SE462394B - Foerfarande foer framstaellning av cellulolytiska enzym - Google Patents

Description

462 394 10 15 20 25 30 35 40 av Allen, A.L. och Andreotti, R.E., Biotechnology and Bio- engineering symposium nr 12, sid. 451-459 (1982); RUT C 30 beskriven av Montenecourt, B.S. och Eveleígh, D.E., Applied Environmental Microbíology, vol. 34, sid. 777 (1977) och CL 847 beskriven av Warzywoda, M. och medarbetare, Biotech- nology Letter, vol. 5, sid. 243 (april 1983).

Denna genetiska förbättring har tillåtit erhållandet av stammar med maximal produktivitet av utsöndrade cellulaser ävensom en minskad katabolisk hämníng i förhållande till den för den vilda stammen. Denna kataboliska hämníng är en faktor som bestämmer produktionen av cellulaser i industriell nivå; syntesen av cellulaser blockeras i verkligheten av närvaron i odlingsmediet av lätt metaboliserbara socker. De olika an- givna stammarna har varit föremål för forsknings- och utveck- lingsarbeten, som har bekräftat deras överlägsenhet över den vilda stammen för utsöndring av cellulaser. Mandels (loc cit) har visat att såsom för den vilda stammen de högsta enzympro- duktionerna erhålles genom att dessa stammar tillföres renade och kol. Under dessa betingel- proportíonell mot mängden åtminstone i den utsträckning medför en alltför hög viskosi- säkerställes hos de olika nöd- vändiga överföringarna i kulturen. Det är sålunda erkänt att maximikoncentrationen av cellulosa som man kan uppnå, är exem- pelvis av storleksordningen 70-80 g/l. Dessa odlingsmedier med hög halt av renad cellulosa kan icke extrapoleras till industriell skala på grund av å ena sidan förhöjd kostnad för den renade- cellulosa , som användes, och å andra sidan förhöjda energiut- gifter för omröring av kulturmediet med mycket stor viskositet.

Kolkällor som tillåter en lättare extrapolering av odlings- mediet, har följaktligen efterforskats. Allen, A.L. och Mortensen, R.E., Biotechnology and Bioengineering, vol. 23, sid. 2641-2645 (1981) har såsom kolkällor föreslagit flera socker, som användes på grund av deras låga kostnad och cellulosor såsom huvudenergikälla ser är produktionen av cellulaser cellulosa som sättes till mediet, som denna cellulosa icke i mediet tet så att en normal effektivitet ensamma eller i blandning, deras goda löslighet i vattenhaltigt medium. Man konstaterar likväl att framställningen av cellulaser som erhålles genom odling av Trichoderma reesei på odlingsmediet på basis av lös- liga socker är mycket lägre än det som erhålles på cellulosa, speciellt på renad cellulosa. Dessa små produktioner är utan 10 15 20 25 30 35 40 3 462 594 tvivel förklarliga genom en hämningsverkan på enzymproduk- tionen genom socker iide koncentratíoner som de användes.

Teknik med kontinuerlig matning av ett kolhaltigt substrat har använts för att till mikroorganismen tillföra exakt nödvän- diga mängder socker för dess behov och för att begränsa halten restsocker i kulturerna, vilket på så sätt tillåter att den kataboliska hämningen på grund av socker ökas. Användningen av sådan teknik med icke-lösliga cellulosahaltiga substrat upp- ställer problem vid extrapolering under sterila betingelser.

Man har följaktligen sökt att använda sådan teknik under använd- ning av lösliga socker, vilkas koncentrerade lösningar lätt kan steriliseras och sterilt insprutas genom pumpning eller något annat överföringsmedel för vätska i reaktorer med större eller mindre kapacitet. Allen och Andreotti (loc cit) har använt en källa av laktos, lösligt socker, såsom kolkälla för stammen MCG 80 Trichoderma reesi, medan Allen och Mortensen (loc cit) har använt glukos, cellobios eller blandningar av artificiella socker med stammen RUT C 30 Trichoderma reesei. De av dem upp- nådda resultaten vid kontinuerligt arbete uppnådde emellertid, om de är bättre än de som iakttagits vid diskontinuerligt arbete med samma substrat, icke de värden som iakttagits vid diskontinuerligt (satsvis) arbete med renade cellulosor, såväl med hänsyn till halter, utbyten som produktivitet av cellulas.

