TWI555845B - 降解含氯有機污染物之好氧性菌株及其用途 - Google Patents

Description

降解含氯有機污染物之好氧性菌株及其用途

本發明係關於一種降解含氯有機污染物之好氧性菌株及其用途，特別是關於一種篩選馴化自台灣本土高雄林園工業區之降解含氯有機污染物之好氧性菌株及其用途。

氯乙烯，又名乙烯基氯(vinyl chloride，VC)，是一種重要的有機單體，可由乙烯及二氯乙烷(ethylene dichloride，EDC)加以合成，並可用於合成各種高分子聚合物，也就是塑膠。由於氯乙烯及二氯乙烷之溶解度低、密度大於水，屬於重質非水相液體(dense non-aqueous-phase liquids,DNAPLs)，當氯乙烯或二氯乙烷經由工廠廢水排放或儲槽、管線的意外洩漏而存在於土壤或地下水時，容易增加土壤污染之深度及範圍，因此氯乙烯或二氯乙烷為氯乙烯化工廠或最終處置場中常見的有機污染物。

現有含氯有機污染物(例如氯乙烯或二氯乙烷等)之地下水或廢水的整治處理方式有物理抽除、化學氧化、生物復育等方法，其中物理抽除法必需將含氯有機污染物抽出，再移置到另外的地點進行污染物處理，如廢水處理、活性碳吸附、離子交換等，因此設備運作時間長且須額外場地。再者，化學氧化法加入的氧化劑需要與含氯有機污染物接觸才有作用，若氧化劑在地下水中反應過快，或滲透較差的區域，氧化劑與污染物的化學反應作用將減少。另外，生物復育法(bioremediation)則使用微生物，其中微生物以含氯有機污染物為碳源進行，經異化(氧化)、同化(還原)或共代謝作用，可將污染物生物降解成無毒的物質，例如分解或轉化成較簡單的有機物或是二氧化碳及水等。相較之下，生物復育法之優點為生產菌種的成本較少，且將菌種投入地下水中自行繁殖影響範圍較大、時效長， 且使用微生物對環境較友善、無明顯衝擊，因此生物復育法相對係整治受污染之地下水較環保、較符合經濟效益的方法。

現地(in-situ)生物復育工作主要為提供適當的環境因子，以提高現地微生物族群的數量，促進現地微生物族群代謝污染物之活性，使其得以有效分解污染物。目前已發展之處理技術大致可分為下列幾項：(1)、生物活化法(biostimulation)：添加生物可分解之界面活性劑或營養鹽於污染場址，活化場址內既有的微生物族群；(2)、生物添加法(bioaugmentation)：直接添加對污染物具有分解能力的特殊菌種於污染場址，或利用基因工程技術，發展具特定污染物分解能力之基因重組微生物。由於基因重組微生物添加至自然生態環境中，必需考量其毒性及對生態系之影響，因此必須經過嚴密而謹慎的審查後才可實施；(3)、生物處理法(biological treatment)：將污染物經通氣或土壤洗滌後送至特殊生物反應器或是生物濾床、生物洗滌塔去除污染物，或是採用地耕法、堆肥處理。

舉例來說，中華民國公告第295575號發明專利揭示一種處理含可吸附有機鹵化合物廢水的方法，其使用多種格蘭陽性、陰性細菌進行生物化學或生物處理來自生產多元醇、氯乙烯和/或聚氯乙烯的廢水。然而，該菌未經馴化篩選，也非來自台灣本土，因此若欲進口輸入用於台灣本土，必需耗時評估是否影響本土之土壤微生物相生態，且其實際應用在台灣本土之適應性及生物降解整治的效果可能受限。

再者，中華民國公開第200951225號發明專利揭示一種用於有機污染物濃度與降解效能檢測之轉形株及其檢測方法，其中該轉形株預先植入至少一特定質體，以用於測定苯類、酚類、四氯乙烯、三氯乙烯和順式二氯乙烯等有機污染物之濃度。然而，該轉形株僅用於檢測有機污染物濃度，且因涉及複雜基改工程，故屬於生物基因改良之菌種，若欲使用於台灣本土，必需耗時評估是否破壞或干擾本土之土壤微生物相生態。

