KR840000126B1 - 부동화(不動化) 미생물을 이용한 고농도 에탄올 제조방법 - Google Patents

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Description

부동화(不動化) 미생물을 이용한 고농도 에탄올 제조방법

제1도는 일련의 원통형 반응장치를 사용하여, 본 발명의 실시예를 나타내는 공정 개요도.

제2도는 역(逆) 원추형 반응장치를 사용하여, 본 발명의 다른 실시예를 나타내는 공정개요도.

제3도는 순환관을 갖는 원통형 반응장치를 사용하여, 본 발명의 또 다른 실시예를 나타내는 공정개요도.

본 발명은 지지(支持)형 겔상물질에 부동화시킨 에탄올―제조작용을 가진 효모(酵母)나 혐기성 생물(嫌氣性生物) (이하에 부동화 미생물이라고 칭함)을 사용하여 고농도 에탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다.

더 구체적으로는, 본 발명은 부동화 미생물을 에탄올의 원료인 발효성 당(發效性糖) 및 미생물 성장에 필요한 발효성 당 이외의 영양소를 함유하는 배양즙(培養汁)과 접촉시키고 ; 미생물을 사용해서 당을 에탄올로 전환(轉換)시키며 ; 이어 상기한 바와같이 고농도로 제조된 에탄올 함유 배양즙을 분리하는 과정으로 되어 있다. 옛날부터, 에탄올은 효모―발효법으로 제조되었다.

재래의 효모―발효법에서는 50내지 70mg/ml 농도의 에탄올 함유배양즙을 20내지 40시간 동안 발효한후 얻을수 있었으나 200mgml의 고농도 에탄을을 제조하는데는 1개월 이상이 걸렸다.

그외에, 종래의 효모―발효방법은 벳취식(Batch Process)으로 실시되었으며 이 벳취식에서는 발효가 완료된 후 효모세포를 회수, 제사용하기 위해서는 방대한 작업과 경비를 요하므로 경제적으로 불리한 것이었다. 근자에, 적합한 기재를 필요로 하는 물질로 전환시키는 반응에 있어 부동화미생물의 복합효모계를 사용함으로서 아주 유용한 물질을 제조할 수 있다는 제안이 있었다.

예를 들면, 알긴산칼슘에 효모세포를 부동화시켜 제조되는 부동화효모를 복합효소계를 글루코오스로부터 에탄올을 제조하는데 사용할 수 있다고 기록하고 있다.

[Biotechnology 및 Bioengineering 제19권, 제387내지 397면 (1977)].

상술한 방법에 의하여 글루코오스의 에탄올 전환반응은 부동화효모를 글루코오스와 염화칼슘함유용액과 접촉하여 진행시킨다. 그러나, 부동화 효모의 에탄올 제조작용이 낮은 관계로 이 방법에 따른 생산성은 낮고, 또 제조된 에탄올 농도는 장시간의 변환반응이 종료된 후에도 약 50mg/ 반응혼합물 ml이하에 지나지 않는다. 또한 효모/성장에 필요한 글루코스 이외의 영양소를 이 반응에서는 사용하지 않고 있으므로, 이 방법은 반응시간 경과에 따라 효모작용이 급속히 저하되는 결점을 갖는다.

본 발명자들은 부동화미생물을 제조하는 신규방법을 전에 개발한바 있다. [일본국특허공개공보 제135295/1979호].

이 방법에 의하여 미생물 세포의 밀집층은 지지 겔내에 형성되며 또 에탄올 제조시에는, 이 방법에 의하여 부동화된 효모 세포의 밀집층은 재래의 효모―발효에 의해 수득한 배양즙을 사용할때보다 10배 이상이나 높은 에탄올 제조작용을 나타낸다.

예를들면, 100mg/ml의 발효성 당을 부동화 효모 (1ml의 겔)과 1시간동안 접촉하여 50mg/ml의 에탄올을 제조한다. 그러나, 발효성 당을 150mg/ml 이상의 농도로 사용할때에, 상기한 부동화 미생물의 에탄올―제조작용이 현저하게 제지되므로, 이와 같은 공지의 방법에 의하여 부동화시킨 에탄올―제조효모나 혐기성 생물을 공업적규모의 제조에 사용하는데는 역시 불만족한 점이 남게 된다.

예를들면, 200mg/ml의 발효성 당으로 접촉시킬때에, 부동화 미생물은 단지 그 고유활성의 30%만을 나타내는데 반하여 이 부동화 미생물은 통상 100mg/ml 이하의 발효성당 존재하에서는 에탄올―제조작용을 충분히 발휘하게 된다. 그리하여 발효성 당의 에탄올 전환반응을 공지 방법에 의하여 부동화 미생물을 사용해서 실시하는 경우는, 발효성 당은 100mg/ml 이하의 농도로 사용하여야 하고 또 제조되는 에탄올의 농도는 50mg/ml 이하이어야 하는데 이렇지 않으면 당은 부동화 미생물의 에탄올―제조작용에 현저한 감소를 유발하기 때문이다.

