FR2983869A1 - Procede de production d'alcool a partir de biomasse lignocellulosique par complementation des enzymes cellulolytiques et hemicellulolytiques de trichoderma reesei par le champignon podospora anserina - Google Patents

Abstract

L'invention décrit un procédé de production d'alcool à partir de matériaux ligno-cellulosiques prétraités, comprenant au moins les étapes suivantes : a) une étape d'hydrolyse enzymatique desdits matériaux lignocellulosiques prétraités utilisant, en mélange, des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques provenant du microorganisme Trichoderma reesei et de protéines du champignon Podospora anserina ; b) une étape de fermentation alcoolique par un microorganisme alcooligène de l'hydrolysat issu de l'étape a) et obtention d'un moût de fermentation et c) une étape de séparation de l'alcool du moût de fermentation.

Description

Domaine technique La présente invention concerne l'utilisation simultanée d'enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques provenant du microorganisme Trichoderma reesei et de protéines du champignon Podospora anserina dans l'étape d'hydrolyse enzymatique d'un matériel lignocellulosique prétraité, en particulier dans le cadre de la production d'éthanol à partir de matériaux ligno-cellulosiques prétraités. État de la technique La biomasse lignocellulosique est une des ressources renouvelables les plus abondantes sur terre et constitue une alternative intéressante aux matières premières fossiles. Son utilisation à des fins énergétiques permet en effet de réduire les gaz à effet de serre, tout en minimisant la dépendance énergétique vis-à-vis des pays producteurs de pétrole. Depuis les années 1970, la transformation de la biomasse ligno-cellulosique en éthanol, après hydrolyse des polysaccharides constitutifs en sucres fermentescibles, a fait l'objet de nombreux travaux.

La biomasse lignocellulosique est composée de trois principaux polymères : la cellulose à une teneur comprise entre 35 et 50%, les hémicelluloses qui sont des polysaccharides essentiellement constitués de pentoses et d'hexoses à une teneur comprise entre 20 et 30% et les lignines à une teneur comprise entre 15 et 25% du poids. La dégradation de la biomasse se révèle difficile car les polysaccharides de la paroi végétale (cellulose et hémicelluloses) sont intimement associés à de la lignine, qui confère aux parois leur rigidité. De ces trois polymères, la cellulose est la principale source de sucres fermentescibles en éthanol car elle est constituée de glucose, ce dernier étant facilement fermenté en éthanol par le microorganisme Saccharomyces cerevisiae dans des procédés industriels éprouvés et performants. Les pentoses contenus dans les hémicelluloses ne sont pas efficacement convertis en éthanol. D'autres microorganismes parmi les genres Saccharomyces, Pichia, Candida, Pachysolen, Zymomonas, Klebsiella, Escherichia, peuvent être choisis pour valoriser les sucres monomères issus de la biomasse en éthanol. Le procédé de transformation des matériaux ligno-cellulosiques en éthanol comprend une étape de prétraitement physico-chimique, suivie d'une étape d'hydrolyse enzymatique ou chimique, d'une étape de fermentation éthanolique des sucres libérés et d'une étape de récupération de l'éthanol.

