DE3022063A1

DE3022063A1 - Verfahren zur herstellung von aethanol

Info

Publication number: DE3022063A1
Application number: DE3022063A
Authority: DE
Inventors: Ichiro Chibata; Jyoji Kato; Mitsuru Wada
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1979-06-13
Filing date: 1980-06-12
Publication date: 1980-12-18
Also published as: BR8003540A; IT1132101B; US4350765A; GB2055121A; CA1143307A; DE3022063C2; FI71949C; PH16533A; FR2458586A1; SE450131B; FR2458586B1; ES8104407A1; GB2055121B; SE8004386L; IT8022740A0; ES492372A0; AU5918180A; AU531176B2; FI71949B; FI801829A

Description

HOFFMANN · EITEJE' '&. PAKTNER"

PAT E N TAN ΛνAET E 3 U 2 2 U O

DR. IKG. E. HOFFMANN (1?30·197<5) . DIPL-ING. W.EITtE · DR, RER, NAT, K, HOFFMANN · DIPL.-IMG.W, LEHN

DIFL.-ING. K. FHCHSLE . DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) ■ D-8000 MÖNCHEN 81 . TELEFON (089) 911087 - TELEX 05-2941P (PATHE)

33 581 o/fi

TANABE SEIYAKU Co.,Ltd. Osaka / Japan

Verfahren zur Herstellung von Äthanol

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Äthanol in hohen Konzentrationen unter Verwendung einer Hefe oder eines Anaerobiers, die auf einem. Trägergel immobilisiert sind und die Fähigkeit haben, Äthanol zu bilden. Nachfolgend werden die Hefen oder Anaerobier immer als immobilisierte Mikroorganismen bezeichnet. Die Erfindung betri^: c insbesondere die Stufen, daß man einen immobilisierten Mikroorganismus mit einer Kulturbrühe, die einen fermentativen Zucker als Quelle für Äthanol und andere Nährmittel für das Wachstum von Mikroorganismen enthält, in Berührung bringt und mikrobiologisch den Zucker in Äthanol umwandelt und dann die Äthanol in hoher Konzentration enthaltende Brühe abtrennt.

Seit dem Altertum wurde Äthanol durch Hefefermentations-Verfahren hergestellt. Obwohl bei üblichen Hef efermentations-Verfahren eine Kulturbrühe mit Äthanol in einer Konzentration von 50 bis 70 mg/1 nach 2O-bis 40-stündiger Fermentierung erhalten v/erden kann, dauert es doch mehr als einen

Q30051/OSÖS

Monat, um Äthanol in einer hohen Konzentration, wie 2OO mg/ml ·

herzustellen. Die übliche hefefermentative Verfahrensweise * _; ist außerdem wirtschaftlich unvorteilhaft, weil sie diskontinuierlich durchgeführt wird und sehr viel Arbeit und Kosten für die Gewinnung und Wiederverwendung der Hefezellen nach

Beendigung des absatzweisen Fermentationsverfahrens erfor- ^

dert. M

Vor einiger Zeit wurde gefunden, daß man gewisse brauchbare f_

Materialien herstellen kann, indem man ein komplexes Enzym- |

system von immobilisierten Mikroorganismen in ümwandlungs- 'ύ

reaktionen von geeigneten Substraten für gewünschte Materia- f-

lien verwenden kann. So ist bekannt, daß man aus einem korn- ^i

plexen Enzymsystem von immobilisierter Hefe, die durch Immo- 1

bilisierung von Hefezellen in Calciumalginatgelen erhalten -|

wurde, Äthanol aus Glukose herstellen kann (Biotechnology |

and Bioengineering, Band 19, Seiten 387 bis 397 (1977) ). |

Nach dem bekannten Verfahren wird die ümwandlungsreaktion %

von Glukose zu Äthanol durchgeführt, indem man immobilisierte k

-Hefe mit einer Glukose-und Calciumchlorid-haltigen Lösung %

behandelt. Die Produktivität dieses Verfahrens ist jedoch fj

niedrig, weil die Äthanol-bildende Aktivität der immobi- f,

lisierten Hefe niedrig ist und die Konzentration an gebilde- |

tem Äthanol liegt im äußersten Fall bei etwa 50 mg pro ml \.

der Reaktionsmischung, selbst wenn man sehr lange Umwand- |

T »._ a_A.L_ T\± TT C_l J 1 j_ Λ 3 1- -3 &

JLU22^C11 CIXXVITC=XXU^i. · ΐν.Χ.^ΐ3^ V CX. X aiii. CIIOWCXOC XlCt- Ct U W C J- VlCllE CZUWII UdI Ώ

Nachteil, daß sich mit Ablauf der Zeit die Enzymaktivität |

sehr schnell verringert, weil andere Nährmittel als Glukose, ξ

wie sie für das Wachstum der Hefe erforderlich sind, bei & der Umsetzung nicht verv/endet werden.

0 3 0051/0906

Die Erfinder haben kürzlich ein neues Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen entwickelt (Japanische Patentveröffentlichung 135295/1979). Gemäß diesem Verfahren wird für die Äthanolherstellung eine dichte Schicht von Mikrobenzellen auf einem Trägergel gebildet, wobei die dichte Schicht der nach diesem Verfahren erhaltenen Hefezellen eine Äthanol-bildende Aktivität entwickein, die mehr EEaIs 10-mal so groß ist wie die einer durch übliche Hefefer-Ementation erhaltene Kulturbrühe. So werden z.B. 50 mg/ml "Äthanol gebildet, wenn man 100 mg/ml eines fermentativen ^Zuckers mit der immobilisierten Hefe (1 ml des Gels) während ileiner Stunde in Berührung bringt. Die Äthanol-bildende Hefe £oder der Äthanol-bildende Anaerobier, der nach diesem Ver- £ fahren immobilisiert wurde, ist jedoch immer noch nicht "^ausreichend für eine wirtschaftliche Herstellung von Äthanol, — ve.ll. die Äthanol-bildende Aktivität der immobilisierten Mikroorganismen merklich abnimmt, wenn ein fermentativer Zucker fin einer Konzentration von mehr als 150 mg/ml verwendet wird. Wird z.B. der immobiliserte Mikroorganismus mit 2OO mg/ml des fermentativen Zuckers in Berührung gebracht, so zeigt er nur 30 % seiner Eigenaktivität, wogegen der immobilisierte Mikroorganismus im allgemeinen eine volle Äthanol-bildende Aktivität in Gegenwart von weniger als 100 mg/ml an fermentativem Zucker zeigt. Wenn man somit die ümwandlungsreaktion eines fermentativen Zuckers in Äthanol nach dem bekannten Verfahren unter Verwendung von immobilisierten Mikroorganismen durchführt, so muß der fermentative Zucker in einer Konzentration von weniger als 100 mg/ml eingesetzt werden und die Konzentration an gebildetem Zucker darf nicht mehr als 5O mg/ ml betragen, weil anderenfalls der Zucker die Äthanolproduktivität des immobilisierten Mikroorganismus erheblich vermindert .