본 발명자들은, 비교적 낮은 농도의 발효성 당은 물론 미생물성장에 필요한 발효성당 이외의 영양소를 함유하는 배양즙은 부동화미생물과 접촉시키고 또 계속하여 비교적 높은 농도의 당을 바람직하게는 기타 영양소와 함께 함유하는 새로운 배양즙의 첨가를 반복함으로서 발효성 당의 에탄올 전환반응을 진행시키는 경우에, 부동화 미생물은 오랜동안 우수한 작용을 나타내며 에탄올을 비교적 짧은 시간내에 약100내지 200mg/ml나 되는 높은 농도로 제조할 수 있음을 새로 발견하였다.

본 발명의 한가지 목적은, 부동화 미생물을 사용하여 고농도 에탄올을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 짧은 시간동안에 고농도 에탄올을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기한 이런 목적과 그외의 목적 및 장점들은 첨부도면을 참조하여 아래에 기술한 것으로 부터 본 기술분야에 숙련된 자들에게는 명백하게 될 것이다.

본 발명에 의하면 부동화 미생물을 사용하여 고농도 에탄올을 제조하는 방법을 제공하는 것인바, 이것은 에탄올 제조효모나 혐기성 생물의 부동화 세포 [이 효모나 혐기성 사카로미세스(Saccharomyces) 및 지이모모나스(Zymomonas)의 속으로 되어 있는 군에서 선택한 것임]를, 발효성 당을 함유하는 영양소 배양즙과 접촉시켜 당을 에탄올로 전환시키는 것을 포함한다.

특히, 본 발명의 전환반응은 : (1)상기한 부동화 미생물을 발효성 당과 미생물 성장에 필요한 그 밖의 영양소를 함유하는 배양즙과 접촉시키고 : (2) 상기한 당을 미생물을 사용해서 에탄올로 전환시키며 ; (3) 전환반응 장치에 당을 함유 하는 새로운 배양즙을 추가하고 ; 그 다음

(4) 제조된 에탄올 함유즙을 분리하는 단계를 거쳐서 바람직하게 진행시킬 수 있다.

더 구체적으로는, 예를들면 미생물 성장에 필요한 발효성 당이외의 영양소와 함께, 발효성 당을 바람직하게는 50-100mg/ml와 같이 비교적은 낮은 농도로 함유하는 배양즙을 처음에는 부동화 에탄올제조 미생물과 접촉시키고 ; 즙에 있는 당의 농도가 초기 농도의 20%이하로 될때까지 미생물을 사용당을 에탄올로 전환시키며 ; 그 다음 에탄올이 75mg/ml 이상의 농도로 제조될때까지, 또는 더욱 적당하게는, 에탄올이 100mg/ml 이상의 농도로 제조될때까지 전환반응 장치에 100mg/ml 이상의 당을 함유하는 새로운 배양즙을 추가함으로서 종전의 효모―발효방법과 비교하여 휠씬 짧은 기간에 약 100내지 200mg/ml의 고농도에탄올을 함유즙을 안정되게 얻을수 있다.

본 발명에 사용하는 미생물은 에탄올 제조작용을 갖는 효모나 또는 혐기성 생물인데, 이 미생물은 사카로미세스 및 지이모모나스 속으로 구성되는 군에서 선택되는 것이다.

이들 미생물의 예로는 사크, 세레비시아(Sacch, cerevisiae) IFO 2018 및 사크 우바름(Saccch, uvarum) 1167과 같은 양조용 효모 ; 사크 ; 세레바시아 IFO 0216, 사크, 세레비시아 IFO 0233, 사크 세레비시아 ATCC 4111 및 사크, 세레비시아 ATCC 4124와 같은 증류주 효모 ; 사크, 사계 ATCC 26422와 같은 사계효모(일본 양조협회 7) ; 사크, 세레비시아 IFO 1661, 사크, 세리비시아 ATCC 4098 및 사크, 세라비시아 ATCC 4921과 같은 와인 효모 ; 사크, 카롤스베르겐시스( Sacch, carlsbergenis) OUT 7013 ; 사크, 파스테리이누스 OUT 7122 ; 사크, 페르멘타티(Sacch, fermentati) IFO 0422 ; 지이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) IFO 13756 ; 지이모모나스 아나에로비아(Zymomonas anaerobea) ATCC 29501 등속이다.

