SK279771B6 - G-penicilínamidázu - Google Patents

Description

Vynález sa týka spôsobu submerznej kultivácie buniek s aktivitou G-penicilin amidázy, najmä buniek obsahujúcich plazmidy, nesúce gén na syntézu G-penicilín amidázy.

Doterajší stav techniky

G-penicilín amidáza (ďalej len PAG) hydrolyzuje amidickú väzbu G-penicilínu (benzyplpenicilín) na 6-aminopenicilánovú kyselinu (6-APK), prípadne amidickú väzbu deacetoxycefalosporínu G (N-fenyl-7-aminodeacetoxycefalosporánová kyselina) na 7-aminocefalosporánovú kyselinu (7-ADCK).

Sú známe spôsoby kultivácie baktérii s aktivitou PAG, využívajúce komplexné zložky živných pôd, ako kvasničné a kukuričné extrakty, rôzne bielkovinové hydrolyzáty v kombinácii s induktorom enzýmu - fenyloctovou kyselinou (pat. spis SRN 1 015 554). Použitie komplexného média v kombinácii s glukózou a fenyloctovou kyselinou je uvádzané tiež na kultiváciu kmeňov, ktoré nesú gén pre PAG na rekombinovaných plazmidoch (Robas a spol., Biotechnol. Bioeng. 41, 14-24, 1993; Lee a Chang, Biotechnol. Lett. 10,787-792,1988).

Použitie syntetickej, chemicky definovanej živnej pôdy, obsahujúcej organický zdroj dusíka a skvasiteľný sacharid (napr. sacharózu) ako zdroj uhlíka, ktorý je možné počas fermentácie pridávať vo viacerých dávkach, pre kmene s aktivitou PAG, uvádza CS 151240. Je známe, že aj pri použití chemicky definovaných pôd je však rýchlosť syntézy PAG značne zvýšená prídavkami induktora fenyloctovej kyseliny, najmä pri použití fenyloctovej kyseliny ako jediného zdroja uhlíka (Vojtíšek a Slezák, Fólia Microbiol. 20, 289-297, 1975; Babu a Panda, Bioprocess Eng. 6,71-74, 1991).