030051/0906

Es wurde nun gefunden, daß immobilisierte Mikroorganismen eine überlegene Aktivität über lange Zeiträume beibehalten und Äthanol in hohen Konzentrationen, wie etwa 100 bis 200 mg/ml innerhalb verhältnismäßig kurzer Zeiten gebildet werden kann, wenn die Lmwandlungsreaktion des fermentativen Zuckers zu Äthanol durchgeführt wird, indem man einen immobilisierten Mikroorganismus mit einer Kulturrbrühe in Berührung bringt, die einen fermentativen Zucker =in einer verhältnismäßig niedrigen Konzentration sowie ^Nährstoffe, die sie von den fermentativen Zuckern unterrscheiden, und die für das Wachstum der Mikroorganismen ^erforderlich sind, enthalten, und wenn man anschließend die Zugabe von frischer, Zucker in verhältnismäßig hoher Konzentration und vorzugsweise auch die anderen Nährstoffe ^enthaltender Kulturbrühe wiederholt.

~Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Äthanol in hoher Konzentration unter Verwendung von immobilisierten Mikroorganismen zu zeigen. Verbunden mit der Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Äthanol in hoher Konzentration in verhältnismäßig kurzer Zeit zu zeigen. Diese Aufgaben, wie auch weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung und den Zeichnungen noch näher hervor.

Fig. 1 ist ein schematisches Fiießbild gemäß einer Ausfuhr ungs form der Erfindung und zeigt eine Reihe von zylindrischen säulenartigen Reaktionsgefäßen;

Fig. 2 ist ein schematisches Fließbild und zeigt eine andere Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung einer umgekehrten konischen Säule, und

- 10 -

030051/090S

Fig. 3 ist ein schematisches Fließbild und zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung einer zylindrischen Säule mit einem umlaufrohr .

Erfindungsgemäf rflrd ein Verfahren zur Herstellung von ätha-—nol in hoher xi-.nzentration unter Verwendung eines immobi-3-isierten'Mikroorganismus gezeigt, das dadurch gekennzeich-3net ist, daß man die immobilisierten Zellen von Äthanol- ^bildender Hefe oder eines Äthanol—bildenden Anaerobiers, ^wobei die Hefe oder der Anaerobier ausgewählt sind aus -der Gruppe der Genera Saccharomyces und Zymomonas mit einer =Nährkulturbrühe, die einen fermentativen Zucker enthält, in —Berührung bringt und dadurch den Zucker in Äthanol umwandelt.

ümwandlungsreaktion kann gemäß dem erfindunsgemäßen Ver fahren nach folgenden Stufen erfolgen:

:(1) Man bringt die immobilisierten Mikroorganismen mit einer Kulturbrühe, die einen fermentativen Zucker und rändere für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Nährmittel enthält; in Berührung;

(2) man wandelt den Zucker mikrobiologisch in Äthanol um;

(3) man gibt frische, den Zucker enthaltend Kulturbrühe zu dem ümwandlungsreaktionssystem und

(4) man trennt die das gebildete Äthanol enthaltende Brühe ab.

Man kann eine Brühe mit einem Äthanolgehalt in einer Konzentration von so hoch wie etwa 100 bis 200 mg/ml herstellen und zwar in einer viel kürzeren Zeit im Vergleich

—

030051 /090S

zu den üblichen Hefefermentationsverfahren, indem man zunächst den immobilisierten Äthanol-bildenden Mikroorganismus mit einer Kulturbrühe in Berührung bringt, die einen fermentativen Zucker in vorzugsweise verhältnismäßig geringer Konzentration, wie 50 bis 100 mg/ml, zusammen mit Nährstoffen, abgesehen von dem fermentativen Zucker, die für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlich sind, enthält, dann wird der Zucker mikrobiologisch in Äthanol umgewandelt, bis die Zuckerkonzentration in der Brühe auf nicht mehr als 20 % der Anfangskonzentration erniedrigt ist, und dann gibt man frische weitere Kulturbrühe, die nicht weniger als 100 mg/ml des Zuckers enthält, zu dem Umwandlungsreaktionssystem, bis das Äthanol in einer Konzentration von nicht weniger als 75 mg/ml und vorzugsweise von nicht weniger als 100 mg/ml gebildet wurde.

Als Mikroorganismen kann man erfindungsgemäß eine Hefe oder einen Anaerobier verwenden, der in der Lage ist, Äthanol zu produzieren, und solche Mikroorganismen werden ausgewählt aus der Gruppe der Genera Saccharomyces und Zymomonas. Beispiele für solche Mikroorganismen sind Brauerei-Gerste, wie Sacch. cerevisiae IFO 2O18 und Sacch.uvarum IFO 1167; Destillationshefe, wie Sacch. cerevisiae IFO 0216, Sacch. cerevisiae IFO O233, Sacch.cerevisiae ATCC 4111 und Sacch. cerevisiae ATCC 4124; eine Sakehefe wie Sacch. sake ATCC 26422 (Japanstamm Kyokai 7); eine Weinhefe, wie Sacch. cerevisiae IFO 1661, Sacch. cerevisiae ATCC 4098 und Sacch.cerevisiae ATCC 4921; Sacch.carlsbergensis OuT 7013; Sacch. paterianüs OÜT 7122; Sacch.fermentati IFO 0422; Zymomonas mobilis IFO 13756; Zymomonas anaerobea ATCC 295O1 und dergleichen. Alle diese erwähnten Mikroorganismen sind bekannt und sind frei und ohne Vorbehalte erhältlich.

