CH642947A5

CH642947A5 - Procede de preparation enzymatique du l-tryptophane.

Info

Publication number: CH642947A5
Application number: CH332780A
Authority: CH
Inventors: Yoshiyuki Asai; Masao Shimada; Kenji Soda
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date: 1979-05-09
Filing date: 1980-04-30
Publication date: 1984-05-15
Also published as: IT8048605A0; FR2456140B1; MX6037E; AU5797980A; NL8002603A; US4335209A; CA1128443A; GB2048266A; FR2456140A1; DE3017861A1; IT1145337B; GB2048266B; AU530435B2; DE3017861C2

Description

La présente invention a pour objet un procédé de préparation enzymatique du L-tryptophane à partir d'indole et de sérine. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de préparation du L-tryptophane selon lequel on fait réagir l'indole avec la sérine en présence de synthétase du tryptophane ou de tryptophanase.

On connaît déjà de très bons procédés de préparation du L-tryp-tophane, en utilisant des enzymes, dans lesquels on prépare le tryptophane à partir d'indole et de sérine en mettant à profit l'effet de la synthétase du tryptophane ou de la tryptophanase. Par exemple, le procédé de préparation du L-tryptophane en mettant à profit l'action de la synthétase du tryptophane est décrit dans la revue «The Journal of Biological Chemistry», 249, pp. 7756-7763 (1974), et le procédé de préparation du L-tryptophane en utilisant un microorganisme producteur de tryptophanase est décrit dans la revue « Vi-taminologica et Enzymologica», 29, pp. 248-251 (1975).

L'indole, qui constitue l'une des matières premières utilisées dans ces procédés connus, est un composé qui peut être fabriqué de manière industrielle avec un prix de revient relativement bas. En ce qui concerne le procédé de préparation de la sérine, qui constitue l'autre matière première, on connaît un procédé d'extraction de protéines, un procédé par fermentation, un procédé enzymatique et un procédé de synthèse organique. Actuellement, la sérine est obtenue avec le prix de revient le plus bas au moyen du procédé par synthèse organique. Cependant, ce procédé de synthèse organique n'est pas satisfaisant, car la sérine obtenue selon ce procédé consiste en DL-

sérine. Seule la L-sérine est capable de subir l'action de la synthétase du tryptophane ou de la tryptophanase et la D-sérine est complètement insensible à l'action de ces enzymes. En conséquence, l'utilisation de la DL-sérine comme matière première pose un problème industriel.

Comme procédé enzymatique de synthèse du tryptophane à partir de l'indole et de sérine, en utilisant la DL-sérine comme matière première, on connaît un procédé décrit dans la revue « Agri-cultural and Biological Chemistry», 38, N° 7, pp. 1343-1349 (1974). Conformément à ce procédé, l'indole et la L-sérine sont transformés en L-tryptophane, la D-sérine n'ayant pas réagi est séparée et récupérée à partir du produit de réaction, puis elle est traitée à température élevée et sous forte pression, dans une solution aqueuse, de manière à provoquer sa racêmisation, et le produit de racémisation est utilisé comme substrat pour la réaction enzymatique. On effectue cette racémisation, par exemple, en traitant la D-sérine, sous forte pression et à une température élevée, telle que 160°C, pendant environ 4 h. En répétant en alternance la réaction enzymatique et la racémisation, on peut finalement transformer de manière pratiquement complète la DL-sérine en L-tryptophane. Toutefois, ce procédé présente certains inconvénients qui sont décrits ci-dessous:

1) Les conditions de racémisation sont beaucoup plus énergétiques que celles de la réaction enzymatique et, en conséquence, il est impossible d'effectuer les deux réactions simultanément.

2) Dans le cas où le L-tryptophane est présent au moment de la racémisation, non seulement la sérine mais également le L-trypto-phane subissent une racémisation et, en conséquence, il faut effectuer la racémisation après séparation complète du L-tryptophane.

3) Du fait que l'enzyme est désactivée dans les conditions de racémisation, il est nécessaire de séparer et de récupérer l'enzyme avant la racémisation afin de permettre d'utiliser l'enzyme de manière continue.

4) Un produit de réaction secondaire est formé lors du traitement thermique de racémisation, effectué sous pression, ce qui provoque la coloration du produit final et, par conséquent, il y a lieu d'effectuer une purification après la réaction.

5) Le traitement thermique de racémisation, effectué sous pression élevée, consomme une quantité importante d'énergie et, en outre, après racémisation, il est nécessaire de refroidir le mélange réactionnel liquide jusqu'à la température convenable pour la réaction enzymatique.

Il ressort des indications qui viennent d'être données que l'utilisation de la DL-sérine, obtenue par le procédé de synthèse organique, comme matière première pour la réaction enzymatique soulève d'importantes difficultés dont l'élimination permettrait d'effectuer de manière très avantageuse la synthèse du L-tryptophane.

La présente invention a donc pour but de fournir un procédé de préparation du L-tryptophane, par réaction de l'indole avec la L-sérine, en présence de la synthétase du tryptophane ou de tryptophanase, permettant d'utiliser judicieusement la DL-sérine ou la D-sérine pour la préparation du L-tryptophane.

L'invention a également pour but de fournir un procédé permettant la transformation de D-sérine en L-sérine sans effectuer un traitement à température élevée et sous forte pression, en vue de l'utilisation de ce dernier composé comme matière première pour la synthèse du L-tryptophane.

Un autre but de l'invention est de fournir un procédé avantageux permettant de transformer la DL-sérine ou la D-sérine en L-tryptophane tout en effectuant une racémisation, sans devoir effectuer, au cours d'opérations échelonnées, la racêmisation de la DL-sérine ou de la D-sérine et la transformation de la L-sérine ainsi obtenue en L-tryptophane.