另外，中華民國公告第I377249號發明專利揭示一種用於清除存在於一受污染的介質中之戴奧辛污染物的微生物試劑及其使用方法，其使用Pseudomonas mendocina NSYSU BCRC 910356等菌株來處理含氯之戴奧辛類化合物等污染物之廢水，但該菌係來自台南中石化安順廠，且未 用於處理受氯乙烯或二氯乙烷污染之場址。

此外，中華民國公告第I422535號發明專利揭示一種用於去除污泥中有機毒化物之微膠囊、其製造方法及其應用，其包含包埋於天然高分子材料與鈣交聯產物中之具有機毒化物分解能力之物質，例如具分解能力之菌株。然而，該專利著重在微膠囊的製劑設計，並未提出如何篩選馴化提高其使用菌株之降解含氯有機污染物能力，也未揭示菌株是否來自台灣本土特定受氯乙烯或二氯乙烷污染之場址。

相似的，美國公告第4,959,315號發明專利揭示一種氯乙烯化合物生物分解方法，其揭示使用Pseudomonas putida F1等菌來降解氯乙烯等污染物。美國公告第5,512,479號發明專利揭示一種降解揮發性有機氯化物的方法及其整治，其揭示使用Pseudomonas mendocina KR-1 ATCC 55706來降解三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯等污染物。美國公告第5,906,932號及第6,319,706號發明專利也提到多種菌株，如Pseudomonas putida BH、Pseudomonas cepacia strain G4、Pseudomonas mendocina KR-1等可用來處理含三氯乙烯等污染物之廢水。然而，該些美國專利揭示的菌株同樣非篩選來自台灣本土，因此若欲進口輸入用於台灣本土，仍舊需耗時評估是否影響本土之土壤微生物相生態，且其實際應用在台灣本土之適應性及生物降解整治的效果可能受限。

值得注意的是，上述提及之菌株皆非篩選自台灣本土受二氯乙烷污染之特定場址(如高雄林園工業區)，且未針對上述特定本土場址之適應性及實際降解效果進行評估。再者，本領域技術人員皆可理解，即使是同菌種，其不同品系(strain)之細胞株，在生理特性及降解效能仍存在有相當大的差異。因此，對於長期受含氯有機物污染的不同場址而言，尚存在許多不同的環境因素(如季節溫度變化、鹽度、土壤組成、含氯有機污染物濃物、地下水量及深度、其他有機/無機污染物等…)影響著各種菌株之存活率及降解能力，且後續篩選方式不同也會影響最後篩選出之菌株生理特性產生差異性。因此，當由某一特定污染場址篩選出之某菌種的篩選菌株使用在同一特定污染場址表現出良好的適應性、耐受性、存活、繁殖狀況及降解效能時，並不代表由不同污染場址(特別是無鄰接之不同國家/地區)取得 或篩選出之同一菌種中其他原生或篩選菌株使用在該同一特定污染場址後就一定會有相同程度之生理特性及降解效能，事實上，異地同菌種之原生或篩選菌株應用在非原生地域時通常不適應該地環境且耐受性差，無法持續存活及繁殖，因而降低應用在非原生地進行含氯有機污染物生物現地整治之實際成效。

故，有必要提供一種降解含氯有機污染物之菌株及其用途，以解決習用技術所存在的問題。

本發明之主要目的在於提供一種降解含氯有機污染物之好氧性菌株及其用途，其係由台灣本土之含氯有機物污染場址(高雄林園工業區台灣氯乙烯公司氯乙烯廠)現地篩選馴化出2種特定好氧性菌株，包含假單胞菌LY 2-3(BCRC 910662)及硫黄酸化菌LY 16-8(BCRC 910663)，其不但長期接觸該地環境中的二氯乙烷，且經二氯乙烷篩選馴化，因此確認具有較高之相關降解酵素表現量，故不但可以高效率的將二氯乙烷等含氯有機物還原成二氧化碳及氯離子並由環境或大氣加以稀釋，也可以適用於對台灣本土鄰近海岸之含氯有機物污染場址進行現地生物整治。同時，該好氧性菌株之篩選、培養迅速，製劑成本低廉、脫氯所需時間短，及移除成效顯著。

