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GENEX CORPORATION pour Procédé de production de L-phénylalanine par réutili- sation de phénylalanine ammonia lyase. Demande de brevet aux Etats-Unis d'Amérique n 432182 du 1er octobre 1982 en faveur de W. E. SWANN
La présente invention concerne un procédé de production de phénylalanine par réaction d'acide t-cinnamique et d'ammoniac catalysée par la phénylalanine ammonia lyase (PAL). Spécifiquement, l'invention concerne un tel procédé de production de la phénylalanine dans lequel un degré élevé d'activité catalytique de la phénylalanine ammonia lyase est entretenu et le catalyseur peut être utilisé.
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La L-phénylalanine est un aminoacide essentiel qui est important pour l'alimentation ainsi que dans divers autres domaines médicaux et diététiques.
Elle a été isolée à l'échelle industrielle de différentes protéines, notamment l'ovalbumine et la lactalbumine.
Dans un procédé de laboratoire connu pour produire la L-phénylalanine, on utilise la phénylalanine ammonia lyase (PAL) en vue de catalyser la réaction réversible :
L-phénylalanine acide trans-cinnamique + ammoniac On peut se référer à ce propos au brevet anglais n 1. 489.468 (19 octobre 1977).
L'équilibre de cette réaction est normalement 80 : 20 en faveur de l'acide t-cinnamique et différents moyens ont été essayés pour atteindre une conversion élevée en L-phénylalanine. Le brevet anglais n 1. 489.468 mentionne qu'un rendement approchant les 20% théoriques de L-phénylalanine peut être obtenu en utilisant une grande masse de cellules contenant la phénylalanine ammonia lyase catalytique et un excès d'ions ammonium.
Conformément au procédé de ce brevet, la source d'ions ammonium est de préférence le chlorure d'ammonium et la réaction est de préférence exécutée à un pH de 8,5 à 9,7.
Yamada, S., et al., mentionnent dans Appl. Environ. Microbiol. 42 : 773-78 (1981) que le rendement de conversion pourrait être augmenté jusqu'à plus de 70% par ajustement du pH de la solution de substrat à 10,0 au moyen d'acide chlorhydrique. Toutefois, ces conditions sont tellement sévères que l'activité de la phénylalanine ammonia lyase des cellules recueillies est beaucoup atténuée au point que la réutilisation de l'enzyme devient impossible. De plus, Yamada et al. précisent que l'immobilisation de l'enzyme cellulaire n'offre aucun avantage sur l'utilisation des cellules intactes.
Par conséquent, bien qu'une concentration élevée en L-phénylalanine soit initialement possible suivant ce
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procédé, l'impossibilité de réutiliser l'enzyme catalytique rend le procédé anti-économique pour une application à grande échelle.
Il est donc resté intéressant de mettre au point un procédé pour produire la L-phénylalanine à partir d'acide t-cinnamique et d'ammoniac, suivant lequel on obtient un rendement élevé en L-phénylalanine et de plus la phénylalanine ammonia lyase conserve suffisamment d'activité catalytique pour pouvoir être réutilisée.
L'invention a donc pour but de procurer un procédé de production de la L-phénylalanine à partir d'acide t-cinnamique, suivant lequel le produit est obtenu en concentrations élevées et la phénylalanine ammonia lyase peut être utilisée à plusieurs reprises.
L'invention a aussi pour but de procurer un tel procédé de production de la L-phénylalanine, suivant lequel la réaction peut être exécutée en système à marche discontinue cellulaire libre ou en système cellulaire ou enzymatique immobilisé.
L'invention a de plus pour but de procurer un procédé économique pour utiliser la phénylalanine ammonla lyase dans la production de la L-phénylalanine.
Le procédé de production de la L-phénylalanine par réaction de l'acide t-cinnamique et de l'ammoniac en présence de phénylalanine ammonia lyase a été amélioré au point que des rendements élevés en L-phénylalanine sont atteints et qu'un degré élevé d'activité catalytique de la phénylalanine ammonia lyase est conservé. Dans des conditions de réaction définies, la stabilité de la phénylalanine ammonia lyase est augmentée au point qu'elle peut être utilisée à plusieurs reprises pour produire de la L-phénylalanine en concentrations élevées.