L'invention a, en outre, pour but de fournir un procédé économique de préparation du L-tryptophane permettant une importante amélioration de la qualité du produit et dans lequel on peut effectuer la réaction de synthèse du L-tryptophane tout en réglant le degré de décomposition de la sérine.

A cet effet, le procédé selon l'invention selon lequel on fait réagir

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l'indole avec la L-sérine, en présence de la synthétase du tryptophane ou de tryptophanase, est caractérisé par le fait que l'on utilise, comme matière première, la DL-sérine ou la D-sérine et que l'on fait réagir ce composé de départ avec la racémase de la sérine, de façon à transformer au moins une partie de la D-sérine en L-sérine.

Ainsi, ce procédé consiste à faire réagir l'indole avec la L-sérine, en présence de synthétase du tryptophane ou de tryptophanase, en utilisant comme produit de départ l'indole et la DL-sérine ou la D-sérine, en présence d'une enzyme capable de provoquer la racémisation de la sérine, afin de transformer au moins une partie de la D-sérine en L-sérine.

Avantageusement, on met en œuvre ce procédé de façon telle que l'enzyme capable de provoquer la racémisation de la sérine se trouve présente, dans le système réactionnel, en même temps que la synthétase du tryptophane ou la tryptophanase, et qu'au moins une partie de la D-sérine soit transformée en DL-sérine.

Lors de la mise en œuvre de ce procédé, il est possible d'améliorer de manière importante la qualité du L-tryptophane obtenu en effectuant la fixation de la synthétase ou de la tryptophanase et/ou de l'enzyme permettant la racémisation de la sérine et en effectuant la réaction en présence d'ions ammonium. Cela permet également la préparation du L-tryptophane de manière particulièrement avantageuse du point de vue économique tout en réglant le processus de décomposition de la sérine.

Dans la description qui va suivre, on désignera l'enzyme capable de provoquer la racémisation de la sérine par le terme de racémase de la sérine. Comme micro-organisme capable de produire la racémase de la sérine, on peut utiliser, par exemple, l'un des micro-orga-nismes suivants: Pseudomonas putida IFO 12996, Brevibacterium leu-cinophagum MT-10072, Pseudomonas desmolytica MT-10170, Pseudomonas fragi MT-10173 et Pseudomonas taetorolens MT-10186.

Parmi ces micro-organismes capables de produire la racémase de la sérine, le Pseudomonas putida IFO 2996 est une souche qui a été d'abord identifiée en tant que Pseudomonas striata. Les propriétés de cette souche, la marche à suivre en vue de l'extraction de la racémase à partir d'une culture de cellules de cette souche ainsi que les propriétés de la racémase ainsi extraite sont décrites dans la publication suivante «Agricultural and Biological Chemistry», 31, N° 9, pp. 10097-10099 (1967), ibid., 33, N° 3, pp. 424-429 (1969), ibid., 33, N° 3, pp. 430-435 (1969), «Biochemical and Biophysical Research Communications», 35, N° 3, pp. 363-368 (1969), et dans la thèse de doctorat intitulée «Studies on Amino Acid of Racemase of Pseudomonas striata» (études concernant l'acide aminé de la racémase de Pseudomonas striata), soutenue par M. Takaharu Osumi à la Faculté d'agriculture de l'Université de Kyoto (Japon). La publication japonaise qui vient d'être mentionnée indique que cette racémase est appelée racémase d'acide aminé à faible spécificité de substrat et que 20 sortes d'acides aminés, comprenant la lysine, l'e-N-acétyllysine et la sérine peuvent constituer des substrats pour cette racémase, alors que 13 sortes d'acides aminés, comprenant l'a-N-acétyllysine, ne peuvent pas constituer des substrats pour cette racémase. Il est également indiqué que, lorsque la sérine est utilisée comme substrat pour cette racémase, l'activité relative de la sérine est de 8,7, valeur bien inférieure à celle de l'activité relative (100) de la lysine ou de l'e-N-acetyllysine. Cependant, le comportement de cette racémase à l'égard du tryptophane n'a pas été décrit.

Des recherches effectuées sur les propriétés de cette racémase à faible spécificité de substrat ont permis de découvrir que cette racémase ne provoque pas la racémisation du tryptophane, qu'elle ne subit pas une inhibition enzymatique de la part du L-tryptophane, qu'elle agit efficacement, dans des conditions optimales de température de réaction et de pH, pour la préparation du L-tryptophane à partir de l'indole et de la L-sérine, en présence de synthétase de tryptophane ou de tryptophanase, et qu'elle a des propriétés appropriées à la synthèse du L-tryptophane. En se fondant sur cette découverte, on a recherché des micro-organismes capables de produire la racémase de la sérine, ce qui a permis de trouver les souches mentionnées plus haut.

L'extraction de racémase d'aminoacide à faible spécificité de substrat à partir de Pseudomonas putida IFO 12996, l'une des souches productrices de racémase de la sérine, peut être effectuée, par exemple, par un procédé comprenant les 6 opérations suivantes:

1) extraction du produit brut,

2) précipitation par le sulfate d'ammonium,

3) première Chromatographie effectuée en utilisant la diéthylami-noéthylcellulose,

4) deuxième opération de Chromatographie au moyen de di-éthylaminoéthylcellulose,

5) Chromatographie au moyen de Sephadex G-200 (marque désignant un produit de la société Pharmacy Fine Chemicals Co.), et

6) cristallisation.

Le procédé d'extraction et de purification est décrit en détail dans la publication «Biochemical and Biophysical Research Communications», 35, N° 3, pp. 363-368 (1969).

