SE450131B - Forfarande for framstellning av etanol i hog koncentration genom anvendning av immobiliserad mikroorganism - Google Patents

Description

10 40 450 151 z av jästen, icke användes i reaktionen.

Ett förfarande har förut utvecklats för framställning av en immobiliserad mikroorganism (japanska patentpublikationen (ograns- kad) 135295/1979). Enligt detta förfarande bildas ett tätt skikt av mikroorganismceller i en uppbärande gel och vid etanolfram- ställning uppvisar det täta skiktet av jästceller, som immobili- serats genom detta förfarande, en etanolframställande aktivitet, som är mer än tio gånger så hög som den för en näringslösning, som erhållits genom konventionell jästfermentering. 50 mg/ml eta- nol framställes exempelvis genom att 100 mg/ml av ett jäsbart socker bringas i kontakt med den immobiliserade jästen (1 ml gel) under 1 timme. Den etanolframställande jästen eller anaeroba mik- roorganism, som immobiliserats genom denna kända metod, är emel- lertid fortfarande otillfredsställande för användning vid fram- ställning av etanol i industriell skala, emedan den etanolfram- ställande aktiviteten hos denna immobiliserade mikroorganism an- märkningsvärt tillbakahälles, när ett jäsbart socker användes i högre koncentration än 150 mg/ml. Den immobiliserade mikroorga- nismen uppvisar exempelvis när den bringas i kontakt med 200 mg/ml jäsbart socker, endast 30 % av sin inneboende aktivitet, medan denna immobiliserade mikroorganism vanligen uppvisar full etanol- framställande aktivitet i närvaro av mindre än 100 mg/ml jäsbart socker. Om överföringsreaktionen för ett jäsbart socker till eta- nol genomföres enligt den kända metoden genom användning av immo- biliserad mikroorganism, måste det jäsbara sockret sålunda använ- das vid lägre koncentration än 100 mg/ml och koncentrationen av etanol, som skall framställas, får icke vara mer än 50 mg/ml, emedan sockret eljest åstadkommer anmärkningsvärd minskning i etanolproduktiviteten hos den immobiliserade mikroorganismen.

Det har nyligen visat sig, att en immobiliserad mikroorga- nism uppvisar överlägsen aktivitet under lång tid och att etanol kan framställas i hög koncentration, t.ex. cirka 100-200 mg/ml l på relativt kort tid, när överföringsreaktionen för jäsbart socker till etanol utföres genom att en immobiliserad mikroorganism bringas i kontakt med en näringslösning innehållande ett jäsbart socker i en relativt låg koncentration samt andra näringsmedel än det jäsbara sockret, vilka är nödvändiga för mikroorganismens tillväxt, och att därefter tillsatsen av ny näringslösning, vilken innehåller sockret i en relativt hög koncentration, upprepas, företrädesvis tillsammans med andra näringsmedel. w 40 ritning, på vilken fig. 1 schematiskt visar ett flytschema som 3 450 151 Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för framställ- ning av etanol i hög koncentration genom användning av en immobi- liserad mikroorganism. Enligt uppfinningen framställes etanol i hög koncentration på kort tid.

Uppfinningen beskrives närmare under hänvisning till bifogade åskådliggör en utföringsform av uppfinningen under användning av en serie cylindriska reaktionskolonner. Fig. 2 visar schematiskt ett flytschema som åskådliggör en annan utföringsform av uppfin- ningen under användning av en reaktionskolonn i form av upp- och nedvänd kon och fíg. 3 visar schematiskt ett flytschema, som åskådliggör ytterligare en annan utföringsform av uppfinningen under användning av en cylindrisk reaktionskolonn med ett cirku- lationsrör.

Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för framställ- ning av etanol i hög koncentration under användning av en immobi- liserad mikroorganism, vilket förfarande innebär att immobilise- rade celler av en etanolbildande jäst eller en anaerob mikroorga- nism, varvid jästen eller den anaeroba mikroorganismen, vilka är valda från den grupp som består av släktena Saccharomyces och Zymomonas bringas i kontakt med en näringsmedelshaltig odlings- lösning innehållande ett jäsbart (fermentativt) socker för över- föring av sockret till etanol. Uverföringsreaktionen enligt före- liggande uppfinning kan speciellt lämpligt utföras i följande steg: (1) Den immobiliserade mikroorganismen bríngas i kontakt med en odlingslösning innehållande ett fermentativt socker och andra näringsmedel, som är nödvändiga för mikroorganismens tillväkt, (2) sockret överföres mikrobiologiskt till etanol, (3) en ytterligare, ny odlingslösning innehållande sockret sättes till överföringssystemet och därefter (4) avskiljes lösningen som innehåller framställd etanol.

