FR3019558A1 - Preparation multi-enzymatique contenant le secretome d'une souche de laetisaria arvalis - Google Patents

Abstract

L'invention est relative à une préparation multi-enzymatique contenant le sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844. Ce sécrétome qui contient notamment des cellulases, cellobiose déshydrogénases et xylanases, est utilisable pour la saccharification de substrats lignocellulosiques, en particulier en association avec le sécrétome de Trichoderma reesei.

Description

PRÉPARATION MULTI-ENZYMATIQUE CONTENANT LE SÉCRÉTOME D'UNE SOUCHE DE LAETISARIA ARVALIS La présente invention est relative à l'amélioration de la saccharification de la biomasse lignocellulosique. La lignocellulose contenue dans la paroi secondaire des cellules végétales constitue l'un des principaux puits de carbone fixé lors de la photosynthèse. Elle présente un intérêt croissant en tant que matière première pour la production de divers produits chimiques, notamment des sucres simples fermentescibles résultant de l'hydrolyse (généralement dénommée saccharification) de ses constituants polysaccharidiques. Le principal produit de saccharification de la biomasse lignocellulosique est actuellement le glucose, qui peut être converti par fermentation éthanolique en éthanol utilisable comme biocarburant. La lignocellulose est constituée principalement de trois types de polymères, en proportions variables selon les espèces de plantes : la cellulose, l'hémicellulose et la lignine.

Ces constituants sont reliés entre eux par différents types de liaisons, covalentes et non- covalentes. La cellulose représente jusqu'à 45% du poids sec de la lignocellulose. Elle est composée de chaines linéaires d'unités D-glucose reliées par des liaisons f3-1,4-glucosidiques, ces chaines étant liées entre elles par des liaisons hydrogène ou des forces de van der Waals. Les hémicelluloses sont des hétéropolymères représentant 15 à 35% de la biomasse végétale, et contenant des pentoses (J3-D-xylose, a-L-arabinose), des hexoses (f3-D-mannose, f3-D-glucose, a-D-galactose) et des acides uroniques. La lignine est un hétéropolymère complexe, constituée d'unités phénylpropane reliées entre elles par différents types de liaisons. La lignine est liée à la fois à l'hémicellulose et à la cellulose, les enrobant dans une structure tri-dimensionnelle complexe qui les rend peu accessibles à l'hydrolyse. L'essentiel de l'énergie de la lignocellulose est stockée dans la cellulose, qui est difficile à hydrolyser en raison de sa structure hautement cristalline, ainsi que dans l'hémicellulose, qui présente des difficultés pour la récupération de l'énergie, en raison de sa complexité et de la diversité structurelle (Foust, 2008). Le caractère réfractaire de la lignocellulose à l'hydrolyse enzymatique est également augmenté par la fraction de lignine, qui agit comme une barrière physique (Jouanin et Lapierre, 2012). A l'heure actuelle, la voie considérée comme la plus prometteuse pour la saccharification de la lignocellulose est l'hydrolyse enzymatique, à l'aide d'enzymes produites par des micro-organismes cellulolytiques, notamment des champignons saprotrophes. Cette hydrolyse est précédée d'un prétraitement de la biomasse, ayant pour but de diminuer la complexité du réseau lignocellulosique, notamment en solubilisant la lignine et/ou l'hémicellulose, en diminuant la cristallinité de la cellulose ou en augmentant sa surface accessible à l'hydrolyse. Ce prétraitement peut être effectué par différentes techniques, telles que le broyage mécanique, la thermolyse, le traitement par un acide dilué, par une base, par un peroxyde ou l'explosion à la vapeur (voir pour revue Hendriks et Zeeman, 2009). Les champignons filamenteux sont parmi les agents de dégradation de la biomasse lignocellulosique les plus efficaces en raison de leur capacité à se développer dans des environnements riches en lignocellulose. Ils sont connus pour sécréter un large éventail d'enzymes actives sur les polysaccharides (Carbohydrate-Active Enzymes; CAZymes ; www.cazy.org) possédant des activités complémentaires incluant les glycoside hydrolases (GHs), les carbohydrate esterases (CEs) et les polysaccharide lyases (PLs) (Cantarel et al., 2009) et des enzymes ayant des activités auxiliaires (AAs) (Levasseur et al., 2013).

