WO2015155677A1 - Préparation multi-enzymatique contenant le sécrétome d'une souche de laetisaria arvalis - Google Patents

Préparation multi-enzymatique contenant le sécrétome d'une souche de laetisaria arvalis Download PDF

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WO2015155677A1
WO2015155677A1 PCT/IB2015/052498 IB2015052498W WO2015155677A1 WO 2015155677 A1 WO2015155677 A1 WO 2015155677A1 IB 2015052498 W IB2015052498 W IB 2015052498W WO 2015155677 A1 WO2015155677 A1 WO 2015155677A1
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WO
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strain
enzymes
cncm
seq
secretome
Prior art date
Application number
PCT/IB2015/052498
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Jean-Guy BERRIN
David Navarro
Bernard Henrissat
Pedro Coutinho
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite D'aix Marseille
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to improving the saccharification of lignocellulosic biomass.
  • Lignocellulose contained in the secondary wall of plant cells is one of the main carbon sinks fixed during photosynthesis. It is of increasing interest as a raw material for the production of various chemicals, including simple fermentable sugars resulting from the hydrolysis (generally referred to as saccharification) of its polysaccharide constituents.
  • saccharification simple fermentable sugars resulting from the hydrolysis (generally referred to as saccharification) of its polysaccharide constituents.
  • the main product of saccharification of lignocellulosic biomass is currently glucose, which can be converted by ethanol fermentation into usable ethanol as biofuel.
  • Lignocellulose consists mainly of three types of polymers, in varying proportions depending on the plant species: cellulose, hemicellulose and lignin. These constituents are interconnected by different types of bonds, covalent and non-covalent.
  • the cellulose is up to 45% of the dry weight of lignocellulose. It is composed of linear chains of D-glucose units linked by P1, 4-glucosidic bonds, these chains being linked together by hydrogen bonds or van der Waals forces.
  • Hemicelluloses are heteropolymers representing 15 to 35% of the plant biomass, and containing pentoses ( ⁇ -D-xylose, ⁇ -L-arabinose), hexoses ( ⁇ -D-mannose, ⁇ -D-glucose, cx- D-galactose) and uronic acids.
  • Lignin is a complex heteropolymer consisting of phenylpropane units linked together by different types of bonds. Lignin is bound to both hemicellulose and cellulose, coating them in a complex three-dimensional structure that makes them less accessible to hydrolysis.
  • lignocellulose The bulk of the lignocellulose energy is stored in cellulose, which is difficult to hydrolyze due to its highly crystalline structure, as well as in ⁇ hemicellulose, which presents difficulties for energy recovery, due to its complexity and structural diversity (Foust 2008).
  • the refractile character of lignocellulose to enzymatic hydrolysis is also increased by the lignin fraction, which acts as a physical barrier (Jouanin and Lapierre, 2012).
  • the most promising route for saccharification of lignocellulose is enzymatic hydrolysis, using enzymes produced by cellulolytic microorganisms. especially mushrooms saprotrophic.
  • This hydrolysis is preceded by a pretreatment of the biomass, aimed to reduce the complexity of the lignocellulose network, in particular by dissolving the lignin and / or hemicellulose by decreasing the crystallinity of the cellulose or by increasing the accessible surface to hydrolysis .
  • This pretreatment can be carried out by various techniques, such as mechanical grinding, thermolysis, treatment with dilute acid, base, peroxide or steam explosion (see for review Hendriks and Zeeman, 2009).
  • Filamentous fungi are among the most effective lignocellulosic biomass degradation agents because of their ability to grow in lignocellulose-rich environments. They are known to secrete a wide range of active enzymes on polysaccharides (Carbohydrate-Active Enzymes; CAZymes; www.cazy.org) with complementary activities including glycoside hydrolases (GHs), carbohydrate esterases (CEs) and polysaccharide lyases (PLs) (Cantarel et al., 2009) and enzymes with ancillary activities (AAs) ( Lcvasseur et al., 2013).
  • GHs glycoside hydrolases
  • CEs carbohydrate esterases
  • PLs polysaccharide lyases
  • AAs ancillary activities
  • the filamentous fungus currently the most widely used in industry for the bioconversion of lignocellulose into simple sugars is the ascomycete Trichoderma reesei.
  • Its secretome (that is to say all the enzymes excreted by the fungus in the culture medium) contains mainly three types of enzymes, the complementary activity of which allows the hydrolysis of cellulose to glucose: endoglucanases (EG, EC 3.2.1.4); exoglucanases, including in particular cellobiohydrolases I and II (CBH, EC 3.2.1.91) and ⁇ -glucosidases (BGL, EC 3.2.1.21) (Herpo ⁇ l-Gimbert et al, 2008, Peterson and Nevalainen, 201 1; et al., 2012).
  • the entire secretome is generally used as an enzymatic cocktail.
  • the saccharification is carried out by simple contact of the lignocellulosic material pretreated with this enzymatic cocktail, and incubation under optimal temperature and pH conditions for the enzymes concerned for a variable duration depending on the nature of the lignocellulosic material concerned and the amount of enzymes used.
  • T. reesei The main interest of T. reesei lies in its ability to secrete very large quantities of enzymes.
  • Strains of T. reesei hypersecreting lignocellulolytic enzymes have been produced by mutagenesis and their secretome is currently used for the saccharification of lignocellulose.
  • MCG77 US Pat. No. 4,275,167
  • MCG 80 Allen and Andreotti, 1982
  • RUT C30 Montenecourt and Evclear 1977
  • CL847 Warzywoda et al., 1983.
  • One of the proposed approaches to improve this cocktail is to look for other cellulolytic fungi. whose secretome contains enzymatic activities capable of complementing those which appear to be insufficient in T. reesei, and to allow a more effective saccharification to be obtained.