Föreliggande uppfinning föreslår ett förfarande för fram- ställning av éellulaser med förhöjda utbyten och halter av enzym.

Det har oväntat visat sig att man med hjälp av en speciell igångsättning av matningen (företrädesvis kontinuerlig) av sub- Strat (Fed-Batch) som tillåter användning av lösliga socker, såsom laktos, glukos, xylos, arabinos, cellobios eller deras blandningar såsom kolkälla, kunde uppnå en produktion av cellulas, vars enzymhalt är tydligt högre i förhållande till känd teknik, speciellt vid diskontinuerligt arbete (Batch) på renad cellulosa ävensom en signifikant förbättring av enzymproduktionen i för- hållande till den använda substratmassan.

Uppfinningen avser sålunda ett förfarande för aeorob fram- ställning av cellulas genom odling av en stam av Trichoderma reesei i en fermenteringszon som innehåller ett näringsmedel, varvid förfarandet innebär att en tillförsel åstadkommes, före- trädesvis kontinuerligt, med hjälp av en vattenhaltig lösning av åtminstone ett lösligt socker, företrädesvis laktos, till 462 594 10 15 20 25 30 35 40 a) b) matníngszonen. Detta förfarande kännetecknas därav: att man under loppet av ett första steg underkastar ett od- fermenteringsbetingelser, varvid mediet mineralsalter och lingsmedium aeroba innehåller en stam av Trichoderma reesei, såsom begynnelsekolsubstrat åtminstone ett material som inne- håller cellulosa, t ex pappersmassa eller renad cellulosa, och minst ett lösligt socker, företrädesvis laktos, var"id viktmängderna cellulosa och lösligt socker i förhållande till odlingsmedlet var och en är mellan 0,01 och 2% (d v s cirka 0,1-20 gram per liter lösning) och varvid det första steget fullföljes utan ny tillsats av lösligt socker under tillräcklig tid för förbrukning av åtminstone 10% av sockret, företrädesvis minst 20%, och för uppnående av en sockerkon- centration i mediet av mindre än 0,3 viktprocent, företrädes- vis mindre än 0,2%, och att man under loppet av ett andra steg fullföljer den aeroba fermenteringen genom tillsats av lösligt socker på progressivt sätt, så att en mängd socker motsvarande totalt minst 3 vikt- procent av odlingsmediet införes allt under det att socker- koncentrationen i odlingsmediet hålles vid ett lägre värde än 0,3 viktprocent och företrädesvis mellan 0,1 och 0,25 vikt- procent.

Koncentrationen av cellulosa är företrädesvis mellan 0,2 och 2 viktprocent och ännu lämpligare mellan 0,5 och 1 viktprocent och sockerkoncentrationen är mellan 0,02 och 1 viktprocent. Socker- koncentrationen är på lämpligt sätt lika med ett värde mellan 10 och 50% av cellulosakoncentrationen.

Förfarandet enligt uppfinningen innebär att det väsentliga av tillväxten och produktionen av enzymer genom Trichoderma reesei säkerställes genom en företrädesvis kontinuerlig till- försel av lösligt socker, t ex laktos, genom att enzymproduk- tionen maximeras genom att i ordlingsmedíet före dess ympning i förväg införlivas en ringa kritisk mängd cellulosahaltigt avledningsmedel. Före tillsatsen av sockerlösníngen till fer- menteringsanordningen, som har mottagit förkulturen, bringar man härför denna förkultur först i kontakt med ett cellulosa- haltigt initieringsmedel.

