JPS5886081A - 発酵法によるウレア−ゼの製造法 - Google Patents
発酵法によるウレア−ゼの製造法Info
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- JPS5886081A JPS5886081A JP18209481A JP18209481A JPS5886081A JP S5886081 A JPS5886081 A JP S5886081A JP 18209481 A JP18209481 A JP 18209481A JP 18209481 A JP18209481 A JP 18209481A JP S5886081 A JPS5886081 A JP S5886081A
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- Japan
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- urease
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- culture
- corynebacterium
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/58—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving urea or urease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発@杜、コリネバタテリウム属,プレビパクテリクム
属,アースロパクター属,グー?クス属,ミクロバクテ
リウム属まえはlルデテラ属κ属し、フレアアミドハイ
ドロラーゼ(以下ウレアーゼという)の生産能を有する
微生物を、栄養培地に培養し、ウレアーゼを培養物中κ
蓄積せしめ、該培養物からウレアーゼを採取することを
特徴とするウレアーゼの製造法に関する。
属,アースロパクター属,グー?クス属,ミクロバクテ
リウム属まえはlルデテラ属κ属し、フレアアミドハイ
ドロラーゼ(以下ウレアーゼという)の生産能を有する
微生物を、栄養培地に培養し、ウレアーゼを培養物中κ
蓄積せしめ、該培養物からウレアーゼを採取することを
特徴とするウレアーゼの製造法に関する。
ウレアーゼ(ILC.:{11.5社尿素を分解して、
アンモニアと炭酸ガスを生ずる反応を触媒する酵素であ
シ、植物,動物,I1生物等、天然界に広く存在するこ
゛とが知られておシ、すでにナタマメ由来のウレアーゼ
が、工業的に製造され、広く利用されている。微生物に
よるウレアーゼの研究も数多く報告されているが、微生
物由来のウレアーゼは、ナタマメ由来ウレアーゼに比し
、生産性悪く、未だ実用化には到っていない。
アンモニアと炭酸ガスを生ずる反応を触媒する酵素であ
シ、植物,動物,I1生物等、天然界に広く存在するこ
゛とが知られておシ、すでにナタマメ由来のウレアーゼ
が、工業的に製造され、広く利用されている。微生物に
よるウレアーゼの研究も数多く報告されているが、微生
物由来のウレアーゼは、ナタマメ由来ウレアーゼに比し
、生産性悪く、未だ実用化には到っていない。
一方ウレア−{は、臨床検査薬等として、尿素m*素の
橢定に広く利用されているが、実用化されているナタマ
メ山東Oウンアーゼの性質は、Km[が1−3X111
(1)H7.5リン酸緩衝液)であル、かかる性質
の酵素では、尿素態窒素嬢皺の測定範囲が狭い欠点を有
している.本発明者等は、棚定範囲の拡大κ着目し、I
ll値大なるIIII黴を有するウレアーゼの工業的製
造法を開発すべく、そO供給源を微生物界κ求め種々検
索を行った。ナタマメ由来のウレアーゼに比しKm値大
なるウレアーゼの微生物における存在については、Jo
urnal of Bact@riology68.6
7〜73(1@54)に、バチルス・パストイリの報告
があるが、安定性が劣るため臨床酵素としての使用に難
点がある。
橢定に広く利用されているが、実用化されているナタマ
メ山東Oウンアーゼの性質は、Km[が1−3X111
(1)H7.5リン酸緩衝液)であル、かかる性質
の酵素では、尿素態窒素嬢皺の測定範囲が狭い欠点を有
している.本発明者等は、棚定範囲の拡大κ着目し、I
ll値大なるIIII黴を有するウレアーゼの工業的製
造法を開発すべく、そO供給源を微生物界κ求め種々検
索を行った。ナタマメ由来のウレアーゼに比しKm値大
なるウレアーゼの微生物における存在については、Jo
