JPS5913193B2 - 固定化酵母を用いる高濃度エタノ−ルの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はゲル状担体に固定化したエタノール生成能を有
する酵母（以下、単に固定化酵母と称する）を用いる高
濃度エタノールの製法に関し、更に詳しくは固定化酵母
を、該ゲル内で増殖するに必要な栄養素とエタノール生
成原料となる発酵性糖とを含有する培地に接触反応させ
ることよりなる高濃度エタノールの製法である。

古来よりエタノールは酵母を用いて発酵法で生産されて
いる。

しかし、その生産は回分操作で行なわれ、２０〜４０時
間の発酵で５０〜７０ｒＩＶＩｒＬｌのエタノールを含
有する培養液が得られるけれども、高濃度にエタノール
を生産するには１ケ月以上の発酵時間を要する。

しかも回分操作で発酵を終了した後、酵母を回収し再使
用するには多大の労力と費用を要し経済的にも有利な方
法ではなかった。

近年、固定化微生物を用いる有用な物質を生産する方法
が開発され、例えば酵母をアルギン酸カルシウムゲルに
固定化し、固定化酵母が持っている複雑な酵素系を利用
してグルコースからエタノールを生産し得ることも報告
されている。

（Ｂｉ。−ｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ、１９，３８７（
７７））しかし、この公知方法は固定化酵母が示すエタ
ノールの生成能が低く、長時間の反応で最大５０”Ｖｒ
ｒｔｌ程度のエタノールが生産される程度であって、そ
の生産性は低く、酵母菌体の増殖に必要な栄養素を含寸
ずエタノール原料のゲルコーストケル保型のための塩化
カルシウムとのみを含有する溶液と接触反応させている
ため、酵素の活性が反応時間の経過に伴って急速に低下
するという難点かあ。

つた。

先に、本発明者等は、ゲル表面に近い部分に微生物生菌
体層を形成せしめることにより微生物が持っている複雑
な酵素系が有効に利用できる新しい固定化微生物の調製
法を完成した（特願昭５３−４１４７１号（特公昭５６
−２９５１７号））。

しかるにこの方法でエタノール生成能を有する酵母を固
定化して得られる固定化酵母は、低濃度のエタノールを
生成する場合にはその性能を発現し通常の発酵法の約１
０倍以上のエタノール生産性を示し、例えば５０７ｒｖ
ｒＩｌｉ程度の濃度のエタノールは約１時間程度の反応
で生産される。

しかし高濃度の発酵性糖を含んだ培地を供給し高濃度の
エタノールを生産する場合は、その性能は著しく低下し
、例えば約１００７ＩＩｕＩＬｌ程度の濃度のエタノー
ルを生産する場合にはその性能のほぼ３０％が発現する
にすぎなかった。

いいかえれば、固定化酵母がその性能を１００受発現す
るのは、１００ｍμｌ以下の濃度で発酵性糖を含んだ培
地を供給する場合で、この時生産されるエタノールは約
５ （Ｆ＠Ａ／！以下であることが認められた。

本発明者らは、更に佃究を重ねた結果、反応の進行に伴
って発酵性糖の濃度が低下し、その濃度が例えば１０ｍ
本ｍｌ以下となった時点で発酵性糖を追加供給するよう
にすれば、固定化酵母はエタノールを効率よく生成する
能力を発現すること、捷た、固定化酵母に菌体増殖に必
要な栄養素を含む新鮮な培地を加え上記同様に反応を行
なうようにすれば、固定化酵母の性能を長時間保持し得
ること、従って、これらの操作を繰返、すことにより２
０ｏＩＩＩＶｆＩＬｌにも達する高濃度エタノールを安
定して生産し得ることを見出した。

即ち、本発明によれば多糖類からなるゲル状担体に固定
化したエタノール生成能を有する酵母を、発酵性糖約５
０〜１０ ｏ７ｎ％ｉおよび酵母の増殖に必要な栄養素
を含有する栄養培地と接触反応させ、該反応液中の発酵
性糖濃度が初期濃度の約２０％以下に低下した段階で、
更に約１００〜令以上の糖を含有する新鮮な栄養培地を
連続的に又は間けつ的に補給することにより高濃度にエ
タノールを製することができる。