L'étape de prétraitement a pour objet de libérer les sucres fermentescibles contenus dans les hémicelluloses sous forme de monomères, essentiellement des pentoses, comme le xylose et l'arabinose, et des hexoses, comme le galactose, le mannose et le glucose, et d'améliorer l'accessibilité de la cellulose, incrustée dans la matrice de lignine et hémicelluloses, aux enzymes hydrolytiques. De nombreuses technologies existent : cuissons acides, cuissons alcalines, explosion à la vapeur, procédés organosolv, etc. L'efficacité du prétraitement se mesure par le taux de récupération des hémicelluloses et par la susceptibilité à l'hydrolyse du résidu cellulosique. Les prétraitements de type acide en condition douce et par explosion à la vapeur sont les mieux adaptés. Ils permettent une récupération totale des pentoses et une bonne accessibilité de la cellulose à l'hydrolyse. Le résidu solide issu de l'étape de prétraitement, composé essentiellement de cellulose et de lignine est hydrolysé par des enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques produites par des microorganismes. Lesdits microorganismes, comme les champignons appartenant aux genres Trichoderma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, ou les bactéries anaérobies appartenant par exemple au genre Clostridium, produisent ces enzymes, lesdites enzymes contenant notamment les cellulases et les xylanases, adaptées à l'hydrolyse totale des polysaccharides contenus dans les végétaux. L'hydrolyse enzymatique s'effectue classiquement dans des conditions douces telles que par exemple à une température comprise entre 45 et 50°C et à un pH de 4,8 et est efficace. En revanche, le coût des enzymes reste très élevé et beaucoup de travaux ont été conduits pour réduire ce coût : notamment i) l'augmentation de la production d'enzymes, en sélectionnant les souches hyperproductrices et en améliorant les procédés de fermentation, ii) la diminution de la quantité d'enzymes en hydrolyse, en optimisant la composition du cocktail enzymatique ou en améliorant l'activité spécifique de ces enzymes. Au cours de la dernière décennie, les principaux travaux se sont attachés à comprendre les mécanismes d'action des cellulases et d'expression des enzymes afin de faire produire et sécréter aux microorganismes le complexe enzymatique le plus approprié à l'hydrolyse des substrats lignocellulosiques en modifiant les souches avec les outils de biologie moléculaire. Le microorganisme le plus utilisé pour la production industrielle de cellulases utilisées pour l'hydrolyse enzymatique est le champignon T. reesei. Ce champignon filamenteux est capable de sécréter, en présence d'un substrat inducteur, la cellulose par exemple, des concentrations importantes de cellulases et hémicellulases. Les enzymes du cocktail enzymatique contiennent trois grands types d'activités : les endoglucanases qui attaquent la cellulose en milieu des chaines et de préférence dans les zones amorphes, les exoglucanases libérant des dimères de glucose, le cellobiose, à partir des extrémités de chaines et les f3-glucosidases qui hydrolysent le cellobiose en glucose. D'autres protéines possédant des propriétés indispensables à l'hydrolyse des matériaux ligno-cellulosiques sont également sécrétées par le microorganisme T. reesei, les xylanases par exemple. La présence d'un substrat inducteur est indispensable à l'expression desdites enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques et la nature du substrat carboné a une forte influence sur la composition du cocktail enzymatique sécrété. C'est le cas du xylose, qui, associé à un substrat carboné inducteur comme la cellulose ou le lactose, permet d'augmenter significativement l'activité dite xylanase dans le mélange. Du point de vue du procédé, il est nécessaire dans un premier temps de récupérer les enzymes produites par ledit champignon dans le milieu de culture et éventuellement de les conditionner avant leur utilisation dans l'hydrolyse enzymatique. Les techniques de génétique classique par mutation ont permis la sélection de souches de T. reesei hyperproductrices de cellulases telles que les souches MCG77, décrites dans le brevet Gallo - US 4275 167, MCG 80 décrites dans Allen, A.L. et Andreotti, R.E., Biotechnol-Bioengi 1982, 12, 451-459 1982, RUT C30 décrites dans Montenecourt, B.S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782 et CL847 décrites dans Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50. Les améliorations ont permis d'obtenir des souches hyperproductrices, moins sensibles à la répression catabolique par les sucres monomères notamment, glucose par exemple, par rapport aux souches sauvages. Cependant, la dégradation de substrats inducteurs complexes, comme la biomasse végétale, nécessite un grand nombre d'activités enzymatiques différentes. Or, le séquençage récent du génome du microorganisme T. reesei (34 méga paires de bases, environ 9100 gènes) a révélé des caractéristiques inattendues décrites dans Martinez et al., Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus T. reesei (syn. Hypocrea jecorina). Nat Biotechnol 2008, 26 pp 553-560. Environ 2,8% des régions codantes de son génome coderaient pour des enzymes de dégradation des sucres, loin derrière les 4 % trouvés chez d'autres champignons filamenteux. En effet, une recherche portée sur son génome a permis de dénombrer 200 glycoside hydrolases (GH), ce qui représente un nombre plus faible que la moyenne de 211 GH chez les sordariomycètes séquencées, et seulement dix gènes codant pour des endoglucanases et des cellobiohydrolases. Ceci est le plus petit nombre de cellulases parmi les douze champignons dont le génome est actuellement disponible, capables de dégrader la paroi végétale de la matière lignocellulosique. Ledit microorganisme T. reesei possède également le plus petit nombre de gènes codant pour des hémicellulases (16 gènes), pour des enzymes de dégradation de la pectine et pour des protéines contenant un CBM ou "carbohydrate binding module" selon la terminologie anglo-saxonne ou module de fixation aux polysaccharides (Martinez et al., Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus T. reesei (syn. Hypocrea jecorina). Nat Biotechnol 2008, 26 pp 553-560).