Le champignon filamenteux actuellement le plus utilisé dans l'industrie pour la bioconversion de la lignocellulose en sucres simples est l'ascomycète Trichoderma reesei. Son sécrétome (c'est-à-dire l'ensemble des enzymes excrétées par le champignon dans le milieu de culture) contient principalement trois types d'enzymes, dont l'activité complémentaire permet l'hydrolyse de la cellulose en glucose : des endoglucanases (EG ; EC 3.2.1.4); des exoglucanases, comprenant notamment des cellobiohydrolases I et II (CBH ; EC 3.2.1.91) et des f3-glucosidases (BGL ; EC 3.2.1.21) (Herpoêl-Gimbert et al., 2008; Peterson et Nevalainen, 2011 ; Couturier et al., 2012). Pour la saccharification de la lignocellulose, on utilise généralement la totalité du sécrétome, sous forme de cocktail enzymatique. La saccharification s'effectue par simple mise en contact du matériau lignocellulosique prétraité avec ce cocktail enzymatique, et incubation, dans les conditions de température et de pH optimales pour les enzymes concernées pendant une durée variable selon la nature du matériau lignocellulosique concerné et la quantité d'enzymes utilisée. Le principal intérêt de T reesei réside dans sa capacité à sécréter des quantités très 30 importantes d'enzymes. Des souches de T reesei hypersécrétrices d'enzymes lignocellulolytiques ont été produites par mutagénèse et leur sécrétome est actuellement utilisé pour la saccharification de la lignocellulose. Parmi ces souches, on citera notamment les souches MCG77 (Brevet US 4 275 167), MCG 80 (Allen et Andreotti, 1982), RUT C30 (Montenecourt et Eveleigh, 1977) et CL847 (Warzywoda et al., 1983). L'analyse génomique de T reesei a révélé que son activité d'hydrolyse repose sur un ensemble réduit d'activités enzymatiques (Martinez et al., 2008) qui dépend principalement de cellulases produites à des concentrations élevées (Peterson et Nevalainen, 2011) mais qui est particulièrement pauvre en enzymes auxiliaires, i.e., hémicellulases, pectinases, carbohydrate oxydases et lignine oxydases classées dans les familles AA (Levasseur et al., 2013). Il apparait donc nécessaire d'améliorer le cocktail enzymatique issu de T reesei en le complétant avec des activités enzymatiques complémentaires. Une des approches proposées pour améliorer ce cocktail consiste à rechercher d'autres champignons cellulolytiques, dont le sécrétome contiendrait des activités enzymatiques capables de complémenter celles qui apparaissent insuffisantes chez T reesei, et de permettre d'obtenir une saccharification plus efficace. Par exemple, certains des Inventeurs ont identifié une souche d'Aspergillus japonicus répondant à ces critères, et permettant notamment, lorsque son sécrétome est utilisé en combinaison avec celui de T reesei, d'augmenter significativement la production de glucose (Demande Internationale WO 2014/037925). Il existe cependant un besoin d'identifier d'autres champignons capables d'apporter une amélioration au cocktail enzymatique de T reesei pour l'hydrolyse de la biomasse lignocellulosique. Dans ce contexte, les Inventeurs ont identifié une souche de Laetisaria arvalis (Aphyllophorales, Corticiaceae) qui a été sélectionnée pour ses capacités de croissance remarquables sur de la biomasse lignocellulosique récalcitrante à la dégradation enzymatique. L. arvalis est un champignon basidiomycète tellurique qui a été très peu étudié à l'exception de quelques études qui le décrivent comme un possible agent de lutte biologique contre les espèces Rhizoctonia solani et Pythium (Burdsall et al., 1980 ; Odvody et al., 1980). Cette souche de L. arvalis, dénommée CIRM-BRFM 514, a été déposée selon le traité de Budapest le 21 mars 2014 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 25 rue du Docteur Roux, Paris, sous le numéro CNCM I-4844. De manière surprenante, cette souche présente une activité cellulasique sept fois supérieure à celle du cocktail industriel de T reesei. En outre, des essais d'hydrolyse de biomasse lignocellulosique (paille de blé prétraitée) utilisant un cocktail enzymatique produit par la souche industrielle T reesei CL847 complémenté par les protéines de cette souche CNCM I-4844 ont montré une augmentation de 20% de la production de glucose.

De plus, les inventeurs ont identifié 13 enzymes présentes dans des sécrétomes de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 qui sont particulièrement intéressantes pour l'hydrolyse de la biomasse lignocellulosique. Ces 13 enzymes sont les cellobiohydrolases (GH7 CBH) de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 4 et 5, la cellobiose déshydrogénase (CDH) de séquence SEQ ID NO : 6 et les polysaccharide monooxygénases (PMO) de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 11. La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844 pour l'obtention d'une préparation multi-enzymatique contenant des cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1.99.18) et xylanases (EC 3.2.1.8), et éventuellement contenant en outre des hémicellulases, carbohydrate oxydases, ligninases (toutes trois appartenant aux familles AA), endoglucanases (EC 3.2.1.4), cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91 et EC 3.2.1.176), 3-glucosidases (EC 3.2.1.21), endo-P-1,4-mannanases (EC 3.2.1.78), a-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55), laccases (EC 1.10.3.2), glucose oxydases (EC 1.1.3.4), aryl alcool oxydases (EC 1.1.3.7) et/ou pectinases, de préférence contenant des cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1.99.18), xylanases (EC 3.2.1.8), cellobiohydrolases (en particulier les GH7 CBH de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 4 et 5) et une cellobiose déshydrogénase (en particulier la CDH de séquence SEQ ID NO : 6), de préférence encore contenant des cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1.99.18), xylanases (EC 3.2.1.8), cellobiohydrolases (en particulier les GH7 CBH de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 4 et 5), une cellobiose déshydrogénase (en particulier la CDH de séquence SEQ ID NO : 6) et des polysaccharide monooxygénases (en particulier les PMO de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 11). Plus spécifiquement la présente invention a pour objet une préparation multi- enzymatique isolée contenant des cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1.99.18) et xylanases (EC 3.2.1.8), et éventuellement contenant en outre des hémicellulases, carbohydrate oxydases, ligninases (toutes trois appartenant aux familles AA), endoglucanases (EC 3.2.1.4), cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91 et EC 3.2.1.176), p-glucosidases (EC 3.2.1.21), endo-p-1,4-mannanases (EC 3.2.1.78), a-L-arabinofurano- sidases (EC 3.2.1.55), laccases (EC 1.10.3.2), glucose oxydases (EC 1.1.3.4), aryl alcool oxydases (EC 1.1.3.7) et/ou pectinases, contenant le sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844. Selon un mode de réalisation préféré de cette préparation multi-enzymatique, elle comprend outre des cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1.99.18) et xylanases (EC 3.2.1.8), au moins une cellobiohydrolase (GH7 CBH) choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 4 et 5, la cellobiose déshydrogénase (CDH) de séquence SEQ ID NO : 6 et éventuellement au moins une polysaccharide monooxygénase (PMO) choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 11. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit sécrétome est susceptible d'être obtenu à partir d'une culture de la souche CNCM I-4844 effectuée en présence d'une source de carbone (e.g., un polysaccharide) inductrice de la production d'enzymes lignocellulolytiques, contenant avantageusement de la cellulose, telle que de la cellulose cristalline (e.g., cellulose cristalline avicel). Des sources de carbone inductrices préférées sont choisies patini les pailles ou les sons de céréales, et/ou leurs fractions autoclavé(e)s ou non. Lesdites fractions comprennent les résidus de paille explosée à la vapeur ou non, la lignocellulose ou un polysaccharide tel que la cellulose, le xylane, le mannane, le maltose et la pectine. Avantageusement, on peut utiliser de la paille ou du son de maïs, de blé ou d'orge (qui peut être autoclavé ou non), du bois etc., ou un mélange de paille ou de son de différentes céréales et ou de leurs fractions ou résidus. Une source de carbone inductrice particulièrement préférée est le papier filtre de cellulose. Lorsque la culture de la souche CNCM I-4844 est effectuée en présence de maltose, le sécrétome de ladite souche contient des cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1.99.18) et xylanases (EC 3.2.1.8). Lorsque la culture de la souche CNCM I-4844 est effectuée en présence de paille de blé (WS), de résidu d'hydrolyse de paille de blé (WS-R) ou d'un autoclavat de son de maïs (MB), le sécrétome de ladite souche contient outre lesdites cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1.99.18) et xylanases (EC 3.2.1.8), des cellobiohydro- lases (en particulier les GH7 CBH de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5) et une cellobiose déshydrogénase (en particulier la CDH de séquence SEQ ID NO : 6). Lorsque la culture de la souche CNCM I-4844 est effectuée en présence de cellulose cristalline (avicel, AVI), le sécrétome de ladite souche contient outre lesdites cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1.99.18), xylanases (EC 3.2.1.8), des cellobiohydrolases (en particulier les GH7 CBH de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5), une cellobiose déshydrogénase (en particulier la CDH de séquence SEQ ID NO : 6) et des polysaccharide monooxygénases (en particulier les PMO de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 11).

