FR2458586A1

FR2458586A1 - Procede de production d'ethanol a une haute concentration en utilisant un micro-organisme immobilise

Info

Publication number: FR2458586A1
Application number: FR8012949A
Authority: FR
Inventors: Ichiro Chibata; Jyoji Kato; Mitsuru Wada
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1979-06-13
Filing date: 1980-06-11
Publication date: 1981-01-02
Also published as: GB2055121B; FI801829A; SE8004386L; ES8104407A1; BR8003540A; AU531176B2; AU5918180A; IT8022740A0; US4350765A; FI71949B; GB2055121A; CA1143307A; SE450131B; DE3022063C2; FR2458586B1; IT1132101B; DE3022063A1; ES492372A0; FI71949C; PH16533A

Abstract

L'INVENTION CONCERNE LA PRODUCTION D'ETHANOL. ON MET EN CONTACT LES CELLULES IMMOBILISEES D'UN MICRO-ORGANISME CHOISI DANS LE GROUPE CONSTITUE PAR LES GENRES SACCHAROMYCES ET ZYMOMONAS AVEC UN BOUILLON DE CULTURE CONTENANT UN SUCRE FERMENTESCIBLE ET D'AUTRES SUBSTANCES NUTRITIVES NECESSAIRES POUR LE DEVELOPPEMENT DU MICRO-ORGANISME; ON TRANSFORME MICROBIOLOGIQUEMENT LE SUCRE EN ETHANOL; ON AJOUTE UN BOUILLON DE CULTURE FRAIS SUPPLEMENTAIRE CONTENANT LE SUCRE AU SYSTEME DE REACTION DE TRANSFORMATION; SI NECESSAIRE, ON REPETE DE MANIERE INTERMITTENTE OU CONTINUE L'ADDITION D'UN BOUILLON CONTENANT LE SUCRE; ET ENSUITE ON SEPARE LE BOUILLON CONTENANT L'ETHANOL PRODUIT. SUR LA FIGURE EST REPRESENTE UN EQUIPEMENT DE REACTION A COLONNES 1,2,3 ALIMENTEES INDIVIDUELLEMENT EN BOUILLON NUTRITIF ET PAR L'EFFLUENT DE LA COLONNE PRECEDENTE. APPLICATION A LA PRODUCTION D'ETHANOL A UNE CONCENTRATION DE L'ORDRE DE 200MGCM.

Description

La présente invention concerne un procédé de

production d'éthanol à une haute concentration en utili-

sant une levure ou un organisme anaérobie ayant une ac-

tivité de production d'éthanol qui est immobilisé dans des gels de support (que l'on appellera ci-après un micro-organisme immobilisé). Plus particulièrement,

le procédé selon la présente invention comprend les é-

tapes consistant à mettre en contact un micro-organisme

immobilisé avec un bouillon de culture contenant un su-

cre fermentescible comme source d'éthanol et des subs-

tances nutritives autres qu'un sucre fermentescible né-

cessafes pour le développement du micro-organisme, à transformer microbiologiquement le sucre en éthanol et ensuite à séparer le bouillon contenant l'éthanol ainsi

produit à une forte concentration.

Depuis très longtemps, on a produit de l'étha-

nol par un procédé de fermentation sous l'action de le-

vures. Bien que dans un procédé classique de fermenta-

tion sous l'action de levures un bouillon de culture contenant de l'éthanol à une concentration de 50 à mg/cm3 puisse être obtenu après fermentation pendant à 40 heures, il faut plus d'un mois pour que l'on obtienne de l'éthanol à une forte concentration telle que de 200 mg/cm3. De plus, un procédé classique de

fermentation sous l'action de levures est désavanta-

geux car ce procédé est mis en oeuvre d'une manière

discontinue et pour récupérer et réutiliser les cellu-

les de levures après la fin de la fermentation dans un procédé discontinu, il faut beaucoup de travail et

cela coûte très cher.

Récemment, il a été proposé de produire cer-

taines matières utiles en utilisant un système enzyma-

tique complexe d'un micro-organisme immobilisé dans une réaction de transformation d'un substrat approprié en la matière désirée. Par exemple, il est rapporté

qu'un système enzymatique complexe d'une levure immo-

bilisée qui est préparé par immobilisation de cellules de levures dans des gels d'alginate de calcium peut être utilisé dans la production d'éthanol à partir de glucose (Biotechnology and Bioengineering, Vol. 19,

pages 387 à 397 (1977)).

Selon le procédé ci-dessus, on conduit une réaction de transformation de glucose en éthanol en

mettant en contact une levure immobilisée avec une so-

lution contenant du glucose et du chlorure de calcium.

Toutefois, la productivité de ce procédé est faible car l'activité de production d'éthanol de la levure immobilisée est faible et la concentration de l'éthanol

produit est au maximum d'environ 50 mg par cm3 du mé-

lange réactionnel même à la fin d'une longue réaction

de transformation. De plus, le procédé a l'inconvé-

nient que l'activité enzymatique diminue rapidement au

cours du temps de réaction, car les substances nutri-

tives autres que le glucose nécessaires pour le déve-

loppement de la levure ne sont pas utilisées dans la réaction. La demanderesse a trouvé antérieurement un

nouveau procédé pour préparer un micro-organisme immo-

bilisé (Publication de brevet japonais (non examinée) NO 135295/1979). Selon ce procédé, une couche dense de cellules microbiennes est formée à l'intérieur d'un gel de support et, dans la production d'éthanol, la couche dense de cellules de levures immobilisées par

ce procédé présente une activité de production d'é-

thanol plus de dix fois supérieure à celle d'un bouil-

lon de culture obtenu par une fermentation classique sous l'action de levures. Par exemple, on produit une

concentration d'éthanol de 50 mg/cm3 en mettant en con-

tact 100 mg/cm3 d'un sucre fermentescible avec la

levure immobilisée (i cm3 de gel) pendant une heure.

