JP3029868B2 - 発酵法によるｌ−アラニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−アラニンの製造法Info
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、生体を構成するアミノ酸であり、栄養輸
液、医薬用、食品添加物等として有用なＬ−アラニンの
製造法に関する。
液、医薬用、食品添加物等として有用なＬ−アラニンの
製造法に関する。
背景技術 従来より、Ｌ−アラニンの製造法として、Ｌ−アスパ
ラギン酸より酵素的に脱炭酸する方法（特公昭46−756
0）、フマル酸をＬ−アスパラギン酸に導き、これを酵
素的に脱炭酸する方法（特開平２−268691）などが知ら
れ、実用に供されている。さらに、これらの方法以外
に、Ｄ−アラニン要求性の大腸菌による乳酸とアンモニ
ア供与体からのＬ−アラニン製造法（特開昭62−3619
6）、コリネバクテリウム・チュメセンスによる糖質か
らの発酵生産法（特公昭36−14298）などの方法が知ら
れている。
ラギン酸より酵素的に脱炭酸する方法（特公昭46−756
0）、フマル酸をＬ−アスパラギン酸に導き、これを酵
素的に脱炭酸する方法（特開平２−268691）などが知ら
れ、実用に供されている。さらに、これらの方法以外
に、Ｄ−アラニン要求性の大腸菌による乳酸とアンモニ
ア供与体からのＬ−アラニン製造法（特開昭62−3619
6）、コリネバクテリウム・チュメセンスによる糖質か
らの発酵生産法（特公昭36−14298）などの方法が知ら
れている。
従来の発酵法によるＬ−アラニンの製造法は、培養液
中での蓄積量が低い、収率が低い、生産速度が遅い、培
養に長時間を要する等の欠点を有し、工業的な製造法と
しては実用性が乏しい。またD,L−アラニンの高収率発
酵生産の報告もある（特公昭57−797）が、生成するア
ラニンがD,L−体のラセミ混合物であるため、Ｌ−アラ
ニンを得るにはD,L−体の光学分割工程を要し、工業的
に有利な製造法とは言い難い。
中での蓄積量が低い、収率が低い、生産速度が遅い、培
養に長時間を要する等の欠点を有し、工業的な製造法と
しては実用性が乏しい。またD,L−アラニンの高収率発
酵生産の報告もある（特公昭57−797）が、生成するア
ラニンがD,L−体のラセミ混合物であるため、Ｌ−アラ
ニンを得るにはD,L−体の光学分割工程を要し、工業的
に有利な製造法とは言い難い。
発明の開示 本発明によれば、アースロバクター属に属し、Ｌ−ア
ラニンデヒドロゲナーゼ活性を有し、アラニンラセマー
ゼ活性を殆どまたは全く有さず、かつＬ−アラニン生産
性を有する微生物を栄養培地中に培養し、該培養物中に
Ｌ−アラニンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−アラニ
ンを採取することを特徴とするＬ−アラニンの製造法を
提供する。
ラニンデヒドロゲナーゼ活性を有し、アラニンラセマー
ゼ活性を殆どまたは全く有さず、かつＬ−アラニン生産
性を有する微生物を栄養培地中に培養し、該培養物中に
Ｌ−アラニンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−アラニ
ンを採取することを特徴とするＬ−アラニンの製造法を
提供する。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる微生物は、アースロバクター属に
属し、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有し、アラ
ニンラセマーゼ活性を殆どまたは全く有さず、かつＬ−
アラニン生産性を有する微生物であればいずれでもよ
い。このような微生物は、アースロバクター属に属し、
Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有し、Ｌ−アラニ
ン生産性をもつ微生物を親株として誘導することができ
る。本発明で用いられる微生物の親株として、例えばア
ースロバクター・エスピー（Arthrobactr sp.）HAP1
（微工研条寄第3644号）、アースロバクター・ウレアフ
ァシエンス（Arthrobacter ureafaciens）ATCC7562、ア
ースロバクター・ヒスチノロボランス（Arthrobacter h
istidinolovorans）ATCC11442などがあげられる。
属し、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有し、アラ
ニンラセマーゼ活性を殆どまたは全く有さず、かつＬ−
アラニン生産性を有する微生物であればいずれでもよ
い。このような微生物は、アースロバクター属に属し、
Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有し、Ｌ−アラニ
ン生産性をもつ微生物を親株として誘導することができ
る。本発明で用いられる微生物の親株として、例えばア
ースロバクター・エスピー（Arthrobactr sp.）HAP1
（微工研条寄第3644号）、アースロバクター・ウレアフ
ァシエンス（Arthrobacter ureafaciens）ATCC7562、ア
ースロバクター・ヒスチノロボランス（Arthrobacter h
istidinolovorans）ATCC11442などがあげられる。
アースロバクター・エスピーHAP1（微工研条寄第3644
号）株は、本発明者らによって町田市の土壌より新たに
分離された菌株であって、その菌学的性質を以下に詳述
する。
号）株は、本発明者らによって町田市の土壌より新たに
分離された菌株であって、その菌学的性質を以下に詳述
する。
（ａ） 形態 細胞の形及び大きさ；桿状あるいは球状で多形体を
とる。
とる。
（直径1.0−2.0μｍ、長さ1.0−4.0μｍあるいはそれ
以上） 運動性；ない。
以上） 運動性；ない。
胞子；形成しない。
グラム染色性；陽性 抗酸性；ほとんど認められない。
（ｂ） 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養；アイボリー色のなめらなか集落
を形成する。拡散性色素は生成しない。
を形成する。拡散性色素は生成しない。
肉汁寒天斜面培養；十分に生育する。
肉汁液体培養；混濁状に生育する。表面生育はしな
い。
い。
肉汁ゼラチン穿刺培養；生育する。ゼラチンを液化
しない。
しない。
リトマス・ミルク；リトマスを還元する。ミルクを
液化する。
液化する。
（ｃ） 生理的性質 硝酸塩の還元；陽性 脱窒反応；陰性 MRテスト；陰性 VPテスト；陰性 インドールの生成；陰性 硫化水素の生成；陰性 デンプンの加水分解；陽性 クエン酸の利用；（Koser）陽性 （Christensen）陽性 無機窒素の利用；硝酸塩（陽性） アンモニウム塩（陽性） 色素の生成；陰性 ウレアーゼ；陽性 オキシダーゼ；陰性 カタラーゼ；陽性 生育の範囲 （１） pH;pH5.1−pH10.0 （２） 温度;7℃−38℃ 酸素に対する態度；好気性 Ｏ−Ｆテスト；酸化 糖類からの酸およびガスの生成 （ｄ） その他の性質 炭素化合物の資化能 資化能有;p−ヒドロキシベンゾエイト、グリオキシ
ル酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチ
ジン、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｄ−ガラクトー
ス、Ｌ−ラムノース、グリセロール 資化能無;D−アラビノース 細胞壁のアミノ酸組成；リジン、アラニン、グルタ
ミン酸、スレオニン、セリン、グリシン 主なキノン;1飽和型メナキノン−９〔MK−９
（H2）〕 以上の菌学的性質を有する菌について、バージェイの
マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）の記
載と照合した結果、グラム陽性で桿状あるいは球状の多
形性の形態をとることから、Vol.2（1986）のSection 1
5（lrrcgular,Nonsporing,Gram Positivc Rods）に属す
る細菌であると判断した。次に、好気性で生育し、嫌気
性で成育せず、細胞壁のアミノ酸組成としてリジン、ス
レオニン、セリンを有すること、また、主なキノンとし
てMK−９（H2）を持つことに基づいて検索した結果、本
菌株は、アースロバクター（Arthrobacter）属に属する
細菌と同定し、HAP1菌株を、アースロバクター・エスピ
ーHAP1（Arthrobacter sp.HAP1）と命名した。本菌株
は、ブダペスト条約に基づき、平成３年11月７日付で工
業技術院微生物工業技術研究所（FRI）に微工研条寄第3
644号（FERM BP−3644）として寄託されている。
ル酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチ
ジン、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｄ−ガラクトー
ス、Ｌ−ラムノース、グリセロール 資化能無;D−アラビノース 細胞壁のアミノ酸組成；リジン、アラニン、グルタ
ミン酸、スレオニン、セリン、グリシン 主なキノン;1飽和型メナキノン−９〔MK−９
（H2）〕 以上の菌学的性質を有する菌について、バージェイの
マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）の記