En lösning innehållande etanol i så hög koncentration som cirka 100-200 mg/ml kan närmare bestämt på ett stabilt sätt er- hållas på mycket kortare tid jämfört med en konventionell jäst- fermenteringsmetod genom att den immobiliserade etanolbíldande mikroorganismen från början bringas i kontakt med en odlingslös- ning innehållande ett fermentativt socker, företrädesvis i en relativt låg koncentration, såsom 50-100 mg/ml, tillsammans med andra näringsmedel än det fermentativa sockret, vilka är nödvän- 40 450 151 4 diga för míkroorganismens tillväxt; socker överföres mikrobiolo- giskt till etanol, tills sockerkoncentrationen i lösningen sjunkit till icke mer än 20 procent av begynnelsekoncentrationen; däref- ter tillsättes en ytterligare, ny odlingslösning innehållande icke mindre än 100 mg/ml av sockret till överföringsreaktionssys- temet, tills etanol bildats i en koncentration av icke mindre än 75 mg/ml eller lämpligare, tills etanolen bildats i en koncentra- tion av icke mindre än 100 mg/ml.

En mikroorganism, som skall användas vid föreliggande förfa- rande, är en jäst eller en anaerob mikroorganism med en etanol- bildande aktivitet och denna mikroorganism väljes från den grupp som består av släktena Saccharomyces och Zymomonas. Exempel på dessa mikroorganismer är bryggerijäst, såsom Sacch. cerevisiae IFO 2018 och Sacch. uvarum IPO 1167; en destillerijäst, såsom Sacch. cerevisiae IFO 0216, Sacch. cerevisiae IFO 0233, Sacch. cerevisiae ATCC 4111 och Sacch. cerevisiae ATCC 4124; en sakéjäst, såsom Sacch. sake ATCC 26422 (japanska stammen Kyokai 7); en vin- jäst, såsom Sacch. cerevisiae IFO 1661, Sacch. cerevisiae ATCC 4098 och Sacch. cerevisiae ATCC 4921; Sacch. carlsbergensis OUT 7013; Sacch. pasterianus OUT 7122; Sacch. fermentati IFO 0422; Zymomonas mobilis IFO 13756; Zymomonas anaerobea ATCC 29501 och liknande. Alla här nämnda mikroorganismer är välkända och fritt tillgängliga.

Någon av de angivna jästsorterna eller anaeroba mikroorganis- merna, som immobiliserats i uppbärande geler, kan användas enligt föreliggande uppfinning och immobiliseringen av mikroorganismen kan genomföras på känt sätt, t.ex. en metod med sulfaterad poly- u sackaridgel (amerikanska patentskriften 4 138 292), en polyakryl-* amidgelmetod (Advances in Applied Microbiology, vol. 22, sid 1 (1977)) och liknande. Vid föreliggande uppfinning kæiimmobilise- ringen även åstadkommas enligt det förfarande som beskrives i den japanska patentpublikationen (ogranskad) 135295/1979. En ringa mängd mikrobceller blandas exempelvis med en lösning av ett gel- basmaterial och den erhållna blandningen-gelatineras i pelletter eller film enligt en känd gelningsmetod; blandningen sättes exem- pelvis droppvis till en lösning av ett gelatíneringsmedel för bildning av små plattor eller film med tjockleken 2 mm-Scm inne- hållande 0,01-10 öglor mikrobceller per 100 g (våt vikt) gel.

