JP4801052B2

JP4801052B2 - 細菌共同体ｎｂｃ２０００及びそれを利用した環境ホルモンの生物学的処理方法

Info

Publication number: JP4801052B2
Application number: JP2007510623A
Authority: JP
Inventors: 李性器
Original assignee: 李性器
Priority date: 2004-04-28
Filing date: 2005-04-28
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2025-04-28
Also published as: JP2007534332A; US7745199B2; CA2564825A1; KR20050104260A; US20080248555A1; WO2005105979A1; EP1745124B1; EP1745124A1; DE602005026272D1; ATE498004T1; EP1745124A4; KR100588305B1

Description

本発明は、環境ホルモンの処理に有用な新規の細菌共同体及びそれを利用した環境ホルモンの処理方法に関する。更に詳細には、環境ホルモンである多塩素化ビフェニル（Ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄｂｉｐｈｅｎｙｌｓ、ＰＣＢｓ）、ダイオキシン（Ｄｉｏｘｉｎ）、五塩素化フェノール（Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、ＰＣＰ）、ペルクロロエチレン（Ｐｅｒｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎe、ＰＣＥ）、トリクロロエチレン（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ、ＴＣＥ）、１，１，１−トリクロロエタン（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ−ｅｔｈａｎｅ、１，１，１−ＴＣＡ）等の有機塩素系溶媒、多環式芳香族炭化水素（Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃａｒｏｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ、ＰＡＨ）、タール酸（Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍｔａｒａｃｉｄs）及びトルエン（Ｔｏｌｕｅｎｅ）等で汚染集積された土壌、廃棄物、水質等に対する生物学的な復元方法に関する。

地球の環境問題の中でも最も深刻に憂慮される環境ホルモン（内分泌系障害物質）は、現在約１４０余種に分類されており、大部分塩素系化合物及び一部の重金属が含まれている。これらは、ここ数世紀の間産業革命と地球環境の汚染、経済発展と共に大気、水質、土壌を始めて人類の食物連鎖を広範囲に汚染させてきた。生態系の食物連鎖を通じた微量濃度の持続的な増幅と無形的な毒性の極大化により、動物と人間の行動異常と癌の発生率を高めてきており、免疫体系の破壊及び精子数の減少等のような生殖機能の混沌が加速化されている。特に、生殖機能に対する致命的な作用により人類そのものの滅種及び生存に対する見えない危険が増加している。

多塩素化ビフェニルの有害物質は、１ｍｇ／ｋｇ以下の微量濃度水準の一部の同種体と嫌気的な実験室の条件で、微生物反応に関する研究報告があっただけであり、好気的な条件と高濃度の多様な同種体のＰＣＢｓ及び現場土壌への接近研究は、国内外で試みられたことがなかった。ＰＣＥ等の塩素系溶媒もこれまで微生物を利用した嫌気的な条件で一部試みられたことがあるが、設備費用及び処理効率の面において現在まで多くの困難が露呈された。その他は、主に焼却熱処理、化学薬品による中和、物理的な高圧凝縮による固形化、洗浄、埋立て等で試みられたものの、その副作用（生態系の不均衡及びダイオキシン等の２次汚染の増大）と費用が過重に出ている。ダイオキシンに対する根本的な処理も全く試みられていない。トルエンとＰＡＨは、依然として多くの生物学的な処理限界を示しており、石油化学産業の副産物であるタール酸に対する生物学的な処理は、まだ基礎的な研究から接近すらできていない実情である。

例えば、以前世紀はコンバータ類のオイルとして用いられてきた絶縁体鉱油（ｉｎｓｕｌａｔｏｒｍｉｎｅｒａｌｏｉｌ）のように、過量の多塩素化ビフェニルを含む鉱油は、現世紀に問題となっている。実際に、過量の多塩素化ビフェニルから構成された絶縁体鉱油は、大規模に未処理されたまま残っている。従って、このような鉱油を分解するための方法が切実に求められている実情である。

前記のような人類の現実的な当面問題を解決すべく、本発明者は土壌及び水質等の生態系に存在する新規の天然有用微生物を見つけ、地球環境を汚染させる内分泌系障害物質である環境ホルモンを環境に優しい方法により根本的に除去する生態的な復元技術を確立しようとする。

前記のような目的を達成するために、本発明による細菌共同体ＮＢＣ２０００は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｃｙ１００菌株（以下、“Ｃｙ１００”と略称する）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．）Ａｅｎｇ１８菌株（以下、“Ａｅｎｇ１８”と略称する）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｄｊｈｃ菌株（以下、“Ｄｊｈｃ”と略称する）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｔａｒ３菌株（以下、“Ｎｔａｒ３”と略称する）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．）Ｎｔａｒ２菌株（以下、“Ｎｔａｒ２”と略称する）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＥＢＣ１０７菌株（以下、“ＥＢＣ１０７”と略称する）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｔｎｈ菌株（以下、“Ｔｎｈ”と略称する）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）Ａｅｎｇ１７菌株（以下、“Ａｅｎｇ１７”と略称する）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｃｐｔｓ菌株（以下、“Ｐｃｐｔｓ”と略称する）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）Ｎｔａｒ１菌株（以下、“Ｎｔａｒ１”と略称する）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｓｐ３００菌株（以下、“Ｓｐ３００”と略称する）、クリセオモナス・ルテオラ（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓｌｕｔｅｏｌａ）Ｇｃ５０１菌株（以下、“Ｇｃ５０１”と略称する）、クリセオモナス属（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｇｃ５００菌株（以下、“Ｇｃ５００”と略称する）、クリセオモナス・ルテオラ（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓｌｕｔｅｏｌａ）Ｇｃ３００菌株（以下、“Ｇｃ３００”と略称する）、ブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｃｙ１０１菌株（以下、“Ｃｙ１０１”と略称する）、ブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｃｙ１０２菌株（以下、“Ｃｙ１０２”と略称する）、ブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｃｙ１０３菌株（以下、“Ｃｙ１０３”と略称する）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｂｓ１００菌株（以下、“Ｂｓ１００”と略称する）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃｙ１０４菌株（以下、“Ｃｙ１０４”と略称する）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｃｙ１０５菌株（以下、“Ｃｙ１０５”と略称する）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｃｙ１０６菌株（以下、“Ｃｙ１０６”と略称する）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｃｙ１０７菌株（以下、“Ｃｙ１０７”と略称する）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）ＥＢＣ１０６菌株（以下、“ＥＢＣ１０６”と略称する）、タール分解グラム陽性細菌であるＢｓ１０１菌株（以下、“Ｂｓ１０１”と略称する）、硫黄菌株であるＮｚ２００１菌株（以下、“Ｎｚ２００１”と略称する）及び油類分解グラム陰性細菌であるＷ２４菌株（以下、“Ｗ２４”と略称する）から構成されたことを特徴とする。

また、本発明による環境ホルモンの処理方法は、前記細菌共同体ＮＢＣ２０００を利用することを特徴とする。

前記の本発明による環境ホルモンの処理方法において、前記環境ホルモンは、多塩素化ビフェニル（Ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄｂｉｐｈｅｎｙｌｓ、ＰＣＢｓ）、ダイオキシン（Ｄｉｏｘｉｎ）、五塩素化フェノール（Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、ＰＣＰ）、ペルクロロエチレン（Ｐｅｒｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎ、ＰＣＥ）等の塩素系化合物、トルエン、石油炭化水素又はタール酸を含むことを特徴とする。

前記の本発明による環境ホルモンの処理方法は、前記細菌共同体ＮＢＣ２０００に加えて、細菌共同体ＥＢＣ１０００（ＫＣＴＣ０６５２ＢＰ）（大韓民国特許第２８４３１３号、米国特許第６３８３７９７号、オーストラリア特許第７５９３３８号、ニュージーランド特許第５１７６４７号）を共に利用することを特徴とする。

また、本発明による環境ホルモンである多塩素化ビフェニル（Ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄｂｉｐｈｅｎｙｌｓ、ＰＣＢｓ）を処理する細菌共同体はＣｙ１０６を必須的に含み、Ｃｙ１００、ＥＢＣ１０７、Ｔｎｈ、Ｃｙ１０１、Ｃｙ１０２、Ｃｙ１０３、Ｃｙ１０４、Ｃｙ１０７及びＥＢＣ１０６菌株から構成された群より選ばれた１つ以上の菌株を更に含むことを特徴とする。

また、本発明による環境ホルモンであるダイオキシン及び五塩素化フェノール（ＰＣＰ）を処理する細菌共同体は、ＥＢＣ１００、ＥＢＣ１０１、ＥＢＣ１０３及びＥＢＣ１０６菌株から構成された群より選ばれた１つ以上の菌株を必須的に含み、Ａｅｎｇ１８、Ｄｊｈｃ、Ｔｎｈ、Ａｅｎｇ１７、Ｐｃｐｔｓ、Ｓｐ３００、Ｇｃ５０１、Ｇｃ５００、Ｇｃ３００及びＮｚ２００１から構成された群より選ばれた１つ以上の菌株を更に含むことを特徴とする。

また、発明による環境ホルモンであるペルクロロエチレン、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）、１，１，１−トリクロロエタン（１，１，１−ＴＣＡ）等の塩素系溶媒を処理する細菌共同体は、ＥＢＣ１０７及びＴｎｈのうち、何れか１つ以上を必須的に含み、ＥＢＣ１０６を更に含むことを特徴とする。

また、本発明による環境ホルモンであるタール酸（Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍｔａｒａｃｉｄｓ）を処理する細菌共同体は、Ａｅｎｇ１７、Ａｅｎｇ１８及びＴｎｈから構成された群より選ばれた１つ以上の菌株を必須的に含み、Ｎｔａｒ３、Ｎｔａｒ２、Ｎｔａｒ１、Ｓｐ３００、Ｂｓ１００、ＥＢＣ１０６、Ｂｓ１０１、Ｗ２４及びＮｚ２００１菌株から構成された群より選ばれた１つ以上の菌株を更に含むことを特徴とする。

また、環境ホルモンであるトルエンを処理する細菌共同体は、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）ＥＢＣ１０６菌株及びグラム陽性菌株であるＥＢＣ１０８のうち、何れか１つ以上を必須的に含み、Ａｅｎｇ１７、Ａｅｎｇ１８、Ｎｚ２００１、ＥＢＣ１０７及び油類分解グラム陰性細菌（ｏｉｌｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅｓｔｒａｉｎ）であるＷ２４菌株から構成された群より選ばれた１つ以上の菌株を更に含むことを特徴とする。