本発明において用いる固定化酵母としては協会６号酵母
（Ｓａｋｅ ｙｅａｓｔ ＩＦＯ２３４６）、協会
７号酵ｍ （Ｓａｋｅ ｙｅａｓｔ ＩＦＯ２３４
７）等のエタノール生成能を有する酵母をゲル状担体に
固定化せしめたものであれば文献公知の固定化酵母を含
めて何でもよいが、とりわけ特願昭５３−４１４７１号
（特公昭５６−２９５１７号）に記載されている固定化
微生物の調製法に従って調製されるものが好ましい。

同特許出願の方法による固定化酵母は、あらかじめ、ゲ
ル１０１’（湿重量）に対して０．０１〜１０白金耳に
和尚する酵母生菌体を含み、かつ厚さ２ｒｆｔｒＩＬ〜
５ｃＩｒＬの粒状もしくは膜状に成形せるゲルを公知の
ゲル包括法によって調製し、ついで該ゲルを該酵母の生
育に適した栄養培地中で２５°Ｃ〜４０℃でインキュベ
ートしてゲル表面に近い個所に濃密な酵母生菌体層を形
成せしめることにより調製される。

ここでゲル基剤としては例えば、寒忍、カラギーナン、
ファーセレラン、アルギン酸ソーダ、ポリビニルアルコ
ール、セルロース・サクシネート、カゼイン・サクシネ
ート、２−メチル−５−ビニルピリジン・メチルアクリ
レート・メタクリル酸共重合体などを用いることができ
る。

本発明の高濃度エタノールの製造は、回分法によっても
またカラムを用いる連続法によっても実施することがで
きる。

回分法による場合、１ず例えば酵母エキス、コーンステ
イープリカー、ペプトン、イーストエキスの如き有機窒
素源、ビタミン源、アンモニウム塩、リン酸塩、有機酸
、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリ
ウム塩等の酵母がゲル内で増殖するに必要な栄養素を含
有する培地を調製し、これに例えばグルコース、糖蜜等
の発酵性糖を培地に対して約１０％つまｖ １ ｏｏｍ
Ｖｒｒｔｇ程度添加し、発酵性糖を含有する栄養培地を
調製する。

この培地に上記固定化酵母を加え、かくはん下に接触反
応させればすみやかに発酵性糖が資化されてエタノール
が生成し同時に反応液中の糖濃度が低下してくる。

そしてその濃度が例えば初期濃度の約２０％程度以下、
好ましくは約１０駒以下となった段階で発酵性糖を補給
すれば、発酵性糖は上記同様に資化されてエタノールが
生成し、同時に反応液中の該糖濃度は再び低下してくる
。

このように反応液中の糖濃度が低下した段階で発酵性糖
を補給していくようにすれば、最高２００ｍＶｒｆＬｌ
程度の高濃度にエタノールを生産することができる。

上記において反応液に追加補給する発酵性糖は、１０φ
か劇程度以上の高濃度に発酵性糖を含有する栄養培地と
するのが好ましく、補給のたびごとに補給培地中の糖濃
度を連続的または間欠的に増加させ、約１００〜４００
７７２々齢程度となるようにしていけば工い。

１だ連続法による場合、固定化酵母を充填したカラムを
用い最初１０ ｏ１１１９／ｆｉｚ程度の発酵性糖を含
んだ栄養培地なカラムの一端から連続的に供給し。

カラム内で固定化酵母によるエタノールの生成を行なわ
せ、カラムの他端から反応終了液を流出させる。

この場合、流出液中の発酵性糖の濃度が初期濃度の約２
０％以下、好ましくは約１昭％ｉ以下となるように、培
地の供給速度を調整し、かつ経時的に供給培地中の発酵
性糖濃度を増していけば固定化酵母は長期間効率よくエ
タノールを生産する能力を発現するので、最大２００ｍ
ｕＬｌの高濃度にエタノールを長期間安定して生産する
ことができる。

また数段のカラムを直列につなぐかあるいは長いカラム
を用いカラムの途中あるいは各カラムの中間において発
酵性糖の濃度が初期濃度の約２０％以下、好ましくは約
１０”Ｆｉ、ｉΩ以下となるように培地の供給速度を調
節し、それらの糖濃度低下個所に前記発酵性糖含有栄養
培地を供給していけば、高濃度エタノールの単位時間あ
たりの生産能力を増大させ得るから上記同様高濃度エタ
ノールを、より一層効率よ（連続的に生産することがで
きる。