  • some of the inventors have identified an Aspergillus japonicus strain meeting these criteria, and notably allowing, when its secretome is used in combination with that of T. reesei, to significantly increase the production of glucose (International Application WO 2014 / 037,925).
  • L. arvalis is a telluric basidiomycete fungus that has been poorly studied with the exception of a few studies that describe it as a possible biological control agent against Rhizoctonia solani and Pythium species (Burdsall et al, 1980, Odvody et al, 1980). ).
  • This strain of L. arvalis was deposited according to the Treaty of Budapest on March 21, 2014 at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms), 25 rue du Dondel Roux. Paris, under number CNCM 1-4844. Surprisingly, this strain has a cellulase activity seven times greater than that of the T. reesei industrial cocktail.
  • hydrolysis tests of lignocellulosic biomass (pretreated wheat straw) using an enzyme cocktail produced by the industrial strain T. reesei CL847 supplemented with the proteins of this strain CNCM 1-4844 showed a 20% increase in the glucose production.
  • the inventors have identified 13 enzymes present in secretomas of the strain Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 which are particularly interesting for the hydrolysis of lignocellulosic biomass.
  • These 13 enzymes are the cellobiohydrolases (GH7 CBH) of sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3 4 and 5, the cellobiose dehydrogenase (CDH) sequence SEQ ID NO: 6 and the polysaccharide monooxygenases (PMO) sequences SEQ ID NO 7, 8, 9, 10, 12 and 13 or comprising the sequence SEQ ID NO: 1 1.
  • the present invention accordingly relates to the use of the strain CNCM 1-4844 Laetisaria arvalis for obtaining a multi-enzyme preparation containing cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose dehydrogenase (EC 1.1.99.18) and xylanases (EC 3.2.1.8), and possibly also containing hemicellulases, carbohydrate oxidases, ligninases (all three belonging to AA families), endoglucanases (EC 3.2.1.4), cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91 and EC 3.2) .1.176), ⁇ -glucosidases (EC 3.2.1.21).
  • cellulases EC 3.2.1.4
  • cellobiose dehydrogenase EC 1.1.99.18
  • xylanases EC 3.2.1.8
  • hemicellulases carbohydrate oxidases
  • ligninases all three belonging to AA families
  • endo- ⁇ -1, 4-mannanases EC 3.2.1.78
  • ⁇ -arabinofuranosidases EC 3.2.1.55
  • laccases EC 1.10.3.2
  • glucose oxidases EC 1.1.3.4
  • aryl alcohol oxidases EC 1.1.3.7
  • pectinases preferably containing cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose dehydrogenases (EC 1 .1.99.18), xylanases (EC 3.2.1.8).
  • this 11 ob i ohy d ro 1 ases (in particular GI 17 CBH sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3 4 and 5) and a cellobiose dehydrogenase (in particular the CDU sequence SEQ ID O: 6).
  • a cellobiose dehydrogenase in particular the CDU sequence SEQ ID O: 6
  • cellulases EC 3.2.1.4
  • cellobiose dehydrogenases EC 1.1 .99.18
  • xylanases (EC 3.2.1.8).
  • cellobiohydrolases in particular the CBH GH7s of sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3 4 and 5
  • a cellobiose dehydrogenase in particular the CDH of sequence SEQ ID NO: 6
  • polysaccharide monooxygenases in particular the PMOs of sequences SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 12 and 13 or comprising the sequence SEQ ID NO: 1 1).
  • the subject of the present invention is an isolated multi-enzymatic preparation containing cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose dehydrogenases (EC 1 .1 .99.18) and xylanases (EC 3.2.1.8), and optionally also containing hemicellulases. , carbohydrate oxidases, ligninases (all three belonging to AA families), endoglucanases (EC 3.2.1.4), cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91 and EC 3.2.1.176).
  • ⁇ -glucosidases EC 3.2.1.21
  • endo- ⁇ -1 4-mannanases
  • EC 3.2.1.78 ⁇ -L-arabinofuranosidases
  • laccases EC 1.10.3.2
  • glucose oxidases EC 1.1 .3.4
  • aryl alcohol oxidases EC 1 .1 .3.7
  • pectinases containing the secretome of the strain Laetisaria arvalis CNCM 1-4844.
  • this multi-enzymatic preparation comprises in addition cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose dehydrogenases (EC 1 .1.99.18) and xylanases (EC 3.2.1.8), at least one cellobiohydrolase (GH7 CBH) selected from the enzymes of SEQ ID NO: 1, 2, 3 4 and 5, the cellobiose dehydrogenase (CDU) sequence SEQ ID NO: 6 and optionally at least one monooxygenase polysaccharide (PMO) selected from the enzymes of sequences SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 12 and 13 or comprising the sequence SEQ ID NO: 1 1.
  • GH7 CBH cellobiohydrolase
  • CDU cellobiose dehydrogenase
  • PMO monooxygenase polysaccharide
  • said secretome is obtainable from a culture of the CNCM 1-4844 strain effected in the presence of a carbon source (eg, a polysaccharide) induction of the production of lignocellulolytic enzymes, advantageously containing cellulose, such as crystalline cellulose (eg, crystalline cellulose avicel).
  • a carbon source eg, a polysaccharide
  • cellulose such as crystalline cellulose (eg, crystalline cellulose avicel).
  • Preferred inductive carbon sources are selected from straws or cereal brans, and / or their autoclaved or non-autoclaved fractions. Said fractions include residues of straw exploded with steam or not, lignocellulose or a polysaccharide such as cellulose, xylan, mannan. maltose and pectin.
  • a particularly preferred inducing carbon source is cellulose filter paper.
  • the secretome of said strain contains cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose dehydrogenases (EC 1.1 .99.18) and xylanases (EC 3.2.1.8). .
  • the secretome of said strain contains in addition to said cellulases (EC 3.2.1.4).