Comme souche productrice de synthétase de tryptophane on peut utiliser, par exemple, l'une des souches suivantes: Escherichia coli MT-10231, Escherichia coli MT-10232, Escherichia coli MT-10238 et Neurospora crassa ATCC 14962. Le procédé d'extraction de la synthétase du tryptophane à partir de cellules cultivées $ Escherichia coli est décrit dans la publication «The Journal of Bioche-mistry», 252, N° 19, pp. 6594-6599 (1977) et le procédé d'extraction de synthétase du tryptophane à partir de cellules cultivées de Neurospora crassa est décrit dans la publication «The Journal of Biological Chemistry», 250, N° 8, pp. 2941-2946 (1975).

Comme souche capable de produire la tryptophanase qui est utilisée pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention, on peut mentionner, par exemple, les suivantes: Proteus vulgaris IFO 3167, Escherichia coli IAM 1268, Aerobacter aerogenes IFO 12019, Klebsiella pneumoniae ATCC 8274 et Bacillus alvei ATCC 6348. Le procédé d'extraction de la tryptophanase à partir des cellules de culture est décrit dans la publication «Amino Acid and Nucleic Acid», N° 31, pp. 102-112 (1975). On peut utiliser comme agent réactif de la tryptophanase que l'on trouve dans le commerce.

On peut employer, pour la culture des souches productrices de synthétase de tryptophane, de tryptophanase ou de racémase de sérine, n'importe quel milieu de culture synthétique ou naturel à condition qu'il contienne une source de carbone, une source d'azote, une substance minérale et, si nécessaire, une petite quantité d'agent nutritif. Lors de la culture de la souche productrice de la synthétase du tryptophane, il est généralement nécessaire d'ajouter une petite quantité de tryptophane, d'acide anthranilique ou d'indole au milieu de culture. Lors de la culture de la souche productrice de tryptophanase, on peut obtenir des cellules de culture ayant une activité élevée en tryptophanase grâce à l'adjonction de tryptophane en quantité de l'ordre de 0,1 à environ 0,5% en poids au milieu de culture, du fait que la tryptophanase est une enzyme inductrice. On peut employer n'importe laquelle des sources de carbone et d'azote qui peuvent être utilisées par la souche de micro-organisme. Par exemple, comme source de carbone, on peut utiliser des hydrates de carbone tels que le glucose, le glycérol, le fructose, le sucrose, le maltose, le mannose, l'amidon, l'amidon hydrolysé et la mélasse. Comme source d'azote, on peut utiliser, par exemple, divers sels d'ammonium organiques et minéraux tels que l'ammoniaque, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le carbonate d'ammonium et l'acétate d'ammonium, et des sources naturelles d'azote organique telles que des extraits de viande, des extraits de levure, des liqueurs de macération de grains de céréales, de la caséine hydrolysée, de la farine de poisson, de la farine de poisson ayant subi un traitement à l'autoclave, du soja dégraissé et du soja dégraissé traité en autoclave. La plupart des sources naturelles d'azote organique peuvent agir non seulement comme source d'azote, mais également comme source de carbone. On peut obtenir de bons résultats grâce à l'utilisation, suivant les besoins, de substances minérales telles que le dihydrophosphate de potassium, le phosphate monohydrodipotassique, le chlorure de potassium, le chlorure de sodium, le sulfate de magnésium et le sulfate ferreux.

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La culture du micro-organisme est effectuée dans des conditions aérobies, selon le procédé de culture sous agitation ou le procédé de culture sous agitation en milieu submergé et aéré. La température de culture est comprise dans le domaine de 20 à 50° C. De préférence, il y a lieu de maintenir le pH du milieu de culture à une valeur neutre ou faiblement alcaline au cours de la culture. Habituellement la durée de culture est de 1 à 7 d.

On peut utiliser la synthétase de tryptophane, la tryptophanase et la racémase de la sérine obtenues par culture selon l'une des manières mentionnées ci-dessus, sous la forme de cellules vivantes prélevées dans le milieu de culture de la souche productrice d'enzyme, sous forme de cellules séchées, sous forme de cellules traitées obtenues en soumettant les cellules à un traitement de pulvérisation, d'autolyse ou un traitement par ultrasons, sous forme d'extraits de ces cellules, sous forme d'enzymes brutes obtenues à partir de tels extraits ou sous forme d'enzymes pures. On peut également utiliser les enzymes décrites ci-dessus après les avoir fixées selon les procédés connus habituellement utilisés pour la fixation d'enzymes, par exemple le procédé de liaison sur un substrat porteur, le procédé de réticulation et le procédé d'inclusion. Dans le procédé de liaison avec un substrat porteur, on effectue la liaison de l'enzyme avec un substrat porteur tel qu'un polymère naturel, un dérivé d'un tel polymère, un polymère synthétique ou une substance minérale en utilisant un procédé de liaison par liaisons covalentes, tel que le procédé de formation de liaisons diazo, le procédé de formation de peptide, le procédé par alkylation ou par acylation, le procédé de liaison ionique, le procédé par adsorption biologique ou le procédé d'ad-sorption utilisant l'affinité biochimique. Dans le procédé de liaison par réticulation, on fixe l'enzyme en utilisant un agent bifonctionnel. En ce qui concerne la méthode de fixation par inclusion, on peut utiliser le procédé dit de réseau dans lequel on inclut une molécule de l'enzyme vivante dans un gel formé par polymérisation d'acrylamide ou d'une substance du même genre, et le procédé dit de microencap-sulation, dans lequel on enferme l'enzyme dans une microcapsule constituée par une membrane semi-perméable en polymère naturel ou synthétique.

Lors de la mise en œuvre du procédé selon l'invention, on choisit de manière appropriée ces procédés de fixation d'enzymes conformément aux divers modes de réaction qui seront décrits ci-dessous.