On trouve de plus une diversité de glycosides hydrolases réduite, certaines familles étant totalement absentes chez le microorganisme T. reesei. En outre, il ne possède pas non plus de gènes codant pour des tannases ou des féruloyl estérases, faits qui soulignent l'handicap probable de T. reesei face à la dégradation des hémicelluloses. La capacité de dégradation des parois végétales du microorganisme T. reesei réside donc principalement dans son aptitude à sécréter de grandes quantités d'enzymes, jusqu'à cent grammes de protéines extracellulaires par litre d'après Cherry J. et Fidantsef A., Directed evolution of industrial enzymes: an update. Curr Opin Biotechnol. 2003, 14 pp 43843. Mais ces enzymes sont peu diversifiées et ne présentent pas de capacité d'hydrolyse supérieure à certains autres ascomycètes. Un tel déséquilibre apparent peut en fait refléter une optimisation du processus d'hydrolyse enzymatique développé par le champignon dans son habitat naturel : le microorganisme T. reesei produit les enzymes essentielles en forte proportion, et sa proximité à d'autres micro-organismes lui permet de tirer profit des activités enzymatiques sécrétées par ceux-ci. Ainsi, il paraît probable que le sécrétome de T. reesei, c'est-à-dire de l'ensemble des protéines sécrétées par ledit microorganisme, peut être amélioré par ajout d'autres enzymes pour une utilisation dans un procédé impliquant une hydrolyse enzymatique de la lig nocellulose Des enzymes pouvant compléter le sécrétome de T. reesei peuvent venir de tout type de microorganismes possédant lesdites enzymes. Notamment, les champignons sont des organismes intéressants pour obtenir des protéines susceptibles d'améliorer l'activité cellulolytique de T. reesei. Environ 72 000 espèces de champignons ont été décrites à ce jour mais Ainsworth et al. ( « Dictionary of fungi », 1971) en répertorient 200 000 et selon Hawksworth (The magnitude of fungal diversity: the 1.5 million species estimate revisited 2001, Mycological research, 105, 1422-1432), le nombre d'espèces dans le monde serait potentiellement de 1,5 millions. Cette immense diversité fongique reste à ce jour inexplorée, et laisse espérer la découverte d'activités enzymatiques nouvelles ou plus performantes pour l'hydrolyse de la biomasse lignocellulosique, selon l'écosystème où ont évolué les souches fongiques.