また、本発明による環境ホルモンである残留ダイオキシンを処理する細菌共同体は、シュードモナス属Ｃｙ１００菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリスＣｙ１０１菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリスＣｙ１０２菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリスＣｙ１０３菌株、バチルス・ステアロサーモフィラスＣｙ１０４菌株、バチルス属Ｃｙ１０５菌株、バチルス属Ｃｙ１０６菌株及びバチルス属Ｃｙ１０７菌株を含むことを特徴とする。

また、本発明による環境ホルモンである多塩素化ビフェニルを含む鉱油を処理する細菌共同体は、バチルス属Ｃｙ１０６菌株を必須的に含み、シュードモナス属Ｃｙ１００菌株、シュードモナス属ＥＢＣ１０７菌株、シュードモナス・アエルギノサＴｎｈ菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリスＣｙ１０１菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリスＣｙ１０２菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリスＣｙ１０３菌株、バチルス・ステアロサーモフィラスＣｙ１０４菌株、バチルス属Ｃｙ１０５菌株、バチルス属Ｃｙ１０７菌株、バチルス・セレウスＥＢＣ１０６菌株、エロモナス・ハイドロフィラＡｅｎｇ１７菌株、セラチア属Ａｅｎｇ１８菌株、バチルス・ステアロサーモフィラスＢｓ１００菌株、硫黄菌株であるＮｚ２００１菌株、油類分解グラム陰性菌株であるＷ２４菌株から構成された群より選ばれた１つ以上の菌株を更に含むことを特徴とする。

前記の環境ホルモンの処理方法及び細菌共同体において、前記タール酸は、ＴＰＨ（ｔｏｔａｌｐｅｔｒｏｌｅｕｍｈｙｄｒｏｃｏｒｂｏｎｓ）、ＰＡＨ（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃａｒｏｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ＢＴＥＸ（ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン）、ベンゼン、エチルベンゼン、トルエン、キシレン、ＥＯＸ（ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅｏｒｇａｎｉｃｈａｌｏｇｅｎｓ）、ＰＯＸ（ｐｕｒｇｅａｂｌｅｏｒｇａｎｉｃｈａｌｏｇｅｎｓ）、ハロゲン化炭化水素（Ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）、クロロ−ベンゼン、クロロ−フェノール、ＰＣＢｓ、シアン化物、ヒ素、鉛、カドミウム、水銀及び硫黄を含むものであることを特徴とする。

本発明による細菌共同体は、自然生態系で分離・発見した新規の野生菌株らから構成された共同体であって、多塩素化ビフェニル、ダイオキシン、五塩素化フェノール、ＰＣＥ等の有機塩素系溶媒、トルエン、ＰＡＨ及びタール酸等の環境ホルモンを炭素源として利用して効率的に分解するので、環境ホルモンが汚染集積された土壌、廃棄物、水質、大気等を環境に優しく浄化復元させることができる。従って、本発明による細菌共同体は、高難度の環境ホルモン有害物質の汚染を効果的に防止することができ、大規模の汚染現場環境を効率的に復元することができる効果がある。また、本発明による細菌共同体は、好気的な方式で用いることができるため、現在まで生物学的な処理が不可能であると知られている多塩素化ビフェニル、ダイオキシン、ＰＣＥ等の有機塩素系溶媒、タール酸及び一部の生分解が可能なトルエン、五塩素化フェノール、ＰＡＨ等を安価な費用と簡便な手続きで大部分生分解することによって、これらが汚染された土壌、廃棄物、地下水、大気等の環境を安価で且つ簡便に復元することができる。

本発明の前記目的、その他の目的、特性及び有利な効果は、以下に添付された図面と共に発明の詳細な説明を通じてより詳しく記述することにする。本発明の下記説明において、本発明の対象をかえって不明確にする恐れがあるときには、既によく知られている機能及び構造に関する詳細な説明は省略することにする。

本発明は、土壌、河川等で分離され、代表的な環境ホルモンとして知られている５００〜１，０００ｍｇ／ｋｇｓｏｉｌの濃度の多塩素化ビフェニルの２０９種の同種体、２，５００ｎｇ／ｋｇｓｏｉｌに達する１７種のＰＣＤＤ／ＰＣＤＦダイオキシン、５０，０００ｍｇ／ｋｇｓｏｉｌの五塩素化フェノール（ＰＣＰ）、５０，０００ｍｇ／ｋｇｓｏｉｌの液状の汎用塩素系溶媒（ＰＣＥ）、４０，０００ｍｇ／ｋｇの液状のトルエン、２０余種の有害物質〔例えば、ＴＰＨ（ｔｏｔａｌｐｅｔｒｏｌｅｕｍｈｙｄｒｏｃｏｒｂｏｎｓ）４２，６００ｍｇ／ｋｇ、ＰＡＨ（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃａｒｏｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）１９０ｍｇ／ｋｇ、ＢＴＥＸ（ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン）３．７６ｍｇ／ｋｇ、ベンゼン０．３３ｍｇ／ｋｇ、エチルベンゼン＜０．０５ｍｇ／ｋｇ、トルエン＜０．０５ｍｇ／ｋｇ、キシレン０．５９ｍｇ／ｋｇ、ＥＯＸ（ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅｏｒｇａｎｉｃｈａｌｏｇｅｎｓ）７６．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯＸ（ｐｕｒｇｅａｂｌｅｏｒｇａｎｉｃｈａｌｏｇｅｎｓ）６１．８ｍｇ／ｋｇ、ハロゲン化炭化水素（Ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）＜０．０１ｍｇ／ｋｇ、クロロ−ベンゼン＜０．１ｍｇ／ｋｇ、クロロ−フェノール＜０．１ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＢｓ＜０．０１ｍｇ／ｋｇ、シアン化物＜０．０１ｍｇ／ｋｇ、ヒ素０．７６ｍｇ／ｋｇ、鉛９３３ｍｇ／ｋｇ、カドミウム０．１４ｍｇ／ｋｇ、水銀０．６６ｍｇ／ｋｇ、硫黄１．８％、ｐＨ１．２〕を含む１００％のタール酸の集積物等を効果的に分解する新規の細菌共同体ＮＢＣ２０００に関するものである。ここで、前記タール酸は、土壌、海底、海水環境のような多様な地域で検出されてきた。

本発明者は、土壌と水質等に汚染された高濃度のＰＣＢｓ、ダイオキシン、ＰＣＰ、ＰＣＥ等の有機塩素系溶媒、トルエン及びＰＡＨを効率的に分解するだけでなく、石油化学産業団地又は海域等に廃棄されている１００％のタール酸の集積物を効果的に分解する特性がある新菌株共同体であるＮＢＣ２０００（ＫＣＴＣ１０６２３ＢＰ）を土壌と水質から分離した。
前記細菌共同体であるＮＢＣ２０００は、２６種の菌株からなっており、その構成員菌株らの各組み合わせによる共同体単位で各該当有害物質を分解する能力を有している。土壌に汚染された２０９種の多塩素化ビフェニルの同種体に対し、１４０日間ＮＢＣ２０００で好気的なスラリー（ｓｌｕｒｒｙ）方式で処理した場合、ほぼ１００％分解されることを確認した。

以下、本発明による新菌株共同体の分離、同定及び活性を詳細に説明する。

１．環境ホルモンを分解することができる新規の細菌共同体の分離
（１）韓国、南ヨーロッパ、オセアニア等で採集した土壌からＰＣＢｓ、ＰＣＰ、ダイオキシン、ＰＣＥ、トルエン、タール酸等を分解する細菌の分離
採集した土壌１ｇをルリア−ベルタニ液体培地（バクト−トリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ＋脱塩水１リットル）で２〜３日間震盪培養した後、１ｍｌを取り、ルリア−ベルタニ寒天培地（バクト−トリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、寒天１．５％＋脱塩水９５０ｍｌ）で各コロニーを分離した。このとき、現われた各コロニーを選択してＰＣＢｓ、ＰＣＰ、ＰＣＥ、トルエン、タール酸がそれぞれ含まれた最小液体培地（Ｋ_２ＨＰＯ_４０．０６５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．０１７ｇ、ＭｇＳＯ_４０．１ｇ、ＮａＮＯ_３０．５ｇ＋脱塩水１リットル）に順次接種し、２５〜３０℃で３日以上震盪培養した。各有害物質の減少確認と共に震盪培養液１ｍｌを取り、ルリア−ベルタニ寒天培地に順次接種し、２５〜３０℃で３〜５日間培養した。

純粋に分類した各コロニーを前記のような最小液体培地に再接種して震盪培養した後、ルリア−ベルタニ固体培地で個別的に形成されたそれぞれ異なる模様のコロニー形態を有し、そのコロニーの継代培養の際に、同一のコロニーが現われる有用細菌５０余種を分離した。

（２）前記で分離した細菌らをＰＣＢｓ、ＰＣＰ、ＰＣＥ、トルエン、タール酸が段階的に高い濃度で含まれた最小培地にそれぞれ順次接種し、（１）項のような方法で繰り返してより高い濃度で生存する菌株及び形態の差によって２６種を分離した。

ここで得られた２６種の細菌らを共同体から構成し、ＮＢＣ２０００と命名し、前記細菌共同体を成すそれぞれの細菌をそれぞれＣｙ１００、Ｃｙ１０１、Ｃｙ１０２、Ｃｙ１０３、Ｃｙ１０４、Ｃｙ１０５、Ｃｙ１０６、Ｃｙ１０７、Ｎｔａｒ１、Ｎｔａｒ２、Ｎｔａｒ３、Ｇｃ３００、Ｇｃ５００、Ｇｃ５０１、Ｂｓ１００、Ａｅｎｇ１７、Ａｅｎｇ１８、Ｓｐ３００、Ｔｎｈ、Ｄｊｈｃ、Ｐｃｐｔｓ、ＥＢＣ１０６、ＥＢＣ１０７、Ｂｓ１０１、Ｗ２４及びＮｚ２００１と命名した。ＮＢＣ２０００のＥＢＣ１０６、ＥＢＣ１０７は国際公開番号第０１/１４５２６号で公開された細菌共同体ＥＢＣ１０００（ＫＣＴＣ０６５２ＢＰ）のＥＢＣ１０６及びＥＢＣ１０７と各々同一の細菌である。