本發明之次要目的在於提供一種降解含氯有機污染物之好氧性菌株及其用途，其係由台灣本土鄰近海岸之含氯有機物污染場址現地篩選出上述多種特定好氧性菌株，該些特定好氧性菌株皆為本土菌株且未經基因改造，因此在現地使用上不會有破壞或干擾本土之水體或含水土壤中微生物菌相生態之疑慮，且該好氧性菌株也可在整治現場繼續繁殖，持續移除含氯污染物。

本發明之另一目的在於提供一種降解含氯有機污染物之好氧性菌株及其用途，其係由台灣本土鄰近海岸之含氯有機物污染場址現地篩選出上述多種特定好氧性菌株，並能選擇複合多種好氧性菌株使用於含氯污染物場址現地進行整治，複合使用多種好氧性菌株有利於確保菌株存活及適應該現地環境，並可在整治現場繼續繁殖，持續移除含氯污染物(二 氯乙烷)，以相對提高整治成效及降低整治次數。

為達上述之目的，本發明提供一種降解含氯有機污染物之好氧性菌株，其選自假單胞菌LY 2-3(Pseudomonas sp.LY 2-3)、硫黄酸化菌LY 16-8(Starkeya novella LY 16-8)或其組合，該些好氧性菌株用以降解含氯有機污染物，並依序以寄存編號BCRC 910662及910663寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。

在本發明之一實施例中，該好氧性菌株係篩選自高雄林園工業區台灣氯乙烯公司氯乙烯廠。

在本發明之一實施例中，該含氯有機污染物係為二氯乙烷。

另一方面，本發明提供一種降解含氯有機污染物之好氧性菌株的用途，其係將至少一種如上所述之好氧性菌株或其組合施加於台灣本土之一含氯有機物污染場址，以進行現地生物整治降解含氯有機污染物。

在本發明之一實施例中，該好氧性菌株係施加於該含氯有機物污染場址之廢水、土壤、地下水或污泥中。

在本發明之一實施例中，該好氧性菌株用以做為一有效成份，以製備一降解含氯有機污染物之生物整治用製劑，該含氯有機污染物係為二氯乙烷。

在本發明之一實施例中，該生物整治用製劑之型式為培養液、懸浮液、粉狀、膠囊或濃漿。

在本發明之一實施例中，該含氯有機物污染場址係一鄰海之含氯有機物污染場址。

在本發明之一實施例中，該鄰海之含氯有機物污染場址係高雄林園工業區。

在本發明之一實施例中，該鄰海之含氯有機物污染場址係高雄林園工業區之台灣氯乙烯公司氯乙烯廠。

為了讓本發明之上述及其他目的、特徵、優點能更明顯易懂，下文將特舉本發明較佳實施例，作詳細說明如下。

本發明一實施例提供一種降解含氯有機污染物之好氧性菌 株，該好氧性菌株係藉由下述篩選方法篩選自高雄林園工業區台灣氯乙烯公司氯乙烯廠(高雄市林園區工業一路1號)，以期篩選出：降解二氯乙烷之好氧性菌株。在篩選出2種好氧性菌株後，本發明可以選擇單獨使用一種好氧性菌株或其組合，將這些好氧性菌株用以做為一有效成份，以製備一降解含氯有機污染物之生物整治用製劑，其中該製劑之型式可為培養液、懸浮液、粉狀、膠囊或濃漿等，該製劑可被施加(注入)到含氯有機物污染場址之地下水、土壤、污泥或廢水中，以進行現地(in-situ)整治。該含氯有機物污染場址例如為一鄰海之含氯有機物污染場址，較佳係為高雄林園工業區，特別是指林園工業區的台灣氯乙烯公司氯乙烯廠(即原取樣之場址，該場址距離高屏溪河床最近約150~200公尺，及距離高屏溪河口最近約2000公尺)。