載と照合した結果、グラム陽性で桿状あるいは球状の多
形性の形態をとることから、Vol.2（1986）のSection 1
5（lrrcgular,Nonsporing,Gram Positivc Rods）に属す
る細菌であると判断した。次に、好気性で生育し、嫌気
性で成育せず、細胞壁のアミノ酸組成としてリジン、ス
レオニン、セリンを有すること、また、主なキノンとし
てMK−９（H2）を持つことに基づいて検索した結果、本
菌株は、アースロバクター（Arthrobacter）属に属する
細菌と同定し、HAP1菌株を、アースロバクター・エスピ
ーHAP1（Arthrobacter sp.HAP1）と命名した。本菌株
は、ブダペスト条約に基づき、平成３年11月７日付で工
業技術院微生物工業技術研究所（FRI）に微工研条寄第3
644号（FERM BP−3644）として寄託されている。
本発明で用いられるアラニンラセマーゼ活性を殆どま
たは全く有さない微生物は、アラニンラセマーゼ活性を
有する野生株を紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下NTGと略す）、亜硝酸
などで化学処理して変異誘起した後、Ｄ−アラニンを含
まない培地で生育できない、もしくは親株に比べ、生育
が遅い菌株を選択することで分離することができる。こ
のような方法で得られた代表株として、アースロバクタ
ー・エスピーNAP1株からLAP7株が、アースロバクター・
ウレアファシエンスATCC7562株からAU−７株が各々誘導
できる。LAP7株およびAU−７株はHAP1株とともに各々、
微工研条寄第3645号（FERM BP−3645）、微工研条寄第3
646号（FERM BP−3646）としてブダペスト条約に基づ
き、平成３年11月７日付で工業技術院微生物工業技術研
究所（微工研）に寄託されている。
たは全く有さない微生物は、アラニンラセマーゼ活性を
有する野生株を紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下NTGと略す）、亜硝酸
などで化学処理して変異誘起した後、Ｄ−アラニンを含
まない培地で生育できない、もしくは親株に比べ、生育
が遅い菌株を選択することで分離することができる。こ
のような方法で得られた代表株として、アースロバクタ
ー・エスピーNAP1株からLAP7株が、アースロバクター・
ウレアファシエンスATCC7562株からAU−７株が各々誘導
できる。LAP7株およびAU−７株はHAP1株とともに各々、
微工研条寄第3645号（FERM BP−3645）、微工研条寄第3
646号（FERM BP−3646）としてブダペスト条約に基づ
き、平成３年11月７日付で工業技術院微生物工業技術研
究所（微工研）に寄託されている。
本発明の微生物によるＬ−アラニンの生産は、通常用
いられる微生物の培養法で実施可能である。使用培地と
しては、炭素源、窒素源、無機物、最適のＤ−アラニン
またはD,L−アラニンその他使用菌株の必要とする微量
の栄養素を程よく含有するものならば合成培地または天
然培地いずれも使用可能である。
いられる微生物の培養法で実施可能である。使用培地と
しては、炭素源、窒素源、無機物、最適のＤ−アラニン
またはD,L−アラニンその他使用菌株の必要とする微量
の栄養素を程よく含有するものならば合成培地または天
然培地いずれも使用可能である。
炭素源としては、用いる微生物が資化できるものなら
ば何でもよいが、例えばグルコース、グリセロール、フ
ラクトース、シュークロース、澱粉加水分解物、糖蜜な
どの炭水化物、ピルビン酸、コハク酸、乳酸、などの各
種有機酸が使用可能である。
ば何でもよいが、例えばグルコース、グリセロール、フ
ラクトース、シュークロース、澱粉加水分解物、糖蜜な
どの炭水化物、ピルビン酸、コハク酸、乳酸、などの各
種有機酸が使用可能である。
窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、尿素などの各種無機及び有機アンモニウム塩類ある
いはペプトン、NZ−アミノ、肉エキス、酵母エキス、コ
ーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物、などの
天然栄養源を用いることができる。
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、尿素などの各種無機及び有機アンモニウム塩類ある
いはペプトン、NZ−アミノ、肉エキス、酵母エキス、コ
ーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物、などの
天然栄養源を用いることができる。