상기한 이들 모든 미생물은 본 기술분야에 잘 알려져 있어서 대중의 사용이 개방되어 있는 것이다.

지지 겔에 부동화 된 상술한 효모나 또는 혐기성 생물은 어느 것이든지 본 발명에 사용될 수 있고, 상술한 미생물의 부동화는 공지방법, 예를들면 황산화 다당류―겔방법(미합중국특허 제4,138,292호), 폴리아크릴아미드―겔 방법(Advances in Applied Microbiology, 제22권 제1면(1977)) 등속으로 실시할 수 있다.

본 발명에서 부동화는 또한 일본국 특허공개공보 제135295/1979호에 발표한 방법에 의하여 실시할 수 있다. 예를들면, 소량의 미생물 세포를 겔 기재의 용액과 혼합하고, 또 이때의 수득 혼함물을 공지된 겔화 방법에 의하여 펠릿이나 필름으로 겔화하는데 예를들면, 이 혼합물을 겔화제용액에 적가해서 100g겔당(습윤 중량) 0.01내지 10백금이량(白金耳量)의 미생물 세포를 함유하는 두께 2mm내지 5cm의 펠릿이나 필름을 얻게 된다.

그 다음, 이들 겔을 15내지 450℃에서 미생물성장에 적합한 영양제 배양즙에서 배양하여서 지지 겔내에 형성된 미생물 세포의 밀집층을 갖는 필요로 하는 부동화 미생물을 수득한다. 겔 기재로서, 황산화 다당류 폴리아크릴 아미드(즉, 2―메틸―5 비닐 피리딘―메틸―메타크릴산염―메타크릴산 공중합체), 알긴산 나트륨, 폴리비닐 알코올, 호박산 셀룰로스, 호박산카제인 등속과 같은 공지의 겔 기재를 사용할 수 있다. 이들 분자에, 10W/W이상, 적당하게는 12내지 62W/W%의 황산염(―SO₃H) 잔기를 함유하는 황산화다당류는 어느 것이든지 상술한 황산화 다당류로 사용할수 있는데, 이러한 황산화 다당류의 예로는, 카라게난, 푸루셀라란 및 황산 셀룰로스를 포함한다.

카라게난은 이 분자에 약 20내지 30W/W%의 황산염(SO₃H) 잔기를 함유한다. 한편, 푸르셀라란은 이 분자에 약 12내지 16W/W%의 황산염 잔기를 함유한다. 이 분자에 12내지 62W/W%의 황산염 잔기를 함유하는 황산 셀룰로오스는, 상표명 "KELCO·SCS"(KELCO 회사, 미국)로 시판되고 있고 (황산염 함유량 : 약53%), 또는 필요하면 셀루로즈를 황산으로 에스테르화시키는 선행방법에 따라 제조할수도 있다. 본 발명의 방법을 실시하는데는 먼저 효모 엑스, 옥수수침지 액, 펩톤 등속과 같은 질소원과 미생물의 성장에 필요한 한개 또는 수개의 기타 영양소를 물에 혼합하여 영양즙을 제조한다.

이같은 기타 영양소는, 티아민, 비오틴, 판토텐산, 이노스톨 등속과 같은 비타민; 인산염, 미그네슘염, 칼슘염, 나트륨염, 칼륨염 등속과 같은 광물 ; 염화 암모늄과 같은 암모늄염 ; 및 이들의 혼합물에서 선택할 수 있다. 첨가되는 이들 영양소의 량은 본 기술분야에 숙련된 자들에게는 명백하게 되겠지만 예를들면, 0.05내지 1.0W/V%의 질소원, 0.0001내지 0.1W/V%의 광물, 0.01 내지 1.0W/V%의 암모늄염과 극미량의 비타민을 영양즙에 첨가할 수 있다.

그다음, 이렇게 하여 제조된 영양즙에 글루코오스, 프럭토오스, 슈크로스, 말토오스 등속과 같은 발효성 당을 영양즙에, 영양제 즙을 기준으로 적당하게는, 약 10W/V%이하 (즉, 약100mg/ml이하), 적당하게는 5내지 10W/V% (즉, 약 50내지 100mg/ml)와 같은 비교적 낮은 농도로 가하여서 배양즙을 제조한다. 당밀은 발효성당과 미생물 성장에 필요한 그 밖의 영양소 양쪽 모두를 함유한다.

따라서 당밀 수용액은 그 자체를 배양즙으로 사용할 수 있다.

본 발명의 방법은, 사용되는 부동화 미생물의 성장에 적당한 15내지 45℃의 온도에서 원주상 반응장치를 사용하는 벳취공정 또는 연속공정에 의거 실시할 수 있다. 벳취공정에 따라 실시하는 경우에는, 부동화 미생물을 우선 교반중인 배양즙과 접촉시켜서 즙내의 발효성 당을 에탄올로 전환시킨다.