  • cellobiose dehydrogenases EC 1.1.99.18
  • xylanases EC 3.2.1.8
  • cellobiohydroases in particular GH7 CBH of sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and 5
  • cellobiose dehydrogenase in particular the sequence CDU SEQ ID NO: 6
  • the secretome of said strain contains in addition to said cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose dehydrogenases (EC 1.1 .99.18), xylanases ( EC 3.2.1.8), cellobiohydrolases (in particular the GH7 CBHs of sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and 5), a cellobiose dehydrogenase (in particular the CDH of sequence SEQ ID NO: 6) and polysaccharides monooxygenases (in particular the PMOs of SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 12 and 13 or comprising the sequence SEQ ID NO: 1 1).
  • the other constituents of the culture medium are the usual constituents of the media for the culture of basidiomycetes which are known in themselves to those skilled in the art. Conventionally, these constituents may include in addition to the source of carbon, minerals, trace elements and vitamins.
  • a culture medium for the CNCM 1-4844 strain comprises or consists of a source of carbon inducing the production of lignocellulolytic enzymes (eg, maltose, corn bran autoclavate, wheat straw, hydrolysis residue of wheat straw or crystalline cellulose), agar-agar and mineral salts.
  • lignocellulolytic enzymes eg, maltose, corn bran autoclavate, wheat straw, hydrolysis residue of wheat straw or crystalline cellulose
  • agar-agar and mineral salts.
  • the culture of the CNCM 1-4844 strain is carried out in a liquid medium and comprises, besides the CNCM 1-4844 strain, maltose (for example at the rate of 2.5 gl -1 maltose) and an inductive carbon source.
  • maltose for example at the rate of 2.5 gl -1 maltose
  • inductive carbon source for example at the rate of 2.5 gl -1 maltose
  • production of lignocellulolytic enzymes such as cellulose filter paper (containing crystalline cellulose), corn bran autoclavate, wheat straw or hydrolysis residues of wheat straw (e.g. gl " 'based on the dry matter).
  • the secretome of the CNCM 1-4844 strain can be obtained from a culture of this strain by simple separation of the cells and the culture supernatant, which contains the secreted proteins. This supernatant can be used as it is, or after simple filtration to rid it of cell debris. However, it is generally preferable to concentrate it for example by diafiltration.
  • the proteins constituting the secretome may also be recovered by ammonium sulfate precipitation.
  • the subject of the present invention is also an isolated multi-enzymatic preparation containing a secretory fraction of the Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 strain as defined above, comprising a cellobiohydrolase (CBH, EC 3.2.1.176), a cellobiose dehydrogenase ( CDU, EC 1.1.99.18) and optionally a monooxygenase polysaccharide (PMO, belonging to the AA9 family).
  • CBH cellobiohydrolase
  • CDU cellobiose dehydrogenase
  • PMO monooxygenase polysaccharide
  • said secretome from which said fraction is obtained can be obtained from a culture of the CNCM 1-4844 strain carried out in the presence of crystalline cellulose.
  • this multi-enzymatic preparation containing a secretory fraction of the Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 strain, it comprises at least one cellobiohydrolase chosen from the enzymes of SEQ ID NO: 1, 2, 3 4 and 5, the cellobiose dehydrogenase of sequence SEQ ID NO: 6 and optionally at least one polysaccharide monooxygenase selected from the enzymes of SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 12 and 13 sequences or comprising the sequence SEQ ID NO: 11.
  • this multi-enzymatic preparation containing a secretory fraction of the Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 strain comprises the 12 enzymes of sequences SEQ ID NO: 1 to 10, 12, 13 and the enzyme comprising the sequence SEQ ID NO: 1 1.
  • Said fraction of the secretome of the strain Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 can be obtained by implementing methods known per se to those skilled in the art. For example, purification by exclusion chromatography, ion exchange, ammonium sulfate precipitation can be mentioned.
  • the subject of the present invention is also an isolated multi-enzymatic preparation comprising at least one cellobiohydrolase chosen from the enzymes of SEQ ID NO: 1, 2, 3 4, 5 and the enzymes having an amino acid sequence having at least 80 % identity with any one of SEQ ID NO: 1, 2, 3 4 or 5, a cellobiose dehydrogenase having an amino acid sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 6 , and optionally at least one monooxygenase polysaccharide chosen from the enzymes of sequences SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 12, 13 or comprising the sequence SEQ ID NO: 1 1 and the enzymes having an amino acid sequence having at least 80% identity with any of SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, January 1, 12 or 13.
  • this multi-enzymatic preparation comprises the 12 enzymes of SEQ ID NO: 1 to 10, 12, 13 and the enzyme comprising the sequence SEQ ID NO: 1 1.
  • the cellobiohydrolascs having an amino acid sequence having at least 80% identity with any one of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5 comprise the sequence SEQ ID NO: 14 and are preferably cellobiohydrolases of Laetisaria arvalis.
  • the sequence SEQ ID NO: 14 contains the conserved amino acids of cellobiohydrolases of the strain Laetisaria arvalis CNCM 1-4844.
  • the cellobiose dehydrogenase having an amino acid sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 6 comprises the sequence SEQ ID NO: 15 and is preferably a Laetisaria cellobiose dehydrogenase. arvalis.
  • the sequence SEQ ID NO: 15 contains the conserved amino acids of cellobiose dehydrogenases.
  • polysaccharide having a sequence of amino acids having at least 80% identity with any of SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, January 1, 12 and 13 comprise the sequence SEQ ID NO : 16 and are preferably polysaccharide monooxygenases of Laetisaria arvalis.
  • the sequence SEQ ID NO: 16 contains the conserved amino acids of the polysaccharide monooxygenases of the strain Laetisaria arvalis CNCM 1-4844.
  • the multi-enzymatic preparations according to the present invention as defined above can be used for the saccharification of lignocellulosic biomass, and in particular simultaneously or sequentially with the secretome of a T. reesei strain.