Gelen inkuberas därefter i en näringsmedelshaltig odlingslösning, som är lämplig för tillväxt av mikroorganismen, vid 15-45°C för 40 S 450 131 erhållande av en önskvärd, immobiliserad mikroorganism, som har ett tätt skikt av mikrobceller, som bildats i den uppbärande ge- len. Såsom gelbasmaterial kan man använda ett känt gelbasmaterial, såsom sulfaterad polysackarid, polyakrylamíd (t.ex. 2-metyl-5- vinylpyridinmetylmetakrylat-metakrylsyrasampolymer), natríumalgi- nat, polyvinylalkohol, cellulosasuccinat, kaseinsuccinat och lik- J nande. Vilken som helst sulfaterad polysackaríd, som icke inne- (vikt/vikt), företrädesvis 12-62 %, sulfat- andel (-SOSH) i molekylen kan användas såsom angiven sulfaterad håller mindre än 10 % polysackarid och exempel på sådana sulfaterade polysackarider innefattar karragenin, furcellaran och cellulosasulfat. Karragenín innehåller cirka 20-30 % (vikt/vikt) sulfatandel (SOSHJ i moleky- len. Å andra sidan innehåller furcellaran cirka 12-16 % (víkt/ vikt) sulfatandel i sin molekyl. Cellulosasulfat innehåller 12-62 procent (vikt/vikt) sulfatandel i molekylen och är tillgängligt under namnet "KELCO SCS" (KELCO 00., USA) (sulfathalt cirka 53 %) eller kan eventuellt framställas genom konventionell förestring av cellulosa med svavelsyra. _ Vid utförandet av föreliggande förfarande framställes först en näringsmedelslösning genom blandning av en kvävekälla, såsom jästextrakt, majsstöpvatten, en pepton eller liknande, och en el- ler ett flertal andra näringsmedel, som är nödvändiga för till- växten av mikroorganism, i vatten. Sådana andra näringsmedel kan väljas bland vitaminer, såsom tiamin, biotin, pantotensyra, iso- sítol eller liknande; mineral, såsom fosfat, magnesiumsalter, kalciumsalter, natriumsalter, kaliumsalter eller liknande; ammo- niumsalter, såsom ammoniumkloríd; och blandningar därav. Den mängd av dessa näringsmedel, som skall tillsättas, är uppenbara för fackmannen och exempelvis 0,05-1,0 % (vikt/vol) av en kvävekälla, 0,0001-0,1 % (vikt/vol) av ett mineral, 0,01-1,0 % (vikt/vol) av ett ammoniumsalt och en spårmängd vitaminer kan tillsättas till en näringsmedelslösning. Ett fermentatívt socker, såsom glukos, fruktos, sackaros, maltos eller liknande sättes därefter till den på så sätt framställda näringsmedelslösningen, företrädesvis i en relativt låg koncentration, såsom icke mer än cirka 10 % (vikt/ vol) (dvs icke mer än cirka 100 mg/ml), företrädesvis 5-10 % (vikt/vol) (dvs cirka 50-100 mg/ml), räknat på näringsmedelslös- ningen, för framställning av en odlíngslösning. Melass innehåller såväl fermentativt socker som andra näringsmedel, som är nödvän- diga för tillväxt av mikroorganismen. Därför kan en vattenhaltig Z5 40 450 0131 6 melasslösning såsom sådan användas såsom odlingslösning.

Förfarandet enligt uppfinningen kan utföras satsvis eller kontinuerligt under användning av en reaktionskolonnutrustning vid en temperatur av 15-45°C, som är lämplig för tillväxt av en immobiliserad mikroorganism, som skall användas.

Vid satsvis utförande av förfarandet bringas den immobilise- ' rade mikroorganismen först i kontakt med en odlingslösning under omröring för överföring av ett fermentativt socker i lösningen till etanol. När koncentrationen av sockret har sjunkit till exempelvis icke mer än cirka 20 procent av den ursprungliga kon- centrationen, företrädesvis icke mer än cirka 10 mg/ml, tillsät- tes ytterligare ny odlingslösning innehållande sockret till över- föringssystemet. Det nytillsatta sockret överföres likaledes till etanol och koncentrationen av sockret i lösningen sänkes ånyo.

Tillsatsen av ny odlingslösning, som innehåller sockret, kan eventuellt upprepas intermittent, tills etanol bildats i hög kon- centration, t.ex» 100 mg/ml till 200 mg/ml. Den ytterligare nya odlingslösning, som skall sättas till överföringsreaktionssyste- met, bör innehålla ett fermentativt socker i en relativt hög kon- centration, t.ex. icke mindre än cirka 100 mg/ml, företrädesvis tillsammans med andra näringsmedel än det fermentativa sockret, vilka erfordras för tillväxt av en immobiliserad mikroorganism, och varje gång när ytterligare lösning tillsättes, kan koncentra- tionen av sockret i lösningen, som skall tillsättas, intermittent ökas upp till cirka 250-400 mg/ml. Det är lämpligt att tillsatsen av ny odlingslösning, som icke innehåller mindre än 100 mg/ml socker, upprepas när koncentrationen av sockret i överföringsreak- tionssystemet sänkes till icke mer än cirka 20 % av dess ursprung- liga koncentration.

Vid kontinuerligt utförande av förfarandet användes en reak- tionskolonnutrustning fylld med en immobiliserad mikroorganism.

Först matas en odlingslösning innehållande icke mer än 100 mg/ml, lämplígare 50-100 mg/ml, av ett fermentativt socker-tillsammans med andra näringsmedel än det fermentativa sockret, vilka erford- ras för tillväxt av mikroorganismen, genom en ände av kolonnen för överföring av sockret till etanol och en på så sätt framställd lösning innehållande etanol bringas att strömma ut genom kolonnens andra ände. Tillförselhastigheten för angiven odlingslösning bör inställas så, att koncentrationen av sockret i utflödet från ko- lonnen icke är mer än cirka 20 % av dess begynnelsekoncentration, 'n , 40 7 450 151 företrädesvis icke mer än cirka 10 mg/ml. Därefter matas en ytter- ligare odlingslösning innehållande icke mindre än 100 mg/ml av sockret till kolonnen, och i detta fall är det speciellt lämpligt att inställa tillförselhastigheten för den nya odlingslösningen så, att koncentrationen av sockret i utflödet blir icke mer än % i en odlingslösning, som kontinuerligt skall tillföras kolonnen, av dess begynnelsekoncentration. Koncentrationen av sockret kan dessutom så småningom med tiden ökas upp till cirka 25-400 mg/ml. När detta förfarande utföres bibehåller en ímmobiliserad mikroorganism en utomordentlig etanolproduktivitet under lång tid och etanol kan framställas i hög koncentration, t.ex. högst cirka 200 mg/ml.

