5’-GTCGACTTGTTGATCCTCAAACTCATGGC-3’；

测序结果表明，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码SEQ ID NO：2所示的蛋白质。

2、用限制性内切酶BamHI和SalI酶切重组质粒pEASY-Blunt-OsRAD23d，回收包含OsRAD23d序列的片段。

3、用限制性内切酶BamHI和SalI酶切pET-30a(+)，回收骨架，与步骤2得到的片段连接，得到pET-30a(+)-OsRAD23d。

4、将pET-30a(+)-OsRAD23d电转化大肠杆菌BL21，将获得的阳性克隆接种于LB培养基，当其生长至OD600为0.4时，加入终浓度为0.5μM的IPTG诱导OsRAD23d蛋白的表达，16℃，150 rpm培养6小时，收集菌体，超声破碎细胞后，得到蛋白粗提液。

5、通过HIS 亲和层析柱填料用Bio-Rad蛋白低压层析系统纯化OsRAD23d-HIS 体外重组蛋白。

6、取纯化的OsRAD23d-HIS重组蛋白6μg 分别与5μg K48 或K63 连接的Ub2-7（BOSTONBIOCHEM）混匀。

7、用Buffer A（Tris-HCl pH7.5 50 mM，NaCl 100 mM，Na₂EDTA 1 mM，NP40 0.1%）洗涤50μL HIS 亲和层析柱填料，然后与上一步的蛋白混液混匀，用Buffer A 补足到500μL体系，室温孵育2 h。

8、用Buffer A 洗涤三次，最后用40μL Buffer A 重悬，加10μL 5×loadingbuffer。

9、沸水浴煮10 min，然后离心取上清进行SDS-PAGE 电泳，用anti-ubiquitin 抗体进行western blot 检测。

检测结果如图1所示，OsRAD23d在体外可以与K48和K63形式连接的多聚泛素结合。

实施例2：OsRAD23d突变体和过表达转基因植物的获得

1、OsRAD23d T-DNA插入突变体的鉴定

从韩国水稻突变体库订购到编号为PFG_2A-10218.R的T-DNA激活标签插入突变体，其背景均为DJ（Japonica rice Oryza sativa cv. Dongjin），T-DNA插入位点位于6号染色体的Os06g0264300，其编码泛素受体家族蛋白，命名为OsRAD23d，并将突变体命名为rad23d。利用CTAB法提取野生型DJ和突变体各个单株的基因组DNA，通过三引物法来鉴定突变体有无纯合体，以特异引物对Y-F/Y-R和中间引物15LB1同时进行PCR反应。然后琼脂糖凝胶电泳检测，野生型应该只有一条1000 bp 大小左右的条带，纯合体应该只有一条500 bp大小左右的条带，杂合体应该两条带都有。

特异引物对：

Y-F：5’-AGAGGCAAAGGCTATTTGCTC-3’

Y-R：5’-GCATCGCGTCGTCTACTACTC-3’

15LB1：

5’-CTAGAGTCGAGAATTCAGTACA-3’

2、OsRAD23d CRISPR/CAS9基因编辑突变体的创建

利用5’-GAGAATCATTGAGAGTACTC-3’为OsRAD23d编码基因的靶位点，连接到含有CAS9的载体pHUN4c12。构建好的载体转入农杆菌EHA105，然后通过愈伤浸染转入DJ品种，获得基因编辑突变体，其中两个基因编辑突变体株系C1和C3，C1是在编码区97位后面插入一个T，C3是在96-97位缺失TA两个碱基，这两种突变均导致蛋白翻译移码后提前终止。

3、OsRAD23d过表达载体转基因株系的创建

利用特异引物对Z-F/Z-R扩增OsRAD23d编码基因全长，并利用无缝克隆方法连接到pCAMBIA3301载体中。构建好的载体转入农杆菌EHA105，然后通过愈伤浸染转入DJ品种，获得两个过表达株系OE1和OE7，OsRAD23d基因表达量为野生型DJ中的4-6倍。