Pour obtenir ce résultat intéressant, on pré-
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pare une solution de substrat en faisant réagir l'acide avec une source d'ions ammonium. La source d'ions ammonium peut être un sel d'ammonium non halogéné quelconque. Le pH de la solution de substrat est ajusté à une valeur d'environ 8,0 à 10, 0 à l'aide d'un acide non halogéné, puis la solution est ajoutée à une source de phénylalanine ammonia lyase comme un système de cellules libres intactes ou un système de cellules ou d'enzymes immobilisées contenant de la phénylalanine ammonia lyase.
Suivant le procédé de l'invention, une solution de substrat est obtenue à partir d'acide t-cinnamique et d'une source d'ions ammonium. La source d'ions ammonium peut être introduite par addition directe d'un sel d'ammonium d'un acide organique ou minéral à l'acide t-cinnamique, ou bien par formation de celui-ci dans la solution de substrat, par exemple par mélange d'hydroxyde d'ammonium avec un acide non halogéné.
Le brevet anglais n 1. 489.468 indique qu'une source préférée d'ions ammonium consiste en un mélange de chlorure d'ammonium et d'hydroxyde d'ammonium (page 3, lignes 25-26). Le mode opératoire de Yamada et al. fait également intervenir le chlorure d'ammonium. Au contraire des indications de l'état connu de la. technique, la Demanderesse a découvert qu'il est avantageux que le sel d'ammonium soit exempt d'ions halogène. La présence des halogènes dans les solutions de susbtrat s'est révélée inhibitrice pour l'activité catalytique de la phénylalanine ammonia. lyase. Par conséquent, les sels d'ammonium préférés sont notamment le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le citrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium et le phosphate d'ammonium. Un sel d'ammonium spécialement préféré est le sulfate d'ammonium.
Il est désirable aussi que le sel d'ammonium soit ajouté à la solution de susbtrat en concentrations
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élevées. La concentration en ions ammonium est généralement d'environ O, 1 à 7,5M et de préférence d'environ 1 à 5M. La concentration élevée en sel d'ammonium augmente la concentration en ammoniac dans le système et agit aussi comme tampon de sorte qu'un ajustement du pH de la réaction peut être assuré plus aisément.
Lorsque la concentration en ions ammonium tombe dans les intervalles indiqués, la concentration en acide t-cinnamique en solution est généralement d'environ 30mM à environ 200mM et de préférence d'environ 60mM à environ 150mM.
Yamada et al. indiquent que la solution de substrat doit être ajustée à un pH de 10,0. Toutefois, dans le procédé de la présente invention, le pH peut être ajusté dans l'intervalle d'environ 8 à 10 et de préférence d'environ 8,5 à 9,5. L'article de Yamada mentionne également l'ajustement du pH de la solution au moyen d'acide chlorhydrique. Ceci peut apporter une quantité sensible de chlorure dans le substrat.
Toutefois, dans le procédé de l'invention, comme déjà indiqué, il est avantageux d'ajuster le pH de la solution de substrat avec un acide exempt d'halogène. Les acides préférés pour l'ajustement du substrat sont l'acide sulfurique, l'acide phosphorique et l'acide acétique, bien que d'autres acides non halogénés conviennent. Un acide spécialement préféré est l'acide sulfurique, parce que lors de son addition à une solution de susbtrat contenant de l'hydroxyde d'ammonium, il forme par réaction le sulfate d'ammonium qui est un agent stabilisant connu pour les enzymes.
La solution de substrat est ajoutée à un bouillon de culture contenant de la phénylalanine ammonia lyase, aux cellules qui en sont séparées ou à l'enzyme isolée. La phénylalanine ammonia lyase est pro-
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duite conformément aux procédés classiques. La réaction catalysée par la phénylalanine ammonia lyase progresse dans les conditions de la production de la L-phénylalanine qui comprennent de préférence une température de réaction d'environ 10 C à environ 45 C. Dans les conditions du procédé de l'invention, la stabilité de la phénylalanine ammonia lyase est augmentée au point qu'elle peut être utilisée à plusieurs reprises pour produire de la L-phénylalanine en concentrations élevées.