En serie kolonner kan vidare användas vid detta kontinuerliga förfarande genom inställning av tillförselhastigheten hos begyn- nelseodlingslösningen så, att koncentrationen av sockret i ett utflöde från den första kolonnen har sjunkit till icke mer än cirka 20 % än cirka 10 mg/ml, varvid en ytterligare odlingslösning innehål- av begynnelsekoncentrationen, företrädesvis icke mer lande sockret matas till den andra kolonnen tillsammans med utflö- det från den första kolonnen, varefter detta matningsförfarande upprepas i efterföljande kolonner. En läng kolonn kan även använ- das genom inställning av tillförselhastigheten hos begynnelseod- lingslösningen så, att koncentrationen av sockret i en viss del av kolonnen är sänkt till icke mer än cirka 20 %“av begynnelse- koncentrationen, att en ytterligare odlingslösning innehållande socker matas till den del av kolonnen, där sockerkoncentrationen har sjunkit, varefter detta matningsförfarande upprepas i efter- följande delar av kolonnen. Naturligtvis kan dessa senare förfa- randen öka produktionen av etanol per tidsenhet och etanol kan helt effektivt och kontinuerligt framställas i hög koncentration.

Avskiljandet av en lösning efter fullbordad överföringsreak~ tion kan åstadkommas på konventionellt sätt, sâsom destillation, centrifugering, dekantering och liknande. Vid användning av en kolonn kan en lösning lätt avskiljas såsom utflöde från kolonnen.

Uppfínningen åskådliggöres närmare i följande exempel. I exemplen bestämmes den etanolbildande aktiviteten hos en immobili- serad míkroorganism från den framställda mängden etanol. Det bör vidare observeras, att koncentrationen av ett fermentativt socker som här beskrives, har uttryckts genom beräkning av det som för _ glukos. ' ' i b! U1 40 450 131 - 8 Exempel 1. En ögla av Sacch. sake ATCC 26422 (japanska stammen Kyokai 7) blandades med en steriliserad, 4,5-procentig (vikt/vol) 1 vattenhaltig lösning av karragenin (framställd av The Copenhagen Pectin Factory Ltd under namnet “GENUGEL Type WG") (20 ml) vid 37°C. Blandningen sattes droppvis från ett munstycke till en 2-procentig (vikt/vol) vattenhaltig lösning av kaliumklorid (200 ml) för framställning av globulåra geler med diametern 4 mm.

En näringsmedelslösning framställdes genom blandning av ett jästextrakt.(0,15 %, vikt/vol), ammoníumklorid (0,25 %, vikt/vol), dikalíumvätefosfat (0,55 %, vikt/vol), magnesiumsulfatheptahydrat (0,025 %, vikt/vol), kalciumklorid (0,001 %, vikt/vol), citron- syra (0,1 %, vikt/vol) och natriumklorid (0,2S %, vikt/vol) i vat- ten och inställning av dess pH till 5,0.

Glukås sattes till de erhållna gelerna vid en koncentration av 10 % (vikt/vol) och de erhållna gelerna inkuberades i den glu- koshaltiga lösningen (S00 ml) under måttlig omskakning vid 30°C under 60 h för tillväxt av jästen i gelerna. Den på så sätt er- hållna, immobiliserade jästen hade en etanolbildningsaktivitet av 50 mg etanol/ml gel per timme.