Cependant, en général, on utilise fréquemment, à titre de méthode préférée, la méthode de fixation par inclusion au moyen d'un monomère du type acrylamide. Comme monomère du type acrylamide, on peut utiliser, par exemple, I'acrylamide, le N-N'-méthylènebisacrylamide et l'éther méthylique du diacrylamide. On effectue la polymérisation de ce monomère en présence d'un initiateur de polymérisation tel que le persulfate de potassium, le persul-fate d'ammonium, la vitamine B, ou le bleu de méthylène et d'un promoteur de polymérisation tel que le p-(diméthylamino)propioni-trile ou la N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine.

On peut effectuer de manière particulièrement avantageuse la préparation du L-tryptophane en fixant la synthétase du tryptophane ou la tryptophanase et/ou la racémase de la sérine selon l'un des procédés de fixation qui viennent d'être mentionnés et en utilisant ces enzymes à l'état fixé pour effectuer la réaction. Plus particulièrement, du fait que le L-tryptophane formé par le procédé enzymatique contient inévitablement des impuretés telles que les cellules et les matières utilisées pour effectuer la culture des diverses protéines, il est pratiquement impossible d'obtenir du L-tryptophane ayant une pureté élevée. En outre, étant donné qu'il est relativement difficile de séparer l'enzyme du L-tryptophane formé, il est difficile d'utiliser l'enzyme de manière répétée. Au contraire, si l'on utilise l'enzyme à l'état fixé, on peut très bien régler l'élution des impuretés provenant de l'enzyme dans la solution aqueuse du L-tryptophane obtenu et, par conséquent, on peut notablement augmenter la pureté du L-tryptophane ainsi obtenu. En outre, cela rend possible l'utilisation de l'enzyme de manière répétée et améliore notablement la liberté du choix des conditions opératoires du procédé de préparation du L-tryptophane.

Comme moyen spécifique pour transformer au moins une partie de la D-sérine en L-sérine, sous l'effet de la racémase de la sérine, et pour préparer le L-tryptophane en utilisant l'indole et la DL-sérine ou la D-sérine comme matière première, conformément au procédé selon l'invention, on utilise la réaction de transformation de la L-sérine en L-tryptophane sous l'effet de la synthétase du tryptophane ou de la tryptophanase et la réaction de racémisation de la sérine sous l'effet de la racémase de la sérine. On peut effectuer ces deux réactions simultanément dans une seule enceinte réactionnelle ou de manière indépendante dans des enceintes réactionnelles différentes. Toutefois, le procédé selon lequel la racémase de la sérine est mise en présence de la synthétase du tryptophane ou de la tryptophanase et le L-tryptophane est préparé en une seule opération est avantageux du point de vue économique, et il permet la simplification de la manière selon laquelle on effectue la réaction. Lorsque l'on utilise la DL-sérine en adoptant ce procédé, il est possible de transformer la DL-sérine de départ en L-tryptophane, avec un rendement élevé, au moyen d'un appareillage simple, car la L-sérine est transformée en L-tryptophane en même temps que la D-sérine est successivement racémisée en DL-sérine et transformée en L-tryptophane. En outre, lorsqu'on utilise la D-sérine, la transformation s'accomplit essentiellement de la même manière que dans le cas où l'on utilise la DL-sérine, car la transformation en L-tryptophane évolue simultanément avec la réaction de racêmisation.

Comme décrit ci-dessus, lors de la mise en œuvre du procédé selon l'invention, les réactions de transformation en L-tryptophane et de racémisation de la sérine peuvent être effectuées soit de manière indépendante l'une de l'autre, soit simultanément. Lorsque l'on utilise l'enzyme à l'état fixé, on peut choisir de manière appropriée les procédés de fixation en fonction des modes de réaction indiqués ci-dessus. Plus particulièrement, on peut adopter un procédé selon lequel seule la synthétase du tryptophane ou la tryptophanase est fixée, ou bien un procédé selon lequel la synthétase du tryptophane ou la tryptophanase et la racémase de la sérine sont fixées et l'on peut combiner ces deux procédés avec ceux qui ont été décrits plus haut, dans lesquels les deux enzymes agissent séparément ou simultanément. En outre, on peut adopter un procédé selon lequel on utilise les deux enzymes fixées en combinaison ou séparément ou bien un procédé de traitement par lots ou encore un procédé de réaction en continu dans lequel on utilise une colonne ou un appareillage du même genre.

On peut modifier de manière appropriée les concentrations d'enzymes, les quantités de substrat telles que l'indole, la DL-sérine et la D-sérine ainsi que la quantité d'enzymes fixées sur les supports, en fonction du choix des modes de réaction indiqués plus haut.

Les quantités de substrat telles que l'indole, la DL-sérine et la D-sérine, présentes dans le système réactionnel ainsi que le rapport de la quantité d'indole à la quantité de DL-sérine et de D-sérine ne sont pas particulièrement critiques. Cependant, on choisit habituellement une concentration de substrat dans le liquide comprise dans la gamme de 0,01 à 20% en poids et on fixe les rapports des quantités de substrat dans les limites indiquées ci-dessus. Toutefois, il est habituellement préférable que la concentration en indole en solution dans le liquide réactionnel soit inférieure à 500 ppm, plus particulièrement de l'ordre de 100 ppm. En conséquence, lorsque l'on désire accumuler le L-tryptophane à une concentration élevée, on adopte souvent une manière de procéder selon laquelle on ajoute l'indole progressivement et de manière continue de façon que sa concentration n'augmente pas à un moment donné. Dans le cas où l'on n'a pas recours à cette manière de procéder par adjonction continue, on peut élever à environ 10% en poids la concentration en indole dissous en incorporant un agent tensio-actif, par exemple le Triton X-100 (marque désignant un agent tensio-actif non ionique appartenant à la famille des éthers polyoxyéthylène-alkylphénols, fabriqué et mis dans le commerce par la société Wako Junyaku Kogyo) dans le milieu réactionnel. De préférence, la quantité de cet agent tensio-actif ajoutée à la solution aqueuse est de 1 à 10% en poids, plus particulièrement de l'ordre de 5% en poids, bien que l'on puisse faire

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varier dans une certaine mesure cette quantité en fonction de la concentration en indole. La solubilité de la DL-sérine dans la solution aqueuse est de l'ordre de 6% en poids à 30° C et la solubilité de la D-sérine ou de la L-sérine dans cette solution est d'environ 25% en poids à 30° C. Toutefois, il est à remarquer que, lorsque la concentration de sérine dans la solution aqueuse est au plus de 10% en poids, la vitesse de réaction augmente avec cette concentration.