Des exemples récents illustrent en effet la faisabilité d'une supplémentation des cellulases de T. reesei par des enzymes venant d'autres champignons : L'étude de Rosgaard et al. (Efficiency of new fungal cellulase systems in boosting enzymatic degradation of barley straw lignocellulose. Biotechnol Prog 22, 493-498) montre que la quantité de sucres réducteurs libérés est plus importante si des protéines produites par différentes espèces, telles que Chaetomium globosum, Thielavia terrestris ou Penicillum funiculosum, sont ajoutées aux enzymes produites par T. reesei. La demande de brevet US2010/0159494A décrit que l'ajout d'enzymes individuelles peut également améliorer l'hydrolyse de substrats lignocellulosiques : des enzymes de famille GH61 provenant de T. terrestris ou Thermoascus aurianticus ont un effet "boost" sur les cellulases de T. reesei pour l'hydrolyse d'un substrat lignocellulosique, même si elles seules ne possèdent qu'une faible activité hydrolytique (Quinlan et al., Insights into the oxidative degradation of cellulose by a copper metalloenzyme that exploits biomass components, Proc. Nat Sci USA 2011 108 (37):15079-84.

La demande de brevet US2010/0124769A décrit qu'un remplacement de 20% du cocktail cellulolytique par une xylanase d'Aspergillus aculeatus et une cellobiohydrolase (Ce16) de Myceliophthora thermophila pouvait améliorer le rendement d'hydrolyse de 16%. Il existe donc un potentiel de renforcer l'efficacité des cellulases sécrétées par T. reesei dans le but d'améliorer la capacité d'hydrolyse d'un substrat lignocellulosique.

Dans ce contexte, la demanderesse a découvert que l'utilisation simultanée d'enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei et de protéines du champignon P. anserina dans l'étape d'hydrolyse enzymatique d'un matériel lignocellulosique prétraité permettait l'amélioration de la capacité d'hydrolyse dudit matériel lignocellulosique, en particulier dans le cadre de la production d'alcool et de préférence d'éthanol, à partir dudit matériel lignocellulosique prétraité. Un objet de la présente invention est donc de fournir un procédé de production d'alcool à partir de matériaux ligno-cellulosiques prétraités, comprenant au moins les étapes suivantes : a) une étape d'hydrolyse enzymatique desdits matériaux lignocellulosiques prétraités utilisant, en mélange, des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei et de protéines du champignon P. anserina ; b) une étape de fermentation alcoolique par un microorganisme alcooligène de l'hydrolysat issu de l'étape a) et obtention d'un moût de fermentation et c) une étape de séparation de l'alcool du moût de fermentation. Un avantage de la présente invention est d'améliorer la capacité d'hydrolyse desdits matériaux lignocellulosique par l'utilisation simultanée d'enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei et de protéines du champignon P. anserina dans l'étape d'hydrolyse enzymatique. Description détaillée de l'invention La présente invention concerne un procédé de production d'alcool et de préférence d'éthanol, à partir de matériaux lignocellulosiques prétraités. Conformément à l'invention, les matériaux lignocellulosiques constituants la charge du procédé selon la présente invention sont prétraités selon les méthodes connues de l'homme du métier décrites plus haut. De préférence, les matériaux lignocellulosiques utilisés dans le procédé selon la présente invention sont choisis parmi les résidus d'exploitation agricole tels que les pailles de céréales, la bagasse de canne à sucre ou tout autre type de résidus ligneux, les résidus d'exploitation forestière tels que les produits résultant de la première éclaircie des forêts, les produits de l'exploitation forestière tels que les copeaux de bois, les résidus de scieries, les cultures dédiées telles que par exemple le miscanthus, les taillis à courte rotation, les résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, les résidus de l'industrie papetière, les déchets végétaux ou les produits de transformation desdits matériaux lignocellulosiques, pris seuls ou en mélange. Conformément à l'étape a) du procédé selon la présente invention, l'étape d'hydrolyse enzymatique desdits matériaux lignocellulosiques prétraités utilise un mélange d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei avec des protéines du champignon P. anserina. Lesdites enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei sont avantageusement produites de manière connues de l'homme du métier. Le brevet FR 2 555 603 décrit par exemple un procédé de production d'enzymes cellulolytiques. De préférence, lesdites enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei, appelées cocktail d'enzymes de T. reesei, sont obtenues à partir d'une souche T. reesei hyperproductrice de cellulases, telles que Rut C30, décrite par Montenecourt B.S. et Eveleigh D.E. Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34 (p. 777) ou CL847, décrite par Warzywoda M. Biotechnol. Lett. 1983, 5 (p.243). Lesdites enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques produites par ledit champignon sont avantageusement récupérées dans leur milieu de culture et éventuellement conditionnées avant leur utilisation dans l'étape a) d'hydrolyse enzymatique du procédé selon l'invention. Le champignon P. anserina est un champignon ascomycète dont l'habitat est tout à fait atypique puisque dans la nature, il se développe exclusivement sur des excréments d'herbivore. Ledit champignon apparaît dans les étapes tardives de dégradation, après la digestion des végétaux dans le tractus digestif de l'animal et après le passage successif de plusieurs autres espèces fongiques. Le champignon P. anserina se caractérise par sa capacité à se nourrir de substrats très récalcitrants, les substances carbonées facilement accessibles étant consommées auparavant. Les protéines extracellulaires du champignon P. anserina sont avantageusement produites sur une large gamme de sources de carbone. De préférence, lesdites protéines du champignon P. anserina sont produites sur des sucres monomères, dimères, polymères ou résidus de végétaux comme sources de carbone. De préférence, lesdites protéines sont obtenues après croissance du champignon sur une source de carbone choisie parmi le xylose, I'arabinose, le saccharose, le cellobiose, le lactose, I'Avicel, la cellulose Solka-Floc, le son de maïs, le xylane de bouleau, la pulpe de betterave et la paille de blé. Selon le substrat utilisé, la quantité et la nature des protéines sécrétées ne sont pas les mêmes. De manière très préférée, lesdites sources de carbone à partir desquelles les protéines du champignon P. anserina sont obtenues sont choisies parmi la paille de blé, la cellulose Solka-Floc, Avicel, le saccharose et la pulpe de betterave.