urnal of Bact@riology68.6
7〜73(1@54)に、バチルス・パストイリの報告
があるが、安定性が劣るため臨床酵素としての使用に難
点がある。
本発明者等は、コリネバクテリウムlI4.ブレビバク
テリウム属、アースpバクター属、グロテウス属、ミク
ロバクテリウム属またはボルデテラ属に属する微生−に
、ナタマメ由来のウレアーゼに比し、Km値大なる**
を有するウレアーゼの存在することを見い出し良、これ
ら微生物よりKm値大なる特徴を有す本ウレアーゼを工
業的安偵に製造する方法を確立し、取得したKm値大な
る特徴を有するウレア−をは、尿素11窒素濃度の測定
範囲として従来のナタマメ由来のウレアーゼに比し2〜
4倍となることを確關し本発明を完成し丸。
テリウム属、アースpバクター属、グロテウス属、ミク
ロバクテリウム属またはボルデテラ属に属する微生−に
、ナタマメ由来のウレアーゼに比し、Km値大なる**
を有するウレアーゼの存在することを見い出し良、これ
ら微生物よりKm値大なる特徴を有す本ウレアーゼを工
業的安偵に製造する方法を確立し、取得したKm値大な
る特徴を有するウレア−をは、尿素11窒素濃度の測定
範囲として従来のナタマメ由来のウレアーゼに比し2〜
4倍となることを確關し本発明を完成し丸。
以下本発明について詳細にw!、明する。
本発明に使用される菌株としては、プリネバクテリウム
m、ブレビバクテリウムJ14.アースロバフタ−属、
プロテウス属、ミクロバクテリウムMまたはボルデテラ
属に属するウレアーゼ生*繭株があげられる。具体的菌
株の例として、コリネバク乎すウム・リリウム(Cor
ynebaateriumllllum ) AT C
C21−44eブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
(Bravlbacteriumamoniagene
g ) A T CC6872*アースロバフタ−・バ
ラフイネウス(Arthrobacter paraf
ineus)ATCC1559Lプロテウス・ブルガリ
ス(Proteus vulgaris ) ATCC
6897#ミクロバクテリウム・アンモニアゲネスム(
Microbacterium ammoniaphi
lum ) A T c c15354 およびボル
デテラ・ブロンチセプテイカ(Bordetella
bronohiaeptica )人TCCQ17 が
あげられる。
m、ブレビバクテリウムJ14.アースロバフタ−属、
プロテウス属、ミクロバクテリウムMまたはボルデテラ
属に属するウレアーゼ生*繭株があげられる。具体的菌
株の例として、コリネバク乎すウム・リリウム(Cor
ynebaateriumllllum ) AT C
C21−44eブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
(Bravlbacteriumamoniagene
g ) A T CC6872*アースロバフタ−・バ
ラフイネウス(Arthrobacter paraf
ineus)ATCC1559Lプロテウス・ブルガリ
ス(Proteus vulgaris ) ATCC
6897#ミクロバクテリウム・アンモニアゲネスム(
Microbacterium ammoniaphi
lum ) A T c c15354 およびボル
デテラ・ブロンチセプテイカ(Bordetella
bronohiaeptica )人TCCQ17 が
あげられる。
使用菌株の培養においては、通常の栄養培地が用いられ
る。嶽素源としては、グルコース。
る。嶽素源としては、グルコース。
シュークロース、7ラクトース、殿粉、廃糖蜜。
アルコ−゛ル類、有機酸類尋、天然栄養源とじてハ、ヘ
フトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステープリカー
(以下CALという)轡、−素源としては、アンモニア
、m安、硝安、塩安。
フトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステープリカー
(以下CALという)轡、−素源としては、アンモニア
、m安、硝安、塩安。
酢安、尿素等、無機塩類としては、リン酸カリウムを塩
化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
亜鉛等をそれぞれ単独又は、組み合せてmいられる。培
養は通常、振とりまたは通気攪拌培養で行う。培養11
1度は20〜40℃、培地pHは6〜8であることが好
適である。通常1〜4日間培養を行うと、菌体中にウレ