당의 농도가 예를들어, 처음 농도의 약 20%이하, 적당하게는 약 10mg/ml이하로 저하할 때에는, 당을 함유하는 새로운 배양즙을 전환 반응장치에 추가한다.

상기한 바와같이, 새로이 첨가된 당 또한 에탄올로 전환되어서 즙내의 당의 농도는 다시 저하된다. 필요에 따라서, 당을 함유하는 새로운 배양즙의 추가는, 에탄올이 100mg/ml 내지 200mg/ml의 높은 농도로 제조될 때까지 간혈적으로 반복할 수 있다.

전환반응 장치에 첨가되는 새로운 부가 배양즙은 적당하게는, 부동화 미생물의 성장에 필요한 발효성 당 이외의 영양소와 함께 약 100mg/ml 이상 비교적 높은 농도인 발효성당을 함유하여야 하므로 부가 즙을 첨가할때마다 첨가되는 즙에 들어있는 당의 농도를 약 250 내지 400mg/ml까지 간혈적으로 증가시킬수도 있다.

100mg/ml 이상의 당을 함유하는 새로운 배양즙의 첨가는, 전환반응 장치에서 당농도가 초기 농도의 약 20%이하로 저하될 때에 반복하는 것이 적당하다. 연속공정에 따라 본 방법을 실시하는 경우에는 부동화 미생물을 채운 원주상 반응장치를 사용한다.

먼저, 100mg/ml이하로 더욱 적당하게는, 50 내지 100mg/ml의 발효성 당을 미생물의 성장에 필요한 발효성당 이외의 영양소들과 함께 함유하는 배양즙을 원주상 장치의 일단을 통하여 공급하여서 당을 에탄올로 전환시키고 이와같이 하여 제조된 에탄올 함유즙은 원주상 장치의 타단을 통하여 유출된다.

상기한 배양즙의 공급속도는 주상체에서 유출하는 당의 농도를 초기농도의 약 20%이하로, 적당하게는 약 10mg/ml이하로 유지되도록 조정되어야 한다. 그 다음, 100mg/ml이상으로 당을 함유하는 부가배양즙을 주상체에 공급하고, 이 경우에 특히 유출물내의 당농도가 초기농도의 20%이하가 되도록끔 새로운 이 배양즙의 공급속도를 조정하는 것이 바람직하다. 부가해서 주상체에 연속하여 공급되는 배양즙에서의 당농도는 시간의 경과에 따라 약 250 내지 400mg/ml까지 점차로 증가시킬수 있다.

상술한 공적을 실시할때에, 부동화 미생물은 오랜기간동안 탁월한 에탄올―제조작용을 유지하고, 에탄올은 최대 약 200mg/ml와 같은 고농도로 제조할 수 있다. 또한 상술한 연속공정에 따라 일련의 주상체들을 사용할 수 있는바, 이는 초기 배양즙의 공급물을 조정하여 제1주상체로부터의 유출물의 당농도가 초기 농도의 약 20%이하로, 적당하게는 약 10mg/ml이하로 저하되게 하고, 제1주상체로부터의 유출물과 함께 제2주상체에 당을 함유하는 부가 배양즙을 공급하고, 그 이후에 연속되는 주상체들에 이와 같은 공급조작을 반복함으로서 상술한 연속과정에 사용할 수 있다.

긴 주상체를 또한 사용할 수 있는바, 이는 초기 배양즙의 공급률을 조정하여 주상체의 어느 부분에서든지 당의 농도가 초기농도의 약20%이하로 저하시키고, 당의 농도가 저하되는 주상체의 부분에 당을 함유하는 부가 배양즙을 공급하고, 또 이어 그 다음주상체의 계속되는 부qns들에서 이러한 공급과정을 반복함으로서 사용할 수 있다.

그 결과, 후자의 이들 공정은 매 단위 시간당 에탄올 생산량을 증가시킬수 있어서 고농도 에탄올을 아주 능률적으로 또 연속하여 제조할 수 있다.

변환반응을 완료한 후 즙의 분리는 증류, 원심분리, 경사분리 등과 같은 종래의 방법으로 실시할 수 있다. 주상체를 사용하는 경우에는 즙을 주상체의 유출물로서 용이하게 분리 할 수 있다.

아래의 실시예들은 본 발명을 상세하게 설명하나 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예에서, 부동화 미생물의 에탄올―제조작용은 제조된 에탄올의 량으로 측정된다. 또한, 본 명세서와 특허청구범위에 기술한 발효성 당의 농도는 글루코오스의 농도로 계산하여 나타낸 것이다.