本発明による細菌共同体ＮＢＣ２０００は、２００４年４月１６日付で韓国生命工学研究院内の遺伝支援センターに寄託番号ＫＣＴＣ１０６２３ＢＰとして国際寄託を行った。

２．細菌共同体ＮＢＣ２０００の成長のための最適条件の確立
ルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）栄養培地［バクト−トリプトン（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ）１０ｇ、バクト−酵母抽出物（ｂａｃｔｏ-ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ、ナトリウムクロライド（ＮａＣｌ）１０ｇ／脱塩水１リットル］で、ｐＨ６〜８、温度２５〜３０℃、震盪（ｓｈａｋｉｎｇ）１分当たり回転数８０〜１２０ｒｐｍにより４８〜９６時間培養すれば、最適成長を示し、継代培養の際にも同一条件でよく成長する。
３．細菌共同体ＮＢＣ２０００の生化学的な同定
土壌から純粋に分離した各細菌に関する同定は、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘｓａ６９２８０ＭａｒｃｙＩ’Ｅｔｏｉｌｅ／Ｆｒａｎｃｅ）から購入したＡＰＩＫｉｔｓであるＡＰＩ２０Ｅ、ＡＰＩ２０ＮＥ、ＡＰＩ５０ＣＨ、ＡＰＩ５０ＣＨＢ等により実施して２３種の属名を決定した（表１乃至表４参照）。

４．細菌共同体ＮＢＣ２０００を構成する各細菌らの分離
１）菌株分離及び方法
各菌株は、韓国、ニュージーランド、スウェーデン及びキプロス等の土壌から純粋に分離してＮＢＣ２０００を構成し、全て運動性を有している特徴があるので、広大で多様な土壌に適用することができる。細菌共同体ＮＢＣ２０００から個別菌株を分離する形態的な特徴の方法は、次の通りである。

（１）ルリア−ベルタニ寒天培地（バクト-トリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、寒天１．５％＋脱塩水９５０ｍｌ）における培養
Ｃｙ１００：４８時間培養後、表面が不均一な不定形の黄色のコロニーとして現われ、４ｍｍの大きさに成長する。

Ｃｙ１０１：４８時間培養後、半透明のアイボリー色の膨らんだコロニーとして現われ、２．５ｍｍの大きさに成長する。

Ｃｙ１０２：４８時間培養後、黄色の丸いコロニーとして現われ、２ｍｍの大きさに成長する。

Ｃｙ１０３：４８時間培養後、アイボリー色の丸く平たいコロニーとして現われ、４ｍｍの大きさに成長する。

Ｃｙ１０４：４８時間培養後、半透明のアイボリー色の丸いコロニーとして現われ、４ｍｍの大きさに成長する。

Ｃｙ１０５：４８時間培養後、アイボリー色の丸いコロニーとして現われ、２．５ｍｍの大きさに成長する。

Ｃｙ１０６：４８時間培養後、無光沢の白色の中間が凹んだ丸いコロニーとして現われ、１．５ｍｍの大きさに成長する。

Ｃｙ１０７：４８時間培養後、無光沢の白色の丸いコロニーとして現われ、１ｍｍの大きさに成長する。

Ｎｔａｒ１：２４時間培養後、半透明の黄色の丸く光沢のあるコロニーとして現われ、１ｍｍの大きさに成長する。

Ｎｔａｒ２：２４時間培養後、ベージュ色とアイボリー色の丸く光沢のあるコロニーとして現われ、２ｍｍの大きさに成長する。

Ｎｔａｒ３：４８時間培養後、アイボリー色の丸く光沢のあるコロニーとして現われ、１．５ｍｍの大きさに成長する。

Ｇｃ３００：２４時間培養後、アイボリー色の丸く光沢のある膨らんだコロニーとして現われ、３ｍｍの大きさに成長する。

Ｇｃ５００：２４時間培養後、アイボリー色の丸く光沢のある膨らんだコロニーとして現われ、１．５ｍｍの大きさに成長する。

Ｇｃ５０１：２４時間培養後、アイボリー色の丸く光沢のある膨らんだコロニーとして現われ、２．５ｍｍの大きさに成長する。

Ｂｓ１００：２４時間培養後、明るいアイボリー色の丸いコロニーとして現われ、２ｍｍの大きさに成長する。

Ａｅｎｇ１７：２４時間培養後、赤色又はアイボリー色の丸いか、又は不定形のコロニーとして現われ、３ｍｍの大きさに成長する。

Ａｅｎｇ１８：２４時間培養後、赤色又はアイボリー色の丸いか、又は不定形のコロニーとして現われ、３ｍｍの大きさに成長する。

Ｓｐ３００：２４時間培養後、ベージュ色と褐色の丸いか、又は不定形のコロニーとして現われ、３ｍｍの大きさに成長する。

Ｔｎｈ：４０時間培養後、半透明のアイボリー色の表面が不均一の金属色のコロニーとして現われ、４ｍｍの大きさに成長する。時間が経過するにつれて培地の色相が藍青色に変化される。

Ｄｊｈｃ：２４時間培養後、アイボリー色の丸く、表面が滑らかな形態で粘度が強く光沢のあるコロニーとして現われ、３ｍｍの大きさに成長する。

Ｐｃｐｔｓ：２４時間培養後、ベージュ色と褐色の丸いか、又は不定形のコロニーとして現われ、３ｍｍの大きさに成長する。

ＥＢＣ１０６：２４時間培養後、アイボリー色の表面が不均一の状態に広がりながら成長する平たい無光沢のコロニーとして現われ、７ｍｍの大きさに成長する。

ＥＢＣ１０７：４０時間培養後、半透明のアイボリー色の表面が不均一で不定形のコロニーとして現われ、４ｍｍの大きさに成長する。

Ｂｓ１０１：２４時間培養後、黄色いアイボリー色の丸く表面に帯が掛かったコロニーとして現われ、５ｍｍの大きさに成長する。これはグラム陽性細菌であり、運動性がある。

Ｗ２４：４８時間培養後、薄い黄色の丸く光沢のある膨らんだ形態のコロニーとして現われ、１．５ｍｍの大きさに成長する。これはグラム細菌であり、運動性がある。

Ｎｚ２００１：４８時間培養後、白色の無光沢のコロニーとして現われ、２．５ｍｍの大きさに成長する。長時間培養時は、コロニーのエッジに菌糸が現われ、運動性がある。

（２）マッコンキー固体培地〔ＭａｃＣｏｎｋｅｙａｇａｒ：ペプトン１７ｇ、プロテオースペプトン（Ｐｒｏｔｅｏｓｅｐｅｐｔｏｎ）３ｇ、ラクトース１０ｇ、胆汁酸塩（ｂｉｌｅｓａｌｔｓＮｏ．３）１．５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１３．５ｇ、ニュートラルレッド０．０３ｇ、クリスタルバイオレット０．００１ｇ、脱塩水１リットル、ｐＨ７．３〜７．５〕で４８時間培養後のコロニーの色相
Ｃｙ１００は、薄い褐色の小さいコロニーが現われ、
Ｎｔａｒ１は、透明な薄い褐色であり、表面が不均一で、
Ｎｔａｒ２は、ベージュ色の小さいコロニーであり、
Ｎｔａｒ３は、薄い赤色の透明な褐色のコロニーであり、
Ｇｃ３００は、濃いピンク色のコロニーで、エッジはベージュ色であり、
Ｇｃ５００は、大部分がベージュ色とピンク色のコロニーであり、
Ｇｃ５０１は、濃いピンク色のコロニーで、エッジはベージュ色であり、
Ａｅｎｇ１７とＡｅｎｇ１８は、濃い赤色のコロニーであり、
Ｓｐ３００は、ベージュ色のコロニーであり、
Ｔｎｈは、暗いカーキ色のコロニーであり、
Ｄｊｈｃは、コロニーの中間は薄いピンク色であり、エッジはベージュ色であり、
Ｐｃｐｔｓは、薄いカーキ色として現われ、
ＥＢＣ１０７は、極めて薄いピンク色のコロニーであり、
Ｎｚ２００１は、ピンク色とベージュ色のコロニーであり、
Ｃｙ１０１、Ｃｙ１０２、Ｃｙ１０３、Ｃｙ１０４、Ｃｙ１０５、Ｃｙ１０６、Ｃｙ１０７、Ｂｓ１００、ＥＢＣ１０６、Ｂｓ１０１、Ｗ２４菌株は、４８時間培養後でもコロニーが現われない。

（３）デスオキシコレート固体培地〔Ｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅａｇａｒ：プロテオースペプトン１０ｇ、ラクトース１０ｇ、デスオキシコレートナトリウム０．５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、クエン酸ナトリウム２ｇ、寒天１５ｇ、ニュートラルレッド０．０３ｇ、脱塩水１リットル、ｐＨ７．３〜７．５〕で４８時間培養後のコロニーの色相
Ｃｙ１０１、Ｃｙ１０２、Ｃｙ１０３、Ｃｙ１０４、Ｃｙ１０５、Ｃｙ１０６、Ｃｙ１０７、Ｂｓ１００、ＥＢＣ１０６、Ｂｓ１０１、Ｗ２４菌株は、４８時間培養後でもコロニーが現われない。

Ｃｙ１００は、薄いピンク色を帯びた黄色のコロニーで、花のように皺ばんだ模様、
Ｎｔａｒ１とＮｔａｒ２、Ｎｔａｒ３は、透明なオレンジ色のコロニー、
Ｇｃ３００とＧｃ５０１は、濃いピンク色のコロニーで、エッジはベージュ色、
Ｇｃ５００は、薄い赤色を帯びたベージュ色のコロニー、
Ａｅｎｇ１７とＡｅｎｇ１８は、濃い赤色のコロニー、
Ｓｐ３００は、透明な薄い褐色のコロニー、
Ｔｎｈは、金属色を帯びた薄い褐色のコロニー、
Ｄｊｈｃは、薄いピンク色とベージュ色が混合された模様、
Ｐｃｐｔｓは、透明な褐色コロニー、
ＥＢＣ１０７は、黄色のコロニー、
Ｎｚ２００１は、赤色を帯びたベージュ色のコロニー、
タールを分解するＢｓ１０１、硫黄菌株Ｎｚ２００１、油類分解菌株Ｗ２４は、現在の方法では同定が困難であったため、未同定菌株と決定した。

５．ＮＢＣ２０００個別菌株らの各環境ホルモンの分解範囲
１）各分離菌株の環境ホルモンの分解範囲
ＰＣＢｓ、ダイオキシン、ＰＣＥ、トルエン、タール酸は、実験室の最適条件で、細菌共同体の構成細菌により測定した値であり、硫黄（ｓｕｌｐｈｕｒ）とＰＣＰは、個別菌株水準で測定した平均値である。