Les autres constituants du milieu de culture sont les constituants usuels des milieux pour la culture des basidiomycètes qui sont connus en eux-mêmes de l'homme du métier. Classiquement, ces constituants peuvent comprendre outre la source de carbone, des minéraux, des oligo-éléments et des vitamines.

A titre d'exemple, un milieu de culture pour la souche CNCM I-4844 comprend ou est constitué d'une source de carbone inductrice de la production d'enzymes lignocellulolytiques (e.g., maltose, autoclavat de son de maïs, paille de blé, résidu d'hydrolyse de paille de blé ou cellulose cristalline), d'agar-agar et de sels minéraux. Avantageusement, la culture de la souche CNCM I-4844 est effectuée en milieu 10 liquide et comprend, outre la souche CNCM I-4844, du maltose (par exemple à raison de 2,5 g.14 de maltose) et une source de carbone inductrice de la production d'enzymes lignocellulolytiques telle que du papier filtre de cellulose (contenant de la cellulose cristalline), un autoclavat de son de maïs, de la paille de blé ou des résidus d'hydrolyse de paille de blé (par exemple à raison 15 g.14 basé sur la matière sèche). 15 Le sécrétome de la souche CNCM I-4844 peut être obtenu à partir d'une culture de cette souche par simple séparation des cellules et du surnageant de culture, qui contient les protéines sécrétées. Ce surnageant peut être utilisé tel quel, ou après simple filtration pour le débarrasser des débris cellulaires. Toutefois, il est généralement préférable de le concentrer par exemple par diafiltration. Les protéines constituant le sécrétome peuvent également être 20 récupérées par précipitation au sulfate d'ammonium. La présente invention a également pour objet une préparation mufti-enzymatique isolée contenant une fraction du sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844 tel que défini ci-dessus, comprenant une cellobiohydrolase (CBH ; EC 3.2.1.176), une cellobiose déshydrogénase (CDH ; EC 1.1.99.18) et éventuellement une polysaccharide 25 monooxygénase (PMO ; appartenant à la famille AA9). Avantageusement, ledit sécrétome à partir duquel ladite fraction est obtenue est susceptible d'être obtenu à partir d'une culture de la souche CNCM I-4844 effectuée en présence de cellulose cristalline. Selon un mode de réalisation préféré de cette préparation multi-enzymatique 30 contenant une fraction du sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844, elle comprend au moins une cellobiohydrolase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO: 1, 2, 3 4 et 5, la cellobiose déshydrogénase de séquence SEQ ID NO: 6 et éventuellement au moins une polysaccharide monooxygénase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 11.

Avantageusement, cette préparation multi-enzymatique contenant une fraction du sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844 comprend les 12 enzymes de séquences SEQ ID NO : 1 à 10, 12, 13 et l'enzyme comprenant la séquence SEQ ID NO : 11.

Ladite fraction du sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844 peut être obtenue en mettant en oeuvre des méthodes connues en elles-mêmes de l'homme du métier. On peut citer par exemple la purification par chromatographie d'exclusion, échange d'ions, précipitation au sulfate d'ammonium. La présente invention a également pour objet une préparation multi-enzymatique isolée comprenant au moins une cellobiohydrolase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 4, 5 et les enzymes présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 4 ou 5, une cellobiose déshydrogénase présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6, et éventuellement au moins une polysaccharide monooxygénase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 12, 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 11 et les enzymes présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13. Avantageusement, cette préparation multi-enzymatique comprend les 12 enzymes 20 de séquences SEQ ID NO : 1 à 10, 12, 13 et l'enzyme comprenant la séquence SEQ ID NO : 11. Sauf précision contraire, l'alignement entre deux séquences peptidiques et le calcul des pourcentages d'identité sont effectués sur toute la longueur des séquences peptidiques à l'aide du programme d'ordinateur « needle » (NEEDLEMAN et WUNSCH, J. Mol. Biol., 25 48, 443-453, 1970) en utilisant les paramètres par défaut : « Matrix » : EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » : 0,5. Avantageusement les cellobiohydrolases présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 ou 5 comprennent la séquence SEQ ID NO : 14 et sont de préférence des cellobiohydrolases 30 de Laetisaria arvalis. La séquence SEQ ID NO : 14 contient les acides aminés conservés des cellobiohydrolases de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844. Avantageusement, la cellobiose déshydrogénase présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 comprend la séquence SEQ ID NO : 15 et est de préférence une cellobiose déshydrogénase de Laetisaria arvalis. La séquence SEQ ID NO : 15 contient les acides aminés conservés des cellobiose déshydrogénases. Avantageusement les polysaccharide monooxygénases présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 comprennent la séquence SEQ ID NO : 16 et sont de préférence des polysaccharide monooxygénases de Laetisaria arvalis. La séquence SEQ ID NO : 16 contient les acides aminés conservés des polysaccharide monooxygénases de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844. Les préparations multi-enzymatiques selon la présente invention telles que définies ci-dessus peuvent être utilisées pour la saccharification de la biomasse lignocellulosique, et notamment simultanément ou séquentiellement avec le sécrétome d'une souche de T reesei. En conséquence selon un mode de réalisation particulièrement préféré d'une préparation multienzymatique conforme à l'invention, elle contient une préparation multienzymatique telle que définie ci-dessus en mélange avec le sécrétome d'une souche de T reesei, et éventuellement une beta-glucosidase. Ladite souche de T reesei peut être par exemple une souche hypersécrétrice d'enzymes lignocellulolytiques telle que l'une des souches MCG77, MCG 80, RUT C30, et CL847 mentionnée ci-dessus. Il peut s'agir également d'une souche recombinante telle que celles décrites dans les Demandes Internationales WO 92/010581, WO 99/46362 ou WO 2010/029259. Des méthodes de production du sécrétome de T reesei sont bien connues en elles- mêmes de l'homme du métier. A titre d'exemple, on citera le procédé décrit dans la Demande FR 2 555 603. Le sécrétome de la souche CNCM I-4844 ou ses fractions peut être mélangé avec celui d'une souche de T reesei dans des proportions (en poids) : protéines du sécrétome de CNCM I-4844/protéines du sécrétome de T reesei allant de 1/2 jusqu'à 5/3. Avantageusement ces proportions vont de 1/2 à 1/1. La présente invention a également pour objet un procédé de production de sucres fermentescibles, et notamment de glucose, à partir d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse dudit substrat à l'aide d'une préparation multienzymatique conforme à l'invention, avantageusement à l'aide d'une préparation contenant le sécrétome de la souche CNCM I-4844 ou ses fraction en mélange avec le sécrétome d'une souche de T reesei telle que définie ci-dessus.

