JPH0224517B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明はクレアチニンデイミナーゼの製造法、
特にバチルス（Bacillus）属に属し、クレアチニ
ンデイミナーゼ生産能を有する菌株によるクレア
チニンデイミナーゼを製造する方法に関する。 （従来の技術） クレアチンおよびクレアチニンは人間の血液ま
た尿中に見出され、その量を迅速かつ正確に検出
測定することは人間の病気、例えば尿毒症、慢性
腎炎、急性腎炎、巨人症、強直性筋異栄養などを
診断するのに非常に重要である。特にクレアチニ
ンの生成量は一定で筋肉の総量によつて決まつて
おり運動や尿量によつて影響されない。また外因
性の食事による影響も殆んどなくクレアチニンの
排泄量は一定していると言われている。したがつ
てクレアチニンの量を測定することは上述の病気
の診断に非常に重要な指標となる。 クレアチニンの定量法としては(1)ピクリン酸を
用いるヤツフエ反応に基づく方法、(2)クレアチニ
ンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒド
ロラーゼ及びサルコシンオキシダーゼを用いる方
法および(3)クレアチニンデイミナーゼを用いる方
法がある。 クレアチニンデイミナーゼは微生物界に広く見
出されており、既に工業的にも製造され、臨床検
査試薬として使用されている。クレアチニンデイ
ミナーゼを生産する株としては、従来クロストリ
デイウム・パラプトリフイリム（Clostridium
paraputrificum）〔ジヤーナル・バクテリオール
（J.Bacteriol）第75巻第633頁（1958）〕、プレビ
バクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバ
クテリウム（Corynebacterium）属、シユードモ
ナス（Pseudomonas）属及びアースロバクター
（Arthrobacter）属〔特開昭52−34976号〕、フラ
ボバクテリウム・フイラメントスム
（Flavobacterium fiamentosum）ATCC31546
〔特開昭56−72692号〕などが知られている。 （発明の目的） 本発明は臨床検査試薬として利用できるクレア
チニンデイミナーゼを得ることにある。 （発明の構成） 本発明はバチルス（Bacillus）属に属し、クレ
アチニンデイミナーゼ生産能を有する菌株を栄養
培地に培養し、培養物中にクレアチニンデイミナ
ーゼを生成畜積せしめ、これを採取することから
なるクレアチニンデイミナーゼの製造方法にあ
る。 本発明で使用する菌株はバチルス（Bacillus）
属に属する菌株であるならば、何れでも良いが、
特に本発明者等が福井県敦賀市内の土壌より採取
したバチルス（Bacillus）CNI−1365（微工研菌
寄第8138号）が好ましい。上記バチルス
（Bacillus）CNI−1365株の菌学的性質を以下に
示す。 (a) 形態 肉汁寒天培地に30℃で20時間培養して、大きさ
（0.5〜1.0μ）×（1.0〜1.5μ）の桿菌であり、グラム
染色は陽性であり運動性はない。胞子を形成する
場合がある。 (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 30℃、48時間で直径２〜３mmの円形のコロニ
ーを形成する。表面は平滑で光沢があり、隆起
は凸円状、コロニーは均質不透明で淡黄色で可
溶性色素は形成しない。 (2) 肉汁寒天斜面培養 30℃、20時間で糸状良好な生育を示す。コロ
ニーは淡黄色である。 (3) 肉汁液体培養 30℃、16時間振盪培養にて生育し濁化する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 30℃、16時間培養で生育し、ゼラチン液化能
はない。 (5) リトマスミルク 変化なし (c) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元；陽性 (2) 脱窒反応；陰性 (3) MRテスト；陰性 (4) VPテスト；陰性 (5) インドールの生成；陰性 (6) 硫化水素の生成；陰性 (7) デンプンの加水分解；陽性 (8) クエン酸の利用；陰性 (9) 無機窒素源の利用；陽性 (10) 色素の生成；なし (11) ウレアーゼ；陽性 (12) オキシダーゼ；陰性 (13) カタラーゼ；陽性 (14) 生育の範囲；生育温度15〜45℃、至適温度