Toutefois, la levure ou l'organisme anaérobie produc-

teurs d'éthanol immobilisés par ce procédé connu sont

encore peu satisfaisants pour utilisation dans une pro-

duction d'éthanol à l'échelle industrielle, parce que l'activité productrice d'éthanol de ce micro-organisme immobilisé est notablement limitée quand on utilise un sucre fermentescible à une concentration supérieure à mg/cm3. Par exemple, le micro-organisme immobilisé quand il est mis en contact avec 200 mg/cm3 du sucre fermentescible présente seulement 30% de son activité intrinsèque, tandis que ce micro-organisme immobilisé

présente habituellement l'activité complète de produc-

tion d'éthanol en présence de moins de 100 mg/cm3 du

sucre fermentescible. Ainsi, si la réaction de trans-

formation d'un sucre fermentescible en éthanol est conduite selon la procédé connu par utilisation du micro-organisme immobilisé, le sucre fermentescible doit être utilisé à une concentration inférieure à mg/cm3 et la concentration de l'éthanol à produire

ne doit pas être supérieure à 50 mg/cm3, parce qu'au-

trement le sucre provoque une diminution importante

dans la productivité en éthanol du micro-organisme im-

mobilisé. La demanderesse a maintenant trouvé qu'un

micro-organisme immobilisé présente une activité su-

périeure au cours d'une longue période et que l'étha-

nol peut être produit à une forte concentration telle que d'environ 100 200 mg/cm3 en un temps relativement court, quand on conduit la réaction de transformation d'un sucre-fermentescible en éthanol par mise en contact d'un mico-organisme immobilisé avec un bouillon de

culture contenant un sucre fermentescible à une concen-

tration relativement faible ainsi que des substances

nutritives autres que le sucre fermentescible nécessai-

res pour le développement du micro-organisme et qu'en-

suite on répète l'addition d'un bouillon de culture

frais contenant le sucre à une concentration relati-

vement forte, de préférence en même temps que les au-

tres substances nutritives.

Un but de la présente invention est de fournir

un procédé pour produire de l'éthanol à une haute con-

centration en utilisant un micro-organisme immobilisé.

Un autre but de la présente invention est de fournir

un procédé pour produire de l'éthanol à une haute con-

centration en un court laps de temps. D'autres buts et avantages de l'invention résulteront encore de la

description ci-après.

Aux dessins annexés, donnés à titre d'exem-

ples non limitatifs:

La figure 1 est un schéma de principe illus-

trant un mode de mise en oeuvre de la présente invention

en utilisant une série de récipients à réaction en for-

me de colonnes cylindriques.

La figure 2 est un schéma de principe illus-

trant un autre mode de mise en oeuvre de la présente invention en utilisant un récipient à réaction du type

colonne en forme de cône renversé.

La figure 3 est un schéma de principe illus-

trant un autre mode de mise en oeuvre de la présente

invention en utilisant un récipient à réaction en for--

me de colonne cylindrique comportant un tube de circu-

lation. Selon la présente invention, il est prévu un

procédé pour la production d'éthanol à une haute con-

centration en utilisant un micro-organisme immobilisé, caractérisé en ce qu'on met en contact les cellules immobilisées d'une levure ou d'un organisme anaérobie producteurs d'éthanol (cette levure ou cet organisme anaérobie étant choisis parmi les genres Saccharomyces

et Zymomonas) avec un bouillon de culture nutritif con-

tenant un sucre fermentescible de manière à transformer ce sucre en éthanol. En particulier, la réaction

de transformation selon la présente invention peut ê-

tre conduite de préférence par les étapes consis-

tant à:

(1) mettre en contact le micro-organisme im-

mobilisé avec un bouillon de culture contenant un su-

cre fermentescible et d'autres substances nutritives nécessaires pour le développement du micro-organisme; (2) transformer microbiologiquement le sucre en éthanol;

(3) ajouter un bouillon de culture frais sup-

plémentaire contenant le sucre au système de réaction de transformation; et ensuite (4) séparer le bouillon contenant l'éthanol produit.

Plus particulièrement, par exemple, un bouil-

lon contenant de l'éthanol à une concentration aussi forte que d'environ 100 à 200 mg/cm3 peut être obtenu en un laps de temps bien plus court que dans un procédé classique de fermentation sous l'action de levures en

mettant initialement en contact le micro-organisme pro-

ducteur d'éthanol immobilisé avec un bouillon de cul-

ture contenant un sucre fermentescible, de préférence à une concentration relativement faible telle que de

à 100 mg/cm3, en même temps que des substances nutri-

tives autres que le sucre fermentescible nécessaires

pour le développement du micro-organisme; en transfor-

mant microbiologiquement du sucre en éthanol jusqu'à ce que la concentration du sucre dans le bouillon soit réduite à pas plus de 20% de la concentration initiale; et en ajoutant ensuite un bouillon de culture frais supplémentaire ne contenant pas moins de 100 mg/cm3

du sucre au système de réaction de transformation jus-

qu'à ce que l'éthanol soit produit à une concentration

de pas moins de 75 mg/cm3, ou d'une façon particuliè-

rement préférable jusqu'à ce que l'éthanol soit produit

à une concentration de pas moins de 100 mg/cm3.