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｃｙ１００：ＰＣＢｓ７００ｐｐｍ；
セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．）Ａｅｎｇ１８：ＰＣＰ５００ｐｐｍ、タール酸、ダイオキシン１００ｎｇ／ｋｇ；
セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．）Ｎｔａｒ２：タール酸；
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｄｊｈｃ：ＰＣＰ１０００ｐｐｍ、ダイオキシン３００ｎｇ／ｋｇ；
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｔａｒ３：タール酸；
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＥＢＣ１０７：ＰＣＢｓ７００ｐｐｍ、ＰＣＰ１００ｐｐｍ、ダイオキシン１００ｎｇ／ｋｇ、ＰＣＥ５０，０００ｍｇ／ｋｇ；
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｔｎｈ：ＰＣＢｓ７００ｐｐｍ、ＰＣＰ５００ｐｐｍ、ダイオキシン３００ｎｇ／ｋｇ、ＰＣＥ５０，０００ｍｇ／ｋｇ、タール酸；
エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ａｅｎｇ１７：タール酸、ＰＣＰ１００ｐｐｍ、ダイオキシン５０ｎｇ／ｋｇ；
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｐｃｐｔｓ：ＰＣＰ１，０００ｐｐｍ、ダイオキシン５００ｎｇ／ｋｇ；
ステノトロフォモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｔａｒ１：タール酸；
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓｐ３００：タール酸、ＰＣＰ７００ｐｐｍ、ダイオキシン１００ｎｇ／ｋｇ；
クリセオモナス属（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｇｃ５０１：ＰＣＰ５００ｐｐｍ、ダイオキシン１００ｎｇ／ｋｇ；
クリセオモナス属（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｇｃ５００：ＰＣＰ５００ｐｐｍ、ダイオキシン１００ｎｇ／ｋｇ；
クリセオモナス属（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｇｃ３００：ＰＣＰ３００ｐｐｍ、ダイオキシン１００ｎｇ／ｋｇ；
ブレブンディモナス属（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｓｐ．）Ｃｙ１０１：ＰＣＢｓ１５０ｐｐｍ；
ブレブンディモナス属（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｓｐ．）Ｃｙ１０２：ＰＣＢｓ１５０ｐｐｍ；
ブレブンディモナス属（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｓｐ．）Ｃｙ１０３：ＰＣＢｓ７００ｐｐｍ；
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｂｓ１００：タール酸；
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｃｙ１０４：ＰＣＢｓ８００ｐｐｍ；
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｃｙ１０５：ＰＣＢｓ７００ｐｐｍ；
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｃｙ１０６：ＰＣＢｓ１，０００ｐｐｍ；
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｃｙ１０７：ＰＣＢｓ１５０ｐｐｍ；
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＥＢＣ１０６：ＰＣＢｓ７００ｐｐｍ、ＰＣＰ１，０００ｐｐｍ、ダイオキシン３００ｎｇ／ｋｇ、タール酸、ＰＣＥ５０，０００ｍｇ／ｋｇ、トルエン５０，０００ｍｇ／ｋｇ；
グラム陽性細菌Ｂｓ１０１：タール酸；
グラム陰性細菌Ｗ２４：ＴＰＨ１００ｐｐｍ、トルエン１００ｐｐｍ；
硫黄菌株Ｎｚ２００１：硫黄（Ｓｕｌｐｈｕｒ）、タール酸、ダイオキシン５０ｎｇ／ｋｇ
６．細菌共同体ＮＢＣ２０００及び各菌株の組み合わせによる環境ホルモンの分解特性
個別菌株の分解能は制限的であるが、ＮＢＣ２０００全体又はその構成菌株らの各組み合わせ別の細菌共同体を試料又は汚染環境に処理すれば、更に広範で効率的な分解効果が示される。これは、ＮＢＣ２０００を構成する個別菌株の機能よりは細菌共同体としての相互協力による創発性の相乗効果は極めて大きいと考えられる。どの菌株も単一菌株としては、複雑多段なＰＣＢｓ、ダイオキシン、タール酸等の環境ホルモンを分解することができないが、ＮＢＣ２０００の各菌株らとＥＢＣ１０００の各菌株らの組み合わせによっては、菌株間の相互補完及び群集内の遺伝子転移の交換方式により効率的な分解効果を示すようになる。これを立証するために、本発明者は、次のような実験を行った。
＜実験例１：ＰＣＢｓの汚染土壌及び絶縁体オイルの生分解の処理実験＞
−実験条件
１）好気的な条件でのＡｒｏｃｌｏｒ１２４２、１２５４、１２６０の生分解実験
ＰＣＢｓの標準物質であるＡｒｏｃｌｏｒ１２５４と１２６０は、Ｈｅｘａｎｅに１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解された商品であり、Ａｃｃｕｓｔａｎｄａｒｄ，Ｉｎｃ．（１２５Ｍａｒｋｅｔｓｔ．Ｎｅｗｈａｖｅｎ、ＣＴ０６５１３）から購入して用いた。Ａｒｏｃｌｏｒ１２５４は１１２個、１２６０は９７個の同種体から構成されており、ＰＣＢｓの検証のための標準物質として利用している。

ＮＢＣ２０００の各構成菌株及びＥＢＣ１０００の各構成菌株を組み合わせ、Ａｒｏｃｌｏｒ１２５４と１２６０の多塩素化ビフェニル（ＰＣＢｓ）の分解を検証した。具体的に、Ｔｎｈ単独（比較例１及び２）、Ｔｎｈ及びＥＢＣ菌株から構成された細菌共同体（実施例１及び４）、Ｃｙ１００、Ｃｙ１０３、Ｃｙ１０４、Ｃｙ１０５、Ｃｙ１０６及びＣｙ１０７から構成された細菌共同体（実施例２及び５）、Ｔｎｈ、ＥＢＣ１０００、Ｃｙ１００、Ｃｙ１０３、Ｃｙ１０４、Ｃｙ１０５、Ｃｙ１０６及びＣｙ１０７から構成された細菌共同体（実施例３及び６）のＰＣＢｓの処理能力を検証した。このために、Ａｒｏｃｌｏｒ１２５４の原液を、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．０６５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．０１７ｇ、ＭｇＳＯ_４０．１ｇ、ＮａＮＯ_３０．５ｇを脱塩水１リットルに溶解して作った最小培地（ｐＨ７．２）１０ｍｌに１０％で混合して添加し、前記各細菌共同体を１０^５〜１０^６／ｍｌで接種した後、好気的な状態で３０℃で１５０ｒｐｍにより震盪培養した（表５）。Ａｒｏｃｌｏｒ１２６０も１２５４と同様な条件で実施した（表６）。その結果は、下記の表５及び表６に示した。

前記の実験から分かるように、Ｔｎｈ菌株単独では、Ａｒｏｃｌｏｒ１２５４ＰＣＢｓを全く分解することができなかったが，ＥＢＣ菌株らと組み合わせた場合は、Ｔｎｈ菌株が１００倍以上増加されて現われ、ＰＣＢｓを殆ど分解した。また、Ｃｙ菌株らのみが組み合わされた場合は、Ｃｙ１０６の菌株が１，０００倍程度増加されてＰＣＢｓを全て分解させた。また、ＴｎｈとＥＢＣ菌株、Ｃｙ菌株らの組み合わせ時には、ＴｎｈとＣｙ１０６がそれぞれ１００倍以上増加されてＰＣＢｓを殆ど分解した。前記表５の結果、微生物数の欄に微生物数の横の括弧内に表示された菌株は優占種を示す。微生物数が増加されたのは、ＰＣＢｓを栄養供給源として利用して微生物が増殖されたことを示すものである。逆に微生物数が減少されたのは、微生物の群集内でＰＣＢｓ多機能分解遺伝子を喪失又は獲得できなかったことによって、毒性汚染物質であるＰＣＢｓにより微生物が成長抑制又は死滅されたことを示すものである。

これを通じて２０９種の同種体の中で、１１２種の同種体から構成されたＡｒｏｃｌｏｒ１２５４を、どの菌株も単独で処理することは困難であり、分解能がある多種の菌株間の相互作用により可能なことを証明するものであり、これを現場試料に適用することができることが分かる。

前記実験においても、Ｔｎｈ菌株単独（比較例２）では、Ａｒｏｃｌｏｒ１２６０ＰＣＢｓを全く分解することができず、Ｃｙ１０６単一菌株（比較例３）は、Ａｒｏｃｌｏｒ１２６０ＰＣＢｓの一部を分解した。更にはＴｎｈ菌株をＥＢＣ菌株らと共に組み合わせた場合（比較例４）、接種された菌株は、約１，０００倍程度減少されて現われ、ＰＣＢｓをほぼ分解するできず、毒性ＰＣＢｓにより微生物が成長抑制又は死滅したことが分かった。これは、Ｔｎｈ及びＥＢＣ菌株以外の他の菌株が相互作用によりＰＣＢｓの分解に必須的であることを示したものである。前記Ｃｙ１０６菌株がＣｙ１０３菌株と組み合わされたとき（実施例５）には、菌株らが約１００倍増加されて良好なＰＣＢｓの分解効能を示した。Ｃｙ１０６菌株が他のＣｙ菌株らと組み合わされたとき（実施例６）、前記Ｃｙ１０４菌株とＣｙ１０６菌株は、それぞれ約１，０００倍程度増加され、全てのＰＣＢｓが分解された。Ｔｎｈ、ＥＢＣ、Ｃｙ菌株が組み合わされたとき（実施例７−Ａ及び７−Ｂ）、前記Ｃｙ１０６菌株は１，０００〜１０，０００倍まで増加され、全てのＰＣＢｓと鉱油が分解されるものと示された。このとき、共通する優占種はＣｙ１０６菌株だった。従って、Ｃｙ１０６菌株は、ＰＣＢｓを分解するのに必須的であり、ここに他のＮＢＣ２０００の構成菌株が必ず追加されてこそＰＣＢｓを大部分円滑に分解することができることが分かる。

前記の結果は、２０９種の同種体の中でそれぞれ９７種、１１２種、１０４種の同種体から構成されたＡｒｏｃｌｏｒ１２６０、１２５４、１２４２を個別菌株単独で完全に処理することは困難であり、分解能がある多種の菌株ら間の相互作用により可能なことを証明するものである。これを現場試料に適用することができることが分かる。