上述台灣氯乙烯公司之林園氯乙烯廠主要係由乙烯及二氯乙烷(1,2-dichloroethane，DCA、EDC)來合成氯乙烯(vinyl chloride，VC)，當氯乙烯或二氯乙烷經由工廠廢水排放或儲槽、管線的意外洩漏而存在於工廠之廢水、土壤或地下水中時，容易增加土壤污染之深度及範圍，因此必需加以進行整治。該林園氯乙烯廠自1992年開始營運至今已22年，因此該場址地下水中的原生微生物在長期接觸該地環境中的二氯乙烷之下，原本即具有較佳之二氯乙烷降解效率，同時也因鄰近河口，故該地的原生微生物也較能適應鄰海河口土壤的環境因素(如季節溫度變化、鹽度、土壤組成、含氯有機污染物濃物、地下水量及深度、其他有機/無機污染物等…)。

一般來說，在好氧狀況下，微生物無法直接以氯乙烯作為生長基質進行生物降解，但可經由分解結構與氯乙烯相似或易分解的基質作為主要生長基質而獲得能量。當微生物獲得主要生長基質做為能量及碳源來源時，微生物會被誘導產生烯烴單氧化酶(alkene monooxygenase)來分解主要生長基質。由於氧化酵素的專一性較低，不僅能分解生長基質，同時具有分解氯乙烯的能力，將氯乙烯轉為環氧化物(exopide)或二氧烷化物(dioxetane)等中間產物，環氧化物極不穩定而自發轉化為羥基(hydroxyl)或氯化酮(oxochlorinated)等較小分子化合物，這些較小分子化合物可輕易的被異營性微生物經由環氧乙烷：輔酶M轉移酶(epoxyalkane：coenzyme M transferase)的作用而分解成無毒害性的二氧化碳及氯離子，達到整治氯乙烯的目的。此種在好氧狀態下藉由主要生長基質所誘導產生的氧化酵素，藉以分解氯乙烯的處理方式稱為好氧共代謝。另外，二氯乙烷則可被微生物經由鹵烷脫鹵酶(haloalkane dehalogenase)的作用而分解成無毒害性的二氧化碳及氯離子。

請參照下文所示，其揭示本發明一實施例之降解含氯有機污染物(二氯乙烷)之好氧性菌株的篩選方法，其篩選步驟如下：首先，由高雄林園工業區台灣氯乙烯工業股份有限公司之氯乙烯廠內之高濃度含氯有機物廢水池中採得一含氯有機化合物之活性污泥。

接著，準備如下表1及2所示之培養基30mL，並加入3mL上述活性污泥，添加10ppm二氯乙烷(EDC)，室溫，以100rpm轉速振盪培養。培養2周後，吸取0.1ml培養液將其塗抹於額外添加含洋菜膠及glucose 1g/L之固態培養基表面上。

此時，固態培養基表面具有多個菌落。由於細菌降解二氯乙烷(EDC)需要鹵烷脫鹵酶(haloalkane dehalogenase)，因此本發明先取樣固態培養基培養出的各細菌菌落，再利用以一組專用引子(如下表3)分別進行聚合酶連鎖反應(PCR)，以放大欲複製片段的數量，其中dhlA 1024F(正向)及dhlA 1906R(反向)即用以複製鹵烷脫鹵酶之片段(882bp)。

在分別進行PCR後，本發明以膠體電泳分離被複製的片段，藉此辨別各細菌菌落是否含有這些基因片段，其中若含有882bp片段則表示具有鹵烷脫鹵酶，而本發明篩選出欲降解二氯乙烷(EDC)的好氧性菌株必需包含鹵烷脫鹵酶。在鑑定出多個偵測到具降解基因的菌落後，再將該些菌落分別四區劃線於另一固態培養基表面培養，重複此步驟以得具有降解基因之多個純化分離株。

接著，針對這些純化出的分離株進一步以一般細菌通用型引子(bacterial universal primers)進行PCR以擴增特定的16S rDNA片段，其帶有足供鑑別菌株種類的基因序列。完成後得到的16S rDNA基因序列如下(SEQ ID NO：3~4)；隨後，如下表4所示，由NCBI網站比對後的結果可知，實驗編號LY 2-3、LY 16-8這兩種分離株的16S rDNA序列分別與假單胞菌HD G1(Pseudomonas sp.HD G1)及硫黄酸化菌DSM 506(Starkeya novella DSM 506)的16S rDNA序列相似，相似度分別為99%、99%。