Man framställer konventionellt från sporer eller mycel av den valda stammen av Trichoderma “eesei en vätskeformig för- kultur i ett odlingsmediur som innehaller mineralsalter och 5 10 15 20 25 30 35 40 f " 462 394 vanliga vitaminkomplement och en kolkälla och energi, företrädes- vis i form av lösliga socker, lämpligen laktos; denna förkultur kan exempelvis framställas i en omrörd kolv anbringad i ett rum med en konstant temperatur av cirka 27OC eller företrädesvis i en fermenteringsanordning. När utvecklandet av denna förkultur har tillåtit uppnåendet av en biomassa motsvarande exempelvis 0,5-1,5 viktprocent torrt material av odlíngsmediet, företrädes- vis 1%, överföres förkulturen sterilt till en fermenteríngsan- ordning för framställning av enzym. Denna fermenteringsanordning för framställning av enzym enligt uppfinningen innehåller ett _odlingsmedium eller näringsmedium som innehåller mineralsalter, vitaminkomplement och vanliga ytaktiva medel, en mängd cellulosa- haltigt initieringsmedel . (exempelvis renad cellulosa, pappers- massa) mellan 0,01 och 2%, företrädesvis mellan 0,5 och 1 vikt- procent, räknat på odlíngsmediet och en ringa mängd av åtminstone. ett socker, såsom förklarats. Man upprätthåller erforderlig kon- takt mellan förkulturen och mediet som innehåller det cellulosa- haltiga initkningsmedlet_, varefter man företrädesvis kontinuer- ligt matar reaktorn med en steril, vattenhaltig lösning av åtminstone ett socker, vars sockerkoncentration är mellan cirka 20 och 30 viktprocent, varvid denna lösning i allmänhet ävenledes innehåller ett odlings- eller näringsmedium, varvid matningshas- tigheten inställes såsom angivits. Denna matning av löslígt socker /motsvarar en användning av koncentrationer av löslígt socker (uttryckta i totalvikt tillsatt socker per slutlig reaktionsvolym) mellan exempelvis och företrädesvis 80 och 120 g/l under en tid av cirka 90-160 h och för åskådlighets skull speciellt cirka 100 g/l under en tid av cirka 140 h.

EXEMPEL 1 (jämförelseexempel) J Man framställer en vattenhaltig lösning av mineralsalter benämnd C1 med följande sammansättning: 3,32 g/l kaliumhydroxid (KOH), 4 ml/l fosforsyra (85-procentig), 5,6 g/l ammoniumsulfat, @H4)2S04; 1,2 g/l magnesiumsulfat (MgSO4, 7 H20), 1,2 g/l kalcium- klorid (CaCl2), 6,4 mg/1 mangansulfat (MnSO4), 5,6 mg/1 zinksulfat (ZnSO4, 7 H20), 8 mg/l koboltklorid (CoCl2), 20 mg/1 järnsulfat (FeSO4, 7 H20).

En fermenteringsanordning innehållande 0,5 liter av lösningen C1, 1,4 liter vatten, 2 g jästextrakt, 160 g cellulosa (Whatman CC4D, 2 ml Tween 80 (kommersiell produkt), 2 ml skumdämpande medel, steriliseras genom autoklavering under 20 minuter vid 120°C. 462 394 10 15 20 25 30 35 40 Efter avsvalning inställes mediets temperatur på 27°C och pH på ett värde av 5. Fermenteringsanordningen ympas då med 200 ml av en vätskeformig förkultur av stammen Trichoderma reesei CL 847. Temperaturen regleras till 27°C under de första 24 tim- marna av odlingen och därefter till ZSOC tills odlingen avslutats.

Under hela odlingstiden regleras pH på värdet S genom tillsats av en ammoníaklösning. Koncentrationen av löst syre i odlingen hålles över 15 viktprocent av mättningskoncentrationen genom inställning av omröringshastigheten och luftningsgraden. Någon tillsats av näringsmedel, förutom ammoniak, utföres icke under -odlingen. Efter 142 h odling utvinnes fermenteringslösningen och analytiska bestämningar utföres på likstora delar av det överskiktade; proteiner analyseras och cellulasaktiviteterna be- stämmes på filtrerpapper och B-glukosidas på cellubios. Man har på så sätt erhållit: 17,9 g/1 proteiner, 13,7 internationella enheter cellulaser per milliliter (UPF/ml), 9,9 internationella enheter ß-glukosidas per milliliter. Man har erhållit 171 cellu- lasenheter per gram använt kolsubstrat.