無機物としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、
硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛および塩化カルシ
ウムなどを添加する。
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、
硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛および塩化カルシ
ウムなどを添加する。
さらに必要に応じて、ビオチン、サイアミンなどビタ
ミン類を添加する。
ミン類を添加する。
培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培地のpHは
中性付近に維持することが望ましい。炭素源、窒素源、
およびその他の栄養源は、微生物の生育の妨げとならな
い限り、培養開始時に一度に供与してもよいし、数次に
分割して、あるいは培養中に連続的に添加してもよい。
培養期間は、炭素源、窒素源、およびその他の栄養源の
量によって異なるが、通常１〜６日間である。
中性付近に維持することが望ましい。炭素源、窒素源、
およびその他の栄養源は、微生物の生育の妨げとならな
い限り、培養開始時に一度に供与してもよいし、数次に
分割して、あるいは培養中に連続的に添加してもよい。
培養期間は、炭素源、窒素源、およびその他の栄養源の
量によって異なるが、通常１〜６日間である。
培養終了後、培養液から菌体を除去し、得られた清澄
液から濃縮晶析、活性炭処理あるいはイオン交換樹脂処
理などの公知の精製方法を用いてＬ−アラニンを単離採
取できる。
液から濃縮晶析、活性炭処理あるいはイオン交換樹脂処
理などの公知の精製方法を用いてＬ−アラニンを単離採
取できる。
発明を実施するための最良の形態 実施例１ アースロバクター・エスピーHAP1株を完全培地（粉末
ブイヨン20gおよび酵母エキス5gを水１リットルに含
み、pH7.2に調整した培地）で30℃、16時間培養した菌
体を集め、0.05M トリス−マレイン酸緩衝液（pH6.0）
で洗浄後菌体の濃度が約109細胞/mlになるように同緩衝
液に懸濁し、これにNTGを終濃度が500mg/lになるよう
に加え、30℃、20分間保持して異変処理を行った。この
変異処理菌体を同緩衝液で洗浄後、その菌体をＤ−アラ
ニン0.05g/含有する最少平板寒天培地（第１表）に塗
布した。
ブイヨン20gおよび酵母エキス5gを水１リットルに含
み、pH7.2に調整した培地）で30℃、16時間培養した菌
体を集め、0.05M トリス−マレイン酸緩衝液（pH6.0）
で洗浄後菌体の濃度が約109細胞/mlになるように同緩衝
液に懸濁し、これにNTGを終濃度が500mg/lになるよう
に加え、30℃、20分間保持して異変処理を行った。この
変異処理菌体を同緩衝液で洗浄後、その菌体をＤ−アラ
ニン0.05g/含有する最少平板寒天培地（第１表）に塗
布した。
（第１表） 最少培地組成 グルコース 5g/ （NH4）2SO4 5g/ MgSO4・7H2O 0.5g/ NH4Cl 3g/ KH2PO4 3g/ FeSO4・7H2O 10mg/ MnSO4・6H2O 2mg/ ビオチン 30μg/ サイアミン塩酸塩 0.5mg/ 寒天 20g/ （pH7.2） 30℃で２〜４日間培養し、該平板培地に生育するコロ
ニーをＤ−アラニン（0.05g/）含有最少寒天培地とＤ
−アラニンを含まない最少寒天培地に塗布し、前者プレ
ート上では親株同様に生育し、後者プレートでは生育し
ない、もしくは生育の遅い株を釣菌した。このような変
異株の中からアラニンラセマーゼ活性低下、または欠失
した株としてアースロバクター・エスピーLAP7株を得
た。
ニーをＤ−アラニン（0.05g/）含有最少寒天培地とＤ
−アラニンを含まない最少寒天培地に塗布し、前者プレ
ート上では親株同様に生育し、後者プレートでは生育し
ない、もしくは生育の遅い株を釣菌した。このような変
異株の中からアラニンラセマーゼ活性低下、または欠失
した株としてアースロバクター・エスピーLAP7株を得
た。
第３表に、親株HPA1株と変異株LAP7株のアラニンラセ
マーゼ活性を示した。
マーゼ活性を示した。
アラニンラセマーゼの活性測定は、Wijsman,H.J.W.の
方法〔Genet.Res.,Camb.20:269−277（1972）〕に、Ｌ
−アラニンデヒドロゲナーゼの活性測定はOhoshima,T.
らの方法〔Eur.J.Biochem.100:29−39（1979）〕に従っ
て行った。
方法〔Genet.Res.,Camb.20:269−277（1972）〕に、Ｌ
−アラニンデヒドロゲナーゼの活性測定はOhoshima,T.