Un micro-organisme à utiliser dans la présen-

te invention est une levure ou un organisme anaérobie

ayant une activité de production d'éthanol et ce micro-

organisme est choisi dans le groupe constitué par les genres Saccharomyces et Zymomonas. Des exemples de ces micro-organismes sont une levure à bière telle que Sacch. cerevisiae IFO 2018 et Sacch. uvarum IFO 1167; une levure de distillerie telle que Sacch. cerevisiae IFO 0216, Sacch. cerevisiae IFO 0233, Sacch. cerevisiae ATCC 4111 et Sacch. cerevisiae ATCC 4124; une levure à saké telle que Sacch. sake ATCC 26422 (souche japonaise Kyokai 7); une levure à vin telle que Sacch. cerevisiae

IFO 1661, Sacch. cerevisiae ATCC 4098 et Sacch. cerevi-

siae 4921; Sacch. carlsbergensis OUT 7013; Sacch.

pasterianus OUT 7122; Sacch. fermentati IFO 0422; Zymomonas môbilis IFO 13756; Zymomonas anaerobea ATCC

29501, etc. Tous les micro-organismes mentionnés ci-

dessus sont bien connus de l'homme de l'art et sont li-

brement disponibles pour le public.

N'importe lesquels des levures ou des organis-

mes anaérobies mentionnés ci-dessus immobilisés dans

des gels de support peuvent être utilisés dans la pré-

sente invention, et l'immobilisation de ce micro-organis-

me peut être effectuée par un procédé connu, par exem-

ple un procédé au gel de polysaccharide sulfaté (bre-

vet des E.U.A. N 4 138 292), un procédé au gel de poly-

acrylamide (Advances in Applied Microbiology, Vol. 22,

page I (1977)), etc. Dans la présente invention, l'im-

mobilisation peut aussi être effectuée selon le procé-

dé décrit dans la Publication de brevet japonais (non examinée) NO 135295/1979. Par exemple, on mélange une

petite quantité de cellules microbiennes avec une solu-

tion d'une matière de base pour gel et le mélange ré-

sultant est gélatinisé en pastilles ou en pellicules selon une technique de gélification connue, par exemple on ajoute le mélange goutte à goutte dans une solution d'un agent de gélification de manière à obtenir des pastilles ou une pellicule de 2 mm à 5 cm d'épaisseur contenant de 0,01 à 10 fois la quantité de cellules microbiennes contenue dans une boucle par 100 g (poids à l'état humide) des gels. On met ensuite les gels à incuber dans un bouillon de

culture nutritif convenable pour développement du mi-

cro-organisme entre 15 et 451C de manière à obtenir un micro-organisme immobilisé désiré qui comporte une couche dense des cellules microbiennes formée à l'intérieur du gel de support. Comme matière de base pour gel, on peut utiliser une matière de base pour gel connue telle qu'un polysaccharide sulfaté, un polyacrylamide

(par exemple un copolymère 2-méthyl-5-vinylpyridine/mé-

thacrylate de méthyle/acide méthacrylique), de l'algi-

nate de sodium, de l'alcool polyvinylique, du succinate de cellulose, du succinate de caséine, etc. N'importe quel polysaccharide sulfaté qui ne contient pas moins de 10% en poids, de préférence contenant de 12 à 62% en poids de portion sulfate (-SO3H) dans sa molécule

peut être utilisé comme polysaccharide sulfaté mention-

né ci-dessus, et des exemples de tels polysaccharides sulfatés sont la carraghénine, la furcellarane et le sulfate de cellulose. La carraghénine contient de 20 à 30% environ en poids de portion sulfate (SO3H) dans la molécule. Quant à la furcellarane, elle contient de 12 à 16% environ en poids de portion sulfate dans sa molécule. Un sulfate de cellulose contenant de 12 à 62% en poids de portion sulfate dans la molécule est disponible sur le marché sous le nom commercial "KELCO

SCS" (KELCO Co., E.U.A.) (teneur en sulfate: 53% envi-

ron) ou, si nécessaire, peut être préparé par esté-

rification classique de cellulose avec l'acide sulfu-

rique. Dans la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, on prépare d'abord un bouillon nu- tritif en mélangeant dans de l'eau une source d'azote

telle qu'un extrait de levures, une liqueur de macéra-

tion de mals, une peptone, etc., et une ou plusieurs

autres substances nutrivives nécessaires pour le dé-

veloppement d'un micro-organisme à utiliser. Ces au-

tres substances nutritives peuvent être choisies parmi des vitamines comme la thiamine, la biotine, l'acide

pantothénique, l'inositol, etc.; des substances mi-

nérales telles que des phosphates, des sels de magné-

sium, des sels de calcium, des sels de sodium, des sels de potassium, etc. ; des sels d'ammonium comme

du chlorure d'ammonium; et un mélange de telles ma-

tières. La quantité de ces substances nutritives à ajouter sera évidente pour l'homme de l'art et, par exemple, on peut ajouter à un bouillon nutritif de 0,05 à 1,0% en poids/volume d'une source d'azote, de

0,0001 à 0,1% en poids/volume d'une substance miné-

rale, de 0,01 à 1,0% en poids/volume d'un sel d'ammonium

et une quantité de l'ordre de traces de vitamines.

Ensuite, un sucre fermentescible comme du glucose, du fructose, du sucrose, du maltose, etc., est ajouté au bouillon nutritif ainsi produit, de préférence à une concentration relativement faible telle que de pas plus d'environ 10% en poids/volume (c'est-à-dire

pas plus d'environ 100 mg/cm3), de préférence compri-

se entre 5 et 10% en poids/volume (c'est-à-dire envi-

ron 50 à 100 mg/cm 3), par rapport au bouillon nutri-

tif, pour former un bouillon de culture. La mélasse

contient à la fois le sucre fermentescible et les au-

tres substances nutritives nécessaires pour le déve-

loppement du micro-organisme. En conséquence, une so-

lution aqueuse de mélasse peut être utilisée telle

quelle comme bouillon de culture.