EXEMPEL z (jäinföreiseexempei) En kultur av stammen Trichoderma reesei RUT C 30 behandlas under betingelser som är identiska med dem som angivits i exem- pel 1. Efter 142 h är de uppnådda resultaten följande: 14 g/1 proteiner, 10 UPF/ml cellulasaktivitet, 5 U/ml ß-g1ukosidas- aktivitet. Man har erhållit 125 enheter cellulaser per gram använt kolsubstrat.

EXEMPEL 3 (jämförelseexempel) I detta exempel ersättes den i exemplen 1 och 2 använda cellulosan (Whatman CC4l) med en laktosblandning och 10 g pappers- massa (cellulosa). Fermenteringsanordningen ympas med 200 ml av en förkultur av stammen Trichoderma reesei CL 847. genomföres under samma betingelser som i exempel 1; efter 162 h är de uppnådda resultaten följande: 14,1 g/1 proteiner, 8,4 UPF/ml cellulasaktivitet, 7,1 U/ml B-glukosidasaktivitet. Man har er- hållit 129 enheter cellulaser per gram använt kolsubstrat.

EXEMPEL 4 (jämförelseexempel) En kultur av stammen RUT C 30 av Trichoderma reesei be- handlas under betingelser som är identiska med dem som angivits i exempel 3. Efter 162 h är de uppnådda resultaten följande: 10,2 g/1 proteiner, 6,1 UPF/ml cellulasaktivitet, 3,2 U/ml B-glukosidasaktivitet. Man har erhållit 94 enheter cellulaser Odlíngen 10 15 20 25 30 35 40 i 462 394 per gram använt kolsubstrat.

EXEMPEL 5 Man bereder en steril vattenhaltig lösning, benämnd C2, innefattande per liter 250 g laktos och 0,625 l av lösningen C1. En fermenteringsanordning som innehåller 0,5 1 av lösning C1, 1,3 l vatten, Z g/l jästextrakt, 2 ml skumdämpande medel, 2 ml Tween 80, 25 g pappersmassa och 7,5 g laktos (cirka 4,16 g/1) steriliseras genom autoklavering under 20 minuter vid 1zo°c.

Efter kylning inställes mediets temperatur på 27°C och mediets pH på 5. Fermenteringsanordningen ympas då med 0,2 l av en vätskeformig förkultur av stammen Trichoderma reesei(1.847.

Temperaturen regleras vid 27°C under de första 24 timmarna av odlingen och därefter vid 25°C tills odlingen avslutats. pH regleras på 5 under hela odlingstiden genom tillsats av en ammoniaklösning; koncentrationen av i odlingsvätskan löst syre hålles över 15 viktprocent av mättningskoncentrationen genom inställning av omröringshastigheten och luftningsgraden.

Dosering av laktos utföres under tiden för provtagningar från kulturen. Efter 25 timmar är koncentrationen av laktos i fermenteringslösningen 1,2 g/l. Fermenteringslösningen matas då sterilt på kontinuerligt sätt med lösningen C2; matnings- hastigheten inställes så, att koncentrationen av laktos icke överskrider 2 g/l under hela odlingstiden. Medelhastígheten för matningen av laktos är 1,9 gram per timme till den tionde timmen och 2,25 g per timme tills odlingen avslutats. Efter 145 timmar insprutas 1 liter av lösningen C2 i fermenterings- lösningen, matningen avbrytes då och fermenteringslösningen uppsamlas. Analytiska bestämningar på denna lösning ger följande resultat: 36 g/l proteiner, 26,3 UPF/ml cellulas- aktivitet, 34 U/ml B-gkujisudas. Man har erhållit 246 enheter cellulaser per gram använt kolsubstrat.