Den immobiliserade jästen (20 ml) bringades i kontakt med näringsmedelslösning innehållande 10 % (vikt/vol) glukos (20 ml) vid 30°C under 1 timme. När koncentrationen av den återstående glukosen i lösningen sänkts till 2 mg/ml, tillsattes ytterligare, ny näringsmedelslösníng innehållande 40 % (vikt/vol) glukos (10 ml) och överföringsreaktionen av glukos till etanol fortsat- tes under samma betingelser. Såsom resultat erhölls en lösning innehållande etanol i en koncentration av 100 mg/ml (30 ml) efter en överföringsreaktion i 3 timmar. ' Exempel 2. exempel 1, erhölls en immobíliserad jäst. Den immobiliserade jäs- Enligt samma förfarande, som det som beskrivits i ten (20 ml) bringades i kontakt med en näringsmedelslösning [sam- ma som i exempel 1) innehållande 10 % (vikt/vol) glukos (20 ml) vid SOOC under 1 timme. När koncentrationen av den återstående glukosen i lösningen sjunkit till 2 mg/ml, tillsattes ytterligare, ny näringsmedelslösning innehållande 40 % (vikt/vol) glukos(5 ml) och överföringsreaktíonen för glukos till etanol fortsattes under ytterligare 1 h under samma betingelser. Därefter upprepades till- satsen av näringsmedelslösning innehållande 40 % (vikt/vol) glukos (5 ml) tre gånger med ett mellanrum om 1 h: Såsom resultat höll den immobiliserade jästen sin etanolbildningsaktivitet vid en 4,1 40 9 450 131 nivå av 50 mg/ml gel per timme under reaktionstiden och en lösning erhölls innehållande etanol i en koncentration av 125 mg/ml (40 ml) efter en överföringsreaktion om 5 timmar.

Exempel 3. exempel 2 utvanns den immobiliserade jästen genom dekantering.

Efter utförande av samma förfarande som beskrivits i Samma förfarande som beskrivits i exempel 2 upprepades under an- vändning av den utvunna, immobiliserade jästen för framställning av etanol. Etanolbildningsaktiviteten hos den utvunna, immobilí- serade jästen hade icke sjunkit ens efter utvinningen och fram- ställningen av etanol upprepades tio gånger och lösningen, som innehöll etanol i en koncentration av 125 mg/ml (40 ml) erhölls vid slutet av varje överföringsreaktíon om 5 timmar.

Exempel 4. samma förfarande som beskrivits i exempel 1, fylldes i en cylind- En immobiliserad jäst (20 ml), som framställts enligt risk kolonn (volym 30 ml). En näringsmedelslösning (samma som i (vikt/vol) glukos matades till ko- lonnen genom dess ena ände med en hastighet av 20 ml/h vid 30°C exempel 1), som innehöll 10 % för att bringa den ímmobiliserade jästen att flvta och strömmade ut ur kolonnen genom dess andra ände med samma hastighet. Efter inkuberíng vid 30°C under 60 h, medan lösningen matades med angi- ven tillförselhastighet, inställdes tillförselhastigheten på 7 ml/h för utströmníng av utflödet, som innehöll glukos i en kon- centration av icke mer än 10 mg/ml. Under dessa betingelser öka- des glukoskoncentrationen i näringsmedelslösningen, som skall ma- tas till kolonnen, så småningom så, att dess glukoskoncentration uppnådde 30 % (vikt/vol), räknat på lösningen efter 120 h. Under denna tid sänktes icke etanolbildningsaktiviteten hos den immobí- liserade jästen och utflödet, som innehöll etanol, erhölls i en koncentration om 150 mg/ml. När näringsmedelslösningen, som inne- höll 30 % i'en hastighet av 7 ml/h, var den immobiliserade jästen i kolon- nen fortfarande stabil under mer än en månad och utflödet, som (vikt/vol) glukos, kontinuerligt matades till kolonnen innehöll etanol i en koncentration av 146 mg/ml i medeltal, er- hölls konstant. s Exempel 5. Etanolframställning utfördes genom användning av en cylíndrisk reaktionskolonnutrustning, såsom visas i exempel 1, med en serie om tre kolonner 1, 2 och 3. Varje kolonn (volym3O1M) bereddes enligt samma förfarande som beskrivits ilexempel 4 genom ifyllning av en immobiliserad jäst (samma som i exempel 1) (20 ml) i kolonnen och matning av näringsmedelslösningen (samma som i .wømvA-fy. 37-; 40 450 131 10 exempel 1), som innehöll 10 % (vikt/vol) glukos vid en hastighet av 20 ml/h vid 30°C under 30 h. Kolonnerna förbands därefter i serie. Näríngsmedelslösningen, som innehöll 10 % (vikt/vol) glukos matades till botten av kolonn 1 genom ett tillförselrör 4 med en hastighet av 20 ml/h vid 30°C. Utflödet från kolonn 1 leddes till kolonn 2 tillsammans med näríngsmedelslösning, som innehöll 40 % ' (vikt/vol) glukos, som matades genom ett lösningstillförselrör 5 med en hastighet av 5 ml/h; Utflödet från kolonn 2 leddes likale- des till kolonn 3 tillsammans med näringsmedelslösning, som inne- höll 40 % (vikt/vol) glukos, som tillfördes genom ett lösnings- tillförselrör 6 med en hastighet av 5 ml/h. Utflödet, som innehöll etanol i en koncentration av 100 mg/ml, erhölls sålunda konstant från kolonn 3 genom ett utloppsrör 7 med en hastighet av 30 ml/h._ Exempel 6: I samma förfarande som beskrivits i exempel 4 användes % (vikt/vol) av en vattenhaltig melasslösning i stället för % (vikt/vol) glukos i begynnelsenäringsmedelslösningen (100 mg/ml såsom glukos) och koncentrationen av den vattenhaltiga melassen i den ytterligare näringsmedelslösningen ökade så småning- om upp till 60 % (vikt/vol) för kontinuerligt erhållande av utflö- de, som innehöll etanol i en koncentration av 142 mg/ml i en mängd av 5 ml/h.