- 12 -

030051/09Og

» ♦ *·ι

- 12 -

Jec"e der erwähnten Hefen oder Anaerobier/ immobilisiert auf einem Trägergel, kann erfindungsgemäß verwendet werden, wobei man die Immobilisierung der Mikroorganismen in bekannter Weise durchführen kann, z.B. nach dem Verfahren unter Verwendung' von sulfatisiertem Polysaccharidgel (US-PS 4 138 292), nach der Polyacrylamidgel-Methode (Advances in Applied Microbiology, Band 22, Seite 1 (1977) und dergleichen. Gemäß der Erfindung kann man die Immobilisierung auch nach der in der japanischen Veröffentlichung 135295/1979 beschriebenen Weise durchführen. Zum Beispiel kann man eine geringe Menge der Mikrobenzellen mit einer ein Gelmaterial enthaltenden Lösung vermischen und die erhaltene Mischung dann zu Granulaten oder Folien durch bekannte Geliermethoden gelatisieren, z.B. indem man die Mischung tropfenweise zu einer Lösung eines Geliermittels gibt, wobei man Granulate oder Filme von 2 mm bis 5 cm Dicke mit einem Gehalt von O₇OI bis 10 Löffelspitzen von Mikrobenzellen pro 100 g (Feuchtgewicht) dss Gels erhält. Diese Gele werden dann in einer für das Wachstum der Mikroorganismen geeigneten Nährkulturbrühe bei 15 bis 45 C inkubiert, wobei man den gewünschten immobilisierten Mikroorganismus erhält, der eine dünne Schicht der Mikrobenzellen in dem Trägergel enthält. Als Ausgangsgelmaterial kann man bekannte Gelmaterialien, wie sulfatierte Polysaccharide, Polyacrylamid (z.B. 2-Methyl-5-vinylpyridin-Methylmethacrylat-Methacrylsäure-Copolymer), Natriumalginat, Polyvinylalkohol, Zellulosesuccinat, Kaseinsuccinat und dergleichen verwenden. Jedes sulfat!- sierte Polysaccharid, das nicht weniger als 10 w/w %, vorzugsweise 12 bis 62 w/w %, Sulfat (-SO^H)-Gruppen im Molekül enthält, kann als eines der obenerwähnten sulfatisierten Polysaccharide verwendet werden und Beispiele für solche sulfatisierten Polysaccharide sind Carrageenan, Furcelleran und Zellulosesulfat- Carrageenan enthält etwa 20 bis 3O w/w %

- 13 -

030051/0906

* * ff *· ·* · »ff «I ff« 9t*· · · ·

Sulfat (SO₃H)-Gruppen im Molekül. Andererseits enthält Furcelleran etwa 12 bis 16 w/w % Sulfatgruppen im Molekül. Zellulosesulfat mit einem Gehalt von 12 bis 62 w/w % an Sulfatgruppen im Molekül ist auf dem Markt erhältlich unter dem Handelsnamen "KELCO SCS" (Kelco Co., USA) (Sulfatgehalt: etwa 53 %) , und kann erforderlichenfalls auch durch übliche Veresterung von Zellulose mit Schwefelsäure hergestellt werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt man zunächst eine Nährbrühe her, indem man in Wasser eine Quelle für Stickstoff,,, die ein Hefeextrakt, Maismaische, ein Pepton und dergleichen löst, und ein oder mehrere andere Nährmittel, wie sie für das Wachstum eines Mikroorganismus benötigt werden. Solche anderen Nährmittel sind z.B. Vitamine, wie Thiamin, Biotin, Pantothensäure, Inosit und dergleichen, Minerale, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Natriumsalze, Kaliumsalze und dergleichen; Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid und Mischungen davon. Die Menge an diesen zugegebenen Nährmitteln ist für den Fachmann geläufig und liegt z.B. bei 0,05 bis 1,0 w/v % für die Stickstoffquelle, 0,0001 bis 0,1 w/v % an Mineral, 0,01 bis 1,0 w/v % an Ammoniumsalz, wobei die Vitamine zu der Nährbrühe in Spuren-■lengen zugegeben werden. Dann gibt man einen fermentativen Zucker, wie Glukose, Fruktose, Saccharose, Maltose oder dergleichen zu der so hergestellten Nährbrühe und zwar vorzugsweise in einer verhältnismäßig niedrigen Konzentration von nicht mehr als etwa 10 w/v % (d.h. nicht mehr als etwa 100 mg/ml), vorzugsweise 5 bis 10 w/v % (d.h. etwa 50 bis 100 mg/ml) bezogen auf die Nährbrühe, wobei man dann eine Kulturbrühe erhält. Melasse enthält sowohl fermentativen Zucker als auch die anderen für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Nährmittel. Deshalb kann man wäßrige

- 14 -

Θ30051/0906

- 14 -

I Melasselösungen per se als Kultürbrühe verwenden.

Das erfindungsgeraäße Verfahren kann entweder diskontinuierlich oder kontinuierlich unter Anwendung von Säulenvor-I richtungen bei einer Temperatur von 15 bis 45°C, wie sie % für das Wachstum von immobilisierten Mikroorganismen geeig-I net &ind, angewendet werden. Bei einem absatzweisen VericJiren bringt man den immobilisierten Mikroorganismus zunächst

I mit einer Kulturbrühe in Berührung um den fermentativen Zucker

" in der Brühe in Äthanol umzuwandeln. Wenn dann die Konzen-

j tration an Zucker auch z.B. nicht mehr als etwa 20 % der

i Ausgangskonzentration und vorzugsweise nicht mehr als etwa

10 mg/ml erniedrigt ist, gibt man weitere frische Kultur- |j brühe, die den Zucker enthält, zu dem Umwandlungsreaktions- \ system. Ebenso wie vorher wird der neuzugegebene Zucker in 1 Äthanol umgewandelt und die Konzentration in der Brühe nimmt I wiederum ab. Erforderlichenfalls kann man die Zugabe an I frischer, den Zucker enthaltender Kulturbrühe, wiederholt ί vornehmen, bis Äthanol in einer hohen Konzentration von

I 100 mg/ml bis 200 mg/ml gebildet wurde. Die zusätzliche frische I Kulturbrühe, die man zu dem ümwandlungsreaktionssystem gibt, I soll den fermentativen Zucker in einer verhältnismäßig hohen I Konzentration, wie beispielsweise nicht mehr als etwa 100 mg/ml I vorzugsweise zusammen mit anderen Nährmitteln, wie sie für das Wachstum an immobilisierten Mikroorganismen erforderlich sind, enthalten, und jedesmal, wenn man zusätzlich Brühe hinzufügt, kann man die Konzentration des Zuckers in der zuzugebenden Brühe allmählich auf 250 bis 4OO mg/ml erhöhen. Es wird bevorzugt, daß die Zugabe an frischer Kulturbrühe,

- 15 -

030051/0906

die nicht weniger als 100 mg/ml Zucker enthält, wiederholt wird, wenn die Konzentration des Zuckers in dem Umwandkmgs— reaktions system auf nicht mehr als etwa 2O % der Ausgangskonzentration erniedrigt ist.