[실시예1]

1백금이량(白金耳量)의 사크, 사게 ATCC 26422 (일본균주협회 7)을, 카라게닌(carrageenan)[상품명 게누겔 형 WG" (Genugel Type WG)로, 코펜하겐 펙틴 제조회사(Cppenhagen Pectin Factory Ltd)에서 제조한] 의 살균 소독한 4.5W/V% 수성용액(20ml)과 함께 370℃에서 혼합하였다. 이 혼합물을 노즐에서 염화 칼륨의 2W/V% 수성용액(200ml)에 적가하여서 직경 4mm인 구형 겔을 수득하였다. 효모엑스(0.15W/V%), 염화 암모늄(0.25W/V%) 인산수소 디칼륨(0.55W/V%), 황산마그네슘 헵타 수화물(0.025W/V%), 염화칼슘(0.001W/V%), 구연산(0.1W/V%) 및 염화 나트륨(0.25W/V%)을 수중에서 혼합하고, 이것의 pH를 5.0로 조정하여서 영양즙을 제조하였다.

상술한 바와같이 얻은 겔에 10W/V%의 농도로 글루코오스를 가하고 위에서 얻은 겔을 글루코오스 함유즙(500ml)에서 60시간 300℃에서 부드러운 진동을 행하면서 배양하여서 효모를 겔에서 성장하게 하였다.

이와 같이 하여 얻은 부동화 효모는 에탄올―제조 작용인 겔/시간의 50mg 에탄올/ml로 되었다. 부동화 효모(20ml)를 10W/V%의 글루코오스(20ml)를 함유하는 영양즙과 1시간 동안 300℃에서 접촉하였다. 즙에서 잔유한 글루코오스의 농도가 2mg/ml로 저하할때에 40W/V%의 글루코오스(10ml)를 함유하는 새로운 부가 영양즙을 가하고 글루코오스의 에탄올 전환반응을 상기한 바와 동일한 조건하에서 계속하였다. 이결과로 100mg/ml(30ml) 농도의 에탄올 함유즙을 3시간동안 전환 반응시켜 수득하였다.

[실시예 2]

실시예 1에 기술한 바와 동일한 과정에 의하여, 부동화 효모를 얻었다. 이 부동화 효모(20ml)를 의 글루코오스(20ml)를 함유하는 영양즙(실시예 1에서와 동일함)과 300℃에서 1시간동안 접촉하였다. 즙에 남은 글루코오스의 농도가 2mg/ml로 저하된 때에, 40W/V%의 글루코오스(5ml)를 함유하는 새로운 부가 영양즙을 가하고 글루코오스의 에탄올 전환반응을 상기한 바와 동일한 상태하에 1시간 동안 더 계속하였다.

그 다음, 40W/V%의 글루코오스(5ml)를 함유하는 영양즙의 부가를 한시간 간격으로 3차 반복하였다.

이 결과로, 부동화 효모는 반응기간동안 겔/시간의 50mg/ml의 수준으로 이것의 에탄올―제조작용애을 유지하였으며, 5시간 동안의 전환반응후에, 125mg/ml(40ml) 농도의 에탄올을 함유하는 즙을 얻었다.

[실시예 3]

실시예 2에 기술한 바와 동일한 과정을 실시한 후, 부동화효모를 경사 분리시켜 회수하였다. 에탄올을 제조하기 위해 회수한 부동화 효모를 사용하여서 실시예 2에 기술한 바와 동일한 과정을 반복하였다.

회수한 부동화 효모의 에탄올―제조작용을, 회수후에도 저하하지 않고 에탄올의 제조를 10차 반복하여서 125mg/ml(40ml) 농도의 에탄올 함유즙을 5시간 동안의 매 전환반응을 완료할때마다 얻었다.

[실시예 4]

실시예 1에 기술한 바와 동일한 과정에 의하여 제조한 부동화 효모(20ml)을 원통형 주상체(柱狀體)에 채웠다. (용량 : 30ml).

10W/V%의 글루코오스를 함유하는 영양즙(실시예 1에서와 동일한 것)을 30℃에서 20ml/시간의 율로 원주체에, 이것의 일단을 통하여 공급하여 고정된 효모를 부동(浮動)하게하고, 원주체의 타단을 통하여 동일한 율로 원주체에서 유출시킨다. 즙을 상기한 공급률로 공급하면서 60시간 30℃에서 배양한 후 공급률을 7ml/시간으로 조정하여서 10mg/ml 이하의 농도의 글루코오스 함유 유출물을 유출하였다.