Le substrat lignocellulosique peut être issu de n'importe quel matériau riche en lignocellulose, par exemple des résidus d'exploitation agricoles tels que les pailles de céréales, des résidus d'exploitation du bois, des matériaux issus de cultures dédiées telles que le miscanthus et le peuplier, des résidus de l'industrie papetière ou de toute autre industrie de transformation des matériaux cellulosiques et lignocellulosiques. Préalablement à l'hydrolyse, ce matériau est prétraité, comme décrit ci-dessus, pour obtenir le substrat lignocellulosique sur lequel sera effectuée l'hydrolyse. Le prétraitement est effectué de manière connue en elle-même de l'homme du métier, par exemple selon une des méthodes indiquées plus haut. Une méthode de prétraitement particulièrement préférées est l'explosion à la vapeur en conditions acides. Les conditions de ce prétraitement (quantité d'acide, pression, et durée) sont des conditions classiques, connues en elles-mêmes de l'homme du métier. L'hydrolyse enzymatique sera généralement effectuée à une température de 30°C à 50°C, de préférence entre 37 et 45°C, et à un pH généralement compris entre 4,5 et 5,5.

Généralement le mélange réactionnel contient de 1 à 20% en poids de matière sèche de substrat lignocellulosique, et la préparation enzymatique conforme à l'invention est utilisée à raison de 5 à 30 mg par gramme de substrat (en poids de matière sèche). La durée de l'hydrolyse enzymatique peut varier notamment selon la nature du substrat et la quantité de préparation enzymatique utilisée, et la température à laquelle est effectuée la réaction. Elle est généralement de 24 à 120h, de préférence 72h à 96h. Le suivi de l'hydrolyse peut être effectué par dosage des sucres réducteurs libérés et des sucres simples glucose et xylose. Les sucres simples obtenus par le procédé conforme à l'invention peuvent être récupérés à partir de l'hydrolysat, en vue d'une utilisation ultérieure.

Alternativement, l'hydrolysat peut être utilisé directement pour la production d'alcool, notamment d'éthanol, par fermentation en présence d'un micro-organisme alcooligène. La présente invention a donc également pour objet un procédé de production d'alcool, notamment d'éthanol, caractérisé en ce qu'il comprend la production, conformément à l'invention, d'un hydrolysat contenant des sucres fermentescibles à partir d'un substrat lignocellulosique, et la fermentation alcoolique de cet hydrolysat par un microorganisme alcooligène. La fermentation alcoolique peut être effectuée, à la suite de l'hydrolyse enzymatique, dans des conditions classiques bien connues de l'homme du métier.

Généralement on utilise un microorganisme alcooligène tel que la levure Saccharomyces cerevisiae ou la bactérie Zymomonas mobilis, et la fermentation est effectuée à une température comprise de préférence entre 30 et 35°C. Alternativement, la fermentation alcoolique peut être effectuée simultanément à l'hydrolyse enzymatique, selon un procédé de saccharification et fermentation simultanées dit procédé SSF. Les conditions opératoires mises en oeuvre dans ce cas pour l'hydrolyse enzymatique et la fermentation alcoolique diffèrent principalement de celles indiquées ci-dessus par la température et la durée de la réaction. La température est généralement de 28 à 40°C, et la durée de la réaction est généralement de 50 h à 300 h.