Wird das erfindungsgeraäße Verfahren kontinuierlich durchgeführt, so wendet man eine Säulen vorrichtung an, in welcher die Säule mit einem immobilisierten Mikroorganismus gepackt ist. Zunächst wird die Kultur brühe mit einem Gehalt von nicht mehr als 100 mg/ml und vorzugsweise 50 bis 100 mg/ml und ein fermentativer Zucker zusammen mit den Nährmitteln (die unterschiedlich sind-von dem fermentativen Zucker) und die erforderlich sind für das Wachstum der Mikroorganismen in das eine Ende der Säule eingeführt, um den Zucker in Äthahol zu überführen und die Brühe, die nun gebildetes Äthanol enthält, fließt am anderen Ende der Säule heraus. Die Zuführgeschwindigkeit der vorerwähnten Kulturbrühe soll so eingestellt sein, daß die Konzentration an Zucker in dem Abfluß der Säule nicht mehr als etwa 20% der Anfangskonzentration und vorzugsweise nicht mehr als etwa 1O mg/ml ausmacht. Anschließend gibt man weitere Kulturbrühe, die nicht mehr als 100 mg/ml an Zucker enthält in die Kolonne und in diesem Falle ist es ganz besonders bevorzugt, die Zuführgeschwindigkeit an der erwähnten frischen KuItürbrühe so einzustellen, daß die Konzentration des Zuckers in dem Abfluß nicht mehr als 20 % der Anfangskonzentration beträgt. Weiterhin kann man die Konzentration des Zuckers in der Kulturbrühe, die kon ΐ.χΓ«ϊίθϊ1.ΐθΪΊ iü. die Kuiüiiiit: eixiyeiüni: L wii'u, ctiiffiäi'iiJLcii LjiS auf etwa 250 bis 400 mg/ml im Laufe der Zeit erhöhen. Wenn dieses Verfahren durchgeführt wird, dann behält der immobilisierte Mikroorganismus über einen langen Zeitraum eine sehr gute Äthanolproduktivität bei und man kann Äthanol

- 16 -

030051/0908

in hoher Konzentration, bis zu etwa 200 mg/ml, erzeugen.

Wendet man bei dem kontinuierlichen Verfahren eine Reihe von Kolonnen an, so kann man die Zuführgeschwindigkeit in der Eingangskulturbrühe so einstellen, daß die Konzentration des Zuckers in dem Abfluß aus der ersten Kolonne auf nicht mehr als etwa 2O % der Anfangskonzentration, ~vorzugsweise nicht mehr als etwa 1O mg/ml erniedrigt wird, Ξ worauf man dann zusätzliche Kulturbrühe, die den Zucker enthält, in die zweite Kolonne zusammen mit dem Abfluß aus der ersten Kolonne einleitet, und dann wiederholt man diese Zuführmethode bei den folgenden Kolonnen. Man kann eine lange Kolonne verwenden, indem man die Zuführmenge der Anfangskulturbrühe so einstellt, daß die Konzentration des Zuckers in einem bestimmten Teil der Kolonne auf nicht mehr -als etwa 20 % der Ausgangskonzentration erniedrigt wird, ^worauf man dann weitere, den Zucker enthaltende Kulturbrühe in den Teil der Kolonne einführt, in dem die Zuckerkonzentration erniedrigt ist,worauf man dann dieses Zuführverfahren in den nachfolgenden Teilen der Kolonne wiederholt. Dieses letztere Verfahren kann die Produktivität an Äthanol prc Zeiteinheit und Äthanol außerordentlich wirksam erhöhen und ermöglicht die kontinuierliche Herstellung von Äthanol in hohen Konzentrationen.

Die Abtrennung der Brühe nach Beendigung der Umwandlungsreaktion kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z.B. durch Destillieren, Zentrifugieren oder Dekantieren.. Wendet man eine Säule an, so kann man die Brühe einfach als Abfluß aus der Säule abtrennen.

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung im einzelnen erläutert. Die Äthanol-bildende Aktivität der immobilisierten

- 17 -

030051/0806

Mikroorganismen wird anhand der Menge des gebildeten Äthanols bestimmt. Weiterhin ist festzuhalten, daß die Konzentration eines fermentativen Zuckers in der Beschreibung , den Beispielen und den Ansprüchen so ausgedrückt ist, daß sie sich jeweils auf Glukose bezieht.

BEISPIEL 1

Eine Löffelspitze Sacch. Sake ATCC 26422 (Japan Stamm Kyokai Ξ7) wurde mit einer sterilisierten 4,5 w/v %-igen wäßrigen :-Lösung von Carrageenan (hergestellt von The Copenhagen Pectin -Factory Ltd. , unter dem Handelsnamen "GENUGEL Type WG")

(20 ml) bei 37 C vermischt. Die Mischung wurde aus einer ^Düse tropfenweise zu einer 2 w/v %-igen wäßrigen Lösung von -Kaliumchlorid (200 ml) eingetropft, wobei man Gelkügelchen mit einem. Durchmesser von 4 mm erhielt.

Eine Nährbrühe wurde hergestellt, indem man ein Hefeextrakt (0,15 w/v %) Ammoniumchlorid (0,25 w/v %) , Dikaliumhydrogenphosphat (0,55 w/v %) , Magnesiumsulfatheptahydrat (0,025 w/v % Calciumchlorid (0„001 w/v %), Zitronensäure (0,1 w/v %) und Natriumchlorid (O₁,25 w/v %) in Wasser mischte und den pH auf 5,0 einstellte.