Vzhľadom na to, že syntéza PAG podlieha katabolickej represii glukózou (príp. inými sacharidmi) a parciálnej represii acetátom, vznikajúcej tiež pri utilizácii glukózy (Vojtíšek a Slezák, Fólia Microbiol. 20, 298-306, 1975), boli v minulosti pripravené rôzne regulačné mutantné kmene menej citlivé proti tejto represii (Robas a spol., Biotechnol. Bioeng., 41, 14-24, 1993; CS 188 631). Špecifická aktivita PAG však bez fenyloctovej kyseliny nedosiahla vysoké hodnoty (40 U.g*l suchej hmoty buniek) (Vojtíšek a Slezák, Fólia Microbiol. 20, 289-297, 1975). Rekombinantné kmene, pripravené z týchto mutantných kmeňov, sú taktiež menej citlivé proti katabolickej represii a celý rad z nich môže syntetizovať PAG konštitutívne v neprítomnosti fenyloctovej kyseliny. Vlastnosti kmeňov Escherichia coli, nesúcich rôzne nekombinované plazmidy, sú uvedené v CS 278 516aCS(PV 1269-92).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je spôsob submerznej kultivácie buniek kmeňa mikroorganizmu, najmä Escherichia coli obsahujúceho rekombinované plazmidy, produkujúcich G-penicilín amidázu (PAG) v minerálnej živnej pôde, obsahujúcej ako zdroj asimilovateľného uhlíka skvasiteľný sacharid a ako zdroj dusíka anorganickú soľ a minerálne živné soli, ktorý spočíva v tom, že sa v priebehu kultivácie kmeňa mikroorganizmu pridáva skvasiteľný sacharid v dávkach zodpovedajúcich koncentrácii 0,01 až 3,0 %, alebo kontinuálne v závislosti od spotreby sacharidu, pri súčasnej úprave pH v rozmedzí 6,0 až 7,5, výhodne 6,4 až 7,0, prídavkom alkálií, pri zvýšenom pH 7,3 až 8,0 na začiatku kultivácie. Živné médium môže výhodne obsahovať vápnik vo forme rozpustnej soli, v koncentrácii Ca 2.10*5 až 0,1 % a/alebo vo forme CaCC>3 v koncentrácii 0,05 až 1 %, železo vo forme rozpustných solí v koncentrácii 1.10*5 až 2.10*3 % _a horčík vo forme rozpustných solí v koncentrácii Mg zodpovedajúcej 0,001 až 0,05 %. Vynález sa týka kultivácie najmä buniek obsahujúcich rekombinované plazmidy, nesúce gén pre PAG. Tieto rekombinantné kmene produkujú väčšinou PAG aj bez prídavku fenyloctovej kyseliny pri súčasne zníženej represii syntézy PAG zdrojmi uhlíka (napr. glukóza, sacharóza, glycerol). Tieto vlastnosti zvýhodňuje predmetný vynález vhodne regulovanou kultiváciou na dosiahnutie maximálnej produkcie PAG. Spôsob submerznej kultivácie spočíva v použití syntetických, chemicky definovaných pôd, obsahujúcich utilizovateľný zdroj uhlíka, výhodne sacharid, a anorganický zdroj dusíka, pričom sa obidva počas kultivácie, vzhľadom na eventuálnu a čiastočnú represiu, dávkujú, aby sa dosiahla vysoká koncentrácia buniek s vysokou aktivitou PAG. Vzhľadom na to, že počas utilizácie zdroja uhlíka vznikajú organické kyseliny (napr. octová kyselina), ktoré znižujú pH pod optimálnu hodnotu a tým negatívne ovplyvňujú rast, je žiaduca súčasná regulácia pH. Vzhľadom na to, že skorá regulácia pH môže negatívne ovplyvniť produkciu enzýmu, je výhodnejšie zvýšiť štartovacie pH média alebo pridať CaCC>3, ktorý zvyšuje pufrovaciu kapacitu média. Pre produkciu PAG je dôležitá tiež vhodná koncentrácia Mg2+ iónov a nízka koncentrácia Fe2+ resp. Fe3+ iónov. Je výhodné dávkovať zdroj dusíka vo forme hydroxidu amónneho, čím sa súčasne udržuje optimálne pH a potrebná hladina dusíka. Celý kultivačný proces je možné kombinovať sledovaním parciálneho tlaku kyslíka (pOž) vyregulovaného tak, že rýchly a náhly nárast pO2 signalizuje zastavenie rastu bunkovej kultúry z nedostatku zdroja uhlíka, prípadne dusíka. Po pridaní ďalšej dávky potrebného zdroja a jeho pokračujúcej utilizácii pC>2 opäť poklesne. Týmto spôsobom je možné dosiahnuť vysokú koncentráciu buniek s vysokou aktivitou PAG (t. zn. vysokú celkovú a špecifickú aktivitu PAG) a teda značne zvýšiť výťažnosť enzýmu a získať kvalitný bunkový materiál.

Spôsob kultivácie je možné použiť najmä pre kmene Escherichia coli obsahujúce rekombinované plazmidy, nesúce PAG gén, ako sú napr. kmene obsahujúce plazmidy podľa CS 278 516 a podľa CS (PV 1269-92). Tak isto je možné kultivačný postup použiť pre rôznych producentov PAG neobsahujúcich rekombinované plazmidy, najmä so zníženou katabolickou represiou proti použitému zdroju uhlíka a bez potreby induktora Výhodne je možné použiť kmeň Escherichia coli CCM 4228, obsahujúci rekombinovaný plazmid pKA18. Opísaným spôsobom kultivácie je možné dosiahnuť bez prítomnosti fenyloctovej kyseliny značnú produkciu PAG, pričom je eliminované nebezpečenstvo občasných lýz (rozpadnutí) bunkovej populácie v prevádzkovom meradle farmaceutického priemyslu, ku ktorým dochádzalo pri indukcii PAG fenyloctovou kyselinou (pravdepodobne genetická súvislosť uvoľnenia profága pri intenzívnom prepise génov).

Množstvo PAG bolo určované v bunkách, premytých 0,1 M fosfátovým tlmivým roztokom pH 8,0, meraním počiatočnej rýchlosti hydrolýzy penicilínu G v 0,05 M fosfá2 tovom tlmivom roztoku s pH 8,0 pri teplote 37 °C v oblasti kinetiky nultého radu. Produkt reakcie 6-APK bol stanovený spektrofotometricky s použitím p-dimetylaminobenzaldehydu (Balasingham a spol., Biochim. Biophys. Acta 276, 250-260, 1972). Jednou jednotkou je také množstvo enzýmu, ktoré zodpovedá tvorbe jedného mikromolu 6-APK za minútu. Špecifická aktivita je definovaná ako U.g' suchej hmoty buniek.