La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non limitatifs illustrant les propriétés et la composition de sécrétomes de la souche CNCM I-4844, ainsi que des figures annexées : Figure 1 : Profils électrophorétiques des sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844. SDS-PAGE (A) et CMC-zymogramme (B). 20 gg de chaque sécrétome ont été chargés sur gel. 1-2, maltose; 3-4, MB; 5-6, AVI; 7-8, WS; 9-10, WS-R ; M, marqueur de taille. Figure 2 : Caractérisation de l'activité enzymatique de CAZymes présentes dans des sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844 et de leur potentiel à améliorer la conversion de la paille de blé prétraitée. (A) Représentation du groupement des activités liées à la dégradation de la lignocellulose dans les sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844. Le degré d'activité sur différents substrats des sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844 obtenues en conditions de culture sur AVI, WS, WS-R et MB, et du sécrétome de T. reesei CL847 est représenté par une échelle de couleurs avec différentes nuances de gris. Cette Figure a été obtenue à l'aide du logiciel Multiexperiment Viewer (Saeed et al., 2006). (B) Contribution des sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844 à la saccharification de la paille de blé explosée à la vapeur. L'hydrolyse de la biomasse a été réalisée avec les sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844 obtenues en conditions de culture sur AVI, WS, WS-R ou MB respectivement en association avec le cocktail enzymatique de T reesei CL847. Le glucose libéré a été quantifié au plateau de saccharification correspondant à 30 gg de CL847 ce qui représente l'activité de libération de sucre à 100% (Navarro et al., 2010). Les valeurs sont 30 les moyennes de six mesures indépendantes. Figure 3: Distribution des protéines identifiées par LC-MS/MS (annotation CAZy) dans les sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844 à partir de différentes conditions de culture (sur maltose, MB, AVI, WS ou WS-R). (A) Diagramme de Venn montrant la distribution des protéines sécrétées parmi les sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844. (B) profil de distribution d'enzymes dans les sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844. La taille de la barre indique le nombre de protéines sécrétées identifiées selon la classe d'enzyme (GH, AA, PL, CE et protéines non CAZy). EXEMPLE : PROPRIÉTÉS ET COMPOSITION DES SÉCRÉTOMES DE LA 5 SOUCHE CNCM I-4844 Matériel et méthodes Souches fongiques et cocktails enzymatiques commerciaux Les souches fongiques utilisées dans cette étude sont conservées sur pente gélosée MA2 (Extrait de malt 2% w/v) pour la souche de L. arvalis CNCM 1-4844, et sur pente 10 gélosée MYA2 (Extrait de malt 2% et extrait de levure 0,1% w/v) pour la souche de T. reesei QM6a. Le cocktail cellulolytique E508 XL-Pure, produit à partir de la souche industrielle de T. reesei CL847, a été obtenu auprès de l'Institut Français du Pétrole - Energies Nouvelles (IFPEN, France). Le cocktail SP188 (Novozymes, Bagsvaerd, Danemark) riche en activité [3-glucosidase, est produit par une souche industrielle 15 d'Aspergillus piger. Croissance sur la biomasse et la cellulose Tests de croissance sur différentes biomasses : Pour tester la capacité de la souche L. arvalis CNCM I-4844 à croitre en milieu solide sur paille de blé (WS) ou sur résidu de saccharification de paille de blé (WS-R), 5 g de biomasse sont stérilisés par autoclavage 20 (30 min à 110°C) avant ajout de 15mL de milieu minimum (12 g/L NaNO3, 2 g/L KH2PO4;1 g/L KCL, 1 g/L MgSO4) et 200 µL de solution de Vischniac (Vishniac and Santer, 1957). Les deux biomasses sont ensemencées avec des fragments mycéliens (5 rondelles de boite de Petri broyées dans 1 mL de milieu minimum). Les cultures sont incubées 8 jours à 30°C en condition statique. 25 Tests de croissance et de dégradation de la cellulose : Les tests de dégradation de la cellulose par T reesei QM6a et L. arvalis CNCM I-4844 ont été réalisées dans du milieu minimum contenant pour 1L : 10,72 g de K2HPO4, 5,24 g de KH2PO4, 2g de (NH4)2SO4, 0,5 mL d'une solution de Fer (1 mg FeSO4 dans lml HCl 0,01M), lmL d'une solution de MgSO4 (1M), 1 mL d'une solution de thiamine (lmg/mL), 5 mL d'une solution d'oligo- 30 éléments (Takasuka et al., 2013). Une bandelette (10 cm x 1 cm) de papier filtre (cellulose, Whatman 3M) est ajoutée comme seule source de carbone dans 7 mL de milieu minimum, inoculés avec les broyats mycéliens (5 rondelles de boite de Petri broyées dans 1 mL de milieu minimum) de chaque champignon. Les cultures sont incubées durant 15 jours à 30°C sous agitation à 160 rpm.

Conditions de cultures, et production des sécrétomes concentrés Les cultures de champignons et la préparation des sécrétomes ont été effectuées comme décrit par Couturier et al. (2012) en utilisant 15 gr de différents substrats carbonés inducteurs : cellulose cristalline avicel (AVI), paille de blé (WS), résidu d'hydrolyse de paille de blé (WS-R), autoclavat de son de maïs (MB), ou 20 gr de maltose (Maltose) pour la condition standard. Les cultures, réalisées en duplicats, sont arrêtées à 10 jours après l'inoculation. Les surnageants sont filtrés au travers d'une membrane en fibre de verre GF/F de 0.7 .t,M (Whatman). Les filtrats obtenus sont concentrés sur membrane (polyethersulfone) d'ultrafiltration de 10 kDa (Sartorius Stedim, Aubagne, France) puis dialysés dans un tampon Acétate de sodium 50 mM pH4,8 (Sigma- Aldrich). Les protéines totales sont dosées dans chaque sécrétome par le réactif de Bradford (Biorad, France). Les sécrétomes concentrés sont aliquotés et conservés à -20°C. SDS-PAGE et zymogramme Les gels d'électrophorèse SDS-PAGE sont préparés à 12% de polyacrylamide, et 10 ptg de protéines totales sont utilisées. Les bandes protéiques sont colorées au bleu de Coomassie G250. En conditions dénaturantes, les masses moléculaires sont déterminées par comparaison aux étalons de masse moléculaire fournis par Amersham Pharmacia Biotech (Orsay, France). Pour visualiser les bandes protéiques possédant des activités cellulases, 0.2% de CMC (CarboxyMethylCellulose) sont incorporés aux gels avant polymérisation (Bey et al., 2011). Dans ce cas, les sécrétomes, contenant les protéines, sont mélangés au tampon de charge (3% SDS w/v, 10% glycérol w/v et 30 mM de tampon Tris-HC1 pH 6,8) en l'absence d'agent réducteur, puis chauffés à 100°C pendant 1 minute. Après électrophorèse, les gels sont lavés à l'eau désionisée, puis saturés dans une solution de Triton X-100 (2,5% v/v) pendant 1 heure à 4°C. Pour la détection d'activité cellulase, les gels sont ensuite saturés dans un tampon sodium phosphate (100mM) pH 5 à 45°C pendant 2 heures. Après incubation, les gels sont colorés au rouge Congo (0,1%) pendant 1 heure, puis décolorés avec une solution de NaC1 (1M) pendant 1 heure. Les bandes protéiques possédant des activités cellulase sont révélées par l'absence de coloration. Dosage des activités enzymatiques Hydrolyse de substrats complexes : Pour chaque substrat utilisé, une suspension (ou solution) à 1% (w/v) dans un tampon acétate de sodium (50mM) p114,8 est préparée, puis distribuée en microplaque 96 puits (100µL/puits). Une gamme étalon de glucose (de 0 à 20mM) est additionnée dans la première colonne de la microplaque. Les plaques préparées sont congelées ainsi à -20°C jusqu'à leur utilisation. Les activités d'hydrolyse enzymatique sont réalisées avec un robot de criblage haut-débit (Freedom Evo TECAN, France) comme décrit par Navarro et al. (2010), utilisant 20 µl de chaque sécrétome, à différentes concentrations, pendant 1h à 37°C sous agitation (1000 rpm). Les sucres réducteurs totaux, libérés par l'hydrolyse enzymatique, sont quantifiées par la méthode à l'acide di-nitro salicylique (DNS). Une unité d'enzyme est définie comme 1 innole d'équivalent glucose libéré par mg de protéine et par minute. Hydrolyse de substrats chromogéniques : Pour tous les substrats utilisés, les solutions sont préparées à 1 mM dans un tampon acétate (50mM) pH4,8 et distribuées en microplaque 96 puits (100g/puits). Une gamme étalon de p-nitrophénol (de 0 à 0,2 mM) est additionnée dans la première colonne de la microplaque. Les plaques préparées sont ainsi congelées à -20°C jusqu'à leur utilisation. Les activités d'hydrolyse enzymatique sont réalisées avec 20 pl de chaque sécrétome, à différentes concentrations, pendant 30 minutes à 37°C sous agitation à 1000 rpm. Les réactions enzymatiques sont stoppées par l'ajout de 130 1.11_, de tampon carbonate 1M pH 11,5. Les quantités de p-nitrophénol libéré sont dosées au spectrophotomètre à 410 nm. Une unité d'enzyme est définie comme 1 gniole de p-nitrophénol libéré par mg de protéine et par minute. Sur le même principe, le substrat pCe13 (Megazyme, Wicklow, Irlande) est utilisé selon les recommandations du fabricant. Activité laccase et CDH : L'activité laccase est déterminée selon la méthode décrite par Temp et Eggert (1999). La vitesse d'oxydation d'une solution de 5001.1M d'ABTS (Sigma-Aldrich) est suivie à 420nm dans du tampon sodium tartrate (50mM) pH4, à 30°C et pendant 30 secondes. L'activité CDH est déterminée en suivant la réduction de 0,2 mM 2,6-dichlorophénol indophénol (DCPIP, Sigma-Aldrich) dans du tampon acétate (50mM) pH 5, en présence de cellobiose (10mM) comme substrat. La réduction du DCPIP est suivie par spectrophotométrie à 520 nm pendant 1 minute (Bey et al., 2011).