25〜35℃、生育PH5.0〜8.0、至適PH6.0〜7.5 (15) 酸素に対する態度；好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト；発酵 (17) 糖から酸の生成；Ｄ−グルコース、Ｄ−マ
ンノース、Ｄ−フラクトース、麦芽糖、シヨ
糖、トレハロース、Ｄ−マンニツト、デンプン
等から酸を生成する。 (18) その他 アルギニンの分解；陰性 リジンの脱炭酸反応；陰性 オルニチンの脱炭酸反応；陰性 上記菌学的性質の同定のための実験方法は主と
して長谷川武治編著「微生物の分類と同定」学会
出版センター（1975年）によつて行なつた。また
分類同定の基準としてバージーズ・マニユアル・
オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー第
８版（1974年）を参考にした。上記文献および上
記菌学的性質からCNI−1365株はバチルス属に属
するとみなされる。 本発明方法を実施するに当つては、通常の栄養
培地を使用できるが、好ましくはクレアチニンま
たはその誘導体を用いて培養するのが好ましい。
培地の炭素源としてはクレアチニン、グルコー
ス、シユクロース、フラクトース、澱粉、廃糖
蜜、アルコール類、有機酸類が利用でき、天然栄
養源としてはペプトン、肉エキス、酵母エキス、
コーンステイープリカー等が利用でき、窒素源と
してはクレアチニン、アンモニア、硫安、硝安、
塩安、尿素等が利用でき、無機塩類としてはリン
酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫
酸マグネシウム等が利用できる。これらの栄養源
はそれぞれ単独に用いることもでき、また組合せ
て用いることもできる。 菌株を培養するに当つては通常、振盪培養また
は通気撹拌培養で行なうことができる。一般に培
養温度は25〜35℃、培地PHは6.5〜7.5であるのが
好ましく、通常１〜２日間培養を行なうと菌体中
にクレアチニンデイミナーゼが生成蓄積する。培
養条件は使用する菌株、培地組成などに応じ、ク
レアチニンデイミナーゼの生産量が最大になるよ
うに設定することは当然である。 本発明の方法によつて生成蓄積されたクレアチ
ニンデイミナーゼを採取するに当つては、培養液
を遠心分離、過等の操作により培養液から菌体
を集め、集めた菌体をビーズ破砕もしくは超音波
破砕等の操作をして菌体中からクレアチニンデイ
ミナーゼを取り出す。かくして得られた粗酵素液
からクレアチニンデイミナーゼを単離するに当つ
ては、通常の酵素精製に使用される方法を使用で
きる。例えば塩析、有機溶媒沈澱、透析、等電
点、沈澱、イオン交換法、ゲル過等の方法を組
合せて使用できる。例えば粗酵素液を遠心分離
し、上清を得る。さらにその上清の硫安塩析画分
（0.2〜0.6飽和）を得る。一夜透析後、DEAE−セ
フアロースCL4Bイオン交換体に吸着、溶出させ
る。活性画分を濃縮後、セフアクリルS200のゲ
ル過を行なうことにより高度に精製されたクレ
アチニンデイミナーゼを単離することができる。 本発明方法により得られるクレアチニンデイミ
ナーゼの酵素化学的および理化学的性質は次のと
おりであつた。 (1) 作用： 本発明の酵素は１モルのクレアチニンを加水分
解して１モルの１−メチルヒダントインと１モル
のアンモニアを生成する。 (2) 基質特異性： クレアチニンに特異的に作用する。 (3) 至適PH： 本発明の酵素の至適PHは第１図の曲線で表わさ
れる如く、PH6.5〜9.0に高い活性を有している。 (4) 至適温度： 本発明の酵素の至適温度は第２図の曲線で表わ
される如く、60℃〜65℃にある。 (5) PH安定性： 本発明の酵素を65℃でそれぞれのPHで60分間処
理したときのPH安定性を第３図に示す。第３図よ
り明らかな如く、本発明の酵素はPH7.0〜8.5の間