Získanú suspenziu vysoko aktívnych buniek je možné použiť alebo vo forme separovanej bunkovej pasty, alebo vo forme zahustenej suspenzie ako východiskový materiál na výrobu imobilizovaných celých buniek alebo ich častí po dezintegrácii, alebo je možné pastu, resp. zahustenú suspenziu použiť na izoláciu surového enzýmu a jeho následnú imobilizáciu a získať tak katalyzátory' s vysokou aktivitou PAG a s vysokou účinnosťou pri štiepení G-penicilínu.

Vynález je ďalej doložený príkladmi uskutočnenia, ktoré ho však neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Pripravila sa tuhá a tekutá živná pôda s nasledujúcim zložením: 2 % glycerol, 0,4 % (NH4)₂SC>4, 1,36 % KH2PO4, 0,3 % NaOH, 0,001 % FeSO4.7H2O, 0,005 % CaC12.6H2O, 0,2 % MgSO4.7H2O, pH 7,2-7,3; sterilizácia 30 minút pri 1,2 atm. V prípade tuhej živnej pôdy bolo toto médium doplnené 1,5 % agaru. K tekutej aj tuhej pôde sa v aseptických podmienkach pridal kanamycín v koncentrácii 35 pg.ml'l.

Na tuhú pôdu v Petriho miskách sa naočkoval kmeň z glycerolovej konzervy skladovanej pri -20 °C a misky sa inkubovali pri 30 °C 48 hodín. Vyrasteným kmeňom sa slučkou zaočkovalo 100 ml tekutej pôdy v 500 ml varnej banke a táto sa inkubovala na rotačnej trepačke (240 ot/min. výstredník 25 mm) 24 hodín pri 30 °C.

V sklenenom fermentačnom tanku s objemom 5 litrov (vnútorný priemer 158 mm, výška 250 mm), vybavenom radiálnym miešadlom so šiestimi lopatkami s priemerom 70 mm, sa pripravili 2 litre pôdy so zložením: 2 % glycerol, 0,2 % (NH4)₂SO4, 1,36 % KH₂PO₄, 0,3 % NaOH, 0,5 CaCOj, 0,001 % FeSO4.7H2O, 0,005 % CaC12.6H2O, 0,2 % MgSO4-7H2O, 0,015 % silikónového odpeňovača SAG 471, pH 7,2-7,3; sterilizácia 40 minút pri 1,2 atm. Roztoky MgSO4, FeSO4, CaC12 a CaCO3 boli sterilizované zvlášť.

ml inokula z banky, pripraveného spôsobom ako je uvedené, sa aseptický prilialo do sterilnej živnej pôdy vo fermentačnom tanku a vykonala sa kultivácia pri teplote 25 °C, pri prevzdušnení 1 objem vzduchu na objem živnej pôdy pri frekvencii miešania 400 ot/min. Počas kultivácie sa postupne zvyšovala rýchlosť miešania až na 600 ot/min. a odoberali sa vzorky na stanovenie optickej denzity kultúry, amoniakálneho dusíka, suchej hmoty buniek a aktivity PAG. V troch dávkach sa počas kultivácie pridalo celkom 0,4 % (NH4)2SO4· Kultivácia prebiehala 17 hodín. Hodnota pH kultúry na konci fermentácie bola 6,0. V jednom litri kultivačnej kvapaliny sa dosiahla produkcia PAG 4 700 U a nárast buniek 8,3 g suchej hmoty. Špecifická aktivita bola 560 U.g'l suchej hmoty buniek.

Príklad 2

Pripravila sa kultúra na tuhom agare a 10 buniek inokula Escheríchia coli CCM 4228 (pKA19), ako je uvedené v príklade 1, s tým rozdielom, že tekutá pôda pre inokulum bola obohatená predzrážaným kukuričným extraktom (250 ml. 1'1 živnej pôdy).