Hydrolyse enzymatique de la paille de blé : La capacité des sécrétomes à hydrolyser la paille de blé a été testée sur de la paille prétraitée en condition industrielle (explosion à la vapeur à pH neutre), fournie par l'IFPEN. Elle est constituée de 52% de cellulose, de 7% d'hémicellulose et de 35% de lignine. Les microplaques 96 puits ont été préparées préalablement comme décrit dans Navarro et al. (2010). Les solutions enzymatiques à tester 30 ont été déposées sur la plaque préparée, en complémentation du cocktail enzymatique E508 de T. reesei (30 µg/mg), lui-même supplémenté en f3-glucosidase (SP188, 60 mU/mg). Les sécrétomes sont testés à leur quantité maximale, soit 15 Ill de chaque sécrétome. L'hydrolyse a été effectuée à 37°C sous agitation durant 24h. Après incubation, les échantillons ont été filtrés et les sucres réducteurs ont été quantifiés avec la méthode DNS.

Les teneurs en glucose et xylose libéré sont dosées par chromatographie à échange d'ions (HPAEC-PAD, Dionex) sur une colonne CarboPac PA-1 (Dionex) selon la méthode décrite dans Couturier et al. (2011). Analyse protéomique semi-quantitative des sécrétomes concentrés : 20 1.tg de protéines des sécrétomes sont insérés dans un mini-gel d'électrophorèse SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris, Invitrogen, France). Après une courte migration (lcm), les protéines sont colorées au bleu de Coomassie (Bio-rad, Marnes-la-Coquette, France) puis récupérées en découpant 1 à 2 bandes de 2mm de largeur. Après une digestion trypsique standard, les extraits peptidiques obtenus sont séparés par CLHP sur colonne C18, puis chaque peptide est analysé par spectrométrie de masse (Q-exactive, Thermo Scientific). Les peptides sont ionisés et détectés complets ou après fragmentation. L'identification des protéines est réalisée par comparaison des peptides identifiés (en spectrométrie de masse) aux peptides théoriques obtenus après trypsinolyse in silico des données transcriptomiques, réalisée par le programme X!Tandem Cyclone (http://www.thegpm.org). Seules les protéines avec au moins 2 peptides uniques identifiés sont validées. Résultats Croissance sur la biomasse et la cellulose La souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844 a été identifiée après sélection de souches de champignon pour leur capacité à dégrader efficacement la biomasse lignocellulosique. La souche CNCM I-4844 a également été sélectionnée pour sa capacité à croître rapidement non seulement sur la paille de blé (WS) mais aussi sur un résidu d'hydrolyse de paille de blé (WS-R) résultant d'une explosion à la vapeur dans des conditions acides ainsi que pour sa capacité de saccharification en association avec un cocktail d'enzymes de la souche Trichoderma reesei CL847 (Berrin et al., 2012). Le mycélium de L. arvalis CNCM I-4844 colonise entièrement la paille de blé ou le résidu de paille de blé après seulement 4 jours d'incubation lorsque la souche CNCM I-4844 est cultivée sur boite de pétri directement sur la biomasse solide comme seule source de carbone. L. arvalis CNCM I-4844 est aussi capable de croître et de dégrader complètement la cellulose à partir d'un milieu minimal contenant des bandes de papier filtre en tant que seule source de carbone. Par comparaison, dans ces mêmes conditions, la souche de Trichoderma reesei QM6a est capable de croître sur des bandes de papier filtre mais aucune dégradation n'est visualisée après 10 jours d'incubation.