Exempel 7._ Etanolframställníng utfördes genom användning av en reaktionskolonnutrustning_med omvänd kon, såsom visas i fig. 2.

En kolonn 1 i form av omvänd kon (volym 30 ml) framställdes genom fyllning av en immobiliserad jäst i kolonnen (20 ml), vilken jäst erhållits enligt samma förfarande som beskrivits i exempel 1, matning av en näringsmedelslösning (samma som i exempel 1), som innehöll 10 % (vikt/vol) glukos till botten av kolonnen 1 genom ett lösningstillförselrör 4 vid en hastighet av 20 ml/h vid 30°C och utflytning av lösningen från kolonnens 1 överdel genom ett ut- loppsrör 7 med samma hastighet. Efter inkubering vid 3000 under 40 h under matning av lösningen med angiven tillförselhastighet, inställes tillförselhastigheten på 6 ml/h för utflytning av ut- flödet, som innehöll glukos, i en koncentration av icke mer än mg/ml. Under dessa_betingelser ökade så småningom glukoskoncen- . trationen i näringsmedelslösningen, som skulle matas till kolon- nen, på så sätt att dess glukoskoncentration uppnådde 35 % _ (vikt/vol), räknat på lösningen, efter 72 h. Under denna tid sänk- tes icke den immobiliserade jästens etanolbildningsaktivitet och utflödet, som innehöll etanol i en koncentration av 175 mg/ml, 'vi 40 11 ' 450 131 erhölls konstant. När kolonnen i form av upp- och nedvänd kon användes, kan sålunda etanol effektivt framställas, eftersom bil- dad C02-gas vid en överföringsreaktion av ett fermentativt socker till etanol, effektivt kan avlägsnas.

Exemgel 8. Etanolframställning utfördes under användning av en cylíndrisk reaktionskolonnutrustning med ett cirkulatíonsrör, så- som visas i fig. 3. En kolonn 1 med ett církulatíonsrör 8, vilket har förmåga att cirkulera en del av en lösning, som flyter genom kolonnen 1 till kolonnens botten, framställes genom fyllning av en immobiliserad jäst (25 ml) som erhållits genom samma förfarande som beskrivits i exempel 1 i kolonnen, matning av en 20~procentig (vikt/vol) vattenhaltig melasslösning (100 mg/ml såsom glukos) till kolonnens 1 botten genom ett lösningstillförselrör 5 med en hastighet“av 25 ml/h vid 3006 för uppflytning av den immobilise- rade jästen i kolonnen och utflytning av lösningen från kolonnens topp genom ett utloppsrör 7 vid samma hastighet. Efter inkubering vid 30°C under 40 h under matning av lösningen med angiven till- förselhastighet matades S0-procentig (vikt/vol) av en vattenhaltig melasslösning (250 mg/ml såsom glukos) till kolonn 1 med en has- tighet av 10 ml/h, medan en del av lösningen, som strömmade genom kolonnen, återfördes till kolonnens botten genom röret 8 i en mängd av 100 ml/h. Koncentrationen av vattenhaltig melass, som återfördes genom röret 8, sänktes till icke mer än 10 mg/ml såsom glukos. Under dessa betingelser sänktes icke den immobiliserade jästens etanolbildningsaktivitet och utflödet, som innehöll etanol i en koncentration av 125 mg/ml utströmmade kontinuerligt från röret 7, eftersom koncentrationen av vattenhaltig melass i lös- ningen, som skulle matas till kolonnen, späddes med den genom rö- ret 8 återförda lösningen.

Exemyel 9. steriliserad, 4,5-procentig (vikt/vol) vattenhaltig karragenin- Blögla aVZymomonas mobilis IFO 13756 blandades med en lösning (20 ml) vid 37°C. Blandningen tillsattes droppvis från ett munstycke till en 2-procentig (vikt/vol) vattenhaltig kalium- kloridlösning (200 ml) för framställning av globulära geler med diametern 4 mm.

En näringsmedelslösning framställdes genom blandning av jäst- extrakt (0,15 %, vikt/vol), ammoniumklorid (0,Z5 %, vikt/vol), dikaliumvätefosfat (0,S5 %, vikt/vol), magnesiumsulfatheptahydrat (0,0Z5 %, vikt/vol), kalcíumklorid [0,001 %, vikt/vol), citron- syra (0,1 %, vikt/vol) och natriumklorid (0,Z5 %; vikt/vol) i 40 450 151 g 12 vatten och inställning av dess pH på 6,8.