  • a multienzymatic preparation according to the invention, it contains a multienzymatic preparation as defined above mixed with the secretome of a strain of 71 reesei, and optionally a beta-glucosidase. .
  • Said strain of T. reesei may for example be a hypersecretory strain of lignocellulolytic enzymes such as one of the MCG77 strains. MCG 80, RUT C30, and CL847 mentioned above. It may also be a recombinant strain such as those described in International Applications WO 92/010581, WO 99/46362 or WO 2010/029259.
  • T. reesei secretome Methods of producing T. reesei secretome are well known to those skilled in the art. By way of example, mention may be made of the process described in Application FR 2 555 603.
  • the secretome of the CNCM 1-4844 strain or its fractions may be mixed with that of a T. reesei strain in proportions (by weight): CNCM I-4844 secretome proteins / T. reesei secretome proteins from 1/2 to 5/3.
  • these proportions range from 1/2 to 1/1.
  • the present invention also relates to a fermentable sugar production process, and in particular glucose, from a lignocellulosic substrate, characterized in that it comprises the hydrolysis of said substrate using a multi-enzyme preparation according to the invention, advantageously using a preparation containing the secretome of the strain CNCM 1-4844 or fraction mixed with secretome a T. reesei strain as defined above.
  • the lignocellulosic substrate may be derived from any material rich in iignocellulose, for example farm residues such as cereal straws, wood harvesting residues, materials from dedicated crops such as miscanthus and poplar, residues from the pulp and paper industry or any other cellulosic and lignocellulosic material processing industry.
  • this material Prior to hydrolysis, this material is pretreated, as described above, to obtain the lignocellulosic substrate on which the hydrolysis will be carried out.
  • the pretreatment is carried out in a manner known per se to those skilled in the art, for example according to one of the methods indicated above.
  • a particularly preferred pretreatment method is the steam explosion under acidic conditions.
  • the terms of the pre-treatment (amount of acid, pressure, and duration) are conventional conditions known in themselves in the art.
  • the enzymatic hydrolysis will generally be carried out at a temperature of 30 ° C to 50 ° C, preferably between 37 and 45 ° C, and at a pH generally between 4.5 and 5.5.
  • the reaction mixture contains from 1 to 20% by weight of lignocellulosic substrate solids, and the enzyme preparation according to the invention is used in a proportion of 5 to 30 mg per gram of substrate (by weight of dry matter).
  • the duration of the enzymatic hydrolysis may vary in particular according to the nature of the substrate and the amount of enzyme preparation used, and the temperature at which the reaction is carried out. It is generally from 24 to 120h, preferably 72h to 96h.
  • the monitoring of the hydrolysis can be carried out by assaying the reducing sugars released and glucose and xylose simple sugars.
  • the simple sugars obtained by the process according to the invention can be recovered from the hydrolyzate for later use.
  • the hydrolyzate can be used directly for the production of alcohol, especially ethanol, by fermentation in the presence of an alcoholic microorganism.
  • the subject of the present invention is therefore also a process for the production of alcohol, in particular ethanol, characterized in that it comprises the production, according to the invention, of a hydrolyzate containing fermented sugars from a lignocellulosic substrate. and the alcoholic fermentation of this hydrolyzate by an alcoholic microorganism.
  • the alcoholic fermentation can be carried out, following enzymatic hydrolysis, under standard conditions well known to those skilled in the art.
  • an alcoholic microorganism such as the yeast Saccharomyces cerevisiae or the bacterium Zymomonas mobilis is used, and the fermentation is carried out at a temperature preferably between 30 and 35 ° C.
  • the alcoholic fermentation can be carried out simultaneously with the enzymatic hydrolysis, according to a simultaneous saccharification and fermentation process known as the SSF method.
  • the operating conditions used in this case for enzymatic hydrolysis and alcoholic fermentation differ mainly from those indicated above by the temperature and the duration of the reaction.
  • the temperature is generally 28 to 40 ° C, and the reaction time is generally 50 h to 300 h.
  • Figure 1 Electrophoretic profiles of L. arvalis secretcomes CNCM 1-4844. SDS-PAGE (A) and CMC-zymogram (B). 20 ⁇ g of each secretome were loaded on gel. 1 -2. maltose; 3-4, MB; 5-6. AVI; 7-8, WS; 9-10, WS-R; M. size marker.
  • Figure 2 Characterization of the enzymatic activity of CAZymes present in L. arvalis CNCM 1-4844 secretomas and their potential to improve the conversion of pretreated wheat straw.
  • A Representation of the grouping of activities related to the degradation of lignocellulose in L. arvalis CNCM 1-4844 secretomas. The degree of activity on different substrates of L. arvalis CNCM 1-4844 secretomes obtained under culture conditions on AVI. WS, WS-R and MB, and T. reesei CL847 secretome is represented by a color scale with different shades of gray. This figure was obtained using the Multiexperiment Viewer software (Saeed et al., 2006). (B) Contribution of L.
  • arvalis CNCM 1-4844 secretomas to the saccharification of steamed wheat straw.
  • the hydrolysis of the biomass was carried out with the secretomas of L. arvalis CNCM 1-4844 obtained under culture conditions on AVI, WS, WS-R or MB respectively in association with the enzyme cocktail of T. reesei CL847.
  • the glucose released was quantified at the saccharification plateau corresponding to 30 ⁇ g of CL847 which represents the 100% sugar release activity (Navarro et al., 2010).
  • the values are the averages of six independent measurements.
  • Figure 3 Distribution of proteins identified by LC-MS / MS (CAZy annotation) in L. arvalis CNCM 1-4844 secretomas from different culture conditions (on maltose, MB, AVI, WS or WS-R).