Lesdites protéines du champignon P. anserina sont avantageusement récupérées dans leur milieu de culture et éventuellement conditionnées avant leur utilisation dans l'étape a) d'hydrolyse enzymatique du procédé selon l'invention, en mélange avec les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei. Les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei et de lesdites protéines du champignon P. anserina sont avantageusement mélangées dans des proportions allant de 40:60 jusqu'à 95:5. De préférence, elles sont mélangées dans des proportions 50:50. Une enzyme p-glucosidase, tel que l'enzyme SP188 (Novozymes) peut avantageusement être ajoutée au dit mélange utilisé dans l'étape a) d'hydrolyse enzymatique. Un tel ajout permet d'accélérer la vitesse initiale de l'hydrolyse et d'obtenir des rendements d'hydrolyse plus importants. L'étape a) d'hydrolyse enzymatique est avantageusement effectuée à une température comprise entre 30°C et 50°C, et de préférence entre 37 et 45°C. Ladite étape est avantageusement effectuée à un pH compris entre 4,5 et 5,5. La réaction d'hydrolyse enzymatique peut avantageusement contenir entre 1 et 20% de substrat lignocellulosique, c'est-à-dire de matière sèche, et la teneur en charge enzymatique totale est avantageusement comprise entre 5 et 30 mg par gramme de substrat (matière sèche). L'étape a) d'hydrolyse enzymatique est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 24 et 120h, et de préférence entre 72h et 96h. La réaction d'hydrolyse enzymatique est suivie par dosage des sucres libérés, notamment le glucose par la méthode DNS connue de l'homme du métier. Conformément à l'étape b) du procédé selon l'invention, l'hydrolysat issu de l'étape a) subit une étape de fermentation alcoolique par un microorganisme alcooligène de manière à obtenir un moût de fermentation. L'étape b) de fermentation alcoolique du procédé selon la présente invention est avantageusement mise en oeuvre dans des conditions classiques connues de l'homme du métier.