Le-procédé selon la présente invention peut être mis en oeuvre de manière discontinue ou continue en utilisant un récipient à réaction du type colonne

à une température de 15 à 450C convenable pour le dé-

veloppement d'un micro-organisme immobilisé à utiliser.

Dans une mise en oeuvre discontinue du procé-

dé, on met d'abord le micro-organisme immobilisé en

contact avec un bouillon de culture en agitant de ma-

nière à transformer en éthanol un sucre fermentescible présent dans le bouillon. Quand la concentration du sucre est tombée à par exemple pas plus d'environ 20% de la concentration initiale, de préférence pas plus d'environ 10 mg/cm3, on ajoute au système de réaction

de transformation un bouillon de culture frais supplé-

mentaire contenant le sucre. Comme ci-dessus, le sucre nouvellement ajouté est également transformé en éthanol et la concentration du sucre dans le bouillon est réduite de nouveau. Si nécessaire, on peut répéter de manière intermittente l'addition d'un bouillon de

culture frais contenant le sucre jusqu'à ce que l'é-

thanol soit produit à une forte concentration telle que de 100 à 200 mg/cm3. Le bouillon de culture frais supplémentaire à ajouter au système de réaction de transformation doit contenir un sucre fermentescible à une concentration relativement forte telle que de pas moins d'environ 100 mg/cm3, de préférence en même

temps que des substances nutritives autres que le su-

cre fermentescible nécessaire pour le développement d'un micro-organisme immobilisé et chaque fois qu'on ajoute un bouillon supplémentaire, la concentration

du sucre dans le bouillon à ajouter peut être aug-

mentée d'une manière intermittente jusqu'à environ 250-400 mg/cm3. Il est préféré que l'addition d'un bouillon de culture frais ne contenant pas moins de

mg/cm3 du sucre soit répétée quand la concentra-

tion est tombée à pas plus d'environ 20% de sa concen-

tration initiale. Dans le cas d'une mise en oeuvre continue du procédé selon l'invention, on utilise un récipient à réaction du type colonne garni d'un micro-organisme immobilisé. Tout d'abord, un bouillon de culture ne

contenant pas plus de 100 mg/cm3, de préférence con-

tenant de 50 à 100 mg/cm3 d'un sucre fermentescible en même temps que des substances nutritives autres

que le sucre fermentescible nécessaires pour le déve-

loppement du micro-organisme est introduit par une extrémité de la colonne pour transformation du sucre en éthanol et un bouillon contenant l'éthanol ainsi produit sort par l'autre extrémité de la colonne. Le débit d'introduction du bouillon de culture mentionné

ci-dessus doit être réglé de manière que la concentra-

tion du sucre dans l'effluent de la colonne ne soit

pas supérieure à 20% environ de sa concentration ini-

tiale, de préférence pas supérieure à environ 10 mg/cm3.

Ensuite, on introduit dans la colonne un bouillon de culture supplémentaire ne contenant pas plus de 100 mg/

cm du sucre et, dans ce cas, il est spécialement préfé-

ré de régler le débit d'introduction de ce bouillon de culture frais de manière que la concentration du sucre dans l'effluent ne devienne pas supérieure à 20%o de sa concentration initiale. De plus, la concentration du

sucre dans un bouillon de culture à introduire de ma-

nière continue dans la colonne peut être portée à un niveau d'environ 250 à 400 mg/cm3 au cours du temps

Quand on met en oeuvre le procédé ci-dessus, un micro-

organisme immobilisé conserve une excellente producti-

vité en éthanol pendant une longue période et l'éthanol il peut être produit à une haute concentration telle que

d'au maximum environ 200 mg/cm3.

De plus, on peut utiliser une série de co-

lonnes dans le procédé continu ci-dessus en réglant le débit d'introduction du bouillon de culture ini- tial de manière que la concentration du sucre dans l'effluent de la première colonne soit réduite à pas plus de 2O% de la concentration initiale, de préférence pas plus d'environ 10 mg/cm3, en introduisant un bouillon de culture supplémentaire contenant le sucre dans la deuxième colonne en même temps que l'effluent de la première colonne et en répétant ensuite ce mode d'introduction dans les colonnes suivantes. On peut aussi utiliser une colonne longue en réglant le débit

d'introduction du bouillon de culture initial de ma-

nière que la concentration du sucre à une certaine partie de la colonne soit réduite à pas plus d'environ b de la concentration initiale, en introduisant un bouillon de culture supplémentaire contenant le sucre

dans la partie de la colonne dans laquelle la concen-

tration du sucre est réduite et en répétant ensuite ce mode d'introduction dans les parties suivantes de la colonne. Evidemment, ces derniers procédés peuvent augmenter la production d'éthanol par unité de temps et l'éthanol peut être produit très efficacement et

d'une manière continue à une haute concentration.

La séparation d'un bouillon après achèvement de la réaction de transformation peut être effectuée

par des techniques classiques telles que la distilla-

tion, la centrifugation, la décantation, etc. Dans

le cas o on utilise une colonne, un bouillon peut faci-

lement être séparé sous la forme d'un effluent de

la colonne.

Les exemples suivants illustrent encore en détail la présente invention, mais ne doivent pas être

considérés comme la limitant. Dans les exemples, l'ac-

tivité de production d'éthanol d'un micro-organisme im-

mobilisé est déterminée d'après la quantité d'éthanol produite. De plus, on notera que la concentration d'un

sucre fermentescible dans la présente description et

dans les revendications a été exprimée en calculant

en glucose.