  • A Venn diagram showing the distribution of secreted proteins among L. arvalis CNCM 1-4844 secretomas.
  • B enzyme distribution profile in secretomas of L. arvalis CNCM 1-4844. The size of the bar indicates the number of secreted proteins identified according to the class of enzyme (GI I. A A. PL, CE and non-CAZy proteins).
  • the fungal strains used in this study are stored on the MA2 (malt 2% w / v) agar slope for the L. arvalis CNCM 1-4844 strain, and on the MYA2 agar slope (2% malt extract and yeast extract). 0.1% w / v) for T. reesei strain QM6a.
  • the SP188 cocktail (Novozymes, Bagsvaerd, Denmark) rich in ⁇ -glucosidase activity is produced by an industrial strain of Aspergillus niger.
  • Cellulose growth and degradation tests The cellulose degradation tests by T. reesei QM6a and L. arvalis CNCM 1-4844 were carried out in minimal medium containing for IL: 10.72 g of K21 IP04, , 24 g KH2P04, 2g (NH4) 2S04, 0.5 ml of a solution of Iron (FeS04 1 mg in 1 ml 0.01 M HCl), l mL of a MgS04 solution (1M), 1 mL a solution of thiamine (1 mg / ml), 5 ml of a solution of trace elements (Takasuka et al, 2013).
  • IL 10.72 g of K21 IP04, , 24 g KH2P04, 2g (NH4) 2S04, 0.5 ml of a solution of Iron (FeS04 1 mg in 1 ml 0.01 M HCl), l mL of a MgS04 solution (1M), 1 mL a solution
  • a strip (10 cm x 1 cm) of filter paper (Whatman 3 M cellulose) is added as the sole source of carbon in 7 ml of minimum medium, inoculated with mycelial homogenates (5 plates of petri dish crushed in 1 ml of minimum medium) of each mushroom. The cultures are incubated for 15 days at 30 ° C. with shaking at 160 rpm. Crop conditions, and production of concentrated secretomes
  • Fungi cultures and the preparation of secretomas were performed as described by Couturier et al. (2012) using 15 gL- 1 of different inducing carbon substrates: avicel crystalline cellulose (AVI), wheat straw (WS), hydrolysis residue of wheat straw (WS-R), corn bran autoclavate (MB) ), or 20 gL "1 maltose (maltose) to the standard condition.
  • the cultures, made in duplicate, are stopped at 10 days after inoculation.
  • the supernatants are filtered through a 0.7 ⁇ g GF / F glass fiber membrane (Whatman).
  • the filtrates obtained are concentrated on a 10 kDa ultrafiltration membrane (po 1 y ether su 1 fone) (Sartorius Stedim, Aubagne, France) and then dialyzed in a buffer of 50 mM sodium acetate 14.8 (Sigma-Aldrich). .
  • the total proteins are assayed in each secretome by the Bradford reagent (Biorad, France). Concentrated secretomes are aliquoted and stored at -20 ° C.
  • the SDS-PAGE electrophoresis gels are prepared at 12% polyacrylamide, and 10 ng total proteins are used.
  • the protein bands are stained with Coomassie blue G250. Under denaturing conditions, the molecular weights are determined by comparison with the molecular weight standards provided by Amersham Pharmacia Biotech (Orsay, France). To visualize the protein bands possessing cellulase activities, 0.2% of CMC (CarboxyMethylCellulose) are incorporated in the gels before polymerization (Bey et al, 2011).
  • CMC CarboxyMethylCellulose
  • the secretomes containing the proteins, are mixed with the loading buffer (3% SDS w / v, 10% glycerol w / v and 30 mM Tris-IIC1 buffer pH 6.8) in the absence of reducing agent and then heated at 100 ° C for 1 minute. After electrophoresis, the gels are washed with deionized water and then saturated in a solution of Triton X-100 (2.5% v / v) for 1 hour at 4 ° C. For detection of cellulase activity, the gels are then saturated in sodium phosphate buffer (100 mM) at 45 ° C for 2 hours. After incubation, the gels are stained with Congo red (0.1%) for 1 hour, then decolorized with NaCl solution (1M) for 1 hour. The protein bands possessing cellulase activities are revealed by the absence of coloring.
  • the loading buffer 3% SDS w / v, 10% glycerol w / v and 30 mM Tris-
  • Laccase and CDH Activity Iaccase activity is determined according to the method described by Temp and Eggert (1999). The oxidation rate of a solution of 500 ⁇ ABTS (Sigma-Aldrich) is monitored at 420 nm in sodium tartrate buffer (50 mM) pH4 at 30 ° C and for 30 seconds. The CDH activity is determined by following the reduction of 0.2 mM 2.6-dichlorophenol indophenol (DCPIP, Sigma-Aldrich) in acetate buffer (0mM) pH 5, in the presence of cellobiose (1 OmM) as substrate. The DCPIP reduction is monitored spectrophotometrically at 520 nm for 1 minute (Bey et al, 201 1).
  • DCPIP 2.6-dichlorophenol indophenol
  • Enzymatic Hydrolysis of Wheat Straw The ability of the secretomes to hydrolyze wheat straw was tested on pretreated straw in industrial condition (vapor explosion at neutral pH), provided by IFPEN. It consists of 52% cellulose, 7% hemicellulose and 35% lignin.
  • the 96-well microplates were previously prepared as described in Navarro et al (2010).
  • the enzymatic solutions to be tested were deposited on the prepared plate, in addition to the E508 enzyme cocktail of T. reesei (30 g / mg), itself supplemented with ⁇ -glucosidase (SP188, 60 mU / mg). Secretomas are tested to their maximum amount, ie, each secretome.
  • the hydrolysis was carried out at 37 ° C.
  • the identification of the proteins is carried out by comparison of the peptides identified (in mass spectrometry) with the theoretical peptides obtained after trypsinolysis in silico of the transcriptomic data, carried out by the program X! Tandem Cyclone (http://www.thegpm.org). Only proteins with at least 2 identified unique peptides are validated.