Caractérisation de l'activité enzymatique du sécrétome de L. arvalis CNCM I-4844 La composition du système de dégradation de la lignocellulose de la souche CNCM I-4844 induit par différentes sources de carbone (son de maïs [MB], cellulose cristalline avicel [AVI], paille de blé [WS] et résidus d'hydrolyse de paille de blé [WS-R]) a 5 été évaluée par SDS-PAGE, analyse de zymogramme ainsi que par détermination de l'activité des enzymes liées à la dégradation de la paroi cellulaire végétale. L'analyse qualitative des profils électrophorétiques de sécrétomes de la souche CNCM I-4844 induits en utilisant différentes sources de carbone a révélé une bonne reproductibilité entre les réplicats biologiques (Figure 1). Ces sécrétomes ont donc été mis en commun pour le reste 10 de l'étude. La croissance sur AVI et WS a donné les meilleurs rendements de sécrétion de protéines avec 71 et 74 mg de protéines totales par litre de culture, respectivement, alors qu'en condition de culture sur maltose (contrôle) le rendement de sécrétion est de 0,8 mg de protéine totale par litre de culture. 15 Les activités des enzymes de la souche CNCM I-4844 agissant sur la cellulose et l'hémicellulose ont été mesurées dans chaque sécrétome et comparées au cocktail enzymatique industriel de T reesei CL847. Les activités endoglucanase, cellobiohydrolase (CBH) et xylanase maximales ont été mesurées en condition de culture sur AVI, tandis que les activités [3-glucosidase, [3-mannanase et pectinase les plus élevées ont été mesurées en 20 condition de culture sur WS, WS-R et MB respectivement (Figure 2). De manière surprenante les activités cellulase étaient jusqu'à 7,5 fois plus élevées que celles présentes dans le cocktail enzymatique industriel de référence de la souche T reesei CL847 (voir Tableau 1 ci-dessous). Tableau 1 : Principales activités de clivage des glucides du cocktail enzymatique de 25 T reesei CL847 et des sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844 induits avec de la cellulose cristalline avicel (AVI), du son de maïs (MB), de la paille de blé (WS) ou des résidus d'hydrolyse de paille de blé (WS-R). Les activités enzymatiques sont exprimées en U.me. n.d., aucune activité n'est détectée. pG1c, para-nitrophény1-13-D-glucose ; pLac, paranitrophényl-n-D-lactose ; pCel, para-nitrophény1-13-D-cellobiose ; pCel3, para-chloro- 30 phény113-D-glucotrio se ; DCPIP, 2,6-dichloro-phénol-indophénol; CMC, carboxyméthyl cellulose ; pXyl, para-nitrophényl-P-D-xylose ; pAra, para-nitrophényl-a-L-arabinose ; pGal, para-nitrophényl-f3-D-galactose ; pMan, para-nitrophény1-(3-D-mannose ; BirchX, Xylane de bouleau ; WheatX, arabinoxylane de blé ; Man, Mannane ; GalMan, Galactomannan ; AraGal, Arabinogalactan.

Substrat T reesei L. arvalis CNCM I-4844 CL847 MB AVI WS WS-R pGlc 0.22 ± 0.00 0.04 ± 0.00 0.08 + 0.00 0.26 ± 0.00 0.15 ± 0.00 pLac 0.04 ± 0.01 n.d. 0.05 + 0.00 0.01 ± 0.00 0.02 ± 0.01 pCel 0.06 ± 0.00 n.d. 0.06 ± 0.00 0.04 + 0.00 0.02 ± 0.00 pCel3 10.46 ± 0.53 0.86 ± 0.03 13.80 ± 0.30 10.10 ± 0.32 8.96 ± 0.33 DCPIP n.d. 0.06 + 0.11 0.84 ± 0.07 1.38 + 0.25 1.44 ± 0.04 CMC 0.33 ± 0.02 n.d. 2.46 ± 0.08 0.93 ± 0.03 1.94 ± 0.12 Avicel 0.010 ± 0.005 n.d. 0.075 ± 0.004 0.010 ± n.d. 0.003 pXyl 0.01 ± 0.00 n.d. 0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.00 n.d. pAra 0.03 ± 0.00 0.48 ± 0.01 0.01 ± 0.00 0.09 ± 0.00 0.03 ± 0.01 pGal n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. pMan n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. Pectine 0.12 ± 0.00 6.73 ± 0.03 6.33 ± 0.16 0.77 ± 0.06 3.06 ± 0.09 BirchX 0.94 ± 0.04 0.10 ± 0.01 5.4 + 0.51 4.39 ± 0.02 3.79 ± 0.10 WheatX 1.59 ± 0.03 0.35 ± 0.02 9.71 ± 0.80 5.93 ± 0.61 6.78 ± 0.02 Man 0.01 ± 0.00 0.06 + 0.01 1.63 ± 0.08 1.10 ± 0.04 3.23 ± 0.23 GalMan 0.02 ± 0.00 0.31 ± 0.06 3.99 + 0.03 2.22 ± 0.10 6.88 ± 0.53 Arabinane 0.01 ± 0.00 0.14 ± 0.01 0.06 ± 0.02 0.23 ± 0.02 0.05 ± 0.01 AraGal 0.01 ± 0.00 0.11 ± 0.05 n.d. n.d. n.d. Laccase n.d. 0.04 ± 0.02 n.d. 0.01 ± 0.00 n.d. La capacité des sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844 à améliorer la conversion de la paille de blé prétraitée a été évaluée. La libération de glucose à partir de paille de blé explosée à la vapeur a été quantifiée au plateau de saccharification en utilisant le cocktail enzymatique de T reesei CL847 supplémenté en P-glucosidase (SP188) comme référence. Des expériences ont été effectuées en utilisant chaque sécrétome de L. arvalis CNCM I-4844 en combinaison avec le cocktail enzymatique de T reesei CL847 supplémenté en P-glucosidase. Parmi les quatre sécrétomes testés, celui induit en condition de culture sur AVI se distingue des autres par l'amélioration de la libération de glucose de 26% (Figure 2).