EXEMPEL 6 (jämförelseexempel) En odling av stammen Trichoderma reesei CL 847 genomför- des under betingelser som är identiska med dem som angivits i exempel 5, förutom för matningen av lösning C2, som utföres så, att 1 liter av denna lösning insprutas under loppet av de första 110 timmarna av odlingen. Resthalten laktos i odlingslösningen uppgår till 22 g/1 vid 40 timmar och 6,5 g/l vid 85 timmar.

Efter avslutad matning av lösning C2 vid den .10:nde timmen 8' 462 394 10 15 23 25 30 35 40 fullföljes odlingen till den 160:nde timmen. De uppnådda resultaten är följande: vid 110:nde timmen 13,6 g/1 proteiner, 7,2 UPP/ml cellulasaktivitet, 7,3 U/ml B-glukosidas; vid 145:te timmen 14,5 g/l proteiner, 7,9 UPP/ml cellulasaktivitet, 7 U/ml B-glukosidas. Man har fullföljt försöket upp till 160 timmar. Det sker icke längre någon utveckling från den 145:te timmen. Man har erhållit 67 enheter cellulaser per gram använt kolsubstrat.

EXEMPEL 7 En odling av stammen Trichoderma reesei RUT C30 utföres under betingelser som är identiska med dem som angivits för exempel 5: kontinuerlig insprutning av 1 l lösning C2 sker till 14S:te timmen; koncentrationerna av laktos överskrider aldrig 2 g/1. De uppnådda resultaten är följande: 29,5 g/l proteiner, 18,5 UPP/ml cellulasaktivitet, 13,2 U/ml ß-glukosi- das. Man har erhållit 173 enheter cellulaser per gram använt kolsubstrat.

EXEMPEL 8 (jämförelseexempel) En odling av stammen Trichoderma reesei RUT C30 utföres under betingelser som är identiska med dem som angivits för exempel 5, förutom för tíllsatsen av pappersaassa, som är ute- lämnad under beredningen av mediet före sterilisering; kon- tinuerlig insprutning av 1 1 lösning C2 utföres till den 145:te timmen; koncentrationerna av laktos överskrider aldrig 2 g/l.

De uppnådda resultaten är följande: 18,4 g/l proteiner, 12,8 [EF/ml cellulasaktivitet, 8,7 U/ml B-glukosidas. Man har erhållit 132 cellulasenheter per gram använt kolsubstrat.

EXEMPEL 9 (jämförelseexempel) En förodling i vätska av stammen Trichoderma reesei RUT C 30 utföres på 2 viktprocent cellulosa Whatman CC4l såsom enda kol- och energikälla. Efter 40 h överföres 200 ml av denna förkultur till en fermenteringsanordning, som framställts enligt betingel- serina i exempel 1, förutom för cellulosan Whatman CC4l, varav endast 40 g innefattas i mediet före sterilisering. Odlingsbe- tingelserna är desamma som dem i exempel 1. Från den 42:dra timmen till den 90:nde timmen utföres en tillsats av 8 gram steril cellulosa Whatman CC4l var åttonde timme; från den 98:nde timmen till den 138:nde timmen utföres en tillsats av 18,5 av samma cellulosa var åttonde timme. Till följd av de upprepade öppningarna av fermenteringsanordningen, vilka erfonhas 10 15 20 25 -& 462 394 genom cellulosatillsatserna, uppträder en bakterieförorening från den 70:nde timmen; denna förorening blir mer eller mindre betydande och odlingen fullföljes icke efter 138 timmar. Resul- taten från analytiska bestämningar, som utföres pà den över- skiktade vätskan i den utvunna odlingslösningen vid den 138:nde timmen, är följande: 24,3 g/1 proteiner, 15,8 UPF/ml cellulas- aktivitet, 10,2 U/ml B-glukosidasaktivitet. Man har erhållit 159 enheter cellulaser per gram använt kolsubstrat.