이와 같은 상태하에 주상체에 공급되는 영양즙에서의 글루코오스의 농도는 점차로 증가하여서 이것의 글루코오스 농도는 120시간 후에는 즙으로 기준으로 30W/V%에 달하였다. 이 기간동안, 부동화 효모의 에탄올 제조작용은 저하되지 않고, 150mg/ml 농도의 에탄올 함유유출물을 얻었다. 또한, 30W/V%의 글루코오스를 함유하는 영양즙을 7ml/시간의 율로 주상체에 연속하여 공급할때에, 주상체내의 부동화효모는 1개월 이상 여전히 안정되여서 평균 146mg/ml농도의 에탄올 함유유출물을 계속적으로 얻었다.

[실시예 5]

일련의 3개 주상체 (1)(2) 및 (3)을 가진 제1도에 도시한 원통형 주상(柱狀)반응장치를 사용하여 에탄올 제조를 실시하였다. 실시예 4 에 기술한 바와 동일한 조작에 의하여 부동화 효모(실시예 1과 동일한)(20ml)을 주상체에 채우고, 10W/V%의 글루코오스를 함유하는 영양즙(실시예 1과 동일한)을 30℃에서 60시간동안 20ml/시간의 율로 공급하여서 각 주상체(용량 : 30ml)을 마련하였다. 그 다음 이들 주상체를 직렬로 연결하였다. 10W/V%의 글루코오스를 함유하는 영양즙을 30℃에서 20ml/시간의 율로 공급 파이프(4)를 통하여 주상체(1)의 밑으로 공급하였다.

주상체(1)에서의 유출물을 5ml/시간의 율로 즙 공급파이프(5)를 통하여 공급된 40W/V%의 글루코오스를 함유하는 영양즙과 함께 주상체(2)에 도입하였다.

이와같이 주상체(2)에서의 유출물을 5ml/시간의 율로 즙 공급 파이프(6)을 통하여 공급된 40W/V%의 글루코오스를 함유하는 영양즙과 함께 주상체(3)에 도입하였다. 이리하여 100mg/ml 농도의 에탄올을 함유하는 유출물을 30ml/시간의 율로 배출 파이프(7)을 통하여 주상체(3)에서) 일정속도로 수득한다.

[실시예 6]

실시예4 에 기술한 바와 동일한 조작으로, 처음의 영양즙내의 10W/V%의 글루코오스(글루코오스로서 100mg/ml) 대신에 20W/V%의 당밀 수용액을 대응하고 또 부가 영양즙에 있는 수성 당밀의 농도를 60W/V%까지 점차로 증가시켜서 142mg/ml농도의 에탄올을 함유하는 유출물을 5ml/시간의 율로 연속하여 얻게 하였다.

[실시예 7]

제2도에 도시된 역 원주형 반응장치를 사용하여 에탄올 제조를 실시하였다.

실시예 1에 기술한 바와 동일한 조작으로 얻은 부동화 효모(20ml)를 주상체에 채우고, 10W/V%의 글루코오스를 함유하는 영양즙(실시예 1과 동일한)을 20ml/시간의 율로 30℃에서 즙 공급 파이프(4)를 통하여 주상체(1)의 하부로 공급하고 그리고 배출 파이프(7)을 통하여 동일한 율로 주상체(1)의 정상에서 즙을 유출하는 것으로 역 원추형 주상체(1)(용량 : 30ml)를 마련하였다. 즙을 상기한 공급률로 공급하면서 40시간 동안 300℃에서 배양한 후, 공급률을 6ml/시간으로 조정하여서 10mg/ml이하 농도로 글루코오스를 함유하는 유출물을 유출하게 하였다.

이 상태하에 주상체에 공급되는 영양즙의 글루코오스농도를 점차로 증가시켜서 이것의 글루코오스 농도를 72시간후 즙을 기준으로 35W/V%에 달하게 하였다.

이 기간동안 부동화효모의 에탄올―제조작용은 저하되지 않았으며, 175mg/ml 농도의 에탄올 함유 유출물을 일정하게 얻었다. 이와같이 하여 역 원추형 주상체를 사용할때에 발효성 당의 에탄올 전환반응에서 형성된 CO₂가스는 효율적으로 제거되므로 에탄올을 효율적으로 제조할 수 있다.