De préférence, la solution sucrée ou hydrolysat obtenue est fermentée dans des conditions bien connues de l'homme de l'art, en présence d'un microorganisme alcooligène tel que la levure Saccharomyces cerevisiae ou tel que la bactérie Zymomonas mobilis, à une température avantageusement comprise entre 30 et 35°C.

Conformément à l'étape c) du procédé selon l'invention, l'alcool obtenu à l'issue de l'étape b) de fermentation est séparé du moût de fermentation. L'alcool obtenu est séparé du moût de fermentation et des résidus non solubles par distillation et le résidu est constitué des vinasses de distillation.

Selon un mode de réalisation préférée du procédé selon l'invention, l'étape a) d'hydrolyse enzymatique du procédé selon la présente invention, utilisant en mélange, des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei et au moins une protéine du champignon P. anserina et l'étape b) de fermentation alcoolique sont réalisées en une seule étape. Selon ce mode de réalisation préféré, le procédé selon la présente invention est un procédé de saccharification et fermentation simultanées dit procédé SSF. Les conditions opératoires mises en oeuvre dans ledit mode de réalisation sont identiques à celle décrites ci-dessus dans le cas ou l'étape a) d'hydrolyse enzymatique et l'étape b) de fermentation alcoolique sont mises en oeuvre séparément, aux différences prés que la température est avantageusement comprise entre 28 et 40°C, et la réaction est avantageusement réalisée pendant une durée comprise entre 50h et 300h. Les exemples ci-dessous illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemple 1 : Culture du champignon P. anserina Les cultures de P. anserina S mat+ sont réalisées avec un milieu M2 (KH2PO4 0,25 K2HPO4 0,3 g.1-1, MgS047H20 0,25 g.1-1, urée 0,5 thiamine 0,05 mg.1-1, biotine 0,25 pg.1- 1, acide citrique 2,5 mg.I-1, ZnSO4 2,5 mg.I-1, CuSO4 0,5 mg.1-1, MnSO4 125 pg.1-1, acide borique 25 pg.1-1, molybdate de sodium 25 pg.1-1, alun de fer 25 pg.I-1, dextrine 5 g.1-1, extrait de levure 10 g.1-1. Ajuster à pH7 avec une solution de KH2PO4). En phase de croissance, le mycélium pousse de 7 mm par jour à 27°C sur gélose de M2 (M2 + agar 12,5 g.1-1). Pour les cultures liquides, une préculture à partir de 5 rondelles de gélose de 0,5 mm de diamètre broyées pendant 30 sec à puissance 5 au Fastprep (MP Biomedicals) est réalisée permettant d'ensemencer 200 ml de milieu M2 en fiole de Roux. Les mycelia des 7 fioles de Roux sont récupérés après 5 jours de culture et broyés au mixeur pendant 20 secondes à une puissance moyenne. Ce broyat permet d'ensemencer 2 I de culture de façon homogène. Toutes les cultures sont réalisées à 27°C et à pH 7, 100 rpm, en fioles bafflées de 500 ml contenant 100 ml/fiole de M2. Une culture de quatre jours sur dextrine comme substrat de carbone permet d'obtenir 70 mg 1-1 de protéines extracellulaires. A partir des substrats complexes, la concentration en protéine produite est plus forte. La paille de blé micronisée permet d'obtenir 306 mg.1-1 et la pulpe de betterave 220 mgr' de protéines. Exemple 2 : Activités enzymatiques présentes dans les sécrétomes de P. anserina L'exemple 2 vise à caractériser les activités enzymatiques présentes dans les protéines sécrétées de P. anserina. Les tests d'hydrolyse de sucres simples sont réalisés avec 4 pg de protéines de P. anserina dans un volume de 100 }.11 de tampon acétate 50 mM pH 5 et 1 mM de substrat, pendant 20 min à 37°C sous agitation. Les substrats testés sont les 4-nitropheny1-6-D-glucopyranoside (pNP-3-D-glucopyranoside), pNP-6-D-lactopyranoside, pNP-6-D-cellobioside, pNP-6-D- xylopyranoside, pNP-OE-D-arabinofuranoside, pNP-a-D-galactopyranoside et pNP-[3-Dmannopyranoside. La réaction est stoppée par l'ajout de 130 !al de Na2CO3 1M, et I'absorbance à 410 nm est mesurée. Un blanc réalisé avec 10011 I d'H20 est soustrait aux mesures et une gamme de 0,02 à 0,2 mM de 4-nitrophenol est dosée en parallèle de chaque série de tests. L'activité enzymatique est basée sur le dosage colorimétrique du pNP libéré dans le milieu sous l'action enzymatique. Elle est exprimée en Ftmol de paranitrophénol libéré par minute et par mg d'enzyme. Les hydrolyses des substrats complexes CMC, Avicel® pH-101, pectine d'agrume, et xylane de bouleau, xylane de blé, 1,4 [3-D mannane, le galactomannane, l'arabinane de pulpe de betterave et l'arabinogalactane de mélèze, sont réalisées dans un volume de 100 µl de tampon acétate 50 mM pH 5 et 1% (poids/volume) de substrats avec 12 pg de protéines, pendant 1h à 37°C, sous agitation. Les sucres réducteurs libérés au cours de l'hydrolyse sont quantifiés par le dosage DNS. Inductions Activités sur substrats liés au pNP (en UIang-1) pNP-Glc pNP-Lac PNP-Cell pNP-Xyl pNP-Ara pNP-Gal pNP-Man Avicel 395,6 169,1 128,7 nd nd 155,4 nd Solka-Floc 242,4 79,2 59,8 nd nd 86,5 nd Betterave 0,7 nd nd nd nd 24,8 nd paille de blé native 0,05 nd nd nd nd 8,5 nd Saccharose 24,2 nd nd nd nd nd nd Tableau 1 : Activités des productions enzymatiques de P. anserina sur les substrats synthétiques marqués au pNP. Abréviations : pNP-Glc = 4-nitrophenyl 13-D-glucopyranoside, pNP-Lac = 4-nitrophenyl lactopyranoside, pNPCeI = 4-nitrophenyl 13-D-cellobioside, pNP-Xyl = [3-D-xylopyranoside, pNP-Gal = 4-nitrophenyl a-D-galactopyranoside, pNP-Man = 4-nitrophenyl mannopyranoside. nd : activité non détectée dans les conditions du test.