EXEMPEL 10 (jämförelseexempel) En odling av stammen Trichoderma reesei MCG 77 genomföres under betingelser som är identiska med dem som angivits i exem- pel 1, med undantag av att cellulosan Whatman CC4l, som an- vänts i exempel 1, ersättes med en blandning av laktos och 10 g pappersmassa (cellulosa). Fermenteringsanordningen ympas med 200 ml av en förkultur av stammen Trichoderma reesei MCG 77.

Efter 162 h är de uppnådda resultaten följande: 4,8 g/1 proteiner, '2,6 UPF/ml cellulasaktivítet, 1,2 U/ml B-glukosidasaktivitet.

Man har erhållit 40 enheter cellulaser per gram använt kolsubstrat.

EXEMPEL 11 En odling av stammen Trichoderma reesei MCG 77 genomföres under betingelser som är identiska med dem som angivits i exem- pel 5. Den,kontinuerliga insprutningen av lösningen CZ sker till den 148:nde timmen; koncentrationerna av laktos överskrider aldrig 2 g/1. De uppnådda resultaten är följande: 22,6 g/1 pro- teíner, 14 UPP/ml cellulasaktivítet, 5 U/ml glukosidasaktivitet.

Man har erhållit 131 enheun cellulaser per gram använt kol- substrat.

Claims (8)

/ø 462 394 PATENTKRAV

1. Förfarande för aerob framställning av cellulas genom odling av en stam av Trichoderma reesei i en fermenteringszon, som innerhaller ett näringsmedium, varvid förfarandet innebär matning av laktos till denna fermenteringszon och k ä n n e- t e c k n a s därav: a) att man underkastar ett odlingsmedium aeroba fermente- ringsbetingelser under loppet av ett första steg, varvid odlingsmediet innehåller en stam av Trichoderma reesei, mineralsalter och såsom begynnelsekolsubstrat åtminstone ett material, som innehåller cellulosa och laktos, och varvid viktmängderna av cellulosan och laktosen i för- hållande till odlingsmediet var och en innefattar mellan 0,01 och 2 I och varvid det första steget fullföljes utan ny tillsats av laktos under tillräcklig tid för förbrukning av åtminstone 10 Z av laktosen och för er- hållande av en laktoskoncentration i mediet av mindre än 0,3 viktprocent, och b) att man under loppet av ett andra steg fullföljer den aeroba fermenteringen genom tillsats av laktos pá pro- gressivt sätt, så att en mängd laktos utgörande totalt minst 3 viktprocent av odlingsmediet införas allt under det att laktoskoncentrationen i odlingsmediet hàlles vid ett lägre värde än 0,3 viktprocent.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att matningen av laktos till fermenteringszonen under loppet av det andra steget genomföras kontinuerligt.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k- n a t därav, att det cellulosainnehállande materialet är en pappersmassa.

4. Förfarande enligt nagot av krav 1-3, k ä n n e- t e c k n a t därav, att viktmängderna cellulosa och laktos under steget a) är mellan 0,2 och 2 X resp mellan 0,02 och 1 1 och att kontakt upprätthálles tills laktoskoncentrationen är lägre än 0,2 viktprocent och att minst 20 X av laktosen har förbrukats. 462 394

5. Förfarande enligt nàgot av krav 1-4, k ä n n e- t e c k n a t därav, att mängden laktos i steg a) är mellan 10 och 50 viktprocent, räknat pá mängden cellulosa, och att koncentrationen av laktos under steget b) är mellan 0,1 och 0,25 viktprocent.

6. Förfarande enligt något av krav 1-5, k ä n n e- t e c k n a t därav, att man icke utför tilleatsen av det cellulosainnehàllande materialet under loppet av det andra steget.

7. Förfarande enligt nagot av krav 1-6, k ä n n e- t e c k n a t därav, att man använder hyperproducerande stammar av Trichoderma reesei.

8. Användning av cellulosa, som erhållits enligt något av krav 1-7 vid hydrolysreaktionen av cellulosa eller en hemicellulosa.