上述分離株之完整16S rDNA序列係如下所示：

LY 2-3 16S rDNA(SEQ ID NO：3)：

LY 16-8 16S rDNA(SEQ ID NO：4)：

在確認菌種之種類後，先分別進行培養馴化，其中具有降解二氯乙烷(EDC)的2種分離株LY 2-3、LY 16-8，其液態培養基添加20ppm EDC培養，以便馴化並維持其降解能力。

接著，進行降解效果測試：針對具有降解二氯乙烷(EDC)的2種分離株LY 2-3、LY 16-8，以42ml樣品瓶添加20ml液態培養基，以及15ppm二氯乙烷，各組添加EDC降解菌(該EDC降解菌係從固態培養基表面所培養出的細菌，勾取菌落，以5ml基礎培養基，添加glucose 1g/L，在30℃、150rpm轉速下培養1天，取100μl進行降解測試)，及一組為控制組(沒有添加菌種)，二氯乙烷以GC分析定量。分離株LY 2-3實驗結果如下表5所示，在降解第1天，控制組二氯乙烷仍有15487ppb，但添加EDC降解菌LY 2-3則可降解二氯乙烷到管制標準濃度50ppb以下且幾乎為0。分離株LY 16-8實驗結果如下表6所示，在降解第4天，控制組二氯乙烷仍有29700ppb，但添加EDC降解菌LY 16-8則可降解二氯乙烷到管制標準濃度50ppb以下且幾乎為0。

再者，另外測試分離株LY2-3可降解EDC的濃度範圍，測試濃度為100、150、200ppm EDC。以42ml樣品瓶添加20ml培養基，一組添加分離株LY2-3(該分離株LY2-3係從固態培養基表面所培養出的細菌，勾取菌落，以5ml基礎培養基，添加glucose 1g/L，在30℃、150rpm轉速下培養1天，取50μl進行降解測試)，及一組為控制組(沒有添加菌種)，靜置10天後，二氯乙烷以GC分析定量。實驗結果如下表7所示，在EDC濃度為100、150ppm時，分離株LY2-3降解率皆可達100%；而在EDC濃度為200ppm時，降解率亦仍有38.2%。

再者，另外測試分離株LY 16-8可降解EDC的濃度範圍，測試濃度為100、150、200ppm EDC。以42ml樣品瓶添加20ml培養基，一組添加分離株LY2-3(該分離株LY2-3係從固態培養基表面所培養出的細菌，勾取菌落，以5ml基礎培養基，添加glucose 1g/L，在30℃、150rpm轉速下培養1天，取50μl進行降解測試)，及一組為控制組(沒有添加菌種)，靜置14天後，二氯乙烷以GC分析定量。實驗結果如下表8所示，在EDC濃度為100、150、200ppm時，分離株LY 16-8降解率皆可達100%。

如上所述，本發明由高雄林園工業區台灣氯乙烯公司氯乙烯廠篩選出：降解二氯乙烷之好氧性菌株，其選自假單胞菌LY 2-3(Pseudomonas sp.LY 2-3)、硫黄酸化菌LY 16-8(Starkeya novella LY 16-8)或其組合；上述2種好氧性菌株依序以寄存編號BCRC 910662及910663寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。上述好氧性菌株之用途例如係可選擇將至少一種如上所述之好氧性菌株或其組合施加於台灣本土之一含氯有機物污染場址，以進行現地生物整治。在本發明一實施例中，較佳同時使用2種降解二氯乙烷之好氧性菌株以進行現地生物整治，該好氧性菌株係可選擇施加於該含氯有機物污染場址之廢水、土壤、地下水或污泥中。在本發明另一實施例中，該好氧性菌株較佳係可施加於一鄰海之含氯有機物污染場址，例如高雄林園工業區，特別是高雄林園工業區內之台灣氯乙烯公司氯乙烯廠。