２）キプロスの土壌３ｋｇ＋菌株＋好気的なスラリー状態の条件
Ａｒｏｃｌｏｒ１２６０系列の９７種のＰＣＢｓが汚染されたキプロスの現場土壌に対するＰＣＢｓの生分解実験を検証した。約７００〜１，０００ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）の濃度でＰＣＢｓが汚染されたキプロスの現場土壌３ｋｇを３０ｇ〜６０ｇ単位とし、幾度繰り返して好気的なスラリーの条件で長期間実験した。キプロスの土壌３０ｇ〜６０ｇに最小液体培地（Ｋ_２ＨＰＯ_４０．０６５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．０１７ｇ、ＭｇＳＯ_４０．１ｇ、ＮａＮＯ_３０．５ｇを脱塩水１リットルに溶解させて作った最小培地、ｐＨ７．２）４５〜９０ｍｌ程度を添加して湿度が６０〜８０％維持されるようにした。その中で代表的な実験例は、下記表７のように比較例５及び実施例８に区分して実施し、実施例８ではＮＢＣ２０００の構成菌株を添加した後、好気的なスラリー状態で、２５℃で１００ｒｐｍにより１３８日間震盪し、３８日頃にはＮＯ_３Ｎ：ＰＯ_４Ｐ（＝３：１）を添加して菌株の活性を高めた。その結果、単一菌株のみを処理した場合には、ＰＣＢｓがほぼ分解されない反面、２種以上の菌株の組み合わせが処理された場合には、ＰＣＢｓの分解効率が良好であり、複数の菌株の組み合わせの場合には、極めて優れた分解効率を示した。代表的な結果を下記表７に示した。

前記のように実験した結果、ＮＢＣ２０００菌株が接種されていない比較例５の土壌では、スラリーの状態で震盪をしたにもかかわらず、ＰＣＢｓがほぼ分解できず、土着菌株らも停滞した状態であった。これに対し、本発明によるＮＢＣ２０００の構成菌株らが接種された実施例８の土壌では、１３８日頃にＰＣＢｓが全て生分解された。前記Ａｒｏｃｌｏｒ１２６０の検証で確認されたＮＢＣ２０００菌株を接種したとき、ＥＢＣ１０６菌株は６５日頃に１，０００倍程度増加され、Ｃｙ１０３菌株は１０倍程度増加されたものの、その他は停滞又は現われなかった。８５日頃にも６５日よりは低い数値であるが、同様の傾向を示し、１３８日にはＥＢＣ１０６菌株のみが１，０００倍程度と高く現われ、菌株相互間の作用及びキプロスの土壌の生態系内でのＮＢＣ２０００の特性を見ることができる。ＥＢＣ１０６菌株は、Ｔｎｈ及び他のＣｙ菌株らの接合と相補性等の相互補完によりＰＣＢｓを分解するのに優秀性を示している。しかし、ＥＢＣ１０６単一菌株では、土壌に汚染された多塩素化ビフェニル（ＰＣＢ）をほぼ分解することができなかった。このような結果は、図１乃至図５で分析したＧＣＭＳ資料でも明確に再確認された。

図１は、Ａｒｏｃｌｏｒ１２６０の９７種の標準物質に対するＧＣＭＳ分析であり、多塩素化ビフェニル（ＰＣＢｓ）が確認され、図２は、実施例８で微生物を処理する前にキプロスの土壌分析で示された多塩素化ビフェニルの分析であり、前記図１と極めて類似した模様を示した。

図３は、実施例８で６５日間処理した場合の５０％の多塩素化ビフェニルの減少を示し、減少量の測定は面積（Ａｒｅａ）計算法［ＳｔａｎｄａｒｄＭｅｔｈｏｄｓ及びＣｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ４３（２００１）４５５−４５９］に基づいて実施した。図４は、実施例８で８５日間処理した場合の面積計算法に基づいて約８０％の減少を示した。図５は、１３８日間処理した場合のＧＣＭＳクロマトグラムであり、多塩素化ビフェニルが大部分消滅され、多塩素化ビフェニルの同種体は全く検出されなかった。図６は、１３８日間の比較例５のＧＣＭＳクロマトグラムであり、図２の実施例８の処理前の初期模様とほぼ類似して示されている。このように、ＧＣＭＳ分析でもキプロスの土壌に汚染された高濃度の多塩素化ビフェニルの同種体らは、ＮＢＣ２０００等の微生物により完全に生分解されていることを正確に証明されたのである。
＜実験例２：五塩素化フェノール（ＰＣＰ）及びダイオキシンの汚染土壌並びに木材の生分解の処理実験＞
ＧＣ分析（ＧＣ２０１０、ＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）
１）スウェーデンの土壌１００ｇ＋菌株＋Ｈ_２Ｏ_２＋好気的なスラリー条件
スウェーデンの現場土壌１００ｇずつをそれぞれ比較例６（対照区）と実施例９（実験区）とし、２５〜３０℃で９０ｒｐｍにより震盪しながら好気的な状態で検証を実施した。比較例６は、土壌（ｐＨ４．２）と脱塩水を用いて震盪し、実験区にはｐＨを７．０に合わせた後、最小液体培地（Ｋ_２ＨＰＯ_４０．６５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．１７ｇ、ＮａＮＯ_３０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／脱塩水１リットル）２００ｍｌを添加して好気的に震盪した。初期に実験区に接種した菌株は、ＥＢＣ１０００を１０^７／ｍｌスラリとして用い、６０日経過８０日頃には、窒素（ＮＯ_３−Ｎ）とリン（ＰＯ_４−Ｐ）を３：１で添加し、９０日頃には、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）３ｍｌを添加して生分解を促進させた。１７０日頃には、ＮＢＣ２０００菌株の中でＳｐ３００、Ｇｃ３００、Ｇｃ５００、Ｇｃ５０１、Ｔｎｈ、Ａｅｎｇ１７、Ａｅｎｇ１８、Ｐｃｐｔｓを１０^５／ｍｌスラリとして追加接種し、ＥＢＣ１０００菌株も１０^６／ｍｌスラリーとして追加接種して分解能を促進させた。その結果、ＥＢＣ１０００菌株とＮＢＣ２０００菌株の相互作用により生分解が促進された。どの菌株も単独では土壌中の五塩素化フェノールとダイオキシンの分解が行われず、少なくとも２種以上の菌株が組み合わされた共同体らが、ＰＣＰとダイオキシンの分解が良好に行われた。具体的な結果は、下記表８乃至表９、図７乃至図８に示されている。表８はＰＣＰに関する結果であり、表９は１７種のＰＣＤＤ／ＰＣＤＦダイオキシンに関する結果である。また、図７は、実施例９の初期ＰＣＰ濃度のＧＣクロマトグラムであり、図８は、実施例９の２００日間の処理後のＰＣＰ濃度のＧＣクロマトグラムである。

前記表８に示されたように、比較例６の場合、ＰＣＰはほぼ変動がなかったが、実施例９の場合には、総９９．９９９９％のＰＣＰが減少した。図７及び図８のＧＣ分析でも保有期間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ）１２．５分の位置のＰＣＰは、本発明による微生物の投入の有無によってクロマトグラム上で顕著な変化を示した。これは、スウェーデンの土壌の五塩素化フェノールに対する微生物分解の正確な証明である。表８によると、ＥＢＣ１０００の構成菌株らとＮＢＣ２０００の構成菌株ら及びこれらの活動を補助した窒素、リンそして過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）触媒により高濃度のＰＣＰが大部分除去された（表８）
一方、下記表９のように、２１０余種のダイオキシンの同種体の中で毒性が最も強いＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ系列の１７種のダイオキシンも平均的に高い比率で除去された、同分析は、ドイツのＡｎａｌｙｔｉｃａＡＢ（Ｎｙｔｏｒｐｓｎａｇｅｎ１６，１８３２５Ｔａｂｙ．）で実施した。その結果は、下記表９に示されている。

Ｉ−ＴＥＱ＊は、１７種の毒性ダイオキシンの中で２、３、７、８位置に塩素原子が置換された２，３，７，８−ＴｅｔｒａＣＤＤ（２，３，７，８−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−ｄｉｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎ）が最も毒性が大きいので、これを基準にしたダイオキシン類の等価換算係数を示す。各同種体の濃度に換算係数を積算して２，３，７，８−ＴｅｔｒａＣＤＤ濃度に換算し、このときの換算係数をＴＣＤＤ毒性等価換算係数という。ＮＡＴＯ国家らの共同研究によるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＴＥＦ（Ｉ−ＴＥＱ）が最も多く用いられており、このように換算した濃度をＴＣＤＤ毒性等価換算濃度（ＴＣＤＤｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ、ＴＥＱ）という。ＴＥＱ＝Σ（ＴＥＦＸ２，３，７，８−置換異性体の濃度）。

前記表９−Ａに示されたように、前記１７種のダイオキシン全てにおいて極めて優れた分解効果を確認することができた。
しかし、前記実験でダイオキシンを分解した菌株らは、濃縮された残留ダイオキシンの存在のため、それ以上成長することができなかった。これは、少なくとも残留ダイオキシン同種体の一部が、初期ダイオキシン同種体の混合物（ｃｒｕｄｅｄｉｏｘｉｎｃｏｎｇｅｎｅｒｓｍｉｘｔｕｒｅ）よりかえってもっと毒性があることを意味する。そこで、発明者は、このような毒性がある残留ダイオキシンを分解することができる細菌共同体を発明した。これは、シュードモナス属Ｃｙ１００菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリスＣｙ１０１菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリスＣｙ１０２菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリスＣｙ１０３菌株、バチルス・ステアロサーモフィラスＣｙ１０４菌株、バチルス属Ｃｙ１０５菌株、バチルス属Ｃｙ１０６菌株及びバチルス属Ｃｙ１０７菌株を含む。

このような残留ダイオキシンの分解に及ぼす前記細菌共同体の効果を調べるために、次のような実験を行った。

前記表９−Ａの右列の残留ダイオキシン同種体にＰＣＢｓの生分解と関連するＣｙ１００〜Ｃｙ１０７菌株を含む細菌共同体１０^５ｃｆｕ／ｍｌを処理した。約２ヶ月間前記Ｃｙ菌株らは１０^７ｃｆｕ／ｍｌまで増加した。これは、前記Ｃｙ菌株を含む細菌共同体が濃縮された残留ダイオキシンの毒性状態に極めてよく適応し、前記残留ダイオキシンを分解して成長することを示す。