On peut modifier les quantités de synthétase de tryptophane, de tryptophanase et de racémase de sérine présentes dans le système réactionnel, en fonction des procédés de séparation, purification et traitement d'enzyme adoptés parmi ceux qui ont été décrits plus haut, mais ces quantités ne sont pas particulièrement critiques et elles peuvent être choisies de manière appropriée en fonction des rapports des quantités de substrat désirées, de l'activité des enzymes et des autres paramètres. Toutefois? si la quantité de racémase de sérine est nettement inférieure à la quantité de synthétase de tryptophane ou de tryptophanase, la quantité de L-sérine dans le liquide réactionnel est faible et la vitesse de réaction est basse. D'autre part, si la quantité de synthétase de tryptophane ou de tryptophanase est nettement inférieure à la quantité de racémase de la sérine, le rapport de la quantité de D-sérine à celle de L-sérine est de l'ordre de 1, mais la vitesse de formation du L-tryptophane prend une faible valeur. En conséquence, il convient de choisir de manière appropriée les concentrations de synthétase de tryptophane ou de tryptophanase ainsi que le rapport des quantités de ces enzymes en fonction des conditions choisies pour la formation du L-tryptophane.

Lors de la mise en œuvre du procédé selon l'invention, il est possible d'ajouter de nouvelles quantités de substrat au fur et à mesure de l'avancement de la réaction. En outre, on peut prélever du milieu réactionnel une partie ou la totalité du L-tryptophane formé au fur et à mesure de l'avancement de la réaction. On peut incorporer, dans le liquide réactionnel, en plus des substrats, une petite quantité de pyridoxalphosphate, qui est un coenzyme, cette quantité correspondant, par exemple, à une concentration de 1 à 100 ppm.

Lorsque l'on utilise la synthétase du tryptophane ou la tryptophanase sous forme de cellules cultivées, contenant l'enzyme, ou de micro-organisme producteur d'enzyme, on incorpore dans le milieu réactionnel des ions ammonium capables d'inhiber la décomposition de la L-sérine et/ou de la D-sérine, car ces cellules ou ces extraits de cellules contiennent habituellement une enzyme susceptible de provoquer une telle décomposition.

On connaît différentes réactions enzymatiques dans lesquelles on utilise la sérine comme produit entrant en réaction. Toutefois, la décomposition de la sérine dans les systèmes réactionnels ou l'inhibition de cette décomposition ne sont décrites dans aucune publication. On peut l'expliquer par le fait que l'on observe pratiquement pas de décomposition, ou tout au plus une décomposition négligeable, lors de ces réactions, lorsque l'on utilise des enzymes pures. Toutefois, lorsque l'on utilise comme enzyme des cellules provenant de cultures de micro-organismes ou des extraits de telles cellules, la décomposition de la sérine n'est plus négligeable.

Des recherches effectuées en vue de la mise au point d'un procédé dans lequel la décomposition de la L-sérine et/ou de la D-sérine par des cellules provenant de cultures de micro-organismes ou par des extraits de telles cellules est efficacement inhibée ont permis de découvrir que, si le milieu réactionnel contient des ions ammonium, la décomposition de la sérine peut être inhibée de manière efficace. La concentration en ions ammonium que l'on introduit dans une solution aqueuse contenant de la sérine varie selon la température et le pH de la solution aqueuse ainsi que les propriétés des enzymes utilisées pour la réaction. Il est donc impossible de définir cette concentration de manière simple. Toutefois, la concentration en ions ammonium est habituellement de 0,01 à 2 mol/1 de solution aqueuse et, de préférence, de 0,1 à 2 mol/1 de solution. Une concentration plus élevée en ions ammonium est indiquée en vue de l'inhibition de la décomposition de la sérine. Toutefois, si la concentration en ions ammonium est trop élevée, la réaction désirée est elle-même inhibée ou la séparation des produits de la réaction désirée du liquide réactionnel devient très difficile. En conséquence, il y a lieu de maintenir la concentration en ions ammonium à une valeur basse comprise dans le domaine de concentration permettant l'inhibition de la décomposition de la sérine. C'est pourquoi on fixe la limite supérieure de la concentration en ions ammonium à une valeur de 2 mol/1 de solution aqueuse et on règle habituellement cette concentration à une valeur de 0,1 à 0,5 mol/1 de solution aqueuse. Du point de vue industriel, le fait que la décomposition de la sérine puisse être efficacement inhibée avec des valeurs aussi faibles de la concentration en ions ammonium est très avantageux. Comme composé permettant l'obtention d'ions ammonium dans le système réactionnel, on peut utiliser n'importe quel composé fournissant des ions ammonium en solution aqueuse. Par exemple, on peut utiliser divers sels d'ammonium minéraux et organiques, tels que le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le carbonate d'ammonium et l'acétate d'ammonium, ainsi que l'ammoniaque.