Exemple 1

Une quantité de Sacch. sake ATCC 26422 (souche japonaise Kyokai 7) égale au contenu d'une boucle

est mélangée avec une solution aqueuse stéri-

lisée à 4,5% en poids/volume de carraghénine (produite

par The Copenhagen Pectin Factory Ltd., sous le nom com-

mercial "GENUGEL Type WG") (20 cm3) à 37 C.- On ajoute le mélange goutte à goutte par un ajutage à une solution aqueuse à 2% en poids/volume de chlorure de potassium (200 cm3) pour obtenir des gels globulaires de 4 mm de diamètre. On prépare un bouillon nutritif en mélangeant un extrait de levures (0,15% en poids/volume), du

chlorure d'ammonium (0,25% en poids/volume), de l'hydrogé-

nophosphate dipotassique (0,55% en poids/volume), de l'heptahydrate de sulfate de magnésium (0,025% en poids/ volume), du chlorure de calcium (0, 001% en poids/volume), de l'acide citrique (0,1% en poids/volume) et du chlorure de sodium (0,25% en poids/volume) dans de l'eau et en

réglant le pH à 5,0.

On ajoute du glucose aux gels obtenus ci-des-

sus à la concentration de 10% en poids/volume et les

gels obtenus ci-dessus sont mis à incuber dans le bouil-

lon contenant du glucose (500 cm3) tandis qu'on secoue doucement à 30 C pendant 60 heures pour développement de la levure dans les gels. La levure immobilisée ainsi obtenue a une activité de production d'éthanol de 50 mg

d'éthanol par cm3 des gels et par heure.

La levure immobilisée (20 cm3) est mise en contact avec le bouillon nutritif contenant 10% en poids/volume de glucose (20 cm3) à 30WC pendant 1 heure. Quand la concentration du glucose restant dans le bouillon est tombée à 2 mg/cm3, on ajoute le bouillon nutritif frais supplémentaire contenant 40% en poids/volume de glucose (10 cm3) et on continue dans les mêmes conditions la réaction de transformation du

glucose en éthanol. Comme résultat, le bouillon con-

tenant de l'éthanol à la concentration de 100 mg/cm3 (30 cm3) est obtenu après la réaction de transformation

pendant 3 heures.

*Exemple 2

Selon le même mode opératoire que décrit dans l'exemple 1, on obtient une levure immobilisée. La levure immobilisée (20 cm3) est mise en contact avec un bouillon nutritif (le même que dans l'exemple 1) contenant 10% en poids/volume de glucose (20 cm3) à

301C pendant 1 heure. Quand la concentration du glu-

cose restant dans le bouillon est tombée à 2 mg/cm3, on ajoute le bouillon nutritif frais supplémentaire contenant 40% en poids/volume de glucose (5 cm3) et on continue la réaction de transformation du glucose

en éthanol pendant encore 1 heure dans les mêmes con-

ditions. Ensuite, on répète trois fois à des inter-

valles de 1 heure l'addition du bouillon nutritif

contenant 40% en poids/volume de glucose (5 cm3).

Comme résultat, la levure immobilisée conserve son activité de production d'éthanol au niveau de 50 mg/cm3 des gels et par heure durant la période de réaction et le bouillon contenant l'éthanol à une

concentration de 125 mg/cm3 (40 cm3) est obtenu a-

près la réaction de transformation pendant 5 heures.

Exemple 3

Après mise en oeuvre du procédé comme décrit

dans l'exemple 2, on récupère par décantation la le-

vure immobilisée. On répète le même mode opératoire -

que décrit dans l'exemple 2 en utilisant la levure

immobilisée récupérée pour produire de l'éthanol.

L'activité de production d'éthanol de la levure immo-

bilisée récupérée n'est pas réduite même après que la

récupération et la production d'éthanol ont été répé-

tées 10 fois et le bouillon contenant l'éthanol à une concentration de 125 mg/cm3 (40 cm5) est obtenu à la fin de chaque réaction de transformation pendant 5

heures.

Exemple 4

Une levure immobilisée (20 cm3) préparée selon le même mode opératoire que décrit dans l'exemple 1 est mise en place comme garnissage dans une colonne cylindrique (volume: 30 cm3). Un bouillon nutritif (le même que dans l'exemple 1) contenant 10% en poids/ volume de glucose est introduit dans la colonne par une de ses extrémités à raison de 20 cm3/h à 300C de manière à faire flotter la levure immobilisée et il sort de la colonne par son autre extrémité au même débit. Après incubation-à 300C pendant 60 heures tandis qu'on introduit le bouillon au débit ci-dessus, on règle le débit à 7 cm3/h de manière à faire sortir l'effluent contenant le glucose à une concentration de pas plus de 10 mg/cm3. Dans ces conditions, la concentration du glucose dans le bouillon nutritif

à introduire dans la colonne est augmentée progres-

sivement de manière que la concentration du glucose atteigne 30% en poids/volume par rapport au bouillon après 120 heures. Durant cette période, l'activité de production d'éthanol de la levure immobilisée n'est

pas réduite et on obtient l'effluent contenant l'é-

thanol à une concentration de 150 mg/cm3. De plus, quand le bouillon nutritif contenant 30% en poids/ volume de glucose est introduit de manière continue

dans la colonne à raison de 7 cm3/h, la levure immobi-

lisée dans la colonne est encore stable pendant plus

d'un mois et on obtient constamment l'effluent conte-

nant l'éthanol à une concentration de 146 mg/cm3 en moyenne.