Activité sur substrats complexes (en UI.mil) Inductions CMC Avicel X de X de blé Man GalMan Pectine Ara AraGal bouleau Avicel Solka-Floc Betterave Son de maïs X de bouleau 0,55 0,47 nd nd nd nd nd 0,18 nd nd 0,84 3,72 nd nd 3,69 2,63 5,10 0,38 0,17 4,12 1,98 1,12 0,29 0,07 nd 4,03 2,40 0,79 0,35 nd nd nd 0,36 nd nd nd nd 2,82 1,60 nd nd nd 1,00 0,32 nd l'aille de blé nd 0,13 nd 0,22 0,25 2,48 0,95 4,55 1,19 native nd 0,01 0,13 0,01 0,06 nd 0,10 nd 0,21 Glucose nd nd 0,14 0,12 0,02 0,04 0,06 nd 0,18 Dextrine Tableau 2 : Activités enzymatiques des différents sécrétomes de P. anserina sur des polymères présents dans la paroi végétale (cellulose, hémicelluloses et pectine). Abréviations : CMC = Carboxymethyl cellulose, X = Xylane, XI = Xylane Insoluble, Man = mannane, GalMan = GalactoMannane, Ara = Arabinane, AraGal = ArabinoGalactane. nd = activité non détectée dans les conditions du test. Exemple 3 : Hydrolyse de la paille prétraitée avec ajout de 5-plucosidase Les tests sont effectués avec 100 pl d'une suspension de paille de blé prétraitée à l'explosion à la vapeur à raison de 1% (poids/volume) dans du tampon acétate 50 mM pH 5, supplémentés de cycloheximide 30 mg.I-1 et tetracycline 40 mg.I-1. Les quantités de protéines sont de 10 ou 20 µg de protéines de T. reesei (E508) seules ou de 10 pg de E508 supplémentées de 10 pg de protéines de P. anserina. Le mélange réactionnel contient également 25U de p-glucosidase par g de matière sèche (SP188, Novozyme). L'hydrolyse est réalisée à une température de 37°C, les enzymes sont filtrées et les sucres réducteurs sont dosés au DNS à plusieurs temps entre 2h et 96h d'hydrolyse. Après 96 heures d'hydrolyse, on obtient 24 mM de sucres réducteurs libérés avec 10 pg comme avec 20 d'enzymes E508 par mg de substrat. La quantité de sucres totaux hydrolysés après 24 h et 96 h est augmentée avec l'ajout des enzymes de P. anserina induites sur Avicel (17 % de sucres réducteurs supplémentaires) et sur Solka-Floc, pulpe de betterave et paille de blé (13 %, 9 % et 5 % de sucres réducteurs libérés supplémentaires). La Figure 1 illustre également les résultats obtenus par hydrolyse de la paille de blé prétraitée par le cocktail E508 de T. reesei additionné de [3-glucosidase et complémenté par les sécrétomes de P. anserina, produits sur cellulose Solka-Floc, Avicel, pulpe de betterave et paille de blé.