Le procédé de l'invention pour produire de la L-phénylalanine peut être appliqué à un système à marche discontinue avec cellules libres ou un système avec cellules ou enzymes immobilisées. Le système à marche discontinue peut être un système à marche discontinue simple ou à marche discontinue avec alimentation constante. Si la phénylalanine ammonia lyase est immobilisée dans une colonne, celle-ci peut fonctionner en passe simple, avec recyclage ou avec recyclage et alimentation continue. Un procédé préféré pour immobiliser la phénylalanine ammonia lyase ou les cellules contenant cette enzyme est décrit dans le brevet belge n 897. 340 intitulé"Support en vermiculite pour des matières biologiques insolubilisées".
Lorsque la phénylalanine ammonia lyase ou des cellules contenant l'enzyme sont immobilisées dans une colonne, celle-ci peut être maintenue à une température d'environ 10 à environ 400C et de préférence d'environ 18 à 30 C pendant que la solution de substrat est pompée dans la colonne.
La production de la L-phénylalanine dans le mélange de réaction est surveillée par analyse suivant les techniques habituelles. Lorsque l'acide sulfurique remplace l'acide chlorhydrique dans la solution de substrat, la quantité de L-phénylalanine produite vaut environ 8 à 10 fois la quantité produite en présence
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d'acide'chlorhydrique. Lorsque la phénylalanine ammonia lyase a été immobilisée, elle manifeste une rétention d'environ 50% de l'activité après 41 jours de réaction. Ceci fait contraste avec la rétention de 20% après 24 heures mentionnée par Yamada et al.
La L-phénylalanine peut être isolée du mélange de réaction suivant les techniques habituelles.
Les exemples suivants illustrent non limitativement le procédé de l'invention.
EXEMPLE 1
On prépare un milieu de culture suivant le mode opératoire suivant.
On ajoute 10 g de peptone, 10 g d'extrait de levure, 0,5 g de D, L-phénylalanine, 5 g de chlorure de sodium et 5 g de L-isoleucine à 1 litre d'eau désionisée. On ajuste le pH à 6,0 au moyen d'acide sulfurique et on stérilise à l'autoclave à 120 C pendant 10 minutes sous 103kPa. Ceci constitue le milieu normalement inducteur pour les tubes de culture et flacons à secouer.
EXEMPLE 2
On applique le mode opératoire général de l'exemple 1, mais en ajoutant au milieu de l'iodure de potassium (KI) lOOmM. Ceci constitue un milieu de sélection hautement inducteur.
EXEMPLE 3
On applique le mode opératoire général de l'exemple l, mais en ajoutant de l'iodure de potassium 200mM au milieu. Ceci constitue également un milieu de sélection hautement inducteur.
EXEMPLE 4
On applique le mode opératoire général de l'exemple l, sauf qu'on utilise 15 g d'extrait de levure et qu'on supprime la peptone. On ajoute de l'iodure de potassium 200mM. Ceci constitue un milieu de production hautement inducteur pour flacons à secouer.
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EXEMPLE 5
On prépare un milieu de fermentation suivant le mode opératoire général de l'exemple 4, mais en omettant le chlorure de sodium et la L-isoleucine. Ceci constitue un milieu de production par fermentation hautement inducteur.
EXEMPLE 6
On prépare trois milieux de culture comme dans les exemples 1, 2 et 3. Pour inoculer 4,5 ml de chaque culture en tube à essai, on utilise une souche de Rhodotorula rubra (ATCC 4056) produisant de la phénylalanine ammonia lyase qu'on a entretenue sur de la gélose nutritive en culture inclinée. On introduit les tubes ensuite dans un appareil secoueur fonctionnant à 30 C à 250 tours par minute. On réalise sept transferts (0,2 ml) de chaque tube à 24 et 48 heures dans 4,5 ml de milieu de culture frais. On utilise les tubes de culture pour inoculer 200 ml de milieu dans des flacons à secouer de 1000 ml. On récolte à la 30e heure et à la 54e un flacon de chaque milieu.