で安定である。 (6) 熱安定性： 本発明の酵素をPH7.0でそれぞれの温度で60分
間処理したときの熱安定性を第４図に示す。第４
図から明らかな如く、本発明の酵素は65℃まで安
定である。 (7) 阻害剤： 下表１に示す如く、硝酸銀、塩化水銀、硫酸銅
で阻害された。

【表】 (8) Km値： 本発明の酵素のKm値は約４×10^-3Ｍである。 (9) 分子量： 本発明の酵素はセフアアクリルＳ−200を用い
たゲル過法で約260000である。 (10) 酵素活性測定法 本発明の酵素活性の測定は下記条件で１分間に
１マイクロモルのアンモニアを生成する酵素活性
を１単位（Ｕ）とする。 50mMクレアチニン溶液2.4ml、3mM
NADPH溶液0.3ml、10.mM α−ケトグルタル酸
溶液0.3ml及びグルタミン酸脱水素酵素0.05mlを
キユベツト（ｄ＝1.0cm）に入れ、37℃で５分間
予備加熱する。50mMリン酸緩衝液PH7.5で希釈
した酵素溶液0.1mlを添加し、混和後、水を対照
に37℃にて、340nmの吸光度変化を３〜４分間記
録し、その初期直線部分から１分間当りの吸光度
変化を求める。盲検は酵素溶液の代りに50mMリ
ン酸緩衝液PH7.5を添加する。NADPHのミリモ
ル分子吸光係数6.22を用いて計算し、Ｕ／ml＝
ΔOD／min×5.06×希釈倍数として求める。 実施例 １ 培地組成 2.0％グルコース、0.5％クレアチニ
ン、0.1％K₂HPO₄、0.05％KCl、0.05％MgSO₄・
7H₂O、0.1％酵母エキスPH7.0 上記の培地50mlを500mlの坂口フラスコに入れ、
121℃で10分間オートクレーブ殺菌する。バチル
ス（Bacillus）属CNI−1365（微工研菌寄第8138
号）の一白金耳を上記培地に接種し、30℃、20時
間振盪培養し、種培養液とした。別に同条件にて
殺菌した培地６を含む10容ジヤーフアメンタ
ーへ上記種培養液50mlを接種した。300rpm通気
量２／min、30℃で16時間培養した。 得られた培養液のクレアチニンデイミナーゼ活
性は0.3U／mlであつた。培養液６を遠心分離
し、菌体を集め50mMリン酸緩衝液に懸濁し、１
としてビース破砕機（ダイノミルDyno−
millKDL）により破砕した。菌体破砕液を遠心
分離し上清を得た。上清液に0.2飽和になる様、
硫安を加え、遠心分離し上清を得た。その上清液
にさらに0.6飽和になるよう硫安を加え遠心分離
し、沈澱物を得た。50mMリン酸緩衝液PH7.5、
250mlに再溶解した。再溶解液を50mMリン酸緩
衝液PH7.5で平衡化したセフアデツクスＧ−25カ
ラム（２）で脱塩した。脱塩液をDEAE−セフ
アロースCL−4Bカラム50mlに吸着させ、0.4M
NaClにて溶出した。溶出液を限外過して濃縮
し、セフアアクリルＳ−200カラムにて分子篩を
行なつた。 活性画分の比活性は1.9U／mg蛋白で、全活性
420Uを得た。 （発明の効果） 本発明方法により得られるクレアチニンデイミ
ナーゼは熱安定性が良く、至適PHが6.5〜9.0と広
く、Km値も４×10^-3Ｍで臨床検査試薬として好
適である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明より得られたクレアチニンデイ
ミナーゼのPHと活性の関係を表わし、第２図は温
度と活性の関係を表わし、第３図は65℃でそれぞ
れのPHで１時間処理したときのPHと活性の関係を
表わし、第４図はPH7.0でれぞれの温度で１時間
処理したときの温度と活性の関係を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ バチルス（Bacillus）属に属し、クレアチニ
   ンデイミナーゼ生産能を有する菌株を栄養培地に
   培養し、培養物中にクレアチニンデイミナーゼを
   生成畜積せしめ、これを採取することを特徴とす
   るクレアチニンデイミナーゼの製造法。 ２ 菌株がバチルス（Bacillus）CNI−1365であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   クレアチニンデイミナーゼの製造方法。