由於本發明之降解含氯有機污染物之好氧性菌株，其係由台灣本土之含氯有機物污染場址(高雄林園工業區台灣氯乙烯公司氯乙烯廠)現地篩選馴化出上述2種特定好氧性菌株，其長期接觸該地環境中的二氯乙烷，且經二氯乙烷篩選馴化，在篩選後經實驗證實具有較高之相關降解酵素表現量，故不但可以高效率的將二氯乙烷等含氯有機物還原成二氧化碳及氯離子並由環境或大氣加以稀釋，也可以適用於對台灣本土該地(林園台氯廠)或其他鄰近海岸之含氯有機物污染場址進行現地生物整治。同時，該好氧性菌株之篩選、培養迅速，製劑成本低廉、脫氯所需時間短，及移除成效顯著。

再者，由於本發明是由台灣本土鄰近海岸之含氯有機物污染場址現地篩選出特定好氧性菌株，該些特定好氧性菌株皆為本土菌株且未經基因改造，因此在現地使用上不會有破壞或干擾本土之水體或含水土壤中微生物菌相生態之疑慮，且該好氧性菌株也可在整治現場繼續繁殖，持續移除含氯污染物。另外，本發明並能選擇複合多種好氧性菌株使用於含氯污染物場址現地進行整治，複合使用多種好氧性菌株有利於確保菌株存 活及適應該現地環境，並可在整治現場繼續繁殖，持續移除含氯污染物(二氯乙烷)，以相對提高整治成效及降低整治次數。

雖然本發明已以較佳實施例揭露，然其並非用以限制本發明，任何熟習此項技藝之人士，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

食品工業發展研究所、2014-11-12、BCRC910662

食品工業發展研究所、2014-11-12、BCRC910663

<110> 台灣氯乙烯工業股份有限公司

<120> 降解含氯有機污染物之好氧性菌株及其用途

<130> TP140407-TW

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> haloalkane dehalogenase primer(鹵烷脫鹵酵素引子)

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> haloalkane dehalogenase primer(鹵烷脫鹵酵素引子)

<400> 2

<210> 3

<211> 1530

<212> DNA

<213> Pseudomonas sp(假單胞菌屬)

<400> 3

<210> 4

<211> 1477

<212> DNA

<213> Starkeya novella(硫黃酸化菌)

<400> 4

Claims (7)

1. 一種降解含氯有機污染物之好氧性菌株，其中該好氧性菌株是假單胞菌LY 2-3(Pseudomonas sp.LY 2-3)，其篩選自鄰海之高雄林園工業區台灣氯乙烯公司氯乙烯廠，該好氧性菌株用以降解含氯有機污染物，並以寄存編號BCRC 910662寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。
2. 如申請專利範圍第1項所述之降解含氯有機污染物之好氧性菌株，其中該好氧性菌株另包含硫黄酸化菌LY 16-8(Starkeya novella LY 16-8)，其以寄存編號BCRC 910663寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之降解含氯有機污染物之好氧性菌株，其中該含氯有機污染物係為二氯乙烷。
4. 一種降解含氯有機污染物之好氧性菌株的用途，其係將至少一種如申請專利範圍第1或2項所述之降解含氯有機污染物之好氧性菌株施加於台灣本土之一含氯有機物污染場址，以進行現地生物整治降解含氯有機污染物，其中該含氯有機物污染場址係鄰海之高雄林園工業區台灣氯乙烯公司氯乙烯廠。
5. 如申請專利範圍第4項所述之降解含氯有機污染物之好氧性菌株的用途，其中該好氧性菌株係施加於該含氯有機物污染場址之廢水、土壤、地下水或污泥中。
6. 如申請專利範圍第4項所述之降解含氯有機污染物之好氧 性菌株的用途，其中該好氧性菌株用以做為一有效成份，以製備一降解含氯有機污染物之生物整治用製劑，該含氯有機污染物係為二氯乙烷。
7. 如申請專利範圍第6項所述之降解含氯有機污染物之好氧性菌株的用途，其中該生物整治用製劑之型式為培養液、懸浮液、粉狀、膠囊或濃漿。