Glukos sattes till näringsmedelslösningen i en koncentration av 10 % (vikt/vol) och de erhållna gelerna inkuberades i den glu- koshaltiga lösningen (S00 ml) vid 30°C under 90 h under kvävgas för tillväxt av den anaeroba mikroorganismen i gelerna. Den på så sätt erhållna, immobiliserade, anaeroba mikroorganismen hade en I etanolbildningsaktivitet av 77 mg etanol/ml gel och timme.

Den immobiliserade anaeroba mikroorganismen (20 ml) bringades i kontakt med näringsmedelslösningen, som innehöll 10 % (vikt/vol) glukos (20 ml) vid SOOC under 45 min. När koncentration av kvarva- rande glukos í lösningen sänkts till 2 mg/ml, tillsattes ytterli- gare, ny näringslösning innehållande 40 % (vikt/vol) glukos (10 ml) och överföringsreaktionen av glukos till etanol fortsat- tes under samma betingelser. Såsom resultat erhölls en lösning innehållande etanol i en koncentration av 100 mg/ml (30 ml) efter överföringsreaktionen under 2 timmar utan sänkning av aktiviteten hos den immobiliserade anaeroba míkroorganismen. šxempel 10. Enligt samma förfarande som beskrivits i exempel 9 erhölls en immobiliserad anaerob mikroorganism. Den immobiliserade anaeroba mikroorganismen (20 ml) bringades i kontakt med en nä- ringsmedelslösníng (samma som i exempel 9) innehållande 10 % (vikt/vol) glukos (20 ml) vid 3000 under 40 min. När koncentratio- nen av kvarvarande glukos i lösningen sänkts till 2 mg/ml, till- sattes ytterligare, ny näríngsmedelslösning innehållande 40 % (vikt/vol) glukos (5 ml), och överföringsreaktionen för glukos till etanol fortsattes under ytterligare 40 min under samma be- tingelser. Tillsatsen av näringsmedelslösning innehållande 40 % glukos (5 ml) upprepades därefter tre gånger med mellanrum om 40 min. Såsom resultat bíbehöll den immobiliserade anaeroba mikro- organísmen sin etanolframställningsaktivitet vid en nivå av 77 mg etanol/ml gel och timme och lösningen, som innehöll etanol i en koncentration av 125 mg/ml (40 ml) erhölls efter en överförings- reaktion om 200 min.

Exemgel 11._ Efter utförande av samma förfarande som beskrivits i exempel 10 utvanns den immobiliserade anaeroba míkroorganismen genom dekantering. Samma förfarande som beskrivits i exempel 10 upprepades under användning av den utvunna, immobiliserade, anaeroba mikroorganismen för framställning av etanol. Etanolfram- ställningsaktiviteten hos den utvunna, immobiliserade, anaeroba mikroorganismen sänktes icke ens efter utvinningen och framställ- --_»-__1_,-.¿ ,» .. 40 13 450 131 ningen av etanol upprepades tio gånger och en lösning innehållande etanol i en koncentration av 125 mg/ml (40 ml) erhölls efter varje överföringsreaktion om 200 min. _ Exempel 12. Enligt samma förfarande som beskrivits i exempel 5 genomfördes etanolframställningen under användning av en cylind- risk reaktionskolonnutrustníng, såsom den som visas i fig. 1. Var: je kolonn (volym 30 ml) bereddes genom fyllning med en immobili- serad, anaerob mikroorganism (samma som i exempel 9) (20 ml) i kolonnen och inmatning av en näringsmedelslösning (samma som i exempel 9) innehållande 10 % (vikt/vol) glukos vid en hastighet om 30 ml/h vid SOOC under 90 h. Kolonnerna 1, 2 och 3 förbands därefter i serie. Näringsmedelslösningen innehållande 10 % (vikt/vol) glukos inmatades i mitten av kolonn 1 genom ett lös- ningstillförselrör 4 med en hastighet om 30 ml/h vid 30°C..Utflö- det från kolonn 1 leddes till kolonn 2 tillsammans med en närings- medelslösning innehållande 40 % (vikt/vol) glukos, som inmatades P genom ett rör 5 med en hastighet om 7 ml/h. Utflödet innehållande etanol i en koncentration om 100 mg/ml utströmmade sålunda konti- nuerligt från kolonn 3 genom ett utloppsrör 7 med en hastighet av _ 44 ml/h. _w _ Exempel 13. Vid samma förfarande som beskrivits i exempel 10 _ användes en 20-procentig (vikt/vol) vattenhaltig melasslösning i stället för glukos i den ursprungliga näringsmedelslösningen (100 mg/ml såsom glukos) och koncentrationen av vattenhaltig me- lass-ökade så småningom upp till 60 % (vikt/vol) för erhållande av en lösning innehållande etanol i en koncentration av 125 mg/ml_ (40 ml) efter överföringsreaktionen av vattenhaltig melass till etanol under 3 h.