[실시예 8]

제3도에 도시된 바와같은 순환관을 가진 원통형 원주상 반응장치를 사용하여 에탄올 제조를 실시하였다. 주상체의 밑에 주상체(1)을 통하여 흐른 즙의일부를 순환시킬 수 있는 순환관(8)을 가진 주상체(1)을 실시예 1에 기술한 바와 동일한 조작으로 얻은 부동화 효모(25ml)를 채우고, 20W/V%의 당밀 수용액(글루코오스로서 100mg/ml)을 30℃에서 25ml/시간의 율로 즙 공급파이프(5)를 통하여 주상체(1)의 하부로 공급하여서, 주상체에서 부동화 효모를 부동(浮動)하게 하여 배출 파이프(7)을 통하여 주상체의 정상에서 상기한 율로 즙을 유출하게 하였다. 즙을 상기한 공급률로 공급하면서 40시간 동안 30℃에서 배양한후, 50W/V%의 수성 당밀 용액(글루코오스로서 250mg/ml)을 10ml/시간 율로 주상체(1)에 공급하는 동시에 주상체를 통해 흐르는 즙의 일부를 100ml/시간의 율로 관(8)을 통하여 주상체의 하부로 순환하게 하였다. 관(8)을 통하여 순환하는 수성 당밀의 농도를 글루코오스로서 10mg/ml이하가 되도록 저하시켰다.

이 상태하에, 주상체에 공급되는 즙에서 수성 당밀의 농도는 관(8)을 통하여 순수한 즙으로 희석되였으므로 부동화 효모의 에탄올 제조작용은 저하되지않고, 125mg/ml 농도의 에탄올을 함유하는 유출물은 파이프(7)에서 연속하여유출하였다.

[실시예 9]

1백금이량의 지이모모나스 모빌스(Zymomonas Mobils) IFO 13756을 살균 소독한 4.5W/V%의 수성 카라게닌 용액(20ml)과 37℃에서 혼합하였다. 이 혼합물을 노즐에서 2W/V%염화 칼슘 수용액 염화물(200ml)에 적가하여서 직경 4mm인 구상(球狀)겔을 얻게 하였다.

영양즙을 효모 엑스(0.15W/V%), 염화암모늄(0.25W/V%), 인산 수소 디 칼륨(0.55W/V%)황산 마그네슘 헵타 수화물(0.025W/V%), 염화칼슘(0.001W/V%), 구연산(0.1W/V%) 및 염화 나트륨(0.25W/V%)을 수중에서 혼합하고 이것의 pH를 6.8에 조정하여서 제조하였다.

글루코오스를 10W/V% 농도의 영양즙에 가하고 상기에서 얻은 겔을 질소하에서 90시간동안 이 글루코오스를 함유하는 즙(500ml)에서 300℃로 배양하였다. 이와 같이하여 얻은 부동화 혐기성생물(嫌氣性生物)은, 겔/시간의 에탄올―제조작용이 77mg 에탄올/ml이었다. 부동화 혐기성 생물(20ml)를 10W/V%의 글루코오스(20ml)를 함유하는 영양즙과 300℃에서 45분 동안 접촉하였다.

즙에 남아있는 글루코오스의 농도가 2mg/ml로 저하할때에 40W/V%의 글루코오스(10ml)를 함유하는 새로운 부가 영양즙을 가하고 글루코오스의 에탄올 전환반응을 상기한 바와 동일한 상태하에서계속하였다.

이 결과로, 100mg/ml 농도의 에탄올을 함유하는 즙 (30ml)을 2시간동안 전환 반응시킨후에도 부동화 혐기성 생물의 작용을 저하하지 않은 상태로 수득하였다.

[실시예 10]

실시예 9에 기술한 바와 동일 조작에 의하여 부동화 혐기성 생물을 얻었다.

이 부동화 혐기성 생물(20ml)을 10W/V%의 글루코오스(20ml)을 함유하는 영양즙(실시예 9와 동일한)과 40분 동안 300℃로 접촉하였다. 즙에 남아있는 글루코오스의 농도가 2mg/ml로 저하될때 40W/V% 글루코오스(5ml)를 함유하는 새로운 부가 영양즙을 가하여서 글루코오스의 에탄올 전환반응을 상기한 바와 동일 상태하에 40분동안 더 계속하였다. 그다음, 40W/V%의 글루코오스(5ml)를 함유하는 영양즙의 첨가를 40분 간격으로 3차 반복하였다.

이 결과로, 부동화 협기성 생물은 겔/시간의 77mg에탄올/ml의 수준으로 이것의 에탄올―제조작용을 유지하고, 또 200분 동안 전환반응을 한 후 125mg/ml(40ml)농도의 에탄올을 함유하는 즙을 얻었다.

[실시예 11]

실시예 10에 기술한 바와 동일한 조작을 실시한 후 부동화 혐기성 생물을 경사 분리하여 회수하였다. 실시예 10에 기술한 바와 동일한 조작을 회수한 부동화 혐기성 생물을 사용하여 반복함으로서 에탄올을 제조하였다. 회수한 부동화 혐기성 생물의 에탄올―제조작용은 회수한 후에도 저하하지 않았으며, 또 에탄올의 제조를 10차 반복하여서 125mg/ml(40ml)농도의 에탄올을 함유하는 즙을 200분 동안의 매 전환반응 끝에 얻었다.