Zu dem oben erwähnten Gel wurde Glukose in einer Menge von 10 w/v S zugegeben und der oben erwähnte Gel wurde in der glukosehaltigen Brühe (500 ml) unter schwachem Schütteln 60 Stunden bei 30°C inkubiert, um die Hefe in dem Gel wachsen zu lassen. Die so erhaltene immoßiiisierte Hefe hatte eine äthanolbildende Aktivität von 5O mg Äthanol/ml Gel/h.

Die immobilisierte Hefe (20 ml) wurde mit der Nährbrühe, enthaltend 10 w/v % Glukose (20 ml) eine Stunde bei 30°C in Berührung gebracht. Nachdem sich die Konzentration der verbleibenden Glukose in der Brühe auf 2 rag/ml erniedrigt hatte, wurde frische Nährbrühe mit einem Gehalt von 40 w/v %

- 18-030051 /0906

t ■* * S ■» »1

1 · · · I > ft 1

1*» · .11 ) II* )

111 IVI) · · ·· SB -■

- 18 -

Glukosa (1O ml) zugegeben und die Dmwandlungsreaktion von Glukose in Äthanol wurde unter den gleichen Bedingungen weitergeführt. Als Ergebnis erhielt man eine Äthanol in einer Konzentration ν: η. 100 mg/ml (3O ml) enthaltende Brühe nach einer Umwand."! uj.jsreaktion _von 3 stunden.

BEISPIEL

Nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde immobilisierte Hefe hergestellt. Die immobilisierte Hefe (20 ml) wurde mit einer Nährbrühe (der gleichen wie im Beispiel 1) enthaltend 10 w/v % Glukose (2O ml) während einer Stunde bei 30⁰C in Berührung gebracht. Nachdem sich die Konzentration der in der Brühe verbleibenden Glukose auf 2 mg/ml erniedrigt hatte, wurde zusätzliche frische Nährbrühe mit einem Gehalt von 40 w/v % Glukose (5 ml) zugegeben und die ümwandlungsreaktion von Glukose in Äthanol unter den gleichen Bedingungen eine Stunde weiter durchgeführt. Anschließend wurde die Zugabe der 40 w/v % Glukose (5 ml) enthaltenden Nährbrühe noch dreimal in Abständen von einer Stunde wiederholt. Die immobilisierte Hefe behielt ihre Äthanol-bildende Aktivität in einer Menge von 50 mg/ml Gel/h während der Reaktionszeit bei und man erhielt eine Äthanol in einer Konzentration von 125 mg/ml QO ml) enthaltende Brühe nach einer Umwandlungsreaktionszeit von 5 Stunden.

BEISPIEL

Nach Durchführung des gleichen Verfahrenj wie im Beispiel 2 wurde die immobiliserte Hefe durch Dekantieren gewonnen. Das im Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung der so gewonnenen immobilisierten Hefe

- 19 -

030051/0906

Φ 4 ·· I · · t

ff * t

und unter Bildung von Äthanol. Die Äthanol-bildende Aktivität der wiedergewonnenen immobilisierten Hefe erniedrigte sich auch nicht nach der ^Wiedergewinnung und die Bildung von Äthanol wurde zehnmal wiederholt und man erhielt eine Brühe, die Äthanol in einer Konzentration von 125 mg/ml (40 ml) nach jeder Ümwandlungsreaktion nach 5 Stunden enthielt.

BEISPIEL

Eine immobilisierte Hefe (20 ml), hergestellt nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, wurde in eine zylindrische Säule (Volumen: 30 ml) gepackt. Eine Nährbrühe (die gleiche wie im Beispiel 1), enthaltend 1O w/v % Glukose wurde an einem Ende der Säule in einer Menge von 20 ml/h bei 30⁰C eingegeben und floß über die immobiliserte Hefe und am anderen Ende der Kolonne mit der gleichen Geschwindigkeit ab. Nach 6O-stündiger Inkubierung bei 30⁰C während der die Brühe in der vorerwähnten Zufuhrgeschwindigkeit eingeleitet wurde, wurde die Zufuhrmenge auf 7 ml/h reguliert, so daß der Abfluß die Glukose in einer Konzentration von nicht mehr als 1O mg/ml enthielt. Unter diesen Bedingungen wurde die Glukosekonzentration in der in die Kolonne eingeführten Nährbrühe allmählich so erhöht, daß die Glukosekonzentration 30 w/v %, bezogen auf die Brühe nach 120 Stünden erreichte. Während dieser Zeit erniedrigte sich die Äthanolbildungsaktivität der immobilisierten Hefe nicht und man erhielt in dem.Abfluß Äthanol in einer Konzentration von 15Ο mg/ml. Wenn die 3O w/v % Glukose enthaltende Nährbrühe kontinuierlich in die Kolonne in einer Menge von 7 ml/h eingeleitet wurde, dann blieb die immobilisierte Hefe in der Kolonne für mehr als 1 Monat unverändert aktiv und man konnte konstant in den Abfluß Äthanol in einer Konzentration von 146 mg/ml durchschnittlich erhalten.

- 2O -

©30051/0906

r« ·· · · tff ♦ *

· 4 0 0 ···«

TtEISPIEL 5

Die Bildung von Äthanol wurde durchgeführt unter Verwendung einer zylindrischen Kolonnenexnrichtung, wie sie in Fig. 1 gezeigt wird, und die aus einer Reihe von 3 Kolonnen 1, 2 und 3 bestand. Jede Kolonne (Volumen: 30 ml) wurde nach dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren zubereitet und mit immobilisierter Hefe (der gleichen wie im Beispiel 1) in einer Menge von 20 ml gefüllt und die Zufuhrmenge der Nährbrühe (der gleichen wie im Beispiel 1) enthaltend 10 w/v % Glukose, betrug 20 ml/h bei 30°C während 60 Stunden. Die Kolonnen waren in Serie geschaltet. Die Nährbrühe mit einem Gehalt von 10 w/v % Glukose wurde in den Boden der Kolonne 1 durch die Zufuhrleitung 4 in einer Menge von 20 ml/h bei 30 C eingeleitet. Der Abfluß aus Kolonne 1 wurde in die Kolonne 2 zusammen mit einer Nährbrühe, die 40 w/v % Glukose enthielt und die durch eine Brühzuführungsleitung 5 in einer Menge von 5 ml/h eingeleitet wurde, eingeleitet. Ebenso wurde der Abfluß aus der Kolonne 2 zur Kolonne 3 geführt und zwar zusammen mit einer 40 w/v % Glukose-haltigen Nährbrühe, die durch eine Brühzuführungsleitung 6 in einer Menge von 5 ml/h zugeleitet wurde. Auf diese Weise wurde konstant in einer Menge von 30 ml/h hinter der Kolonne 7 an dem Auslaßrohr 7 ein Abfluß erhalten, der Äthanol in einer Konzentration von 1 mg/ml enthielt.