Exempel 14. Enligt samma förfarande som beskrivits i exempel 8 genomfördes etanolframställningen under användning av en cylind- risk reaktionskolonnsutrustning med ett cirkulationsrör, såsom den som visas i fig. 3. En kolonn bereddes genom fyllning i ko- lonnen av en immobiliserad, anaerob mikroorganism (25 ml), som erhållits genom samma förfarande som beskrivits i exempel 9, var- vid 20-procentig (vikt/vol) vattenhaltig metanollösning (100 mg/ml såsom glukos) inmatades i botten av kolonn 1 genom ett rör 5 med en hastighet av 40 mg/h vid SOOC under 90 h och utströmning från kolonnens överdel genom ett utloppsrör 7 med samma hastighet. 50-procentig (vikt/vol) melasslösning (250 mg/ml såsom glukos)_ inmatades därefter i kolonn 1 med en hastighet av 15 ml/h, medan ~ 450 131g ' 1; en del av lösningen, som strömmar igenom kolonnen, återfördes 'till kolonnens botten genom cirkulationsröret 8 vid en hastighet av 100 ml/h. Koncentrationen hos den vattenhaltiga melass, som återfördes genom röret 8, sänktes till icke mer än 10 mg/ml såsom glukos. Under dessa betingelser sänktes icke etanolframställnings- aktiviteten hos den immobiliserade, anaeroba mikroorganismen och utflödet innehållande etanol i en koncentration av 125 mg/ml ut- strömmade kontinuerligt från röret 7, eftersom koncentrationen hos vattenhaltig melass, som skall matas till kolonnen, utspäddes med den genom röret 8 äterförda lösningen. :w

Claims (9)

(J 450 131 I5 Patentkrav

1. Förfarande för framställning av_etanol genom en överförings- reaktion för ett fermentativt socker till etanol, k ä n n e t e c k- n a t av följande steg: (a) att en etanolbildande mikroorganism, som immobíliserats 1 en sulfaterad polysackarid, vilken innehåller icke mindre än 10 % (vikt/vikt) sulfat (-SO3H), bríngas i kontakt med en närings- medelshaltig odlingslösning som innehåller 50-100 mg/ml av ett fermentativt socker, varvid den etanolbildande mikroorganismen valts från den grupp som består av släktena Saccharomyces och Zymomonas och varvid ett tätt skikt av mikrobceller bildas i den sulfaterade polysackaridgelen, (b) att sockret mikrobiologiskt överföres till etanol, tills sockerkoncentrationen sänkts till icke mer än 20 % av dess be- gynnelsekoncentratíon, (C) att till överföringsreaktionssystemet sättes ytterligare, ny odlingslösningen innehållande icke mindre än 100 mg/ml av det fermentativa sockret, tills etanol bildas i en koncentration av icke mindre än 75 mg/ml, ' (d) och att därefter odlingslösningen innehållande bildad etanol avskiljes. '

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att tillsatsen av ny odlingslösning, som innehåller sockret och andra näringsmedel, genomföras tills etanol bildats i en koncen- tration av icke mindre än 100 mg/ml.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att tillsatsen av ny odlingslösning, som innehåller sockret och andra näringsmedel, upprepas intermittent eller kontinuerligt.

4. Pörfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att den nya odlingslösningen, som innehåller sockret och andra' näringsmedel, sättes till överföringsreaktionssystemet sa, att sockerkoncentrationen i odlingslösningen i överföríngsreaktions~ systemet inställes på 100-400 mg/ml.

S. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att överföringsreaktionen genomföres satsvis.

6. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att tillsatsen av ny odlingslösning upprepas, när koncentrationen av sockret i överföringsreaktionssystemet sänkts till icke mer än 20 % av dess ursprungskoncentration. .

7. Förfarande enligt något av krav 1-4, k ä n n e t e c k - 450 131 ra n a t därav, att överföríngsreaktionen genomföres kontinuerligt under användning av en eller flera kolonner fyllda med den ímmobi- liseradc mikroorganismen.

8. Förfarande enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att tillsatsen av ny odlingslösning upprepas kontinuerligt genom inställning av tíllförselhastigheten hos odlingslösníngen så, att koncentrationen av sockret i ett utflödc icke är mer än 20 % av dess bcgynnelsekoncentration.

9. Förfarande enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att kolonnen är en kolonn i form av en upp och ned vänd kon med ett tillförselrör för odlingslösning vid dess botten och ett utlopps- rör vid kolonnens topp. ___..._.._._.._--_.._.. 'êß