La température de réaction pour la formation du L-tryptophane en utilisant la synthétase du tryptophane ou la tryptophanase et la racémase de la sérine est habituellement de 20 à 60° C et, de préférence, de 30 à 45° C. La valeur du pH adopté pour cette réaction est habituellement de 6,0 à 11,0 et, plus particulièrement, de 7,5 à 9,0. On règle de manière appropriée ces conditions de réaction selon la manière de procéder adoptée, par exemple la manière de procéder selon laquelle on fait passer les substrats à travers une suspension ou un lit fixe de synthétase de tryptophane ou de tryptophanase fixée et de racémase de sérine fixée, la manière de procéder selon laquelle on fait passer la synthétase de tryptophane ou la tryptophanase et les substrats à travers un lit fixe de racémase de sérine fixée, et la manière de procéder selon laquelle on fait passer la racémase de sérine et les substrats à travers un lit fixe de synthétase de tryptophane ou de tryptophanase fixée.

On peut facilement isoler du liquide réactionnel le L-tryptophane formé au moyen d'un traitement d'absorption-désorption en utilisant une résine échangeuse d'ions, du charbon actif ou une substance du même genre. Plus particulièrement, dans le cas où le L-tryptophane précipite sous forme de cristaux dans le liquide réactionnel, on ajoute de l'eau pour provoquer la dissolution des cristaux, on enlève du liquide réactionnel, par centrifugation ou filtra-tion, les substances insolubles telles que les cellules de micro-orga-nisme et on récupère habituellement le L-tryptophane selon l'une des manières de procéder suivantes:

1) une manière de procéder selon laquelle on ajuste la valeur du pH du liquide réactionnel au point isoélectrique, de manière à précipiter le L-tryptophane, et on récupère le L-tryptophane ainsi précipité,

2) une manière de procéder selon laquelle on adsorbe le L-tryp-tophane en utilisant une résine échangeuse d'ions et l'on provoque ensuite la désorption du L-tryptophane de cette résine,

3) une manière de procéder selon laquelle on précipite le L-tryp-tophane sous la forme d'un sel métallique peu soluble et on récupère le sel métallique précipité,

4) une manière de procéder selon laquelle on ajoute au filtrat un solvant organique soluble dans l'eau, de manière à provoquer la cristallisation, et l'on récupère les cristaux ainsi obtenus, et

5) une manière de procéder selon laquelle on soumet le filtrat à une électrodialyse et on récupère le L-tryptophane ainsi séparé.

On va maintenant donner, à titre non limitatif, des exemples de mise en œuvre du procédé selon l'invention.

Dans ces exemples, on a effectué la confirmation qualitative de la formation du L-tryptophane d'après la valeur du Rf du L-trypto-phane sur Chromatographie sur papier, les valeurs de l'absorption ultraviolette et le test de coloration effectué au moyen du réactif de Ehrlich. Les résultats d'analyse quantitative sont fondés sur les valeurs d'absorption de l'extrait de la tache sur le chromatogramme sur papier à 280 m(i et conformément à l'essai biologique. Dans ces exemples, tous les pourcentages indiqués sont en poids.

5

10

îs

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

642 947

6

Exemple 1:

On inocule une quantité $ Escherichia coli MT-10231 correspondant à la quantité fixée par une boucle de platine, dans un milieu de culture ayant la composition I indiquée plus bas et l'on effectue la culture sous agitation, à 30° C, pendant 20 h.

Composition du milieu de culture I:

Extrait de viande 1,0%

Peptone 0,5%

Extrait de levure 0,1%

KH2P04 0,2% pH initial 7,0

Ensuite, on soumet 11 du milieu de culture à une séparation par centrifugation, de manière à recueillir les cellules et l'on utilise les cellules ainsi recueillies comme source d'enzyme contenant la synthétase de tryptophane.

On inocule une quantité de Pseudomonas putida IFO 12996 correspondant au contenu d'une boucle de platine dans 50 ml de milieu de culture ayant la composition II indiquée ci-dessous et on soumet 11 de liquide de culture à une séparation par centrifugation de façon à recueillir les cellules. Les cellules ainsi recueillies sont utilisées comme source d'enzyme contenant la racémase de la sérine. Composition du milieu de culture II:

Extrait de viande 1,0%

Peptone 1,0%

NaCl 0,5%

Dans 50 g de Triton X-100, on dissout 20 g d'indole et 36 g de DL-sérine, 1 g de Na2S03) 100 mg de pyridoxalphosphate et on ajoute à cette solution les deux sortes de cellules mentionnées ci-dessus recueillies par centrifugation, de façon que le volume total soit de 11. On provoque la réaction en agitant le liquide réactionnel, pendant 72 h, en maintenant sa température à 30° C et son pH à 8,5. On obtient ainsi la formation de 28,5 g de L-tryptophane qui s'accumule dans le liquide réactionnel (ce qui correspond à un rendement de 41 % fondé sur la sérine).

A titre de comparaison, on effectue la réaction de la même manière que celle qui vient d'être décrite, mais sans ajouter les cellules obtenues par culture de la souche de micro-organisme productrice de racémase de la sérine. Au bout du temps de réaction, la quantité de L-sérine accumulée est de 23,5 g (ce qui correspond à un rendement de 34% fondé sur la sérine), ce qui correspond donc à une quantité de L-tryptophane accumulé inférieure de 5,0 g à celle que l'on obtient dans le cas où l'on utilise les deux enzymes, c'est-à-dire la racémase de la sérine et la synthétase du tryptophane, lors de la réaction.

Exemple 2:

On procède de la même façon que dans l'exemple 1, mais en utilisant Y Escherichia coli MT-10238 au lieu de Y Escherichia coli MT-10231. On obtient une quantité de 27,8 g de L-tryptophane accumulé dans le liquide réactionnel (ce qui correspond à un rendement de 40% fondé sur la sérine). Dans un essai comparatif dans lequel on n'a pas utilisé de racémase de la sérine, on n'observe aucune accumulation de L-tryptophane.