BEISPIEL

Das im Beispiel 4 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei man eine 20 w/v %-ige wäßrige Melasselösung anstelle der 10 w/v % Glukose in der Eingangsnährbrühe (100 mg/ml als Glukose) verwendete und die Konzentration an wäßriger Melasse in der zusätzlichen Nährbrühe allmählich auf 60 w/v \ erhöhte und wobei man kontinuierlich einen Abfluß erhielt,

- 21 -

030051/09Og

• ··· I II! · tft )

- 21 -

in eirsr Konzentration von 142 mg/ml in einer Menge von 5 ml/h enthielt.

BEISPIEL 7

Die Äthanolherstellung wurde durchgeführt mit einer umgekehrten konischen Säulenanordnung, wie sie in Fig. 2 gezeigt wird. Eine umgekehrte konische Säule 1 (Volumen: 30 ml) wurde zubereitet, indem man in die Säule eine immobilisierte Hefe (20 ml), die in gleicher Weise,wie im Beispiel 1 beschrieben wurde, erhalten worden war, packte und dann die Nährbrühe (die gleiche wie im Beispiel 1) enthaltend 10 w/v % Glukose in den Boden der Kolonne 1 durch eine Brühzuführungsleitung 4 in einer Menge von 20 ml bei 30⁰C einleitete und die Brühe am Kopf der Kolonne 1 durch ein Auslaßrohr 7 in der gleichen Menge entnahm. Nach 40-stündiger Inkubierung bei 3O C und Zuführung der Brühe in der vorerwähnten Zuführungsmenge wurde die Zuführungsmenge auf 6 ml/h eingestellt, damit in dem Abfluß Glukose in einer Konzentration von nicht mehr als 10 mg/ml enthalten war. Unter diesen Bedingungen wurde die Glukosekonzentration in der Nährbrühe, die in die Kolonne eingeleitet wurde, allmählich erhöht, so daß die Glukosekonzentration auf 35 w/v %, bezogen auf die Brühe, nach 72 Stunden anstieg. Während dieser Zeit erniedrigte sich die Äthanolbildungsaktivität der immobilisierten Hefe nicht und man erhielt konstant in dem Abfluß einen Äthanolgehalt in einer Menge von 175 mg/ml. Wenn man die umgekehrte konische -Kolonne verwendete, kann man Äthanol sehr wirksam herstellen, weil CO₂-GaS, das sich bei der ümwandlungsreaktion des ferraentativen Zuckers in Äthanol bildet, sehr wirksam entfernt wird.

030051/0906

- 22 -

BEISPIEL 8

Die Äthanolherstellung wurde durchgeführt unter Verwendung einer zylindrischen Säulenanordnung mit einem Zirkulaticnsrohr wie in Fig. 3 gezeigt. Eire Kolonne 1 mit einem Zirkulationsrohr 8, durch welches ein Teil der durch die Kolonne 1 fließenden Brühe in den Boden der Kolonne zirkuliert wfcrde, wurde mit einer immobilisierten Hefe (25 ml), die in gleicher Weise wie im Beispiel 1 hergestellt worden war, gepackt, worauf dann 2O w/v % einer wäßrigen Melasselösung (100 mg/ml als Glukose) in den Boden der Kolonne 1 durch die Brühzufuhrleitung 5 in einer Menge von 25 ml/h bei 30°C eingeleitet wurden und durch die immobilisierte Hefe in der Kolonne strömte und am Kopf der Kolonne in der gleichen Menge wie der Zuführmenge durch ein Auslaßrohr 7 ausströmte. Nach 40-stündiger Inkubierung bei 3O°C während der die Brühe in der vorerwähnten Zufuhrmenge zugegeben wurde, wurde eine 50 w/v %-ige wäßrige Melasselösung (250 mg/ml als Glukose) in die Kolonne 1 in einer Menge von 10 ml/h eingeleitet, während ein Teil der durch die Kolonne fließenden Brühe vom Boden der Kolonne durch die Leitung 8 in einer Menge von 100 ml/h im Kreislauf geführt wurde. Die Konzentration der durch die Leitung 8 zirkulierenden wäßrigen Melasse erniedrigte sich auf nicht mehr als 10 mg/ml Glukose. Unter diesen Bedingungen erniedrigte sich die Äthanolbildungsaktivität der immobilisierten Hefe nicht und aus dem Rohr 7 konnte kontinuierlich ein Abfluß mit einer Jlthanolkonzentration von 125 mg/ml abgezogen werden, weil die Konzentration der wäßrigen Melasse in der der Kolonne zugeführten Brühe mit der umlaufenden Brühe durch die Leitung 8 verdünnt wurde.

- 23 -

030051/09QS

BEISPIEL 9

3022053

Eine Löffeispitze Zymomonas mobils IFO 13756 wurde mit einer sterilisierten 4,5 w/v %-igen wäßrigen Carageenanlösung (20 ml) bei 37 C vermischt. Die Mischung wurde tropfenweise aus einem Gel zu einer 2 w/v %-igen wäßrigen Kaliumchloridlösung (200 ml) gegeben, wobei man kugelförmige Gelperlchen mit 4 min Durchmesser erhielt.

S I

Eike Nährbrühe wurde hergestellt, indem man Hefeextra>t ^

(0,15 w/v %) Ammoniumchlorid (0,25 w/v %) Dxkali amhydrogen- %

phosphat (0,55 w/v %) , Magnesiumsulfat-Heptahydrat (0,025 w/v %) , 1

Calciumchlorid (0,001 w/v %) , Zitronensäure (O,1 w/v %) und ^

Natriumchlorid (0,25 w/v %) in Wasser vermischte und den pH I

auf 6,8 einstellte. %

Zu der Nährbrühe wurde Glukose in einer Konzentration von H§ 1O w/v % gegeben und das vorerwähnte Gel wurde in der gluko- 1 sehaltigen Brühe (500 ml) 90 Stunden bei 3O°C unter Stickstoff und unter Wachsen des Anaerobiers in dem Gel inkubiert. Der immobilisierte Anaerobier hatte eine Äthanol produzierende Aktivität von 77 mg Äthanol/ml Gel/h.