アーゼが生成蓄積する。培養を停止した発酵液よシ、遠
心分離などによシ、菌体を分離する。該菌体を適当な手
段で破砕し、破砕液から、□遠心分離などによって上清
を得る。上清液からのウレアーゼの精製単−紘、通常酵
素精#!に用いられる方法、たとえば、塩析、有機漕媒
沈殿。
化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
亜鉛等をそれぞれ単独又は、組み合せてmいられる。培
養は通常、振とりまたは通気攪拌培養で行う。培養11
1度は20〜40℃、培地pHは6〜8であることが好
適である。通常1〜4日間培養を行うと、菌体中にウレ
アーゼが生成蓄積する。培養を停止した発酵液よシ、遠
心分離などによシ、菌体を分離する。該菌体を適当な手
段で破砕し、破砕液から、□遠心分離などによって上清
を得る。上清液からのウレアーゼの精製単−紘、通常酵
素精#!に用いられる方法、たとえば、塩析、有機漕媒
沈殿。
透析9等電点沈殿、a着体な・どを用いるカラムクロマ
トグラフィー瞥凍結乾燥勢O方法を、組み合せて用いる
ことができる。
トグラフィー瞥凍結乾燥勢O方法を、組み合せて用いる
ことができる。
ウレアーゼの活性の測定は、種々あるが、事始1切にお
いては、臨床検査薬等で広く使用されている紫外部吸収
側定法を用いた。即ち尿素を基質としウレアーゼを作用
させ、発生したアンモニアとα−ケトグルタミン酸にグ
ルタメートデヒドロゲナーゼを作用させ消費する水素の
供与体として、還元型ニコチン酸アミドジヌクレオチド
pリン[(以下NADPHという)を用い、NADPH
の減少による紫外部吸収暮の減少量を測定することによ
り酵素の力価を求めた。
いては、臨床検査薬等で広く使用されている紫外部吸収
側定法を用いた。即ち尿素を基質としウレアーゼを作用
させ、発生したアンモニアとα−ケトグルタミン酸にグ
ルタメートデヒドロゲナーゼを作用させ消費する水素の
供与体として、還元型ニコチン酸アミドジヌクレオチド
pリン[(以下NADPHという)を用い、NADPH
の減少による紫外部吸収暮の減少量を測定することによ
り酵素の力価を求めた。
この測定法の詳細は以下の通りである。
0.1Mリン酸緩衝液(pH7,5) λ6−α
−ケトグルタt :、yell (1s1d) o
、ty尿 素 (20農シー)
0.15ajN A L) P H(1”@/iu)
0.1mグルタメートデヒドロゲナーゼ (1500明’ag) Q、02m+7これらを混
合し、37℃ 5分間放置後、測定すべき酵素液+10
1−を添加し、37℃1分後の吸光fOD、、、工(E
□)および2分後の吸光ME、 OD s a enJ
n(”z )を分光々変針により測定する。
−ケトグルタt :、yell (1s1d) o
、ty尿 素 (20農シー)
0.15ajN A L) P H(1”@/iu)
0.1mグルタメートデヒドロゲナーゼ (1500明’ag) Q、02m+7これらを混
合し、37℃ 5分間放置後、測定すべき酵素液+10
1−を添加し、37℃1分後の吸光fOD、、、工(E
□)および2分後の吸光ME、 OD s a enJ
n(”z )を分光々変針により測定する。
下記の式により酵素量を求める。
ウレアーゼ力価の表示は、1分間に1マイクロモルのN
H3を生成する酵素量を1単位(U)とする。
H3を生成する酵素量を1単位(U)とする。
次に本発明の実施例をボす。
実施例1 .
1次槽培地として、ペプトンi fAt、 肉エキス1
flit、裏地0.3 flit、 pH7,2から
なる培地30I1.lを2501容三角フラスコに盆注
し、120℃ 15分分画−る。(以下培mはすべて、
該条件で殺菌する。)種菌としてコリネバクゾリウム・
リリウム人TCC21644を1白金斗、1次棟培地に
嵌柚し、28℃で24時間振とり培資する0次に1次〜
培地と同じ組成の培地3001を2j谷三片フラスコに
分注し、1次橡培V液30屓jを移し、28℃、24時
…j振とう培簀する。かくして得られた2次st@養液
11を、301′6ジヤーフアーメンター中、154の
発酵培地(グルコース10 flit 。
flit、裏地0.3 flit、 pH7,2から
なる培地30I1.lを2501容三角フラスコに盆注
し、120℃ 15分分画−る。(以下培mはすべて、
該条件で殺菌する。)種菌としてコリネバクゾリウム・
リリウム人TCC21644を1白金斗、1次棟培地に
嵌柚し、28℃で24時間振とり培資する0次に1次〜
培地と同じ組成の培地3001を2j谷三片フラスコに
分注し、1次橡培V液30屓jを移し、28℃、24時