Les cellules collectées à la 30e heure donnent en moyenne 14 g de pâte par litre et à la 54e heure, en moyenne 29 g de pâte par litre. L'activité de phénylalanine ammonia lyase du KI lOOmM est supérieure de 31% à celle du témoin. L'activité de phénylalanine ammonia lyase du KI 200mM est supérieure de 39% à celle du témoin.
EXEMPLE 7
On applique le mode opératoire général de l'exemple 6 pour cultiver R. rubra dans du milieu hautement inducteur 200mM en KI, sauf qu'on réalise 25 transferts de sélection de la culture 200mM en KI. De plus, 24 heures après avoir inoculé le flacon à secouer, on utilise 2,5% de milieu pour inoculer 15 flacons à secouer frais (flacon final) et après 24 heures de cul-
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ture, on recueille le contenu des flacons. On calcule les rendements cellulaires et l'activité de phénylalanine ammonia lyase pour quelques flacons et pour le produit final formé par le mélange des pâtes de cellules. L'activité maximale de phénylalanine ammonia lyase à 28,7 g de pâte par litre de milieu est de 18,4 U/g de pâte (528 unités de phénylalanine ammonia lyase par litre).
(1 unité correspond à 1 mole de L-phénylalanine convertie en acide t-cinnamique et en ammoniac par minute à 300C). On détermine l'activité suivant une variante du procédé décrit par Kalghatgi et Subba Rao, Biochem. J. 149 : 65-72,1975. Le produit final formé par l'ensemble des cellules a une activité de 15,0 unités de phénylalanine ammonia lyase par g de pâte à 27 g de pâte par litre comme rendement moyen en cellules (405 unités de phénylalanine ammonla lyase par litre).
EXEMPLE 8
On prépare une solution de cinnamate d'ammonium constituant le substrat suivant le mode opératoire général suivant. On ajoute de l'acide cinnamique à de l'hydroxyde d'ammonium (à 28%) jusqu'à dissolution.
On ajoute ensuite de l'eau et de l'acide pour ajuster le volume et le pH respectivement. La concentration en acide cinnamique, la concentration en ammoniac et le pH (quantité d'acide ajoutée) varient dans les exemples ci-après et les quantités de sel d'ammonium qui sont produites varient donc également.
EXEMPLE 9
On évalue les effets des concentrations élevées en halogène sur la phénylalanine ammonia lyase en utilisant différents acides pour abaisser le pH des solutions de substrat. On prépare deux substrats suivant le mode opératoire général de l'exemple 8 (acide cinnamique 60mM ; NH3 7, 5 M ; pH 10,0). On ajuste
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le pH de la solution A avec de l'acide chlorhydrique et celui de la solution B avec de l'acide sulfurique.
On introduit des cellules de R. rubra cultivées comme dans l'exemple 4 dans des béchers à chemise d'eau à agitateur à 30oC. On prélève suivant un horaire défini des échantillons dans lesquels on dose la L-phénylalanine par chromatographie en couche mince et par détermination de l'activité enzymatique de la L-amino acide oxydase. La solution de substrat A (contenant du chlorure d'ammonium) se révèle inhiber la phénylalanine ammonia lyase. Les cellules de la solution de substrat B produisent 10 fois plus de L-phénylalanine (après 24 heures de réaction) que les cellules de la solution de substrat A.
EXEMPLE 10
On applique le mode opératoire général de l'exemple 9 pour comparer l'acide phosphorique à l'acide sulfurique. Les cellules de R. rubra dans la solution de substrat dont le pH est ajusté au moyen d'acide phosphorique produisent 90% de la quantité de L-phénylalanine produite dans le substrat dont le pH est ajusté à l'acide sulfurique.
EXEMPLE 11
On applique le mode opératoire général de l'exemple 9 pour comparer l'acide acétique à l'acide sulfurique. La quantité de L-phénylalanine produite dans les réacteurs est la même.