  • the strain Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 was identified after selection of fungus strains for their ability to degrade the lignocellulosic biomass effectively.
  • the strain CNCM 1-4844 has also been selected for its ability to grow rapidly not only wheat straw (WS) but also a residue of wheat straw hydrolysis (WS-R) resulting from an explosion at the vapor under acidic conditions as well as for its saccharification capacity in association with a cocktail of enzymes of the strain Trichoderma reesei CL847 (Berrin et al., 2012).
  • the mycelium of L was identified after selection of fungus strains for their ability to degrade the lignocellulosic biomass effectively.
  • the strain CNCM 1-4844 has also been selected for its ability to grow rapidly not only wheat straw (WS) but also a residue of wheat straw hydrolysis (WS-R) resulting from an explosion at the vapor under acidic conditions as well as for its saccharification capacity in association with a cocktail of enzymes of the strain Tri
  • arvalis CNCM 1-4844 fully colonizes the wheat straw or the wheat straw residue after only 4 days of incubation when the CNCM 1-4844 strain is grown on a petri dish directly on the solid biomass alone. carbon source.
  • L. arvalis CNCM 1-4844 is also capable of growing and degrading cellulose completely from a minimal medium containing filter paper webs as the sole carbon source. By comparison, under these same conditions, the strain of Trichoderma reesei QM6a is able to grow on filter paper strips but no degradation is visualized after 10 days of incubation. Characterization of the enzymatic activity of the L.
  • arvalis secretcome CNCM 1-4844 The composition of the lignocellulose degradation system of the CNCM 1-4844 strain induced by different carbon sources (corn bran [MB], crystalline cellulose avicel [ AVI], wheat straw [WS] and residues of hydrolysis of wheat straw [WS-R]) was evaluated by SDS-PAGE zymogram analysis and by determining the activity of enzymes associated with degradation the plant cell wall.
  • Qualitative analysis of electrophoretic profiles of secreted CNCM 1-4844 secreted by using different carbon sources revealed good reproducibility between biological replicates ( Figure 1). These secretomas were therefore pooled for the remainder of the study.
  • Table 1 Main carbohydrate cleavage activities of T. reesei CL847 enzymatic cocktail and L. arvalis CNCM 1-4844 secretomas induced with avicel crystalline cellulose (AVI), corn bran (MB), straw wheat (WS), or residues of wheat straw hydrolysis (WS-R).
  • AVI avicel crystalline cellulose
  • MB corn bran
  • WS straw wheat
  • WS-R residues of wheat straw hydrolysis
  • the enzymatic activities are expressed in ⁇ Mg -1 , nd, no activity is detected, pG1c, para-nitrophenyl, -D-glucose, pLac, para-nitrophenyl-PD-lactose, pCel, para-nitrophenyl-PD- cellobiose, pCeI3, para-chlorophenyl- ⁇ -D-glucotriose, DCPIP, 2,6-dichlorophenol-indophenol, CMC, carboxymethyl cellulose, pXyl, para-nitrophenyl-PD-xylose, pAra, para-nitrophenyl- L-arabinose, pGal, para-nitrophenyl- [3-D-galactose, pMan, para-nitrophenyl-PD-mannose, BirchX, birch xylan, WheatX, wheat arabinoxylan, Mn Mannane, GalMan, Galactomannan, AraG
  • L. arvalis CNCM 1-4844 secretomas The ability of L. arvalis CNCM 1-4844 secretomas to improve the conversion of pretreated wheat straw was evaluated. Glucose release from steamed wheat straw was quantified at the saccharification plateau using the T. reesei CL847 enzymatic cocktail supplemented with ⁇ -glucosidase (SP188) as a reference. Experiments were performed using each L arvalis CNCM 1-4844 secretome in combination with the T. reesei CL847 enzymatic cocktail supplemented with ⁇ -glucosidase. Among the four secretomas tested, that induced in culture condition on AVI is distinguished from the others by the improvement of glucose release by 26% ( Figure 2).
  • L. arvalis CNCM 1-4844 produces an enzyme-rich secretome acting on cellulose, including seven polysaccharide monooxygenases (SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13). .
  • This secretome significantly stimulates the T. reesei enzymatic cocktail for biomass conversion.

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Abstract

L'invention est relative à une préparation multi-enzymatique contenant le sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844. Ce sécrétome qui contient notamment des cellulases, cellobiose déshydrogénases et xylanases, est utilisable pour la saccharification de substrats lignocellulosiques. en particulier en association avec le sécrétome de Trichoderma reesei.

Description

PRÉPARATION MULTI-ENZYMATIQUE CONTENANT LE SÉCRÉTOME
D'UNE SOUCHE DE LAETISARIA ARVALIS
La présente invention est relative à l'amélioration de la saccharification de la biomasse lignocellulosique.
La lignocellulose contenue dans la paroi secondaire des cellules végétales constitue l'un des principaux puits de carbone fixé lors de la photosynthèse. Elle présente un intérêt croissant en tant que matière première pour la production de divers produits chimiques, notamment des sucres simples fermentescibles résultant de l'hydrolyse (généralement dénommée saccharification) de ses constituants polysaccharidiques. Le principal produit de saccharification de la biomasse lignocellulosique est actuellement le glucose, qui peut être converti par fermentation éthanolique en éthanol utilisable comme biocarburant.