…j振とう培簀する。かくして得られた2次st@養液
11を、301′6ジヤーフアーメンター中、154の
発酵培地(グルコース10 flit 。
C8L 20か安、(11[安1 flit 、リン酸
1カリウム0.5f、44.塩化カリウムα5 r/’
dj、硫酸マグネシウム0.5 r/lit、 p
H7,2)に移し、300 r−p、 m、通気1i1
5仏1ny2g℃で48時間培養する。かくして得られ
た培養液のウレアーゼ力価は、、 11 ル釘であった
。培養液161を遠心分離し、菌体を集め、0.03
M IJンkm衝液液1jフィルアップし、マントンガ
ラリン菌体破砕機で菌体を破砕する。菌体破砕液を遠心
分離して、粗酵素液を得る。との粗酵素液に7(l飽和
まで硫安を添加し、生成してくる沈殿物を遠心分離によ
って集める。この沈殿物をα03Mリン酸緩衝液(pH
7,0)50−に溶解し、これをセロファンチューブを
透析族として、0.03Mリン酸緩術液51を外液とし
7て、4℃1夜透析する。この濃縮酵素液をD E A
E−セルロースカラム2001Ijに通塔し吸宸させ
、α4M食塩にて耐重する。このときの!!#累活性は
40 Uk蛋白であった。溶出液は、安定化削として、
アルブミンまたはラクトースをo、 119/U ム加
し、濃縮後、凍結11L燥し約4ooIIIIFを得た
。
1カリウム0.5f、44.塩化カリウムα5 r/’
dj、硫酸マグネシウム0.5 r/lit、 p
H7,2)に移し、300 r−p、 m、通気1i1
5仏1ny2g℃で48時間培養する。かくして得られ
た培養液のウレアーゼ力価は、、 11 ル釘であった
。培養液161を遠心分離し、菌体を集め、0.03
M IJンkm衝液液1jフィルアップし、マントンガ
ラリン菌体破砕機で菌体を破砕する。菌体破砕液を遠心
分離して、粗酵素液を得る。との粗酵素液に7(l飽和
まで硫安を添加し、生成してくる沈殿物を遠心分離によ
って集める。この沈殿物をα03Mリン酸緩衝液(pH
7,0)50−に溶解し、これをセロファンチューブを
透析族として、0.03Mリン酸緩術液51を外液とし
7て、4℃1夜透析する。この濃縮酵素液をD E A
E−セルロースカラム2001Ijに通塔し吸宸させ
、α4M食塩にて耐重する。このときの!!#累活性は
40 Uk蛋白であった。溶出液は、安定化削として、
アルブミンまたはラクトースをo、 119/U ム加
し、濃縮後、凍結11L燥し約4ooIIIIFを得た
。
ここで得られた酵素の性質は以下のとおりである。
l)作用
1モルの尿素より1モルの水を消費し、2モルCD 7
7モニアと1モルの炭酸ガスヲ生成する。
7モニアと1モルの炭酸ガスヲ生成する。
2)至適pH
7,5〜8.0
3)I)H安定性
37’C,30分間の処理でpH7〜10で安定・
4)至適温度
45〜50℃
5)温菱安定性
pH7,30分間処理で50℃まで安定6)基JR%異
性 基 實 相対活性←) 尿 素 100 ビウレツト 13 アラントイン 11 7)阻 害 剤 −100 AfNO31XIG−’ 11 Cu8041 X 10 ”” 10グアニジン
塩酸 4X10−” 318)Km値 本酵素の性質は、xm(izxto−”(pH7,5リ
ン酸緩衡液)とナタマメ由来ウレアーゼのKm値に比し
約10倍を示すt¥f倣を有している。
性 基 實 相対活性←) 尿 素 100 ビウレツト 13 アラントイン 11 7)阻 害 剤 −100 AfNO31XIG−’ 11 Cu8041 X 10 ”” 10グアニジン
塩酸 4X10−” 318)Km値 本酵素の性質は、xm(izxto−”(pH7,5リ
ン酸緩衡液)とナタマメ由来ウレアーゼのKm値に比し
約10倍を示すt¥f倣を有している。
9)本酵素は結晶化が困難である。
10)分子量 約440,000(セフ7デツクスG−
200ゲルびl過流) li)元素分析 結晶化困難の丸め測定せず。
200ゲルびl過流) li)元素分析 結晶化困難の丸め測定せず。
実施例2
表−1に不した各種−株について、実施例1と同様に培
齋し、菌体を取得し、粗酵素液を調製し、ウレアーゼ活
性およびKm値を測定した。
齋し、菌体を取得し、粗酵素液を調製し、ウレアーゼ活
性およびKm値を測定した。
結果は表−1に示すごとく、ナタマメ由来ウレアーゼに
比し5〜20倍のKm値を示した。
比し5〜20倍のKm値を示した。
表 −1
ノ(fシ!・
代表省木下祝部・S<;・
第1頁の続き
0発 明 者 遠藤験−
三島市安久310−2
0発 明 者 勝又英雄
御殿場市北久原613−5
0発 明 者 新井雑光
静岡県駿東郡長泉町納米里410