Claims (9)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de production d'alcool à partir de matériaux ligno-cellulosiques prétraités, comprenant au moins les étapes suivantes : a) une étape d'hydrolyse enzymatique desdits matériaux lignocellulosiques prétraités utilisant, en mélange, des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei et de protéines du champignon P. anserina ; b) une étape de fermentation alcoolique par un microorganisme alcooligène de l'hydrolysat issu de l'étape a) et obtention d'un moût de fermentation ; et c) une étape de séparation de l'alcool du moût de fermentation.
2. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit procédé est un procédé de production d'éthanol.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel lesdits matériaux lignocellulosiques sont choisis parmi les résidus d'exploitation agricole, la bagasse de canne à sucre ou tout autre type de résidus ligneux, les résidus d'exploitation forestière, les produits de l'exploitation forestière, les résidus de scieries, les cultures dédiées, les résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, les résidus de l'industrie papetière, les déchets végétaux et les produits de transformation desdits matériaux lignocellulosiques, pris seuls ou en mélange.
4. 4. Procédé selon la revendication 1 à 3 dans lequel lesdites enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques sont récupérées dans leur milieu de culture avant leur utilisation dans ladite étape a) d'hydrolyse enzymatique.
5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel les protéines du champignon P. anserina sont produites sur des sucres monomères, dimères ou polymères ou résidus de végétaux choisis parmi la paille de blé, la pulpe de betterave, Avicel, Solka-Floc cellulose ou le saccharose.
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques provenant du microorganisme T. reesei et lesdites protéines du champignon P. anserina sont mélangées dans des proportions allant de 40:60 jusqu'à 95:5.
7. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 dans lequel une enzyme 3-glucosidase est ajoutée audit mélange utilisé dans l'étape a) d'hydrolyse enzymatique.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 dans lequel l'étape a) d'hydrolyse enzymatique est effectuée à une température comprise entre 30°C et 50°C, à un pH compris entre 4,5 et 5,5 et pendant une durée comprise entre 24 et 120h.
9. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 dans lequel l'étape a) d'hydrolyse enzymatique et l'étape b) de fermentation alcoolique sont réalisées en une seule étape à une température entre 28 et 40°C pendant 50 à 300h.