下記表９−Ｂに示されたように、Ｃｙ菌株の１００倍増加からほぼ全ての残留ダイオキシン同種体らが生物学的に分解されたことが分かる。

２）ニュージーランドの土壌

菌株＋最小培地＋脱塩水＋Ｈ_２Ｏ_２
ニュージーランドの現場土壌３０ｇずつをそれぞれ比較例７（対照区）と実施例１０（実験区）とし、３０℃で１５０ｒｐｍにより震盪しながら好気的な状態で検証を実施した。比較例７は、土壌（ｐＨ８．３）と脱塩水を用いて震盪し、実施例１０にはｐＨを８．５に合わせた後、最小液体培地（Ｋ_２ＨＰＯ_４０．６５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．１７ｇ、ＮａＮＯ_３０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／脱塩水１リットル）５０ｍｌを添加して好気的に震盪した。初期に実験区に接種した菌株は、ＥＢＣ菌株を１０^７／ｍｌスラリーとして用い、１７日、２７日と５０日頃には五塩素化フェノール（ＰＣＰ）、窒素（ＮＯ_３−Ｎ）、リン（ＰＯ_４−Ｐ）を１００：３：１で添加し、４５日頃には（Ｈ_２Ｏ_２）３ｍｌを添加して生分解を促進させた。２５日と４６日頃にはＮＢＣ２０００菌株の中でＴｎｈ、Ｐｃｐｔｓ、Ｓｐ３００、Ａｅｎｇ１７、Ａｅｎｇ１８、Ｎｚ２００１を１０^６／ｍｌスラリーとして追加接種し、ＥＢＣ菌株も１０^７／ｍｌスラリーとして追加接種して分解能を促進させた。その結果、単独菌株のみではほぼ分解が行われなかったものの、２種以上の菌株を組み合わせた場合には、良好な分解効率を示し、更に多くの菌株を組み合わせる場合、極めて優れた分解効率を示した。その中で代表的な例は、下記表１０及び図９乃至図１０に示した。

前記表１０に示されたように、前記実験で比較例７のＰＣＰはほぼ変動がなかったが、実験例１０では、９９．９９％の五塩素化フェノール（ＰＣＰ）が減少した。ＥＢＣ菌株とＮＢＣ２０００の構成菌株及びこれらの活動を補助した窒素、リンそして過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）の触媒により高濃度の五塩素化フェノール（ＰＣＰ）が大部分除去された。

全般的な菌株の減少と五塩素化フェノールの分解過程で、特にＥＢＣ１０６菌株は、２７日頃に初期接種菌株の数が適応過程で１００倍減少され、７０日頃には１，０００倍程度増加される現象を示し、優占種（１０^５ｃｆｕ／ｇ）として引き続き現われて群集の相互作用によりＥＢＣ１０６の役割が卓越した。

また、図９及び図１０におけるＧＣ分析でも１２．５分の位置の五塩素化フェノールが顕著な変化を示しており、初期（図９）のクロマトグラムが７０日頃（図１０）には全く示されておらず、ニュージーランドの土壌でもＥＢＣ１０００の構成菌株らとＮＢＣ２０００の構成菌株らの組み合わせによる微生物群集の相互作用により五塩素化フェノールが大部分生分解されていることを再確認した。

３）韓国国防部及び米国８軍の弾薬箱５トンに対するプラント処理（実施例１１）
−弾薬木材箱５トン＋菌株＋地下水
−プラント設計図：０．５〜１トンの弾薬箱の円形状態の板材が定置される反応槽を作製した後、反応水（地下水＋微生物菌株）の回転循環によって木材の五塩素化フェノール（ＰＣＰ）が分解処理されるように設計運転し、反応処理水は地下水を用いて３．８〜４トン程度になるように調節した。

−処理期間：３０〜５０日
−処理効率：各国の軍部隊に大量に積置されている弾薬箱用木材は腐食を防止するために、５％五塩素化フェノール（ＰＣＰ）溶液に沈積して用いてきており、長時間の露出により木材表面の濃度が不均一に分布している。本発明による菌株共同体によるＰＣＰの処理効果を調べるために、土着微生物による分解の場合（比較例８）とＥＢＣ１０００、Ｔｎｈ、Ｐｃｐｔｓ、Ｄｊｈｃから構成された細菌共同体を処理した場合（実施例１１）のＰＣＰの分解効率を測定した。その結果、実施例１１の場合、前記反応水の回転方式による処理で五塩素化フェノールは、平均的に９９．９９％以上生分解され、反応処理水の五塩素化フェノールの濃度はほぼ検出されなかった。これにより、高濃度の五塩素化フェノールにより汚染された弾薬箱用木材は、円形状態の模様に木材資源を再生することができる。

−結果：五塩素化フェノールの汚染木材５トンの処理による結果の中で代表的な例は、下記表１１と表１２、図１１乃至図１３に示されている。表１２は、反応処理水の理化学的条件を示す。

前記表に示されたように、比較例８の実験で土着微生物による分解でＰＣＰの一部の減少効果が示されたが、分解効率は微々たるものであった。これに対してＥＢＣの構成菌株らとＮＢＣ２０００の構成菌株らであるＴｎｈ、Ｐｃｐｔｓ、Ｄｊｈｃの投入による土着微生物との相互作用で更に効果的な分解効率を示した。

一方、図１１は、実施例１１の初期ＰＣＰ濃度のＧＣクロマトグラムであり、図１２は、実施例１１の菌株を５０日間処理した後の木材のＰＣＰ濃度を測定したＧＣクロマトグラムであり、図１３は、実施例１１の菌株を５０日間処理した後の反応処理水のＰＣＰ濃度を測定したＧＣクロマトグラムである。

前記図面に示されたように、弾薬箱木材の初期濃度は極めて高く示されているが（図１１の１１．４４分の位置）、５０日間の微生物反応後には、木材（図１２の１１．３９分の位置）で微量の五塩素化フェノールのみが検出され（１０〜２０ｐｐｍ）、板材を反応させた反応処理水には、図１３のように五塩素化フェノールが全く現われなかった。
＜実験例３：タール酸の生分解の処理実験＞
スウェーデンのタール酸３ｋｇ＋ルリア−ベルタニ液体培地＋菌株＋最小液体培地
〔ＴＰＨ（ｔｏｔａｌｐｅｔｒｏｌｅｕｍｈｙｄｒｏｃｏｒｂｏｎｓ）４２，６００ｍｇ／ｋｇ、ＰＡＨ（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃａｒｏｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）１９０ｍｇ／ｋｇ、ＢＴＥＸ（ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン）３．７６ｍｇ／ｋｇ、ベンゼン０．３３ｍｇ／ｋｇ、エチルベンゼン＜０．０５ｍｇ／ｋｇ、トルエン＜０．０５ｍｇ／ｋｇ、キシレン＜０．５９ｍｇ／ｋｇ、ＥＯＸ（ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅｏｒｇａｎｉｃｈａｌｏｇｅｎｓ）７６．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯＸ（ｐｕｒｇｅａｂｌｅｏｒｇａｎｉｃｈａｌｏｇｅｎｓ）６１．８ｍｇ／ｋｇ、ハロゲン化炭化水素（Ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）＜０．０１ｍｇ／ｋｇ、クロロ−ベンゼン＜０．１ｍｇ／ｋｇ、クロロ−フェノール＜０．１ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＢｓ＜０．０１ｍｇ／ｋｇ、シアン化物＜０．０１ｍｇ／ｋｇ、ヒ素０．７６ｍｇ／ｋｇ、鉛９３３ｍｇ／ｋｇ、カドミウム０．１４ｍｇ／ｋｇ、水銀０．６６ｍｇ／ｋｇ、硫黄１．８％、ｐＨ１．２〕を含む１００％のタール酸１ｇを滅菌したルリア−ベルタニ液体培地（バクトトリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／脱塩水１リットル）５０ｍｌに混合した後、Ｎａ_４ＯＨを用いてｐＨを８に調整した。その後、ＮＢＣ２０００の菌株の中でＢＳ１００、ＳＰ３００、Ｔｎｈ、ＥＢＣ１０６、Ａｅｎｇ１７、Ａｅｎｇ１８、Ｂｓ１０１、Ｎｚ２００１菌株を１０^５／ｍｌで接種して反応させた。５０日頃、７０日頃には２０ｍｌずつの最小液体培地を用いて窒素とリンを添加し、９０日、１００日、１２０日、１３０日頃には脱塩水２０ｍｌずつを補充した。その結果、個別菌株を接種した場合には、分解がほぼ行われない反面、２種以上の菌株を組み合わせて接種した場合には良好な分解効率を示した。前記菌株の中でＮｚ２００１のみを除く残りの菌株を全て組み合わせて処理した結果と、前記全体菌株を全て組み合わせて処理した結果は、下記表に示されている。

前記表に示されたように、前記実験では、Ａｅｎｇ１７、Ａｅｎｇ１８菌株が１，０００倍程度増加し、Ｔｎｈも１０倍程度増加した。ルリア−ベルタニ（ＬＢ）液体培地に完全に溶解されたタール酸は、ＮＢＣ２０００菌株の代謝作用によって代謝産物を二酸化炭素に気化させながら、完全に分解処理することが分かる。タール酸は、２０種以上の多様な汚染物質からなる集積固まりであるため、各汚染物質の処理効率を個別的に測定することは極めて煩雑であるので、本実験例では総炭素量の計算を通じて分解効率を測定した。これは、投入される全ての炭素量（タール酸＋培地＋菌株）と、その結果、最終的に残った全ての炭素量を比較することにより、タール酸に含まれていた炭素量がどのぐらい微生物菌株の炭素量に伝達されたのかを計算するものである。本実験で投入されたタール酸内の炭素量は４５〜５０ｍｇであり、前記菌株を１４０日間処理した後に測定した総炭素量は４，５００ｍｇ／ｌであった。熱力学の検証計算は、次の通りである。

熱力学の検証計算：
総投入炭素量（Ａ）約６５０ｍｇ→総算出炭素量（Ｂ）約６７５ｍｇ
Ａ：投入されるタール酸１ｇに含まれた有害物質の総炭素量４５〜５０ｍｇ＋ルリア−ベルタニ液体培地の炭素量約６５０ｍｇ＝総約７００ｍｇ
Ｂ：測定された総炭素量（ＴＣ）は４，５００ｍｇ／ｌであり、脱塩水８０ｍｌ＋最小液体培地４０ｍｌ＋ルリア−ベルタニ液体培地５０ｍｌ＝１７０ｍｌ−１０ｍｌ〜２０ｍｌ（気化される量）＝１６０ｍｌ、前記ＴＣに基づいて１５０ｍｌ内の炭素量を計算すれば７２０ｍｇとなる（１６０：ｘ＝１０００：４５００）。