Exemple 5

On effectue une production d'éthanol en utili-

sant un équipement de réaction à-colonnes cylindriques tel que représenté sur la figure 1 comportant une série de trois colonnes 1, 2 et 3. On prépare chaque colonne

(volume: 30 cm3) selon le même mode opératoire que dé-

crit dans l'exemple 4 en garnissant la colonne d'une levure immobilisée (la même que dans l'exemple 1) (20 cm3) et en introduisant le bouillon nutritif (le

même que dans l'exemple 1) contenant 10% en poids/vo-

lume de glucose au débit de 20 cm3/h à 300C pendant heures. Ensuite, on relie les colonnes en série. Le

bouillon nutritif contenant 10% en poids/volume de glu-

cose est introduit au fond de la colonne 1 par un tuyau d'alimentation 4 au débit de 20 cm3/h à 301C. L'effluent de la colonne 1 est conduit à lacolonne 2 en même temps que le bouillon nutritif contenant 40 /0 en poids/volume

de glucose qui est introduit par un tuyau 5 d'alimenta-

tion en bouillon au débit de 5 cm3/h. De même, l'ef-

fluent de la colonne 2 est conduit à la colonne 3 en même temps que le bouillon nutritif contenant 40% en

poids/volume de glucose arrivant par un tuyau 6 d'ali-

mentation en bouillon au débit de 5 cm3/h. Ainsi, l'effluent contenant l'éthanol à une concentration de

100 mg/cm3 est obtenu constamment à partir de la colon-

ne 3 par un tuyau de sortie 7 au débit de 30 cm3/h.

Exemple 6

Dans le même mode opératoire que décrit dans l'exemple 4, on substitue 20% en poids/volume d'une solution aqueuse de mélasse aux 10%6 en poids/volume de glucose dans le bouillon nutritif initial (100 mg/cm3

en glucose) et on augmente progressivement la concen-

tration de la mélasse aqueuse dans le bouillon nutri-

tif supplémentaire jusqu'à 60% en poids/volume de ma-

nière à obtenir continuellement un effluent contenant l'éthanol à une concentration de 142 mg/cm3 au débit

de 5 cm3/h.

Exemple 7

On effectue une production d'éthanol en utili-

sant un récipient à réaction du type colonne en forme de cône renversé comme représenté sur la figure 2. On prépare une colonne 1 en forme de cône renversé (volume cm3) en plaçant comme garnissage dans la colonne une levure immobilisée (20 cm3) obtenue par le même mode opératoire que décrit dans l'exemple 1, en introduisant

un bouillon nutritif (le même que dans l'exemple 1) con-

tenant 10% en poids/volume de glucose au fond de la co-

lonne 1 par un tuyau 4 d'alimentation en bouillon au débit de 20 cm3/h à 301C et en faisant sortir le bouillon

du sommet de la colonne 1 par un tuyau de sortie 7 au mê-

me débit. Après incubation à 30C pendant 40 heures

tandis qu'on introduit le bouillon au débit indiqué ci-

dessus, on règle le débit d'introduction à 6 cm3/h de manière à faire sortir l'effluent contenant le glucose à une concentration de pas plus de 10 mg/cm3. Dans ces conditions, on augmente progressivement la concentration du glucose dans le bouillon nutritif à introduire dans la colonne de manière que la concentration du glucose atteigne 35% en poids/volume par rapport au bouillon après 72 heures. Durant cette période, l'activité de production d'éthanol de la levure immobilisée n'est pas réduite et on obtient constamment un effluent contenant

l'éthanol à une concentration de 175 mg/cm. Ainsi, quand.

on utilise la colonne en forme de cône renversé, l'é-

thanol peut être produit efficacement parce que le C02 gazeux formé dans une réaction de transformation d'un

sucre fkimentescible En éthaol Dae-t être efficacement éliminé.

Exemple 8

On effectue une production d'éthanol en utili-

sant un récipient à réaction en forme de colonne cy-

lindrique ayant un tube de circulation comme représen-

té sur la figure 3. On prépare une colonne I compor-

tant un tube de circulation 8 qui est capable de recy-

cler au fond de la colonne une partie du bouillon ayant traversé la colonne en plaçant comme garnissage dans la colonne une levure immobilisée (25 cm3) obtenue par le

même mode opératoire que décrit dans l'exemple 1, en in-

troduisant 20%,/ en poids/volume d'une solution aqueuse de mélasse (100 mg/cm3 en glucose) au fond de la colonne I par un tuyau 5 d'alimentation en bouillon au débit de cm3/h à 300C.de manière à faire flotter la levure' immobilisée dans la colonne et en faisant sortir le bouillon du haut de la colonne par un tuyau de sortie 7 au même débit. Après incubation à 301C pendant 40

heures tandis qu'on introduit le bouillon au débit in-

diqué ci-dessus, on introduit dans la colonne I 50% en poids/volume de la solution aqueuse de mélasse (250 mg/cm3 en glucose) au débit de 10 cm3/h tandis qu'une

partie du bouillon ayant traversé la colonne est recy-

clée au fond de la colonne par le tube 8 au débit de

cm3/h. La concentration de la mélasse aqueuse cir-

culant dans le tube 8 tombe à pas plus de 10 mg/cm3 en glucose. Dans ces conditions, l'activité de production d'éthanol de la levure immobilisée n'est pas réduite et un effluent contenant l'éthanol à une concentration de mg/cm3 sort de manière continue par le tuyau 7, car la concentration de la mélasse aqueuse dans le bouillon à introduire dans la colonne est réduite par le bouillon

recyclé par le tube 8.

Exemple 9

Une quantité de Zymomonas mobilis IFO 13756 égale au contenu d'une boucle est

mélangée avec une solution aqueuse à 4,5% en poids/vo-

lune de carraghénine (20 cm3) à 37 C. On ajoute le mélange goutte à goutte par un ajutage à une solution aqueuse à 2% en poids/volume de chlorure de potassium (200 cm3) pour obtenir des gels globulaires de 4 mm

de diamètre.

On prépare un bouillon nutritif en mélangeant

de l'extrait de levures (0,15% en poids/volume), du chlo-

rure d'ammonium (0,25% en poids/volume), de l'hydrogé-

nophosphate dipotassique (0,55% en poids/volume), de l'heptahydrate de sulfate de magnésium (0,025% en poids/ volume), du chlorure de calcium (0, 001% en poids/volume), de l'acide citrique (0,1% en poids/volume) et du chlorure de sodium (0,25% en poids/volume dans de l'eau et en

réglant le pH à 6,8.