Analyse protéomique de sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844 Pour déterminer la composition des sécrétomes de L. arvalis CNCM I-4844 pendant sa croissance sur maltose, MB, AVI, WS ou WS-R, une chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) a été réalisée sur 10 jours de culture. Dans l'ensemble, 171 protéines ont été détectées de manière certaine et identifiées par comparaison avec une base de données résultant du transcriptome de L. arvalis. Les sécrétomes des cinq conditions de culture diffèrent en taille de 22 protéines détectées pour la condition de culture sur maltose jusqu'à 129 protéines identifiées pour la condition de culture sur WS. Le rapport entre les protéines GH, AA, PL et CE était assez similaire entre les conditions de culture sur MB, AVI, WS et WS-R avec un ensemble de 12 protéines commun à tous les sécrétomes (Figure 3) comprenant deux cellobiohydrolases (GH7 CBH) putatives et une oxydase à cuivre putative (AA5_1). Seules deux protéines étaient spécifiques à la condition de culture sur AVI alors que 13, 29 et 10 protéines étaient spécifiques aux conditions de culture sur MB, WS et WS-R respectivement (Figure 3). Il est intéressant de noter que (i) les cinq GH7 CBH (SEQ ID NO : 1, 2, 3 4 et 5) ont été identifiées avec la CDH (SEQ ID NO : 6) dans toutes les conditions de culture sauf sur maltose, (ii) les deux protéines identifiées uniquement dans les conditions de culture sur AVI sont de fonction inconnue, (iii) parmi les 12 protéines communes aux conditions de culture AVI, WS et WS-R, 7 présentent un module de liaison aux carbohydrates de la famille 1 (CBM1) et (iv) la laccase putative (AA1_1) n'a été identifiée que pour la condition de culture sur WS. Pour la condition de culture sur AVI, L. arvalis CNCM I-4844 produit un 20 sécrétome riche en enzymes agissant sur la cellulose dont sept polysaccharide monooxygénases (SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13). Ce sécrétome stimule de façon significative le cocktail enzymatique T reesei pour la conversion de la biomasse. REFERENCES 25 Allen A.L. and Andreotti R.L., Biotechnol Bioeng. 1982, 12:451-459 Benin J.G. et al., Appl Environ Microbiol. 2012, 78:6483-90 Bey M. et al., Microb Cell Fact. 2011, 10:113 Burdsall H.H., et al. Mycologia. 1980, 72:728-736 Cantarel B.L., et al., Nucleic Acids Res. 2009, 37(Database issue):D233-8 30 Couturier M., et al., BMC genomics. 2012, 13:57 Couturier M., et al., Appl Environ Microbiol. 2011, 77:237-46 Foust T.D., et al., The biorefinery, p 7-37. In Himmel ME (ed), Biomass recalcitrance: deconstructing the plant cell wall for bioenergy, 1st ed. Blackwell Publishing Ltd., Oxford, United Kingdom (2008) Hendriks A.T. and Zeeman G. Bioresource Technology. 2009, 1:10-8 Herpoël-Gimbert I., et al., Biotechnol Biofuels. 2008, 1:18 Jouanin L. and Lapierre C. Lignins, (lst Edition) Biosynthesis, Biodegradation and Bioengineering. Advances in Botanical Research, Editor(s): Jouanin & Lapierre (2012) Levasseur A., et al., Biotechnol Biofuels. 2013, 6:41 Martinez D., et al., Nat Biotechnol. 2008, 26:553-60 Montenecourt B.S. and Eveleigh D.E., Appl. Environ. Microbiol., 1977, 34:777-782 Navarro D. et al., Microb Cell Fact. 2010, 9:58 Odvody G.N., Phytopathology. 1980, 70:655-658 Peterson R. and Nevalainen H., Microbiology (Reading, England). 2011, 158:58-68 Saeed A.I. et al., Biotechniques. 2003, 34:374-8 Takasuka T.E. et al., Sci Rep. 2013, 3:1030 Temp U. and Eggert C., Appl Environ Microbiol. 1999, 65:389-395 Vishniac W. and Santer M., Bacteriol Rev. 1957, 21:195-213 Warzywoda M., et al., Biotechnol Bioeng. 1983, 25:3005-3011

Claims (11)

1. REVENDICATIONS1. Préparation multi-enzymatique isolée contenant des cellulases, cellobiose déshydrogénases et xylanases, caractérisée en ce qu'elle contient le sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844.
2. 2. Préparation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit sécrétome est susceptible d'être obtenu à partir d'une culture de la souche CNCM I-4844 effectuée en présence d'une source de carbone inductrice de la production d'enzymes lignocellulolytiques, contenant de préférence de la cellulose.
3. 3. Préparation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite source de carbone inductrice est choisie parmi le papier filtre de cellulose, les pailles ou les sons de céréales et les fractions ou résidus de pailles ou sons de céréales, ou leurs mélanges.
4. 4. Préparation multi-enzymatique contenant une fraction du sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844 défini à l'une quelconque des revendications 2 ou 3, comprenant une cellobiohydrolase, une cellobiose déshydrogénase et éventuellement une polysaccharide monooxygénase.
5. 5. Préparation selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une cellobiohydrolase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5, la cellobiose déshydrogénase de séquence SEQ ID NO : 6 et éventuellement au moins une polysaccharide monooxygénase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 11.
6. 6. Préparation mufti-enzymatique comprenant au moins une cellobiohydrolase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5 et les enzymes présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 ou 5, une cellobiose déshydrogénase présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6, et éventuellement au moins une polysaccharide monooxygénase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 12, 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 11 et les enzymes présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13.
7. 7. Préparation multi-enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle contient en outre le sécrétome d'une souche de Trichoderma reesei.
8. 8. Utilisation d'une préparation multi-enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la saccharification d'un substrat lignocellulosique.
9. 9. Procédé de production de sucres fermentescibles à partir d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse dudit substrat à l'aide d'une 5 préparation multienzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
10. 10. Procédé de production d'alcool à partir d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend la production d'un hydrolysat contenant des sucres fermentescibles par un procédé selon la revendication 9, et la fermentation alcoolique dudit hydrolysat par un micro-organisme alcooligène. 10
11. 11. Utilisation de la souche Laetisaria arvalis CNCM I-4844 pour l'obtention d'une préparation multi-enzymatique contenant des cellulases, des cellobiose déshydrogénases et des xylanases.