前記計算を通じて、投入炭素量と算出炭素量が対応することが分かる（若干の誤差は、実験過程上の誤差に該当する）。即ち、前記表１３で時間が経過するにつれて増加された微生物菌株の数は、微生物がタール酸を炭素源を利用して増殖されたことを立証するものである。タール酸（Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍｔａｒａｃｉｄｓ）は水に自然的には溶解されない固体であるため、タール酸（Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍｔａｒａｃｉｄｓ）の分解菌株の代謝作用が無くては完全溶解されず、溶解及び分解速度を促進させるために、栄養補助の触媒としてＬＢを用いる必要がある。現場環境の処理工程でも基本的に酸素、栄養添加剤、微生物菌株を投入してバイオオギュメンテイション（ｂｉｏａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を達成している。

大多数の微生物菌株らは、高濃度の複合毒性物質が濃縮されたタール酸又は高濃度のタール酸が含まれた栄養培地等で生長することができないが、本発明によるＮＢＣ２０００菌株は、タール酸及び触媒栄養補助源がある所でタール酸を炭素源として利用して活性化されていることを確認した。

また、Ｎｚ２００１菌株を除く残りの菌株らのみで処理した場合（比較例９）には、微生物菌株の数がほぼ増加しない反面、Ｎｚ２００１菌株を含む全体菌株らで処理した場合（実施例１２）には、微生物菌株が顕著に増加した。これは、Ｎｚ２００１菌株がタール酸に含まれた１．８％（１８ｍｌ）の高濃度の硫黄（ｓｕｌｐｈｕｒ）をアミノ酸代謝及びエネルギー源として利用する硫黄菌株であることを立証するものである。

前記結果を裏付けるために、本発明者は、下記のような実験を追加して行った。ＬＢ以外の最小液体培地、水道水及び滅菌蒸留水をタール酸（Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍｔａｒａｃｉｄｓ）と混合して微生物の生長及びＴｎｈとＡｅｎｇ１７、１８優占菌株の１０〜１００倍の増加出現を再確認した。

前記の１００％のタール酸各１ｇずつをそれぞれ滅菌した最小液体培地（Ｋ_２ＨＰＯ_４０．６５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．１７ｇ、ＮａＮＯ_３０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／脱塩水１リットル）５０ｍｌ、水道水５０ｍｌ、そして滅菌蒸留水５０ｍｌにそれぞれ添加して好気的に震盪した。５０ｍｌに混合した後は、Ｎａ_４ＯＨを用いてｐＨを８に調整した。その後、ＮＢＣ２０００菌株の中でＢＳ１００、Ｓｐ３００、Ｔｎｈ、ＥＢＣ１０６、Ａｅｎｇ１７、Ａｅｎｇ１８、Ｂｓ１０１、Ｎｚ２００１菌株を１０^４〜１０^７／ｍｌで接種し、３０℃で１００ｒｐｍにより５５日間好気的に震盪反応させた。その結果は、下記表１４の実施例１３（最小液体培地）、実施例１４（水道水）、実施例１５（滅菌蒸留水）の通りである。

前記表から分かるように、タール酸以外には炭素源がない最小培地に接種した実験でも、本発明による菌株らが増殖した。これは、前記菌株らがタール酸を炭素源として利用したことを立証するものである。
＜実験例４：ＰＣＥの生分解実験＞
ＰＣＥ＋最小液体培地＋菌株＋Ｏ_２酸素
ペルクロロエチレン（Ｐｅｒｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎe、ＰＣＥ）の生分解を検証するために、ガス（ｇａｓ）用実験装置に最小液体培地（Ｋ_２ＨＰＯ_４０．６５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．１７ｇ、ＮａＮＯ_３０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／脱塩水１リットル）１９３．８ｍｌを入れた状態で実験装置を密閉して滅菌し、放冷させた後、ＥＢＣ１０６、１０７菌株とＴｎｈ菌株を１０^５ｃｆｕ／ｍｌで接種した（実施例１６）。その後、ＰＣＥを６．２ｍｌ添加して約５０，０００ｐｐｍになるようにした。ＰＣＥの溶解度は、０．０１５ｇ／１００ｍｌの水であり（１５０ｍｇ／リットル、２５℃であり）、溶解されない状態は水の底に沈む。

ＰＣＥは、ボトル（Ｂｏｔｔｌｅ）外部に輸出されず、試験装置瓶（Ｂｏｔｔｌｅ）内部の酸素と外部から周期的（２４時間単位）に別途供給する酸素を利用して好気的な状態で生分解実験を行った。ボトル（Ｂｏｔｔｌｅ）内の微生物の生分解活動により発生される二酸化炭素（ＣＯ_２）は、ボトルに連結された実験装置内のＫＯＨを利用して除去（ＣＯ_２＋２ＫＯＨ→Ｋ_２ＣＯ_３＋Ｈ_２Ｏ）した。窒素（ＮＯ_３−Ｎ）、リン（ＰＯ_４−Ｐ）は３〜８日間隔で３：１の比率で添加して微生物の活性を促進させた。これと対照するために、Ｔｎｈのみを１０^５ｃｆｕ／ｍｌで接種して時間によるＰＣＥの減少を調べた。その結果、個別菌株を接種した場合にはＰＣＥが一部の分解を示した反面、２種以上の菌株を組み合わせて接種した場合には良好な分解効率を示した。前記菌株ら全てを組み合わせて接種した場合の効果が最も優れた。代表的な例は、下記表１５及び図１４乃至１６に示した。

前記表１５に示されたように、５日までは菌株の適応が行われながら１０〜１００倍減少した。８日以内に５０，０００ｍｇ／リットルのＰＣＥは、微生物の分解作用により最小液体培地に完全に溶解され、１０日頃にはＰＣＥが全て分解された。その理由は、７日頃に沈澱されたＰＣＥが７０％程度の溶解及びＫＯＨがほぼ溶解され、８日頃には沈澱されたＰＣＥの完全溶解と、１０日頃にＥＢＣ１０７菌株の１，０００倍程度の増加及びＴｎｈ菌株の１，０００倍程度の増加が確認されたからである。このように、ＥＢＣ菌株とＴｎｈ菌株の相互作用によりこれまで好気的な分解が困難であったＰＣＥを菌株によっては、高濃度水準でも好気的に短期間内に完全に生分解することができることを証明した。

図１４は、菌株の処理直前のＰＣＥ初期濃度を示すＧＣクロマトグラムであり、図１５は、単一菌株のみを処理したＰＣＥ濃度を示すＧＣクロマトグラムであり、図１６は、前記全体菌株を処理したＰＣＥ濃度を示すＧＣクロマトグラムである。

前記図１４の初期ＰＣＥ濃度と図１５の比較例のＰＣＥ濃度は図に示されているように、３．７５分の位置に表示されているが、本発明による菌株を処理した図１６の場合には、微生物の生分解処理により３．７５分の位置にＰＣＥが全く現われなかった。
＜実験例５：トルエンの生分解実験＞
トルエン＋最小液体培地＋菌株＋Ｏ_２酸素
５００ｍｌＥｒｌｅｍｅｙｅｒＦｌａｓｋに最小液体培地（Ｋ_２ＨＰＯ_４０．６５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．１７ｇ、ＮａＮＯ_３０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／脱塩水１リットル）１５０ｍｌを入れて滅菌し、放冷させた後、ＥＢＣ菌株とＮｚ２００１菌株を接種した。その後、トルエン３ｍｌを添加して即時密封した後、２５℃で１１０ｒｐｍにより震盪し、トルエンの揮発を二重密封で遮断した。１５日経過後にトルエン３ｍｌと菌株を追加して添加した。その結果、単一菌株のみを処理した場合には、どの場合でも分解が行われない反面、２種以上の菌株を組み合わせた場合には、良好な分解効率を示し、特にＥＢＣ菌株＋（追加Ａｅｎｇ１７＋Ａｅｎｇ１８＋Ｗ２４）、ＥＢＣ菌株＋Ｎｚ２００１＋（追加Ａｅｎｇ１７＋Ａｅｎｇ１８＋Ｗ２４）の場合に優れた分解効率を示した。代表的な結果を下記表に示した。またこの結果は、表１６、図１７乃至図１８に示されている。

ＥＢＣ菌株＋（追加Ａｅｎｇ１７＋Ａｅｎｇ１８＋Ｗ２４）は、２９日頃にトルエンが蒸発・消滅
ＥＢＣ菌株＋Ｎｚ２００１＋（追加Ａｅｎｇ１７＋Ａｅｎｇ１８＋Ｗ２４）は、３６日頃にトルエンが蒸発・消滅

前記実験でＥＢＣ１０６、１０７、１０８とＮｚ２００１を初期にそれぞれ１０^４ｃｆｕ／ｍｌで接種してトルエンの分解を実施したが、ＥＢＣ１０６と１０８菌株のみ現われ、ＥＢＣ１０６、１０８菌株がトルエンに対する優占種として活動していることを証明した。初期にＥＢＣ菌株のみが接種された場合は、２９日頃にトルエンが全て消滅され、ＥＢＣ１０６、１０８菌株が１００，０００倍程度増加された。ＥＢＣ菌株とＮｚ２００１が初期に一緒に接種された場合でも３６日頃にトルエンが消滅された後、約１００，０００倍程度にＥＢＣ１０６、１０８が増加された。ＥＢＣ１０６、１０８菌株が４０，０００ｐｐｍ（ｍｇ／ｍｌ）のトルエンが消滅した後、急激に増加したのは、トルエンを主な炭素源として用いている優占種の証拠になっている。ＥＢＣ菌株とＮＢＣ２０００菌株の相互作用によりＥＢＣ１０６とＥＢＣ１０８菌株の活性が大きく増大していることを再確認した。

図１７は、菌株投入直前のトルエン初期濃度のＧＣクロマトグラムであり、図１８は、菌株を４１日間処理した後、測定したトルエン濃度のＧＣクロマトグラムである。前記図面に示されたように、図１７の２．８７分の位置に示された初期のトルエン濃度は、菌株の反応処理後、図１８のように２．９分の位置に微々たる程度で検出され、大部分のトルエンが生分解されたことを再確認した。
＜実験例６：細菌共同体ＮＢＣ２０００及び細菌共同体ＥＢＣ１０００の処理＞
細菌共同体ＮＢＣ２０００及び／又は細菌共同体ＥＢＣ１０００菌株を共同体単位で投入し、環境ホルモンの生分解を確認した。