EXEMPLE 12
On prépare des cellules suivant le mode opé- ratoire général de l'exemple 6. On utilise ces cellules pour étudier la possibilité de réutilisation (ou stabilité) des cellules entières. On prépare trois substrats contenant de l'acide t-cinnamique 60mM et de l'ammoniac 7,5mM, le pH étant amené à 10,0, à 9,0 et à 8,0 respectivement au moyen d'acide sulfurique.
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On introduit des cellules (4,5 g de pâte de cellules) dans chaque solution de substrat (45 ml) pour une durée de 16 heures à 300C. On évalue la concentration en L-phénylalanine par dosage de la L-amino acide oxydase et chromatographie en couche mince. On centrifuge les cellules, on les lave et on les introduit pour une durée de 16 heures dans de la solution de substrat fraîche.
Les résultats sont détaillés ci-après.
EMI11.1
<tb>
<tb> pH <SEP> Essai <SEP> I <SEP> Essai <SEP> II <SEP> Rétention
<tb> mg <SEP> de <SEP> L-PHE/ml <SEP> mg <SEP> de <SEP> L-PHE/ml <SEP> d'activité, <SEP> %
<tb> - <SEP> 8 <SEP> 0,22 <SEP> 0,12 <SEP> 55
<tb> 9 <SEP> 0,95 <SEP> 0,78 <SEP> 82
<tb> 10 <SEP> 2,02 <SEP> 0,43 <SEP> 21
<tb>
Ces résultats montrent que bien qu'à pH 10,0 l'activité initiale soit le double de celle observée à pH 9,0, les cellules manifestent après une opération à pH 9,0 une activité supérieure de 163% à celle atteinte à pH 10,0.
EXEMPLE 13
On exécute un essai de stabilité pendant 2 semaines comme dans l'exemple 12. Toutefois, le pH dans les réacteurs est ajusté à 8,75, à 9,00 et à 9,25 et la concentration en ammoniac est 5,5 M. On exécute l'essai de 14 jours avec 6 dosages consécutifs des cellules de R. rubra libres.
Les résultats sont rassemblés au tableau suivant.
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EMI12.1
<tb>
<tb> mg <SEP> de <SEP> L-phénylalanine <SEP> par <SEP> heure <SEP> et <SEP> par <SEP> g
<tb> de <SEP> cellules <SEP> en <SEP> poids <SEP> sec <SEP> (% <SEP> restant <SEP> de
<tb> l'activité <SEP> initiale)
<tb> pH <SEP> de <SEP> réaction
<tb> Jours <SEP> au <SEP> pH
<tb> indiqué <SEP> 8,75 <SEP> 9,00 <SEP> 9,25
<tb> 1 <SEP> 5,9 <SEP> 5,7 <SEP> 5,7
<tb> 7 <SEP> 3,6 <SEP> 3,8 <SEP> 4, <SEP> 2
<tb> (61) <SEP> (67) <SEP> (74)
<tb> 14 <SEP> 3,5 <SEP> 3,5 <SEP> 4,0
<tb> (59) <SEP> (61) <SEP> (70)
<tb>
Ces résultats montrent que les conditions appropriées permettent de réutiliser la phénylalanine ammonia lyase pour produire la L-phénylalanine et que la rétention d'activité est élevée pour les cellules libres.
EXEMPLE 14
On immobilise la pâte de cellules obtenue dans l'exemple 7 en appliquant le mode opératoire général de la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique n 400. 141. On pompe du substrat (acide cinnamique 80mM ; NH3 4,8mM ; pH 9,23) en sens ascendant dans une colonne garnie de cellules de R. rubra immobilisées.
Les débits sont de 0, 10, de 0,25 et de 0,50 volume
EMI12.2
spatial par heure à 220C et de 0, 25 et de 0, 50 volume spatial par heure à 28 C. On dose la L-phénylalanine dans l'effluent. Les résultats sont rassemblés au tableau suivant.