尚、本明細書中糖濃度はすべてグルコースに換算した数
値で示した。

また、以下の実施例において固定化酵母のエタノール生
成能は、生産されるエタノール量から求めた。

実施例 １ 協会７号酵母の１白金耳を３７℃で、滅菌処理したカラ
ギーナン水溶液２０ＴＬｌに加えて混合した。

この混合液を２％塩化カリウム水溶液２００献中にノズ
ルから滴下し、直径４１ｆｔ７ＩＬの球状ゲルにした。

このゲル固定化酵母を酵母エキス０．１５％、塩化アン
モニウム０．２５％、リン酸水素二カリウム０．５５％
、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％、塩化カル
シウム０．００１％、クエン酸０．１％および塩化ナト
リウム０．２５％を含み、ｐ Ｈ５，０に調整した栄養
培地（以下、単に培地と略す）にグルコースを濃度１０
％となるように含有せしめたもの５００ｍ／中、３０℃
でゆるやかに６０時間振とうしゲル内で酵母菌体を増殖
させた。

かくして得られた固定化酵母は５０ｍ’！エタノール／
ゲル７７１４／ｈｒのエタノール生成能を発現した。

次いでこの固定化酵母２０１ｒＬｌをグルコース１０楚
含有せしめた培地２０ｍ／で３０°Ｃで静置し１．０時
間後に反応液中のグルコース残量が２％Ωとなった時点
で、グルコースを４０％含んだ培地１０ｙｒｔｉを補充
し、同条件で反応を続けた。

その結果、固定化酵母の性能は低下せず、総反応時間３
０時間後に１００ｍ％ｌの高濃度エタノールを３０ガ生
産することができた。

実施例 ２ 実施例１の如くして調製した固定化酵母の２０献をグル
コース１０％を含有セしめた培地２０ｍ１゜中、３０℃
で１時間反応させ反応液中のグルコース濃度を２７ｎｕ
ｒＬｌとした。

次いでこの反応液にグルコース４０％を含有せしめた培
地５ｄを補充し、以後同条件下１．０時間毎にこの補充
を３回繰返した。

その結果、固定化酵母は５０■エタノール／ゲノ１４／
ｈｒのエタノール生成能を維持し、総反応時間５時間で
１２５ｍ％ｉのエタノール溶液４０ＴＬｌを得た。

実施例 ３ 実施例２と同じ操作を行なった後、固定化酵母を回収し
、実施例２と同様にしてエタノールの生産を繰返した。

１０回繰返しても固定化酵母のエタノール生成能は低下
せず、反応時間５時間毎に１２５’？ｙｆｕｌのエタノ
ール溶液４０威を得た。

実施例 ４ 実施例１と同様にして得た固定化酵母２０Ｔｌｉを円柱
状カラム（容量３０ｍ／）に入れ、３０℃でグルコース
１０％を含有せしめた培地なカラムの他端から２０ｍ１
／ｈｒの速度で供給して固定化酵母を遊動させ、他端よ
り同じ速度で反応液を流出させた。

この供給速度で６０時間インキュベートした後、供給速
度を７ｍＶｈｒに調整し流出液中の糖濃度１０７ｎｕｒ
Ｌｌ以下に保ちながら供給培地中のグルコース濃度を傾
斜的に増し、１２０時間後に供給培地中のグルコース濃
度が３０％になる様にした。

この間、固定化酵母のエタノール生成能は低下せず１５
ｏｄｅのエタノールを含有する流出液が得られた。

更にグルコース３０％を含有せしめた培地を７ＴＬＶｈ
ｒの速度で供給しつづけたところ、カラム中の固定化酵
母は１ケ月以上安定で平均１４６ｍＬ！Ａｌｉのエタノ
ール含有流出液を連続生産できた。

実施例 ５ 実施例４と同様にして、先ず２０ｒｕ／７ｈｒの速度で
グルコース１０％を含有せしめた培地を６０時間供給処
理した固定化酵母を入れた円柱状カラムを３本調製した
後、このカラムを直列に接続し、最下段のカラムから上
方に／１６１ 、 ／／６．２ 、 Ａ ３とする（装
置は第１図参照）。

ＡＩのカラムの下からグルコース１０％を含有せしめた
培地を２０ｍｆ’ｆ１ｒの速度で供給し、／Ｉ６２のカ
ラムには４１からの流出液をその−ｆ−１供給すると共
に、グルコース４０楚を含有せしめた培地をも５ｍ４／
ｈｒの速度で合せ供給する。