Exemple 3:

On procède de la même façon que dans l'exemple 1, mais en utilisant, au lieu de V Escherichia coli MT-10231, Y Aerobacter aerogenes IFO 3317, qui est une souche de micro-organisme productrice de tryptophanase, et en utilisant un milieu de culture ayant la composition III indiquée ci-dessous au lieu du milieu de culture ayant la composition I. On observe l'accumulation de 22,2 g de L-tryptophane dans le liquide réactionnel. Dans un essai comparatif dans lequel on n'a pas ajouté de racémase de la sérine, la quantité de L-tryptophane accumulée était de 19,3 g (ce qui correspond à un rendement de 28% fondé sur la sérine).

Composition du milieu de culture III:

L-tryptophane 0,2%

KH2P04 0,5%

MgS047H20 0,05%

Liqueur de macération de grain de céréales 6,00%

Casaminoacide 2,0% pH initial 8,0

Exemple 4:

On met en suspension, séparément, dans de l'eau pure, des cellules obtenues par culture de souche de micro-organisme productrice de synthétase de tryptophane et des cellules obtenues par culture de souche de micro-organisme productrice de racémase de la sérine, séparées de la manière décrite dans l'exemple 1, de manière à former 100 ml de chacune des deux suspeiîsions. On mélange chacune de ces suspensions avec 15 g d'acrylamide, 1 g de N,N'-méthyIènebisacryla-mide, 15 ml d'une solution de p-(diméthylamino)propionitrile à 4% et 10 ml d'une solution de persulfate de potassium à 2%, et on laisse reposer le mélange, à la température ambiante, pendant 15 min. On pulvérise le produit de réaction et on le lave à l'eau pure. On obtient ainsi 150 g de chacune des enzymes à l'état fixé.

On ajoute ensuite, à de l'eau, 150 g de chacune des enzymes fixées, 1,0 g d'indole, 2,0 g de DL-sérine, 1 g de sulfate de sodium et 100 mg de pyridoxalphosphate de façon que le volume total soit de 11. On effectue la réaction en agitant le liquide réactionnel à 30° C, pendant 72 h. On observe l'accumulation de 1,4 g de L-tryptophane dans le liquide réactionnel (ce qui correspond à un rendement de 29% fondé sur la sérine).

Après la réaction, on sépare les enzymes fixées du liquide réactionnel, on sépare le L-tryptophane formé du liquide résiduel et, simultanément, on ajoute aux enzymes fixées séparées une solution de substrat contenant de l'indole, de la DL-sérine et d'autres additifs en solution. On répète la réaction en procédant de la même façon que celle qui est décrite ci-dessus. La quantité de L-tryptophane formée ne diminue pratiquement pas, même après l'utilisation répétitive, à 30 reprises, des enzymes fixées, de la manière qui vient d'être décrite.

Il est à remarquer que la séparation par filtration des enzymes fixées était très facile à effectuer.

A titre comparatif, on effectue la réaction de la même façon que celle indiquée ci-dessus, mais sans utiliser les cellules obtenues par culture de la souche de micro-organisme productrice de racémase de la sérine. Après la réaction effectuée de cette manière, la quantité de L-tryptophane accumulé dans le liquide réactionnel était seulement de 0,94 g (ce qui correspond à un rendement de 24% fondé sur la sérine).

ExempleS:

On procède de la même façon que dans l'exemple 4 mais en utilisant, au lieu de Y Escherichia coli MT-10231, Y Aerobacter aerogenes IFO 3317, qui est une souche de micro-organisme productrice de tryptophanase, et le milieu de culture ayant la composition III. On observe l'accumulation de 0,89 g de L-tryptophane (ce qui correspond à un rendement de 23% fondé sur la sérine). Dans un essai de la sérine, la quantité de L-tryptophane accumulé était de 0,77 g (ce qui correspond à un rendement de 20% fondé sur la sérine).

Exemple de référence 1:

On effectue la culture de Y Escherichia coli W à 30° C et à un pH de 7,2, avec un taux d'aération de 101/min, pendant 21,5 h, dans une cuve de fermentation ayant une capacité de 201 chargée de 101 de milieu de culture ayant la composition indiquée ci-dessous. On obtient ainsi 315 g de cellules ayant une teneur en eau de 80%. Composition du milieu de culture:

Glucose 2,00%

(NH4)2S04 0,50%

KH2P04 0,10%

MgS04 0,05%

Indole 0,01%

Casaminoacide 0,025%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

642 947

Ensuite, on introduit 0,16 g des cellules ainsi obtenues dans un tube à essai contenant un liquide de réaction ayant la composition indiquée ci-dessous et l'on agite le mélange à 30° C.

Composition du liquide de réaction:

L-sérine 1,91%

Na2S03 0,10%

Pyridoxalphosphate 0,01 %

(NH4)2S04 0 à 2,46% (variable)

Au bout d'une durée de réaction de 48 h, on analyse la teneur en L-sérine par Chromatographie liquide à grande vitesse, ce qui permet d'obtenir les résultats indiqués au tableau 1.

Tableau 1

Essai 1

Essai 2

Essai 3

Essai 4

Concentration

(NH4)2S04 (%)

0

0,165

1,23

2,46

Concentration en ions

ammonium (mol/1)

0

0,10

0,19

0,37

Concentration en L-

sérine (g/1)

3,8

8,5

15,4

19,1

Taux de décomposi

tion de la L-sérine

(%)

79,3

55,5

19,4

0

Essai 1

Essai 2

Essai 3

Concentration en NH4C1 (%)

0

0,1

2,0

Concentration en ions ammo

nium (mol/1)

0

0,02

0,37

Concentration en D-sérine (g/1)

1,2

11,5

17,9

Taux de décomposition de la D-

sérine (%)

94,0

43,3

11,8

Les résultats indiqués ci-dessus indiquent que non seulement la L-sérine mais également la D-sérine sont décomposées et que le taux de décomposition de la D-sérine diminue lorsque la concentration en ions ammonium augmente.