On ajoute du glucose au bouillon nutritif à

la concentration de 10% en poids/volume et les gels ob-

tenus ci-dessus sont mis à incuber dans le bouillon contenant le glucose (500 cm3) à 30 C pendant 90 heures sous azote pour développement de l'organisme anaérobie dans les gels. L'organisme anaérobie immobilisé ainsi obtenu a une activité de production d'éthanol de 77 mg

d'éthanol par cm3 des gels et par heure.

L'organisme anaérobie immobilisé (20 cm3) est mis en contact avec le bouillon nutritif contenant

% en poids/volume de glucose (20 cm3) à 30 C pen-

dant 45 minutes. Quand la concentration du glucose restant dans le bouillon est tombée à 2 mg/cm3, on

ajoute le bouillon nutritif frais supplémentaire con-

tenant 40% en poids/volume de glucose (10 cm3) et on continue dans les mêmes conditions la réaction de transformation du glucose en éthanol. Comme résultat,

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le bouillon contenant l'éthanol à la concentration de mg/cm3 (30 cm3) est obtenu après la réaction de

transformation pendant 2 heures sans réduction de l'ac-

tivité de l'organisme anaérobie immobilisé.

Exemple 10 Selon le même mode opératoire que décrit dans

l'exemple 9, on obtient un organisme anaérobie immobilisé.

L'organisme anaérobie immobilisé (20 cm3) est mis en con-

tact avec un bouillon nutritif (le même que dans l'exem-

ple 9) contenant 10% en poids/volume de glucose (20 cm3) à 30WC pendant 40 minutes. Quand la concentration du glucose restant dans le bouillon est tombée à 2 mg/cm3 on ajoute le bouillon nutritif frais supplémentaire contenant 40C/ en poids/volume de glucose (5 cm3) et on

continue la réaction de transformation du glucose en é-

thanol pendant encore 40 minutes dans les mêmes conditions.

Ensuite, l'addition du bouillon nutritif contenant 40% en poids/volume de glucose (5 cm3) est répétée trois fois

à des intervalles de 40 minutes. Comme résultat, l'orga-

nisme anaérobie immobilisé conserve son activité de pro-

duction de méthanol au niveau de 77 mg de méthanol par

cm3 des gels et par heure et le bouillon contenant l'é-

thanol à une concentration de 125 mg/cm3 (40 cm3) est obtenu après la réaction de transformation pendant 200

minutes.

Exemple 11

Après avoir conduit le même mode opératoire que décrit dans l'exemple 10, on récupère par décantation l'organisme anaérobie immobilisé. On répète le même mode opératoire que décrit dans l'exemple 10 en utilisant l'organisme anaérobie immobilisé récupéré pour produire

de l'éthanol. L'activité productrice d'éthanol de l'or-

ganisme anaérobie immobilisé récupéré n'est pas réduite même après répétition dix fois de la récupération et de

la production d'éthanol et le bouillon contenant l'étha-

nol à la concentration de 125 mg/cm3 (40 cm3) est obte-

nu à la fin de chaque réaction de transformation pen-

dant 200 minutes.

Exemple 12

Selon le même mode opératoire que décrit dans l'exemple 5, on effectue une production d'éthanol en

utilisant un équipement de réaction à colonnes cylin-

driques tel que représenté sur la figure 1. On prépare

chaque colonne (volume: 30 cm3) en plaçant comme gar-

nissage dans la colonne un organisme anaérobie immobilisé

(le même que dans l'exemple 9) (20 cm3) et en intro-

duisant un bouillon nutritif (le même que dans l'exemple 9) contenant 10% en poids/volume de glucose au débit de cm3/h à 300C pendant 90 heures. Ensuite, les colonnes

1, 2 et 3 sont reliées en série. On introduit le bouil-

lon nutritif contenant 10% en poids/volume de glucose au fond de la colonne 1 par un tuyau d'alimentation en bouillon 4 au débit de 30 cm3/h à 300C. L'effluent de la colonne l est conduit à la colonne 2 en même temps que le bouillon nutritif contenant 40% en poids/volume de glucose amené par un tuyau 5 au débit de 7 cm3/h. De même, l'effluent de la colonne 2 est conduit à la colonne 3 en même temps que le bouillon nutritif contenant 40%

en poids/volume de glucose amené par un tuyau 6 au dé-

bit de 7 cm3/h. Ainsi, l'effluent contenant l'éthanol à une concentration de 100 mg/cm3 est évacué de manière continue de la colonne 3 par un tuyau de sortie 7 à

un débit de 44 cm3/h.

Exemple 13

Dans le même mode opératoire que décrit dans l'exemple 10, une solution aqueuse à 20% en poids/volume de mélasse est substituée au glucose dans le bouillon nutritif initial (100 mg/cm3 en glucose) et on porte progressivement la concentration de la mélasse aqueuse à 60% en poids/volume de manière à obtenir le bouillon contenant l'éthanol à une concentration de 125 mg/cm3 (40 cm3) après la réaction de transformation de la

mélasse aqueuse en éthanol pendant 3 heures.

Exemple 14

Selon le même mode opératoire que décrit dans l'exemple 8, on effectue une production d'éthanol en utilisant un équipement de réaction du type colonne cylindrique comportant un tube de circulation comme représenté sur la figure 3. On prépare une colonne en plaçant comme garnissage dans la colonne un organisme anaérobie immobilisé (25 cm3) obtenu par le même mode

opératoire que décrit- dans l'exemple 9, en introdui-

sant 20% en poids/volume d'une solution aqueuse de mélasse (100 mg/cm3 en glucose) au fond de la colonne 1 par un tuyau 5 au débit de 40om3/h à 300C pendant heures et en faisant sortir l'effluent du haut de

la colonne par un tuyau de sortie 7 au même débit.