Der immobilisierte Anaerobier (2O ml) wurde mit der 10 w/v % Glukose (20 ml) enthaltenden Nährbrühe 45 Minuten bei 30⁰C in Berührung gebracht. Nachdem sich die Konzentration der verbleibenden Glukose in der Brühe auf 2 mg/ml erniedrigt hatte, wurde zusätzliche frische Nährbrühe mit einem Gehalt von 40 w/v % Glukose (1O ml) zugegeben und die Umwandlungs-Z"S5jition von GlüküSc ifi jvchtiiioi v/urde outer den gleichen Bedingungen fortgesetzt. Man erhielt eine Brühe, die Äthanol ' in einer Konzentration von 100 mg/ml (30 ml) entlifelt nach einer ümv/andlungsreakt ions zeit von 2 Stunden, ohne daß sich die Aktivität des immobilisierten Anaerobiers erniedrigte.

- 24 -

Q30051/090S

BEISPIEL 10

Wie in Beispiel 9 wurde ein immobilisierter Anaerobier hergestellt. Der immobilisierte Anaerobier (20 ml) wurde mit der gleichen Nährbrühe, wie im Beispiel 9, enthaltend 10 w/v % Glukose (2O ml) 40 Minuten bei 3O°C in Berührung gebracht. Nachdem die Konzentration der zurückbleibenden Glukose in der Brühe sich, auf 2 mg/ml erniedrigt hatte, wurde zusätzliche frische Nährbrühe mit einem Gehalt von 40 w/v % Glukose (5 ml) zugegeben und die Uinwandlungsreaktion von Glukose in Äthanol wurde weitere 40 Minuten unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt. Anschließend wurde die Zugabe der Nährbrühe mit einem Gehalt von 40 w/v % Glukose (5 ml) noch dreimal in 4O-minütigen Abständen wiederholt. Der immobilisierte Anaerobier hielt seine Äthanolproduktionsaktivität auf einem Niveau von 77 mg Äthanol/ml Gel/h und die Äthanolkonzentration in der Brühe betrug nach einer Umwandlungsreaktionszeit von 200 Minuten 125 mg/ml (40 ml).

BEISPIEL 11

ilan arbeitet in gleicher Weise wie im Beispiel 10, wobei der -immobilisierte Anaerobier durch Dekantieren gewonnen wurde. Das im Beispiel 10 beschriebene Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung des wiedergewonnenen immobilisierten Anaerobiers und unter Bildung von Äthanol. Die Äthanolproduktionsaktivität des wiedergewonnenen immobilisierten Anaerobiers erniedrigte sich auch nach der Wiedergewinnung nicht und die Herstellung von Äthanol vrarde lOrnal wiederholt, wobei man eine Brühe erhielt, die Äthanol in einer Konzentration von 125 mg/ml (40 ml) am Ende einer jeden ümwandlungsreaktxon von jeweils 200 Minuten enthielt.

- 25 -

030051/0906

BEISPIEL

12

Nach dem im Beispiel 5 beschriebenen Verfahren wurde Äthanol hergestellt unter Verwendung einer zylindrischen Säulenanordnung, wie sie in Fig. 1 gezeigt wurde. Jede Kolonne (Volumen: 30 ml) wurde zubereitet, indem man den in Beispiel 9 hergestellten immobilisferten Anaerobier (20 ml) r7in die Kolonne packte, und dann in einer Menge von 30 ml/h Twährend 90 Minuten bei 30°C Nährbrühe (die gleiche wie im ^Beispiel 9) mit einem Gehalt von 10 w/v % Glukose einleitete. EDann wurden die Säulen 1, 2 und 3 in Serie geschaltet. Die Ξ10 w/v % Glukose-haltige Nährbrühe wurde durch die Brühzufuhrleitung 4 in einer Menge von 30 ml/h bei 30 C in den Boden £der Kolonne 1 eingeleitet. Der Abfluß aus der Kolonne 1 wurde "dann zusammen mit einer 40 w/v %-igen Glukose, die durch die ^Leitung 5 in einer Menge von 7 ml/h eingeleitet wurde, in die ^Kolonne 2 eingeleitet. Ebenso wurde der Abfluß aus Kolonne -2 in die Kolonne 3 eingeleitet, und zwar zusammen mit einer _; ^Nährbrühe, die durch die Leitung 6 in einer Menge von 7 ml/h Bind mit einem Gehalt von 40 w/v % Glukose in die Kolonne 3 ein= zgeleitet wurde. Durch das Ausiaßrohr 7 der Kolonne 3 erhielt "man kontinuierlich einen Äthanol in einer Konzentration von 100 mg/ml enthaltenden Abfluß in einer Menge von 44 ml/h.

BEISPIEL

13

Bei dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren wurden 20 w/v % einer wäßrigen Melasse lösung ens-htsi l e der Glukose in der eingangs Nährbrühe (100 mg/ml als Glukose) verwendet und die Konzentration der wäßrigen Melasse wurde allmählich auf 60 w/v % erhöht, wobei man eine Äthanol in einer Konzentration von 125 mg/ml (40 ml) enthaltenden Brühe nach einer Umwandlungszeit der wäßrigen Melasse in Äthanol von 3 Stunden erhielt.

- 26 -

030051/0906

BEISPIEL 14

Nach dem im Beispiel 8 beschriebenen Verfahren wird Äthanol hergestellt unter Ver, andung einer zylindrischen Säulenanordnung mit einer Z-'rx-alationsieitung, wie in Fig. 3 gezeigt. Eine Kolonr,u 1 wurde zubereitet, indem man in diese ^eitien immobi.¹· is werten Anaerobier (25 ml) , der nach dem Verfahren gemäß Beispiel 9 erhalten worden war, packte. und 31ann 2O w/v % einer wäßrigen Melasselösung (100 mg/ml r^ls ZGlukose) in den Boden der Kolonne 1 durch die Leitung 5 in feiner Menge von 40 mg/h bei 3O°C während 90 Stunden einleitete, und in der gleichen Menge am Kopf der Kolonne durch :Hdie Auslaßleitung 7 den Abfluß entnahm. Dann wurden 5O w/v % =der Melasselösung (250 mg/ml als Glukose) in die Kolonne 1 in einer Menge von 15 ml/h eingeleitet, während ein Teil der -durch die Kolonne fließenden Brühe zu dem Boden der Kolonne ^durch die Zirkulationsleitung 8 in einer Menge von 100 mi/h ΞζίΓ^Ιίε^ wurde. Die Konzentration der wäßrigen Melasse, diö -durch die Leitung 8 zirkulierte, erniedrigte sich auf nicht weniger als 10 mg/ml als Glukose- unter diesen Bedingungen wurde die Äthanolproduktionsaktivität des immobilisierten Anaerobiers nicht erniedrigt und aus der Leitung 7 floß kontinuierlich ein Abfluß, der Äthanol in einer Konzentration von "5 25 mg/ml enthielt, weil die Konzentration der in die Kolonne eingeleiteten wäßrigen Melasse durch die durch die Leitung 8 zirkulierende Brühe verdünnt war,.