Z-F：5’- gtttggtgttacttctgcagATGAAGCTGTTCGTGAAGACCCT -3’；

Z-R：5’- tcacacgtgagctcggatccTTGTTGATCCTCAAACTCATGGC -3’；

上述引物中的下划线标识的序列为用于重组的pCAMBIA3301载体序列。

实施例3：OsRAD23d相关突变体和过表达转基因植株产量性状分析

对OsRAD23D T-DNA插入突变体rad23d、CRISPR/CAS9基因编辑突变体C1和C3、过表达转基因植株OE1和OE7进行产量性状分析，统计成熟期的株高和穗部性状。相较与野生型DJ，发现突变体株高显著下降，而过表达植株没有差异；观察穗部性状，发现突变体rad23d和C3的穗粒数、二级枝梗数、实穗粒数均显著减少，而过表达植株OE7的二级枝梗数有显著增加，实穗粒数也有增加，表明OsRAD23d可以提高水稻产量，如图2所示。

实施例4：OsRAD23d相关突变体和过表达转基因植株耐盐性分析

对OsRAD23D T-DNA插入突变体rad23d、CRISPR/CAS9基因编辑突变体C1和C3、过表达转基因植株OE1和OE7进行苗期耐盐性鉴定，取萌发一致的种子于37℃浸种1天后催芽，选择萌发整齐的种子种于96孔板用于水培，用Yashida培养液培养至至两叶一心期后更换含有120 mM NaCl的营养液进行处理，一周后复水并统计萎蔫率。在120 mM NaCl高盐胁迫下，DJ的萎蔫率为0.7左右，而OsRAD23d突变体的萎蔫率为0.8-0.9，过表达株系萎蔫率为0.1-0.4，表明OsRAD23d可以提高水稻苗期耐盐性，结果如图3所示。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> OsRAD23d基因及其在提高水稻产量和耐盐性方面的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1242

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

atgaagctgt tcgtgaagac cctgaagggc accaacttcg agatcgaggc gagccccgag 60

gcgtcggtgg ctgaggtgaa gagaatcatt gagagtactc aggggcagaa tgtgtacccg 120

gcggatcagc agatgctcat acaccaaggg aaaattctca aggatgatac aactttggaa 180

ggcaacaaag ttgctgagaa cagcttcctt gttataatgc tgtctaaggc caaagcatca 240

tcaagtggag cttcaactgc ttcaaaggca cctgtgagcc agtctcaacc agcaactcca 300

gttgcctcag ttgcaagaac accacctcca caagcacctg ttgttacacc tgaaccggca 360

cctccaagtg cacagcctcc agttgcttct gccactccag ctgctgctgc cactccagct 420

gctgctgtga ccgcatcaag tgatgcggat gtctacagtc aggctgcatc aaatcttgtt 480

tcaggtagca acctagaaca gacaatccaa caaattcttg acatgggtgg tggcacctgg 540

gaacgtgaca tggttgtccg tgctttgcgt gctgcatata acaaccctga gagagctatt 600

gactatctgt attctggaat tcctgagaat gtggagcccc cacaacctgt ggctcgagca 660

cctgctgctg ttcaacaggg aaatccacag gttccatctc aggctcaggc tgcacctcca 720

ccgcctgtgc agccagctgg tggtgcctca ggacctaatg cgaatcctct aaacctattc 780

ccccagggca ttccaagtgc tgggtcaaat cctggtgctg ctgctggtgc cggtgccggt 840

gctggtgccc ttgatgcatt gcgacaactt ccacagttcc aagcgctgct tgcattggtc 900

caggctaatc cccaaatctt gcagccaatg cttcaagagc ttgggaagca gaatccgcaa 960

atcttgcggt tgattcagga aaatcaggct gaatttctcc gtctggtgaa tgaatctcct 1020

gatagcggcg ctgctggggg aaacatacta ggtcaactag cagccgctat gccacaggca 1080

cttacagtta ctccagagga acgggaggcc attcagcggc tggaggcaat ggggttcaac 1140

cgtgagctcg ttttggaggt cttcttcgca tgcaacaagg atgaagagct ggctgccaac 1200

tatcttttgg atcatggcca tgagtttgag gatcaacaat ag 1242

<210> 2

<211> 413

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Lys Leu Phe Val Lys Thr Leu Lys Gly Thr Asn Phe Glu Ile Glu