La lignocellulose est constituée principalement de trois types de polymères, en proportions variables selon les espèces de plantes : la cellulose, l'hémicellulose et la lignine. Ces constituants sont reliés entre eux par différents types de liaisons, covalentes et non- covalentes. La cellulose représente jusqu'à 45% du poids sec de la lignocellulose. Elle est composée de chaînes linéaires d'unités D-glucose reliées par des liaisons P-l ,4-glucosidiques, ces chaînes étant liées entre elles par des liaisons hydrogène ou des forces de van der Waals. Les hémicelluloses sont des hétéropolymères représentant 15 à 35% de la biomasse végétale, et contenant des pentoses (β-D-xyîose, α-L-arabinose), des hexoses (β-D-mannose, β-D-glucose, cx-D-galactose) et des acides uroniques. La lignine est un hétéropolymère complexe, constituée d'unités phénylpropane reliées entre elles par différents types de liaisons. La lignine est liée à la fois à l'hémicellulose et à la cellulose, les enrobant dans une structure tri-dimensionnelle complexe qui les rend peu accessibles à l'hydrolyse.
L'essentiel de l'énergie de la lignocellulose est stockée dans la cellulose, qui est difficile à hydrolyser en raison de sa structure hautement cristalline, ainsi que dans Γ hémicellulose, qui présente des difficultés pour la récupération de l'énergie, en raison de sa complexité et de la diversité structurelle (Foust. 2008). Le caractère réfractai re de la lignocellulose à l'hydrolyse enzymatique est également augmenté par la fraction de lignine, qui agit comme une barrière physique (Jouanin et Lapierre, 2012).
A l'heure actuelle, la voie considérée comme la plus prometteuse pour la saccharification de la lignocellulose est l'hydrolyse enzymatique, à l'aide d'enzymes produites par des micro-organismes cellulolytiques. notamment des champignons saprotrophes. Cette hydrolyse est précédée d'un prétraitement de la biomasse, ayant pour but de diminuer la complexité du réseau lignocellulosique, notamment en solubilisant la lignine et/ou hémicellulose, en diminuant la cristallinité de la cellulose ou en augmentant sa surface accessible à l'hydrolyse. Ce prétraitement peut être effectué par différentes techniques, telles que le broyage mécanique, la thermolyse, le traitement par un acide dilué, par une base, par un peroxyde ou F explosion à la vapeur (voir pour revue Hendriks et Zeeman, 2009).
Les champignons filamenteux sont parmi les agents de dégradation de la biomasse lignocellulosique les plus efficaces en raison de leur capacité à se développer dans des environnements riches en lignocellulose. Ils sont connus pour sécréter un large éventail d'enzymes actives sur les polysaccharides {Carbohydrate-Active Enzymes; CAZymes ; www.cazy.org) possédant des activités complémentaires incluant les glycoside hydrolases (GHs), les carbohydrate esterases (CEs) et les polysaccharide lyases (PLs) (Cantarel et al. , 2009) et des enzymes ayant des activités auxiliaires (AAs) (Lcvasseur et ai, 2013).
Le champignon filamenteux actuellement le plus utilisé dans l'industrie pour la bioconversion de la lignocellulose en sucres simples est l'ascomycète Trichoderma reesei. Son sécrétome (c'est-à-dire l'ensemble des enzymes excrétées par le champignon dans le milieu de culture) contient principalement trois types d'enzymes, dont l'activité complémentaire permet l'hydrolyse de la cellulose en glucose : des endoglucanases (EG ; EC 3.2.1 .4); des exoglucanases, comprenant notamment des cellobiohydrolases I et II (CBH ; EC 3.2.1.91 ) et des β-glucosidases (BGL ; EC 3.2.1 .21 ) (Herpoël-Gimbert et al , 2008; Peterson et Nevalainen, 201 1 ; Couturier et al., 2012).
Pour la saccharification de la lignocellulose, on utilise généralement la totalité du sécrétome, sous forme de cocktail enzymatique. La saccharification s'effectue par simple mise en contact du matériau lignocellulosique prétraité avec ce cocktail enzymatique, et incubation, dans les conditions de température et de pH optimales pour les enzymes concernées pendant une durée variable selon la nature du matériau lignocellulosique concerné et la quantité d'enzymes utilisée.
Le principal intérêt de T. reesei réside dans sa capacité à sécréter des quantités très importantes d'enzymes. Des souches de T. reesei hypersécrétrices d'enzymes lignocellulolytiques ont été produites par mutagénèse et leur sécrétome est actuellement utilisé pour la saccharification de la lignocellulose. Parmi ces souches, on citera notamment les souches MCG77 (Brevet US 4 275 167), MCG 80 (Allen et Andreotti, 1982), RUT C30 (Montenecourt et Evclcigh. 1977) et CL847 (Warzywoda et al , 1983). L'analyse gcnomique de T. reesei a révélé que son activité d'hydrolyse repose sur un ensemble réduit d'activités enzymatiques (Martinez et al , 2008) qui dépend principalement de cellulases produites à des concentrations élevées (Peterson et Nevalainen. 201 1) mais qui est particulièrement pauvre en enzymes auxiliaires, le., hémicellulases, pectinascs, carbohydratc oxydascs et lignine oxydases classées dans les familles AA (Levasseur et al. , 2013).
Il apparaît donc nécessaire d'améliorer le cocktail enzymatique issu de T. reesei en le complétant avec des activités enzymatiques complémentaires.
Une des approches proposées pour améliorer ce cocktail consiste à rechercher d'autres champignons cellulolytiques. dont le sécrétome contiendrait des activités enzymatiques capables de complémenter celles qui apparaissent insuffisantes chez T. reesei, et de permettre d'obtenir une saccharification plus efficace. Par exemple, certains des Inventeurs ont identifié une souche à' Aspergillus japonicus répondant à ces critères, et permettant notamment, lorsque son sécrétome est utilisé en combinaison avec celui de T. reesei, d'augmenter significativement la production de glucose (Demande Internationale WO 2014/037925).
Il existe cependant un besoin d'identifier d'autres champignons capables d'apporter une amélioration au cocktail enzymatique de T. reesei pour l'hydrolyse de la biomasse lignocellulosique.