Θ30051/0906

Claims

HOFFMANN - EITÜE*& PARTNER " PATENTANWllTE 0 U Z Z U 0 ISiSO-WZa) - DIPL-ING. W-ElTLE - DK.RER. NAT. K. HOFFMANN - DIPL.-ING.W. LEHM DIPL.-ING. K. FOCHSLE - DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 {STERNHAUS} - D-8000 MDNCH EN Sl - TELEFON (OSJ) 911ÜS7 · TELEX 05-27619 (PATHtJ 33 581 o/fi TANABE SEIYAKU Co.,Ltd. Osaka / Japan Verfahren zur Herstellung von Äthanol Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Äthanol durch fermentative Umwandlung" von Zucker in Äthanol, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Äthanol-bildende Hefe oder -bildenden Anaerobier, der auf einem Trägergel immobilisiert ist, und wobei die Hefe oder der Anaerobier ausgewählt ist aus den Genera Saccharomyces und Zymomonas mit einer Kulturbrühe, die einen fermentativen Zucker enthält, im Berührung bringt.

2. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Äthanol-bildende Hefe oder -bildenden Anaerobier, der auf einem Trägergel aus der Gruppe sulfatiertes Polysaccharid, einem Polyacrylamid, Natriumalginat, Polyvinylalkohol, Zellulosesucchinat und Kaseinsuccinat immobilisiert ist, verwendet.

Ö30Ö51/090E

■ ·«· β»· ■■

ο __

3. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Äthanol-bildende Hefe oder -bildenden Anaerobier, der in einem sulfatisierten _-lysaccharid immobilisiert ist,das nicht weniger als 10 v/v.· * -JaIfat (-SO₃H)-Gruppen enthält, verwendet .

-A. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Anspruch 3, ^d a durch gekennzeichnet, daß das sulfa- £tisierte Polysaecharid Carrageenan, Furcellaran oder Zellu-Trlosesulfat ist.

^:^5. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Ansprüchen Vl₇ 2, 3 oder 4, dadurch gekenn zeichnet, daß eine immobilisierte Hefe oder Anaerobier mit einer dichten 'Schicht von in dem Trägergel gebildeten Mikrobenzellen . Verwendet wird.

6. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Ansprüchen 1, 2, 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwandlung in folgenden Stufen erfolgt:

(1) In-Berührung-Bringen des immobilisierten Mikroorganismus mit einer einen fermentativen Zucker enthaltenden Nährkulturbrühe;

(2) mikrobiologische Umwandlung des Zuckers in Äthanol;

(3) Zugabe von frischer.- den Zucker enthaltender Kulturbrühe für die Umwandlung in dem Reaktionssystem und

(4) Abtrennen der gebildetes Äthanol enthaltenden Brühe.

030051/0900

φ Ρ 9

7. Verfahren zur Herstellung von Äthanol nach Ansprüchen 1/2,3 oder 5 , dadurch gekennzeichnet, daß die Umwandlung durch folgende Stufen vorgenommen v/ird:

(1) In~Berührung-Bringen der immobilisierten Hefe oder des immobilisierten Anaerobiers mit einer nicht mehr als 100 mg/ml oder vorzugsv/eise 5O bis 100 mg/ml einer fermentativen Zucker enthaltenden Nährkulturbrühe ;

(2) mikrobiologische Umwandlung des Zuckers in Äthanol bis die Konzentration des Zuckers auf nicht mehr als 20 % der Ausgangskonzentration erniedrigt ist;

(3) Zugabe zu der Umwandlungsreaktion von zusätzlicher frischer Kulturbrühe, die nicht weniger als 100 mg/ml des Zuckers enthält, bis Äthanol in einer Konzentration von nicht weniger als 75 mg/ml gebildet wurde;

(4) Abtrennung der gebildetes Äthanol enthaltenden Brühe.

8. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe der frischen, Zucker enthaltenden Kulturbrühe durchgeführt wird, bis Äthanol in einer Konzentration von nicht weniger als 100 mg/ml gebildet wurde.

9. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe der frischen, Zucker enthaltenden Kulturbrühe absatzweise oder kontinuierlich wiederholt wird.

10. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe der Zucker enthaltenden frischen Kulturbrühe zu dem ümwandlungsreaktionssystem so erfolgt, daß die

-A-

030051/0906

Zuckerkonzentration in der Brühe des Umwandlungsreaktionssystems auf 100 bis 400 mg/ml eingestellt wird.

11. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die ümwandlungsreaktion absatzweise durchgeführt wird.

12. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe der frischen Kulturbrühe wiederholt wird, .wenn die Konzentration des Zuckers in dem ümwandlungsreaktionssystem auf nicht mehr als 2O % der Ausgangskonzentration erniedrigt ist.

13. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwandlung kontinuierlich durchgeführt wird unter Verwendung einer Mehrzahl von mit immobilisierten Mikroorganismen gefüllten Kolonnen.

14. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe der frischen Kulturbrühe kontinuierlich ■ wiederholt wird, indem man die Zuführmenge der Brühe so einstellt, daß die Konzentration des Zuckers in dem abfließenden Material nicht mehr als 20 % der Ausgangskonzentration ausmacht.

15. Verfahren zur Herstellung von Äthanol gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kolonne eine umgekehrte konische Kolonne ist mit einer Brüh-Zuführungsleitung am Boden und einer Ab-

030051/0908

t · 4 ft ff · 9 · »

» φ φ * mem · · t ·

führleitung am Kopf.

03 0 051/0306