Predzrážaný kukuričný výluh sa pripravil nasledovne:

g kukuričného extraktu (60 % suchej hmoty) sa suspendovalo do demineralizovanej vody, pH sa upravilo 40 % roztokom NaOH na 7,6, roztok sa doplnil vodou na 1 liter a zohrieval 15 minút pri 100 °C. Vzniknuté zrazeniny sa odstránili filtráciou. V nerezovom tanku s objemom 75 litrov (priemer 348 mm, výška 810 mm), vybavenom štyrmi zarážkami, tromi radiálnymi miešadlami so šiestimi lopatkami s priemerom 122 mm, umiestnenými na 1 hriadeli (vzdialenosť miešadiel od seba 170 mm, spodného miešadla odo dna 160 mm) a aeračným vencom s priemerom 158 mm, vzdialeným 40 mm odo dna, sa pripravilo 50 1 živnej pôdy s nasledujúcim zložením: 1 % glycerol, 0,4 % (NH4)₂SO4, 1,36 % KH2PO4, 0,3 % NaOH, 0,5 CaCO3, 0,001 % FeSO4.7H₂O, 0,003 % CaC12.6H₂O, 0,2 % MgSO4.7H2O, 0,015 % silikónového odpeňovača SAG 471. Po sterilizácii (40 min, 1,2 atm) sa aseptický pridali roztoky MgSO4, FeSO4, CaC12 a CaCO3 (sterilizácia zvlášť) a pH sa v aseptických podmienkach upravilo 40% NaOH na hodnotu 7,6.

Ďalej boli pripravené sterilné zásobné roztoky: 2,8 litra 50% (hmotn/obj) glycerolu (sterilizácia 2x30 min., 1,2 atm) a 1 liter čpavkovej vody, riedenej 1:1.

Po ochladení pôdy sa vykonalo očkovanie sterilnej živnej pôdy 1 litrom inokula, ktoré sa získalo zliatím obsahu 10 baniek v aseptických podmienkach. Kultivácia prebiehala pri teplote 25 °C. Počiatočné prevzdušnenie bolo 0,3 objemu vzduchu na objem živnej pôdy pri frekvencii miešania 400 ot/min. Počas kultivácie sa meralo pH, parciálny tlak kyslíka (pO₂) a odoberali sa vzorky na stanovenie optickej denzity, amoniakálneho dusíka, suchej hmoty buniek a aktivity PAG. Pri poklese pO₂ k nulovej hodnote (cca od 10. hodiny kultivácie) sa frekvencia miešania postupne zvyšovala. Od 17. hodiny kultivácie sa dávkovali prídavky glycerolu, zodpovedajúce koncentrácii v živnej pôde 0,15 %. Pri poklese pH na hodnotu 6,6 sa začalo s reguláciou pH dávkovaním čpavkovej vody v rozsahu pH 6,3 až 6,6. Kultivácia prebiehala 21 hodín.

V jednom litri kultivačnej kvapaliny sa dosiahla produkcia PAG 5 050 U pri náraste 7,2 g suchej hmoty buniek. Špecifická aktivita bola 701 U.g 1 suchej hmoty buniek.

Príklad 3

Pripravila sa kultúra kmeňa Escheríchia coli CCM 4228 (pKA18) na šikmom agare spôsobom, ako je uvedený v príklade 1. Ďalej sa pripravilo 10 baniek inokula spôsobom, ako je uvedený v príklade 2, s tým rozdielom, že pôda obsahovala namiesto glycerolu 1 % sacharózy.

V nerezovom tanku s objemom 75 litrov, s rovnakým vybavením ako v príklade 2, sa pripravilo 50 litrov pôdy s rovnakým zložením ako pri príprave inokula (t.zn. zdroj uhlíka 1 % sacharóza), ale bez kanamycínu. Na tento účel sa vopred pripravilo 12,5 litra predzrážaného kukuričného extraktu spôsobom, ako je opísaný v príklade 2. Po ochladení pôdy sa v aseptických podmienkach uskutočnilo očkovanie živnej pôdy 1 litrom inokula, získaným zliatím ob3 sahu 10 baniek v aseptických podmienkach. Kultivácia v očkovacom tanku prebiehala v podmienkach prevzdušňovania 0,3 objemu vzduchu na objem pôdy pri frekvencii miešania 300 ot/min. a teplote 28 °C. Počas kultivácie sa sledoval rast kultúry meraním optickej denzity. Pri prechode do stacionárnej fázy kultúry (17. hodina kultivácie) sa kultúra, ktorá vyrástla v očkovacom tanku, použila na očkovanie produkčného tanku.