ＰＣＢｓが汚染されたキプロスの土壌は、実験例１の２）と同様な実験条件で実施した。ＮＢＣ２０００菌株の２６種をそれぞれ１０^５〜１０^６ｃｆｕ／ｍｌの細菌数で全て投入する実験区、そしてＮＢＣ２０００菌株の２６種とＥＢＣ１０００菌株をそれぞれ１０^４〜１０^６ｃｆｕ／ｍｌで全て投入する実験区で１１３日間反応処理した。

ＰＣＰととダイオキシンが汚染されたスウェーデンの土壌は、実験例２と同様な条件でＮＢＣ２０００菌株の２６種をそれぞれ１０^５〜１０^６ｃｆｕ／ｍｌの細菌数で全て投入する実験区、そしてＮＢＣ２０００菌株の２６種とＥＢＣ１０００菌株をそれぞれ１０^４〜１０^６ｃｆｕ／ｍｌで全て投入する実験区でそれぞれ９２日間及び２００日間反応処理した。

ＰＣＥは実験例４と同様な方法で、トルエンは実験例５と同様な方法で、タール酸（Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍｔａｒａｃｉｄｓ）は実験例３と同様な方法で、ＮＢＣ２０００菌株の２６種をそれぞれ１０^５〜１０^６ｃｆｕ／ｍｌの細菌数で全て投入する実験区、そしてＮＢＣ２０００菌株の２６種とＥＢＣ１０００菌株をそれぞれ１０^４〜１０^６ｃｆｕ／ｍｌで全て投入する実験区でそれぞれ３５日間、４５日間、１４０日間反応処理した。

その結果、各環境ホルモン全てにおいて優れた分解効率を示した。具体的な結果は、下記表１７に示されている。

７．実験分析方法
本実験分析は、基本的に水質汚染（韓国環境部告示第２００１−５３号）、廃棄物（韓国環境部告示第２００２−１１２号）、土壌汚染（韓国環境部告示第２００２−１２２号）の工程試験方法と標準工程ら（ＳｔａｎｄａｒｄＭｅｔｈｏｄｓ：ＡＰＨＡ−ＡＷＷＡ−ＷＥＦ、１８ｔｈ＆２０ｔｈｅｄ．）に基づいて実施した。

１）細菌数（ＣＦＵ）
標準工程（ＳｔａｎｄａｒｄＭｅｔｈｏｄｓ）の微生物調査法に基づいて、処理区の土着微生物と接種微生物の共同体をプレート計数方法（ｐｌａｔｅｃｏｕｎｔｍｅｔｈｏｄ）により調査し、初期及び各時間別に有害物質の減少による微生物の増殖現象を確認した。

２）総有機炭素（ＴＯＣ）
標準工程に基づいて原液及び各測定時間別試料を遠心分離し、その上澄液をもって総有機炭素量をＴＯＣ分析器（ＨｉｇｈＴＯＣＩＩ＋ＮｂｙＥｌｅｍｅｎｔａｒＡｎａｌｙｓｅｎｓｙｓｔｅｍｅＧｍｂＨ）により調べた。

３）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析
各処理区の土壌及び液状試料を測定時間別に採取して前処理を行った後、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社で発刊したガスクロマトグラフィー（ＧＣ２０１０、ＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）の運用手引とドナムＧＣ（ＤＳ６２００）の運用手引に基づいて有害物質の変化を定量的に分析した。スウェーデンの土壌試料とニュージーランドの土壌試料に対する五塩素化フェノールの標準検定は、ＧＣ２０１０でＺｅｂｒｏｎ（ＺＢ）−５７ＨＭ−Ｇ００２−１１カラム（３０ｍｘ３０ｍｍｘ２５ｕｍ）を用いて、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ１２．５２〜１２．５５を基準にした。ドナムインストルメント（ＤＳ６２００ＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ、ｄｓＣＨＲＯＭ）のガスクロマトグラフィーで測定した弾薬箱である木材の五塩素化フェノールの標準検定は、Ｚｅｂｒｏｎ（ＺＢ）６２４７ＨＫ−Ｇ００５−３６カラム（３０ｍｘ５３ｍｍｘ３ｕｍ）を用いて、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ１１．３９〜１１．４４を基準にし、ＰＣＥはｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ３．７５基準にし、トルエンはｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ２．８７〜２．９０を基準にして測定した。

４）ＧＣＭＳ分析
各処理区の土壌及び液状試料を測定時間別に採集して前処理を行った後、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社で発刊したＧＣＭＳ運用手引に基づいて有害物質の変化を濃度と分子構造の側面からＧＣＭＳ（ＧＣＭＳＱＰ５０５０Ａ−ＳｈｉｍａｄｚｕＣｏ．）のデータベースにより分析し、ＤＢ−５ｍｓ（Ｃａ．Ｎｏ．１２２５５３２）カラムとヘリウムガスを用いた。

５）有害物質の定量分析のための前処理
細菌共同体による有害化合物質の減少を定量的に分析するための前処理は、標準工程（ＳｔａｎｄａｒｄＭｅｔｈｏｄｓ）に基づいて実施した。主要塩素化合物に対する抽出方式は、本発明者の大韓民国特許第２８４３１３号に記録された内容を並行準用した。

Ａｒｏｃｌｏｒ１２６０の９７種の標準物質に対するＧＣＭＳクロマトグラムである。本発明による微生物を処理する前の土壌の多塩素化ビフェニルのＧＣＭＳクロマトグラムである。本発明による微生物を６５日間処理した場合の５０％の多塩素化ビフェニルの減少を示すＧＣＭＳクロマトグラムである。本発明による微生物を８５日間処理した場合の８０％の多塩素化ビフェニルの減少を示すＧＣＭＳクロマトグラムである。本発明による微生物を１３８日間処理した場合のほぼ１００％の多塩素化ビフェニルの減少を示すＧＣＭＳクロマトグラムである。本発明による微生物を処理せず、１３８日が経過した対照区土壌のＧＣＭＳクロマトグラムである。本発明による微生物を処理する直前の初期ＰＣＰ濃度のＧＣクロマトグラムである。本発明による微生物を２００日間処理した後のＰＣＰ濃度のＧＣクロマトグラムである。本発明による微生物を処理する直前の初期ＰＣＰ濃度のＧＣクロマトグラムである。本発明による微生物を７０日間処理した後のＰＣＰ濃度のＧＣクロマトグラムである。本発明による微生物を処理する直前の初期ＰＣＰ濃度のＧＣクロマトグラムである. 本発明による微生物を５０日間処理した後の木材のＰＣＰ濃度のＧＣクロマトグラムである。本発明による微生物を５０日間処理した後の反応処理水（ｒｅａｃｔｉｏｎｗａｔｅｒ）のＰＣＰ濃度のＧＣクロマトグラムである。本発明による微生物を処理する直前の初期ＰＣＥ濃度のＧＣクロマトグラムである。単一菌株のみを処理したＰＣＥ濃度のＧＣクロマトグラムである。本発明による微生物を処理した場合のＰＣＥ濃度のＧＣクロマトグラムである。本発明による微生物の投入直前のトルエンの初期濃度のＧＣクロマトグラムである。本発明による微生物で４１日間処理した後のトルエン濃度のＧＣクロマトグラムである。

Claims

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｃｙ１００菌株、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．）Ａｅｎｇ１８菌株、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｄｊｈｃ菌株、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｔａｒ３菌株、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．）Ｎｔａｒ２菌株、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＥＢＣ１０７菌株、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｔｎｈ菌株、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）Ａｅｎｇ１７菌株、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｃｐｔｓ菌株、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）Ｎｔａｒ１菌株、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｓｐ３００菌株、クリセオモナス・ルテオラ（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓｌｕｔｅｏｌａ）Ｇｃ５０１菌株、クリセオモナス属（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｇｃ５００菌株、クリセオモナス・ルテオラ（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓｌｕｔｅｏｌａ）Ｇｃ３００菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｃｙ１０１菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｃｙ１０２菌株、ブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｃｙ１０３菌株、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｂｓ１００菌株、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃｙ１０４菌株、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｃｙ１０５菌株、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｃｙ１０６菌株、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｃｙ１０７菌株、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）ＥＢＣ１０６菌株、タール分解グラム陽性細菌であるＢｓ１０１菌株、硫黄菌株であるＮｚ２００１菌株及び油類分解グラム陰性細菌であるＷ２４菌株から構成されたことを特徴とする細菌共同体ＮＢＣ２０００（ＫＣＴＣ１０６２３ＢＰ）。
請求項１に記載の細菌共同体ＮＢＣ２０００を利用して多塩素化ビフェニル（Ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄｂｉｐｈｅｎｙｌｓ、ＰＣＢｓ）、ダイオキシン（Ｄｉｏｘｉｎ）、五塩素化フェノール（Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、ＰＣＰ）、ペルクロロエチレン（Ｐｅｒｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎ、ＰＣＥ）を含む塩素化合物、石油及び鉱油（ｍｉｎｅｒａｌｏｉｌ）炭化水素、タール酸並びにトルエンから構成された群より選ばれた１つ以上の物質を生物学的に処理する方法。
前記細菌共同体ＮＢＣ２０００（ＫＣＴＣ１０６２３ＢＰ）に加えて、細菌共同体ＥＢＣ１０００(ＫＣＴＣ０６５２ＢＰ)を共に利用することを特徴とする請求項２に記載の方法。
前記タール酸は、ＴＰＨ（ｔｏｔａｌｐｅｔｒｏｌｅｕｍｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）、ＰＡＨ（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃａｒｏｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ＢＴＥＸ（ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン）、ベンゼン、エチルベンゼン、トルエン、キシレン、ＥＯＸ（ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅｏｒｇａｎｉｃｈａｌｏｇｅｎｓ）、ＰＯＸ（ｐｕｒｇｅａｂｌｅｏｒｇａｎｉｃｈａｌｏｇｅｎｓ）、ハロゲン化炭化水素（Ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）、クロロ−ベンゼン、クロロ−フェノール、ＰＣＢｓ、シアン化物、ヒ素、鉛、カドミウム、水銀又は硫黄を含むものであることを特徴とする請求項２に記載の方法。