らの方法〔Eur.J.Biochem.100:29−39（1979）〕に従っ
て行った。
実施例２ 前項で取得した変異株アースロバクター・エスピーLA
P7株及びその親株HAP1株を10mlの種培地（グルコース２
％、ペプトン１％、酵母エキス１％、NaCl0.5％、Ｄ−
アラニン200mg/、pH7.2）を含む試験管に接種し、30
℃で24時間振とう培養した。この種培養液1mlを第２表
の発酵培地20mlを含む300ml容三角フラスコに接種し
て、48時間30℃で振とう培養した。培養後、培養濾液を
メルク社製LiChrosorb RP−18カラム（７μｍ）を用い
た高速液体クロマトグラフィーにかけ、オルトフタルア
ルデヒドによるポストカラム発色法によって定量して総
アラニン（Ｔ−Ala）量を測定した。Ｄ−アラニンは、
市販のＤ−アミノ酸オキシダーゼ〔ベーリンガー・マン
ハイム山之内（株）社製〕を用いる方法により、および
ダイセル化学工業（株）社製クラウンパックカラムを用
いて高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で定量した。
その結果を第３表に示す。
P7株及びその親株HAP1株を10mlの種培地（グルコース２
％、ペプトン１％、酵母エキス１％、NaCl0.5％、Ｄ−
アラニン200mg/、pH7.2）を含む試験管に接種し、30
℃で24時間振とう培養した。この種培養液1mlを第２表
の発酵培地20mlを含む300ml容三角フラスコに接種し
て、48時間30℃で振とう培養した。培養後、培養濾液を
メルク社製LiChrosorb RP−18カラム（７μｍ）を用い
た高速液体クロマトグラフィーにかけ、オルトフタルア
ルデヒドによるポストカラム発色法によって定量して総
アラニン（Ｔ−Ala）量を測定した。Ｄ−アラニンは、
市販のＤ−アミノ酸オキシダーゼ〔ベーリンガー・マン
ハイム山之内（株）社製〕を用いる方法により、および
ダイセル化学工業（株）社製クラウンパックカラムを用
いて高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で定量した。
その結果を第３表に示す。
（第２表） 発酵培地組成 グルコース ８％ 硫酸アンモニウム ３％ リン酸１カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ 硫酸マンガン 5mg/ 硫酸亜鉛 10mg/ ビオチン 30μg/ Ｄ−アラニン 200mg/ （pH7.2） 実施例３ 実施例１と同様に、アースロバクター・ウレアファシ
エンスATCC7562を変異処理し、Ｄ−アラニンを含有する
最少平板寒天培地（第１表）上では親株同様に生育する
が、Ｄ−アラニンを含有しない最少平板寒天培地上では
生育しない、もしくは生育の遅い株を釣菌した。このよ
うな変異株の中からアラニンラセマーゼ活性の低下、ま
たは欠失した株アーロスバクター・ウレアファシエンス
AU−７株を得た。第４表に、親株ATCC7562と変異株AU−
７株のアラニンラセマーゼ活性を示した。
エンスATCC7562を変異処理し、Ｄ−アラニンを含有する
最少平板寒天培地（第１表）上では親株同様に生育する
が、Ｄ−アラニンを含有しない最少平板寒天培地上では
生育しない、もしくは生育の遅い株を釣菌した。このよ
うな変異株の中からアラニンラセマーゼ活性の低下、ま
たは欠失した株アーロスバクター・ウレアファシエンス
AU−７株を得た。第４表に、親株ATCC7562と変異株AU−
７株のアラニンラセマーゼ活性を示した。
実施例４ 前項で取得した変異株アースロバクター・ウレアファ
シエンスAU−７株及びその親株ATCC7562を実施例２と同
様に培養し、培養濾液を実施例２と同様に分析した。そ
の結果を第４表に示す。
シエンスAU−７株及びその親株ATCC7562を実施例２と同
様に培養し、培養濾液を実施例２と同様に分析した。そ
の結果を第４表に示す。
実施例５ LAP7株を10mlの種培地（グルコース２％、ペプトン１
％、酵母エキス１％、NaCl0.5％、Ｄ−アラニン200mg/
、pH7.2）を含む試験管に接種し、30℃で24時間振と
う培養した。この種培養液5mlをグルコース ４％、コ
ーンスチープリカー １％、ペプトン 0.5％、硫酸ア
ンモニウム ３％、燐酸１カリウム 0.1％、硫酸マグ
ネシウム 0.05％、硫酸マンガン 5mg/、硫酸亜鉛
10mg/、ビオチン30μg/、Ｄ−アラニン 200mg/
および炭酸カルシウム ％からなる組成の培地（pH7.
2）50mlを含む２リットル容三角フラスコに接種し、30
℃で24時間振とう培養した。この培養物の全量を、グル
コース ５％、硫酸アンモニウム ３％、燐酸１カリウ
ム 0.08％、硫酸マグネシウム 0.07％、硫酸マンガン
7.2mg/、硫酸鉄 7.2mg/、硫酸亜鉛 14.4mg/
、ビオチン 36μg/およびＤ−アラニン 1g/か
らなる組成の培地（pH7.2）1.83リットルを入れ、加熱
殺菌した５リットル容培養槽に接種し、アンモニアにて
pH6.5に保ちつつ、30℃で通気攪はん下培養を行った。
残グルコースが0.1％以下になった時点より、別途に殺
菌したグルコース溶液を連続的に流加し、投入グルコー
ス量が14％になるまで培養した。培養終了時の培養濾液
中のＬ−アラニン、Ｄ−アラニン量は各々76.7g/、4.