／Ｉ６３のカラムには／Ｉ６２からの流出液をそのま１
供給すると共に、グルコース４０％を含有せしめた培地
をも５ｒｒｔ／／ｈｒの速度で合せて供給する。

かくして、／Ｖ；、３０カラムからはエタノールを１０
０ＴＬＩＡｌの濃度で含む反応液が３０ ｍ４’ｈｒの
速度で連続して得られた。

実施例 ６ 実施例４において、グルコース１０％を含有せしめた培
地に代えて２０％の糖蜜水溶液（グルコース換算濃度：
１００ ”９／ｙｍ）を用い、以下実施例４と同様に
して糖蜜濃度を６０％まで傾斜的に上昇させて反応する
ことにより、１４２’Ｐ、、Ｑのエタノール含有流出液
ｗ５ｍＶｈｒの速度で連続して得ることができた。

実施例 ７ 実施例１と同様にして得た固定化酵母２０ｙｄを第２図
に示す逆円錐型カラム（容量：３０ｍ／）に入れ、３０
℃でグルコース１０％を含有せしめた培地なカラムの下
端から２０ ｒｒｔ４／ｈｒの速度で供給し上端より同
じ速度で反応終了液を流出させた。

この供給速度で４０時間インキュベートした後、供給速
度を６ｍ４／ｈｒに調整し流出液中の糖濃度を１ｏ７ｆ
ｔ’ｊ７，１以下に保ちながら供給培地中のグルコース
濃度を傾斜的に増し７２時間後に供給培地中のグルコー
ス濃度が３５％になる様にした。

この間、固定化酵母のエタノール生成能は低下せず１７
５Ｔ２ＶＩｒＬｉのエタノール含有流出液を連続生産で
きた。

この様に逆円錐型カラムを用いた場合は反応に伴う炭酸
ガスを効率よく除去できるために更に効率よくエタノー
ルが生産できることがわかった。

実施例 ８ 実施例１と同様にして得た固定化酵母２５ｒｒＬｌを、
カラム途中からカラムの下端に反応液の１部を循環させ
る還流管を設けである円柱状カラム（装置は第３図参照
）に入わ、３０℃でグルコースの代りに２０％の糖蜜水
溶液（グルコース換算濃度＝１００１１ＶＩｒＬｉ）を
カラムの下端から２５ｍ／ｈｒの速度で供給して固定化
酵母を遊動させ、上端より同じ速度で反応終了液を流出
させた。

この速度で４０時間供給した後、５０％に濃度を上げた
糖蜜水溶液（グルコース換算濃度；２５０ｍＶＩｒＬｌ
）を１０ｍ４’ｈｒの速度で供給すると共に、カラム内
の反応液の１部を還流管中に１００ｙ７１４／ｈｒの速
度で循環させた。

循環液中のグルコース換算糖蜜濃度は１０ｒｒｔｌ／ｈ
ｒ以下に低下した。

供給培地中の糖蜜はこの循環操作により稀釈されるため
カラム内の固定化酵母エタノール生成能は低下せず１２
５ｍＶｒｒｔｉ：のエタノール含有流出液を連続生産で
きた。

【図面の簡単な説明】

第１図は円柱状カラムを用いる場合、第２図は逆円錐型
カラムを用いる場合、第３図は還流管を有する円柱状カ
ラムを用いる場合の各エタノールの製造装置の略図を示
す。 第１〜３図において１゜２および３は固定化酵母を充填
ぜるカラム、４゜５および６は発酵性糖含有栄養培地の
供給口、７は反応終了液の流出口、８は反応液を循環さ
せる還流管をそれぞれ示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 多糖類からなるゲル状担体に固定化したエタノール
   生成能を有する酵母を、発酵性糖約５０〜１００巧Δ屁
   および酵母の増殖に必要な栄養素を含有する栄養培地と
   接触反応させ、該反応液中の発酵性糖濃度が初期濃度の
   約２０％以下に低下した段階で、更に約１００ｍ９／Ｍ
   以上の糖を含有する新鮮な栄養培地を連続的に又は間け
   つ的に補給することを特徴とする高濃度エタノールの製
   法。 ２ 補給する培地中の発酵性糖の濃度を連続的に又は間
   けつ的に増加させながら培地を固定化酵母と接触反応さ
   せる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 固定化酵母を充填したカラムに培地を連続的に供給
   することによって固定化酵母と培地との接触反応を行な
   わせる特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４ カラムが・頂点部分に培地の供給口が設けてあ広底
   面部分に反応終了液の流出口が設けである逆円錐型カラ
   ムである特許請求の範囲第３項記載の方法。