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EMI13.1
<tb>
<tb>
Temp. <SEP> Débit <SEP> L-PHE <SEP> Productivité
<tb> ( C) <SEP> (VS/h) <SEP> produite <SEP> (g/litre/h)
<tb> 0,10 <SEP> 5,4 <SEP> 0,54
<tb> 22 <SEP> 0,25 <SEP> 2,7 <SEP> 0,68
<tb> 0,50 <SEP> 2,1 <SEP> 1,05
<tb> 0,25 <SEP> 3,8 <SEP> 0,95
<tb> 28
<tb> 0, <SEP> 50 <SEP> 2,8 <SEP> 1,40
<tb>
A une vitesse spatiale de O, l/h, on atteint une conversion de 40% du substrat produisant 5,4 g de L-phénylalanine/litre à 22 C.
EXEMPLE 15
On applique les conditions de mise en culture et d'immobilisation de l'exemple 14. On fait fonctionner une colonne de cellules de R. rubra immobilisées contenant de la phénylalanine ammonia lyase pour déterminer la demi-vie de la productivité de la colonne dans certaines conditions. Le substrat est une solution d'acide cinnamique 75mM et de NH3 4, 5 M à pH 9,25 qu'on fait passer à 23 C au débit de 0,25 volume spatial par heure de manière ininterrompue. La demi-vie de la productivité est de 41 jours (voir Fig. 1). Cette expérience démontre que la phénylalanine ammonia lyase immobilisée peut être utilisée longtemps pour produire de manière ininterrompue de la L-phénylalanine.
EXEMPLE 16A
On prépare un milieu de fermentation comme dans l'exemple 5 et on l'utilise pour cultiver R. rubra
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dans un fermenteur de 10 litres. On réalise l'ensemencement du fermenteur comme dans l'exemple 3. On récolte périodiquement des échantillons des cellules dans le fermenteur. On détermine l'activité de phénylalanine ammonia lyase de ces cellules pour apprécier le moment le plus favorable pour la récolte. Il en ressort que dans les 6 heures après l'apparition du pic d'activité, il subsiste moins de 50% de l'activité maximale. On observe aussi que toute la D, L-phénylalanine a été épuisée dans le milieu avant que le pic d'activité soit atteint.
EXEMPLE 16B
On répète l'exemple 16A. Toutefois, juste après avoir atteint le pic d'activité, on introduit de la D, L-phénylalanine (5 g pour 10 litres) dans le fermenteur. On observe une baisse de l'activité de la phénylalanine ammonia lyase dans la première heure, comme dans l'exemple 16A. Toutefois, l'activité de phénylalanine ammonia lyase se stabilise au cours des 3 heures suivantes avant la récolte (voir Fig. 2).
EXEMPLE 17
On prépare des cellules et on les immobilise comme dans l'exemple 14. Toutefois, le substrat est une solution d'acide cinnamique 75mM et de NH3 4, 5 M de pH 9,43 débitée à23 C à raison de 0,50 volume spatial par heure. La colonne se révèle produire 1,9 g de L-phénylalanine par litre de volume de support du lit et par heure. La concentration en L-phénylalanine dans l'effluent est de 3,8 g/litre.
EXEMPLE 18
On prépare des cellules et on les immobilise suivant le mode opératoire général de l'exemple 14.
On tasse les cellules immobilisées dans une colonne dans laquelle on recycle 352 ml de substrat (acide cinnamique 75mM ; NH3 4, 5 M ; pH 9,4) au débit de 1,0 volume
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spatial par heure. On prélève des échantillons sur la masse de substrat à des moments programmés et on détermine la concentration en L-phénylalanine par dosage de l'activité de L-amino oxydase et par chromatographie en couche mince. Les résultats sont rassemblés au tableau suivant.
EMI15.1
<tb>
<tb>
Durée <SEP> de <SEP> recyclage <SEP> L-phénylalanine <SEP> Conversion
<tb> (heures) <SEP> (g/litre) <SEP> (%)
<tb> 7 <SEP> 2,8 <SEP> 23
<tb> 21,5 <SEP> 4,6 <SEP> 37
<tb> 24 <SEP> 5,0 <SEP> 40
<tb> 44, <SEP> 5 <SEP> 6,8 <SEP> 55
<tb>
Le présent exemple démontre que dans les conditions de la réaction, la L-phénylalanine peut être produite en concentrations élevées avec un taux de conversion important au moyen de cellules immobilisées contenant de la phénylalanine ammonia lyase.