Do 300 litrového nerezového tanku (priemer 490 mm, výška 1460 mm), vybaveného 4 zarážkami, tromi radiálnymi miešadlami so šiestimi lopatkami s priemerom 190 mm, umiestnenými na 1 hriadeli (vzdialenosť miešadiel od seba 250 mm, spodného miešadla odo dna 85 mm) a aeračným vencom, vzdialeným 50 mm odo dna, sa pripravilo 180 1 pôdy s nasledujúcim zložením: 1 % sacharóza, 0,4 % (NH₄)₂SO4, 1,36 % KH₂PO₄, 0,4 % NaOH, 0,1 CaCO₃, 0,001 % FeSO₄.7H₂O, 0,003 % CaCl₂.6H₂O, 0,2 MgSO₄.7H₂O, 0,015 % silikónového odpeňovača SAG 471, pH 7,6 až 7,8, sterilizácia 40 minút, 1,2 atm. Ďalej sa pripravili sterilné zásobné roztoky: 15 1 50% roztoku sacharózy, 0,25 1 15% roztoku NH4CI, 61 čpavkovej vody (riedenej 1:1).

Po ochladení pôdy sa v aseptických podmienkach uskutočnilo očkovanie 4 litrami kultúry z inokulačného tanku. Začiatočné prevzdušnenie bolo 0,33 objemu vzduchu na objem živnej pôdy pri frekvencii miešania 150 ot/min. Kultivácia prebiehala pri teplote 25 °C. Počas kultivácie sa meralo pH, parciálny tlak kyslíka (pO₂) a odoberali sa vzorky na stanovenie optickej denzity, amoniakálneho dusíka, suchej hmoty buniek a aktivity PAG. V 17. hodine kultivácie sa pridal NH₄C1 v koncentrácii, zodpovedajúcej 0,02 % v živnej pôde a začalo sa s dávkovaním sterilného roztoku sacharózy zo zásobnej fľaše v prípade náhleho nárastu pO₂, pričom dávky zodpovedali konečnej koncentrácii sacharózy v živnej pôde 0,15 %. Od 19. hodiny kultivácie sa regulovalo pH v rozmedzí 6,4 až 6,6. Kultivácia prebiehala 34 hodín.

V jednom litri kultivačnej kvapaliny sa dosiahla produkcia PAG 14 050 U a nárast 15 g suchej hmoty buniek. Špecifická aktivita bola 937 U.g' suchej hmoty buniek.

Príklad 4

Kultivácia Escherichia coli CCM 4228 (pKA18) sa uskutočnila rovnakým spôsobom ako v príklade 3, s tým rozdielom, že sacharóza bola dávkovaná nepretržite v mikrodávkach, automaticky riadených podľa zmien pO₂ (dávkovanie pri pO₂ nad 7 %).

Kultivácia prebiehala 42 hodín. V jednom litri kultivačnej kvapaliny sa dosiahla produkcia PAG 21 800 U a nárast 22,4 g suchej hmoty buniek. Špecifická aktivita bola 973 U.g'l suchej hmoty buniek.

Priemyselná využiteľnosť

Spôsob fermentácie podľa vynálezu je možné využiť na prípravu medziproduktov pri výrobe antibiotík, tzv. polosyntetických penicilínov, resp. cefalosporínov.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (3)

1. Spôsob submerznej kultivácie buniek kmeňa mikroorganizmu, najmä Escherichia coli obsahujúceho rekombi nované plazmidy, produkujúcich G-penicilín amidázu, v minerálnej živnej pôde, obsahujúcej ako zdroj asimilovateľného uhlíka skvasiteľný sacharid a ako zdroj dusíka anorganickú soľ a minerálne živné soli, vyznačujúci sa t ý m , že počas kultivácie sa pridáva skvasiteľný sacharid v dávkach zodpovedajúcich koncentrácii 0,01 až 3 %, alebo kontinuálne v závislosti od spotreby sacharidu, anorganický zdroj dusíka v množstve zodpovedajúcom koncentrácii 0,01 až 3 % v médiu, vápnik, železo a horčík, pri súčasnej úprave pH v rozmedzí od 6,0 do 7,5, výhodne 6,4 až 7,0, prídavkom alkálií, pri zvýšenom pH 7,3 až 8,0 na začiatku kultivácie.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako anorganický zdroj dusíka sa používa hydroxid amónny, ktorý súčasne slúži na reguláciu pH v uvedenom rozmedzí.

3. Spôsob podľa nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa t ý m , že vápnik sa použije vo forme rozpustnej soli v koncentrácii Ca 2.10'5 až 0,1 % a/alebo vo forme CaCO₃ v koncentrácii 0,05 až 1 %, železo vo forme rozpustných solí v koncentrácii 1.10'5 2.10'3 % _a horčík vo forme rozpustných solí v koncentrácii Mg zodpovedajúcej 0,001 až 0,05 %.