1 5 10 15

Ala Ser Pro Glu Ala Ser Val Ala Glu Val Lys Arg Ile Ile Glu Ser

20 25 30

Thr Gln Gly Gln Asn Val Tyr Pro Ala Asp Gln Gln Met Leu Ile His

35 40 45

Gln Gly Lys Ile Leu Lys Asp Asp Thr Thr Leu Glu Gly Asn Lys Val

50 55 60

Ala Glu Asn Ser Phe Leu Val Ile Met Leu Ser Lys Ala Lys Ala Ser

65 70 75 80

Ser Ser Gly Ala Ser Thr Ala Ser Lys Ala Pro Val Ser Gln Ser Gln

85 90 95

Pro Ala Thr Pro Val Ala Ser Val Ala Arg Thr Pro Pro Pro Gln Ala

100 105 110

Pro Val Val Thr Pro Glu Pro Ala Pro Pro Ser Ala Gln Pro Pro Val

115 120 125

Ala Ser Ala Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Val Thr

130 135 140

Ala Ser Ser Asp Ala Asp Val Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Asn Leu Val

145 150 155 160

Ser Gly Ser Asn Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Ile Leu Asp Met Gly

165 170 175

Gly Gly Thr Trp Glu Arg Asp Met Val Val Arg Ala Leu Arg Ala Ala

180 185 190

Tyr Asn Asn Pro Glu Arg Ala Ile Asp Tyr Leu Tyr Ser Gly Ile Pro

195 200 205

Glu Asn Val Glu Pro Pro Gln Pro Val Ala Arg Ala Pro Ala Ala Val

210 215 220

Gln Gln Gly Asn Pro Gln Val Pro Ser Gln Ala Gln Ala Ala Pro Pro

225 230 235 240

Pro Pro Val Gln Pro Ala Gly Gly Ala Ser Gly Pro Asn Ala Asn Pro

245 250 255

Leu Asn Leu Phe Pro Gln Gly Ile Pro Ser Ala Gly Ser Asn Pro Gly

260 265 270

Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Leu Asp Ala Leu Arg

275 280 285

Gln Leu Pro Gln Phe Gln Ala Leu Leu Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro

290 295 300

Gln Ile Leu Gln Pro Met Leu Gln Glu Leu Gly Lys Gln Asn Pro Gln

305 310 315 320

Ile Leu Arg Leu Ile Gln Glu Asn Gln Ala Glu Phe Leu Arg Leu Val

325 330 335

Asn Glu Ser Pro Asp Ser Gly Ala Ala Gly Gly Asn Ile Leu Gly Gln

340 345 350

Leu Ala Ala Ala Met Pro Gln Ala Leu Thr Val Thr Pro Glu Glu Arg

355 360 365

Glu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ala Met Gly Phe Asn Arg Glu Leu Val

370 375 380

Leu Glu Val Phe Phe Ala Cys Asn Lys Asp Glu Glu Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Tyr Leu Leu Asp His Gly His Glu Phe Glu Asp Gln Gln

405 410

Claims

1.OsRAD23d基因在培育耐盐水稻品种中的应用，其特征在于，所述OsRAD23d基因的多核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1 所示。

2.OsRAD23d基因在培育增产水稻品种中的应用，其特征在于，所述OsRAD23d基因的多核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1 所示。

3.一种提高水稻耐盐性的方法，其特征在于，提高OsRAD23d蛋白在水稻中的表达水平；所述OsRAD23d蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：2 所示。