Ensuite, on introduit dans la colonne 1 la solution

à 50% en poids/volume de mélasse (250 mg/cm3 en glu-

cose) au débit de 15 cm3/h tandis qu'une partie du bouillon ayant traversé la colonne est recyclée au fond de la colonne par le tube de circulation 8 au débit de 100 cm3/hI La concentration de la mélasse aqueuse circulant dans le tube 8 tombe à pas plus de

10 mg/cm3 en glucose. Dans ces conditions, l'acti-

vité productrice d'éthanol de l'organisme anaérobie immobilisé n'est pas réduite et l'effluent contenant l'éthanol à une concentration de 125 mg/cm3 sort

d'une manière continue par le tuyau 7, car la con-

centration de la mélasse aqueuse à introduire dans la colonne est réduite par le bouillon recyclé par

le tube 8.

e

Claims

Revendications

1) Un procédé de production d'éthanol par la réaction de transformation d'un sucre fermentescible en éthanol, caractérisé en ce qu'on met en contact une levure ou un organisme anaérobie producteurs d'é-

thanol immobilisés dans un gel de support (cette le-

vure ou cet organisme anaérobie étant choisis dans le groupe constitué par les genres Saccharomyces et

Zymomonas) avec un bouillon de culture nutritif con-

tenant un sucre fermentescible.

2) Un procédé de production d'éthanol selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une levure ou un organisme anaérobie producteurs d'éthanol immobilisés dans un gel de support choisis parmi un

polysaccharide sulfaté, un polyacrylamide, de l'algina-

te de sodium, de l'alcool polyvinylique, du succinate

de cellulose et du succinate de caséine.

3) Un procédé de production d'éthanol selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise une levure ou un organisme anaérobie producteurs d'éthanol immobilisés dans un polysaccharide sulfaté ne contenant

pas moins de 10% en poids de portion sulfate (-SO3H).

4) Un procédé de production d'éthanol selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polysaccharide sulfaté est de la carraghénine, de la furcellarane ou

du sulfate de cellulose.

) Un procédé de production d'éthanol selon l'une

des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise

la levure ou l'organisme anaérobie immobilisés ayant une

couche dense de cellules microbiennes formée à l'inté-

rieur du gel de support.-

6) Un procédé de production d'éthanol selon l'une

des revendications 1, 2, 3 et 5, caractérisé en ce qu'on

conduit la réaction de transformation par les étapes con-

sistant à: (1) mettre en contact le mico-organisme immobilisé avec

un bouillon de culture nutritif contenant un sucre fer-

mentescible; (2) transformer microbiologiquement le sucre en éthanol; (3) ajouter un bouillon de culture frais supplémentaire

contenant le sucre au système de réaction de transforma-

tion; et

(4) séparer le bouillon contenant l'éthanol produit.

7) Un procédé de production d'éthanol selon l'u-

ne des revendications 1, 2, 3 ou 5, caractérisé en ce

qu'on conduit la réaction de transformation par les éta-

pes consistant à: (1) mettre en contact la levure ou l'organisme anaérobie immobilisés avec un bouillon de culture nutritif ne contenant pas plus de 100 mg/cm 3, de préférence contenant de 50 à 100 mg/cm3 d'un sucre fermentescible; (2) transformer microbiologiquement le sucre en éthanol jusqu'à ce que la concentration du sucre soit réduite à pas plus de 20% de sa concentration initiale; (3) ajouter au système de réaction de transformation un bouillon de culture frais supplémentaire ne contenant

pas moins de 100 mg/cm3 du sucre jusqu'à ce que l'étha-

nol soit produit à une concentration de pas moins de mg/cm3; et ensuite

(4) séparer le bouillon contenant l'éthanol produit.

8) Un procédé de production d'éthanol selon la

revendication 7, caractérisé en ce qu'on effectue l'ad-

dition du bouillon de culture frais contenant le sucre

jusqu'à ce que l'éthanol soit produit à une concentra-

tion de pas moins de 100 mg/cm 9) Un procédé de production d'éthanol selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on répète de

manière intermittente ou continue l'addition du bouil-

lon de culture frais contenant le sucre.

) Un procédé de production d'éthanol selon la revendication 7, caractérisé en ce que le bouillon de culture frais contenant le sucre est ajouté au système

de réaction de transformation de manière que la concen-

tration du sucre dans le bouillon du système de réac-

tion de transformation soit réglée à 100-400 mg/cm3.

11) Un procédé de production d'éthanol selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on conduit la

réaction de transformation d'une manière discontinue.

12) Un procédé de production d'éthanol selon la

revendication 11, caractérisé en ce qu'on répète l'ad-

dition du bouillon de culture frais quand la concentra-

tion du sucre dans le système de réaction de transfor-

mation est réduite à pas plus de 20% de sa concentra-

tion initiale.

13) Un procédé de production d'éthanol selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on conduit la réaction de transformation d'une manière continue en

utilisant une multiplicité de colonnes garnies du micro-

organisme immobilisé.

14) Un procédé de production d'éthanol selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on répète d'une manière continue l'addition du bouillon de culture frais en réglant le débit d'introduction du bouillon de manière que la concentration du sucre dans l'effluent

ne soit pas supérieure à 20% de sa concentration initiale.

) Un procédé de production d'éthanol selon la revendication 13, caractérisé en ce que la colonne est

en forme de cône renversé comportant un tuyau d'ali-

mentation en bouillie à son extrémité inférieure et

un tuyau de sortie à son extrémité supérieure.