Exemple de référence 3:

On inocule le Pseudomonas putida IFO 12996 dans 150 ml de milieu de culture ayant la composition indiquée ci-dessous, que l'on introduit dans un ballon de Sakaguchi ayant une capacité de 500 ml et l'on effectue la culture sous agitation à 30° C pendant 24 h. Composition du milieu de culture:

Extrait de viande 0,3%

5 Polypeptone 0,5%

Glucose 3,0% PH 7,0

Après culture, on recueille les cellules par centrifugation. On examine l'effet de la concentration en ions ammonium sur la décom-îo position de la sérine en utilisant les cellules ainsi obtenues en quantité correspondant à 20 ml du milieu de culture. On effectue l'expérience séparément sur la L-sérine et la D-sérine.

Les résultats obtenus sont indiqués au tableau 3.

15 Tableau 3

Essai 1

Essai 2

Essai 3

Concentration en NH4C1 (%)

0

0,5

2,0

Concentration en ions

ammonium (mol/1)

0

0,10

0,38

Concentration en L-sérine1 (g/1)

0

13,3

18,9

Taux de décomposition de la L-

sérine (%)

100

30,0

0

Concentration en D-sérine2 (g/1)

3,8

8,7

17,5

Taux de décomposition de la D-

sérine (%)

81,3

57,1

13,8

Remarques:

30

1 La concentration initiale en L-sérine était de 19,0 g/1.

2 La concentration initiale en D-sérine était de 20,3 g/1.

Exemple 6:

35 On incorpore 31,5 g de cellules humides obtenues comme indiqué dans l'exemple de référence 1 dans 11 de liquide de réaction ayant la composition indiquée ci-dessous et on effectue la réaction à 35° C pendant 10 h. On analyse le tryptophane obtenu et la L-sérine par Chromatographie liquide à grande vitesse.

40 Composition du liquide de réaction:

Indole 2,0%

L-sérine 3,0%

Na2S03 0,10%

Pyridoxalphosphate 0,01 %

45 (NH4)2S04 0 ou 2,5% Concentration en ions ammonium 0 ou 0,19 mol/1

On ajoute l'indole de manière progressive pendant une durée de 10 h tout en effectuant la réaction.

Après une durée de réaction de 10 h, on détermine les quantités 50 de L-tryptophane et de L-sérine dans le liquide de réaction, ce qui permet d'obtenir les résultats indiqués au tableau 4.

Tableau 4

55

L-tryptophane

L-sérine résiduelle

formé (%)

(%)

(NH4)2S04 non ajouté

2,51

moins de 0,1

60

2,5% (NH4)2S04 ajouté

3,49

1,18

Les résultats indiqués ci-dessus montrent que, lorsque l'on ajoute 2,5% de (NH4)2S04, il se forme du L-tryptophane avec un rendement de 100% fondé sur la quantité d'indole ajoutée, la L-sérine ré-65 siduelle n'étant pratiquement pas décomposée. Au contraire, si l'on n'ajoute pas de sulfate d'ammonium, le rendement en L-tryptophane est faible et la L-sérine résiduelle est notablement décomposée.

Comme on le voit d'après les résultats indiqués ci-dessus, lorsque la concentration en ions ammonium était de 0 mol/1, le taux de décomposition de la L-sérine était de 79,3%. Toutefois, lorsque la cncentration en ions ammonium augmente, le taux de décomposition de la L-sérine diminue et, pour une concentration en ions ammonium de 0,37 mol/1, le taux de décomposition de la L-sérine tombe à 0%.

Exemple de référence 2:

On conserve à — 15°C, pendant une longue durée, les cellules obtenues en procédant de la manière indiquée dans l'exemple 1 et on introduit 0,32 g de ces cellules dans un tube à essai contenant 10 ml de liquide de réaction ayant la composition indiquée ci-dessous. On agite le mélange à 30° C, pendant 48 h, et on analyse la D-sérine de la même manière que dans l'exemple de référence 1.

Composition du liquide de réaction:

D-sérine 2,03%

Na2S03 0,10%

Pyridoxalphosphate 0,01 %

NH4C1 0-2% (variable)

Les résultats obtenus sont indiqués au tableau 2.

Tableau 2

R

Claims

642 947

1. Procédé de préparation du L-tryptophane par voie enzymati-que, selon lequel on fait réagir l'indole avec la L-sérine, en présence de la synthétase du tryptophane ou de tryptophanase, caractérisé par le fait que l'on utilise, comme matière première, la DL-sérine ou la D-sérine et que l'on fait réagir ce composé de départ avec la racé-mase de la sérine de façon à transformer au moins une partie de la D-sérine en L-sérine.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on fait d'abord réagir la DL-sérine ou la D-sérine avec la racémase de la sérine, de façon à provoquer la transformation d'au moins une partie de la D-sérine en L-sérine, et que l'on fait ensuite réagir la L-sérine avec l'indole.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on fait réagir la DL-sérine ou la D-sérine avec la racémase de la sérine, mise en présence de la synthétase du tryptophane ou de tryptophanase, de façon à transformer une partie de la D-sérine en L-sérine, en même temps que l'on effectue la réaction de la L-sérine avec l'indole.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on effectue la réaction à une température de 20 à 60°C et à un pH de 6,0 à 11,0.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on effectue la réaction à une température de 30 à 45° C et à un pH de 7,5 à 9,0.

6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que la synthétase du tryptophane ou la tryptophanase et/ou la racémase de la sérine sont fixées.

7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on utilise des cellules d'une culture d'un micro-organisme contenant de la synthétase du tryptophane ou de la tryptophanase ou de la racémase de la sérine, ou des extraits de telles cellules.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le milieu réactionnel contient une quantité de 0,01 à 2 mol/1 d'ions ammonium minéraux ou organiques.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que la quantité d'ions ammonium est de 0,1 à 0,5 mol/1.