4g/（L/D＋Ｌ＝94.6％）であり、投入グルコースに対
するＬ−アラニン収率は46.2％に相当した。
％、酵母エキス１％、NaCl0.5％、Ｄ−アラニン200mg/
、pH7.2）を含む試験管に接種し、30℃で24時間振と
う培養した。この種培養液5mlをグルコース ４％、コ
ーンスチープリカー １％、ペプトン 0.5％、硫酸ア
ンモニウム ３％、燐酸１カリウム 0.1％、硫酸マグ
ネシウム 0.05％、硫酸マンガン 5mg/、硫酸亜鉛
10mg/、ビオチン30μg/、Ｄ−アラニン 200mg/
および炭酸カルシウム ％からなる組成の培地（pH7.
2）50mlを含む２リットル容三角フラスコに接種し、30
℃で24時間振とう培養した。この培養物の全量を、グル
コース ５％、硫酸アンモニウム ３％、燐酸１カリウ
ム 0.08％、硫酸マグネシウム 0.07％、硫酸マンガン
7.2mg/、硫酸鉄 7.2mg/、硫酸亜鉛 14.4mg/
、ビオチン 36μg/およびＤ−アラニン 1g/か
らなる組成の培地（pH7.2）1.83リットルを入れ、加熱
殺菌した５リットル容培養槽に接種し、アンモニアにて
pH6.5に保ちつつ、30℃で通気攪はん下培養を行った。
残グルコースが0.1％以下になった時点より、別途に殺
菌したグルコース溶液を連続的に流加し、投入グルコー
ス量が14％になるまで培養した。培養終了時の培養濾液
中のＬ−アラニン、Ｄ−アラニン量は各々76.7g/、4.
4g/（L/D＋Ｌ＝94.6％）であり、投入グルコースに対
するＬ−アラニン収率は46.2％に相当した。
実施例６ 実施例５で得られた培養液１リットルから、遠心分離
により菌体を除去し、得られた上澄液を脱色炭処理し
た。この脱色炭処理液を、カチオン交換樹脂ダイヤイオ
ンSK−1B（H+型）を充填したカラムに通しＬ−アラニン
を吸着させ、水洗後2Nアンモニア水で溶出し、Ｌ−アラ
ニン分画を濃縮した。得られた濃縮液にエタノールを加
え、析出する結晶を採取した。この結晶をエタノールに
より再結晶することにより、Ｌ−アラニンの結晶57.7g
を得た。
により菌体を除去し、得られた上澄液を脱色炭処理し
た。この脱色炭処理液を、カチオン交換樹脂ダイヤイオ
ンSK−1B（H+型）を充填したカラムに通しＬ−アラニン
を吸着させ、水洗後2Nアンモニア水で溶出し、Ｌ−アラ
ニン分画を濃縮した。得られた濃縮液にエタノールを加
え、析出する結晶を採取した。この結晶をエタノールに
より再結晶することにより、Ｌ−アラニンの結晶57.7g
を得た。
産業上の利用可能性 本発明によれば、栄養輸液、医薬用、食品添加用とし
て有用なＬ−アラニンを、工業的有利に製造することが
できる。
て有用なＬ−アラニンを、工業的有利に製造することが
できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 審査官 斎藤 真由美
Claims (1)
- 【請求項１】アースロバクター属に属し、Ｌ−アラニン
デヒドロゲナーゼ活性を有し、アラニンラセマーゼ活性
を殆どまたは全く有さず、かつＬ−アラニン生産性を有
する微生物を培地中に培養し、該培養物中にＬ−アラニ
ンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−アラニンを採取す
ることを特徴とするＬ−アラニンの製造法。
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|---|---|---|---|
| PCT/JP1991/001574 WO1993010252A1 (en) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | Process for producing l-alanine by fermentation |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=14014717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3029868B2 (ja) |
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-
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- 1991-11-18 EP EP91919642A patent/EP0567644B1/en not_active Expired - Lifetime
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|---|---|
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| EP0567644B1 (en) | 1997-05-21 |
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