1
手続補正書(自発)
昭和、C7年 を月 2日
特許庁長官殿
1、事件の表示
昭和56年特峰願第1820?4号
2−発明の名称
一発酵法によるウレアーゼの製造流
入補正をする者
事件との関係 特許出願人
郵便番号 100
在 所 東京都千代田区大手町−丁目6番′1号名称
(102)協和醗酵工業株式会社(T肚:03−20
1−7211内線2751)明細書の発明の詳細な説明
の欄 &補正の内容 −(1)明細書第6頁11−166行目次のとおシr
o、 I Mリン酸緩衡液(1)H7,5) zz
dα−ケトグルタミン酸(15?’iu) Q、1
m尿 素 (21鴫/d )
0.5 dNADPI((15■/j) 0.15
mグルタメートデヒドロゲナービ(tsoo′UA)
0.03dJ(2)明細書第8頁1−4行目を次
のとおり訂正する。
(102)協和醗酵工業株式会社(T肚:03−20
1−7211内線2751)明細書の発明の詳細な説明
の欄 &補正の内容 −(1)明細書第6頁11−166行目次のとおシr
o、 I Mリン酸緩衡液(1)H7,5) zz
dα−ケトグルタミン酸(15?’iu) Q、1
m尿 素 (21鴫/d )
0.5 dNADPI((15■/j) 0.15
mグルタメートデヒドロゲナービ(tsoo′UA)
0.03dJ(2)明細書第8頁1−4行目を次
のとおり訂正する。
r15ml’の発酵培地(グルコース1f肩、csh2
f/#、硫安0.1 till 、リン酸−カリウム0
.05 fAI 、塩化カリウムo、 o s f/d
j、硫酸マグネシウムo、 o s t/d1%pH7
,2) に移し、」 手続補正書 昭和5′F句〜、9月 27日 時計庁良官 殿 1、事件の表示 昭和56年特許願第182094号 2、発明の名称 発酵法によるウレアーゼの製造法 3、補止をする者 畢件との関係 %軒出願人 郵便番号 100 住 所 東京都千代田区大手町−丁目6番1号名称
(102)協和#帥工業株式会社(’I’lL:03−
201−7211内紐2751)酸」を「α−ケトゲル
タール酸」に訂正する。
f/#、硫安0.1 till 、リン酸−カリウム0
.05 fAI 、塩化カリウムo、 o s f/d
j、硫酸マグネシウムo、 o s t/d1%pH7
,2) に移し、」 手続補正書 昭和5′F句〜、9月 27日 時計庁良官 殿 1、事件の表示 昭和56年特許願第182094号 2、発明の名称 発酵法によるウレアーゼの製造法 3、補止をする者 畢件との関係 %軒出願人 郵便番号 100 住 所 東京都千代田区大手町−丁目6番1号名称
(102)協和#帥工業株式会社(’I’lL:03−
201−7211内紐2751)酸」を「α−ケトゲル
タール酸」に訂正する。
(2)明細書〔昭和57年9月2日付提出の手続補止1
1(自発)で訂正〕第6頁12行目の「α−ケトグルタ
ミン酸」を「α−ケトゲルタール酸」に訂正する。
1(自発)で訂正〕第6頁12行目の「α−ケトグルタ
ミン酸」を「α−ケトゲルタール酸」に訂正する。
Claims (1)
- コリネバクテリウム属、プレビバタテリウム属、アース
ロバフタ−属、プロテクメ属、ミクロバクテリウム属ま
九はボルデテラ属に属し、フレアアミドハイドロラーゼ
(以下ウレアーゼという)の生産能を有する微生物を、
栄養培地に培養し、ウレアーゼを培養物中に蓄積せしめ
、鋏培養物からウレアーゼを採取することを特徴とする
ウレアーゼの製造法・
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18209481A JPS6055119B2 (ja) | 1981-11-13 | 1981-11-13 | 発酵法によるウレア−ゼの製造法 |
EP82306073A EP0079792B1 (en) | 1981-11-13 | 1982-11-15 | Process for production of urease |
DE8282306073T DE3276708D1 (en) | 1981-11-13 | 1982-11-15 | Process for production of urease |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18209481A JPS6055119B2 (ja) | 1981-11-13 | 1981-11-13 | 発酵法によるウレア−ゼの製造法 |
Publications (2)
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