[실시예 12]

실시예 5에 기술한 바와 동일한 조작에 의하여 제1도에 도시한 원통형 원주상 반응장치를 사용하여 에탄올 제조를 실시하였다. 부동화 혐기성 생물(실시예 9에서와 동일한 것)(20ml)을 주상체에 채우고 10W/V%의 글루코우스를 함유하는 영양즙(실시예 9에서와 동일한)을 90시간동안 30℃에서 30ml/시간 율로 공급하여서 각 주상체(용량 : 30ml)를 갖춘 다음 주상체 (1), (2) 및 (3)을 직렬로 연결하였다. 10W/V%의 글루코오스를 함유하는 영양즙을 30C에서 30ml/시간의 율로 즙 공급 파이프(4)를 통하여 주상체 (1)의 하부로 공급하였다. 주상체(1)에서의 유출물을 7ml/시간의 율로 파이프 (5)를 통하여 공급한 40W/V%의 글루코오스를 함유하는 영양즙과 함께 주상체(2)에 도입하였다.

이와같이, 주상체(2)에서의 유출물을 파이프(6)을 통하여 공급된 40W/V%의 글루코오스를 함유하는영양즙과 함께 7ml/시간의 율로 주상체(3)에 도입하였다. 그리하여, 100mg/ml농도의 에탄올을 함유하는 유출물을 44ml/시간의 율로 배출파이프(7)을 통하여 주상체(3)에서 연속하여 유출하였다.

[실시예 13]

실시예 10에 기술한 바와 동일한 조작에서, 20W/V%의 수성 당밀용액을 처음의 영양즙(글루코오스로서 100mg/ml)에 있는 글루코오스를 대신하여 사용하고, 또 이 수성당밀의 농도를 60W/V%까지 점차로 증가시켜서 3시간 동안 수성 당밀의 에탄올 전환반응을 진행시킨후 125mg/ml(40ml)농도의 에탄올을 함유하는 즙을 얻게 하였다.

[실시예 14]

실시예 3에 기술한 바와 동일한 조작에 의하여, 에탄올의 제조를 제3도에 도시한 순환관을 가진 원통형 원주상 반응 장치를 사용하여 실시하였다.

실시예 9에 기술한 바와 동일한 조작으로 얻은 부동화 혐기성 생물(25ml)을 주상체에 채우고, 20W/V%의 수성당밀 용액(글루코오스로서 100mg/ml)을 90시간동안 30℃에서 40mg/hr의 율로 파이프 (5)를 통하여 주상체(1)의 하부로 공급하고, 그리고 이 율로 배출 파이프(7)을 통하여 주상체의 정상에서 유출하게 하는 주상체(1)을 갖춘다음 50W/V%의 당밀 용액(글루코오스로서 250mg/ml)을 15ml/시간의 율로 주상체(1)에 공급하고 동시에 주상체를 통하여 흐른 즙의 1부를 100ml/시간의 율로 순환관(8)을 통하여 주상체의 밑으로 순환하게 하였다. 관(8)을 통하여 순환하는 수성 당밀의 농도를 글루코오스로서 10mg/ml이하로 저하하였다.

이러한 상태하에서 주상체에 공급되는 수성 당밀의 농도는 관(8)을 통하여 순환한 즙으로 희석되므로 부동화 혐기성 생물의 에탄올―제조작용은 저하시키지 않고 또, 125mg/ml농도의 에탄올을 함유하는 유출물은 파이프(7)에서 연속하여 유출하였다.

Claims (1)

10중량/중량%이상이 황산잔기(―SO₃H)를 함유하는 황산화 다당류 겔에 부동화시킨 에탄올 제조 미생물을 100mg/ml이하의 발효성 당을 함유하는 영양배양즙과 접촉시키며, 이때 에탄올 제조 미생물을 사카로 미세스 및 지이모모나스 속으로 구성되는 군으로부터 선정하며, 또 이 미생물을 겔 표면 부위에 밀집층의 황산화 다당류 겔로 부동화시키고 ; 배양액내의 당농도가 초기 당농도의 20%이하로 떨어질때까지 미생물을 사용해서 당을 에탄올로 전환시키며 ; 이 단계에서의 배양액과 부동화 미생물을 배양액내의 에탄올 농도가 75mg/ml이상으로 될 때까지 100mg/ml 이상의 당을 함유하는 새로운 부가배양액과 접촉시키고 ; 또 이어, 제조된 에탄올 함유 배양액을 분리시키는 단계로 구성되는 발효성 당의 에탄올 전환반응에 따라 에탄올을 제조하는 법방.

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