Dans ce contexte, les Inventeurs ont identifié une souche de Laetisaria arvalis (Aphyllophorales, Corticiaceae) qui a été sélectionnée pour ses capacités de croissance remarquables sur de la biomasse lignocellulosique récalcitrante à la dégradation enzymatique. L. arvalis est un champignon basidiomycète tellurique qui a été très peu étudié à l'exception de quelques études qui le décrivent comme un possible agent de lutte biologique contre les espèces Rhizoctonia solani et Pythium (Burdsall et al , 1980 ; Odvody et al , 1980).
Cette souche de L. arvalis, dénommée CIRM-BRFM 514, a été déposée selon le traité de Budapest le 21 mars 2014 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 25 rue du Docteur Roux. Paris, sous le numéro CNCM 1-4844. De manière surprenante, cette souche présente une activité cellulasique sept fois supérieure à celle du cocktail industriel de T. reesei. En outre, des essais d'hydrolyse de biomasse lignocellulosique (paille de blé prétraitée) utilisant un cocktail enzymatique produit par la souche industrielle T. reesei CL847 complémenté par les protéines de cette souche CNCM 1-4844 ont montré une augmentation de 20% de la production de glucose. De plus, les inventeurs ont identifié 13 enzymes présentes dans des sécrétomes de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 qui sont particulièrement intéressantes pour l'hydrolyse de la biomasse lignocellulosique. Ces 13 enzymes sont les cellobiohydrolases (GH7 CBH) de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 4 et 5, la cellobiose déshydrogénase (CDH) de séquence SEQ ID NO : 6 et les polysaccharide monooxygénases (PMO) de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 1.
La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 pour l'obtention d'une préparation multi-enzymatique contenant des cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1.99.18) et xylanases (EC 3.2.1.8), et éventuellement contenant en outre des hémicellulases, carbohydrate oxydases, ligninases (toutes trois appartenant aux familles AA), endoglucanases (EC 3.2.1 .4), cellobiohydrolases (EC 3.2.1 .91 et EC 3.2.1.176), β-glucosidases (EC 3.2.1.21 ). endo-β-1 ,4-mannanases (EC 3.2.1 .78), a-L-arabinofurano- sidases (EC 3.2.1 .55), laccases (EC 1.10.3.2), glucose oxydases (EC 1.1 .3.4), aryl alcool oxydases (EC 1.1.3.7) et/ou pectinases, de préférence contenant des cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1 .1.99.18), xylanases (EC 3.2.1.8). ce 11 ob i ohy d ro 1 ases (en particulier les GI 17 CBH de séquences SEQ ID NO : 1 , 2. 3 4 et 5) et une cellobiose déshydrogénase (en particulier la CDU de séquence SEQ ID O : 6). de préférence encore contenant des cellulases (EC 3.2.1 .4). cellobiose déshydrogénases (EC 1.1 .99.18), xylanases (EC 3.2.1.8). cellobiohydrolases (en particulier les GH7 CBH de séquences SEQ ID NO : 1. 2, 3 4 et 5), une cellobiose déshydrogénase (en particulier la CDH de séquence SEQ ID NO : 6) et des polysaccharide monooxygénases (en particulier les PMO de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9. 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 1 ).
Plus spécifiquement la présente invention a pour objet une préparation multi- enzymatique isolée contenant des cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1 .1 .99.18) et xylanases (EC 3.2.1.8), et éventuellement contenant en outre des hémicellulases, carbohydrate oxydases, ligninases (toutes trois appartenant aux familles AA), endoglucanases (EC 3.2.1.4), cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91 et EC 3.2.1.176). β-glucosidases (EC 3.2.1.21), endo-β-1 ,4-mannanases (EC 3.2.1.78), a-L-arabinofurano- sidases (EC 3.2.1.55), laccases (EC 1.10.3.2). glucose oxydases (EC 1.1 .3.4), aryl alcool oxydases (EC 1 .1 .3.7) et/ou pectinases. contenant le sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844.
Selon un mode de réalisation préféré de cette préparation multi-enzymatique, elle comprend outre des cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1 .1.99.18) et xylanases (EC 3.2.1.8), au moins une cellobiohydrolase (GH7 CBH) choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 4 et 5, la cellobiose déshydrogénase (CDU) de séquence SEQ ID NO : 6 et éventuellement au moins une polysaccharide monooxygénase (PMO) choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 7, 8. 9. 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 1.
Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit sécrétome est susceptible d'être obtenu à partir d'une culture de la souche CNCM 1-4844 effectuée en présence d'une source de carbone (e.g., un polysaccharide) inductrice de la production d'enzymes lignocellulolytiques, contenant avantageusement de la cellulose, telle que de la cellulose cristalline (e.g. , cellulose cristalline avicel).
Des sources de carbone inductrices préférées sont choisies parmi les pailles ou les sons de céréales, et/ou leurs fractions autoclavé(e)s ou non. Lesdites fractions comprennent les résidus de paille explosée à la vapeur ou non, la lignocellulose ou un polysaccharide tel que la cellulose, le xylane, le mannane. le maltose et la pectine. Avantageusement, on peut utiliser de la paille ou du son de maïs, de blé ou d'orge (qui peut être autoclavé ou non), du bois etc., ou un mélange de paille ou de son de différentes céréales et ou de leurs fractions ou résidus. Une source de carbone inductrice particulièrement préférée est le papier filtre de cellulose.
Lorsque la culture de la souche CNCM 1-4844 est effectuée en présence de maltose, le sécrétome de ladite souche contient des cellulases (EC 3.2.1 .4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1 .99.18) et xylanases (EC 3.2.1.8).
Lorsque la culture de la souche CNCM 1-4844 est effectuée en présence de paille de blé (WS), de résidu d'hydrolyse de paille de blé (WS-R) ou d'un autoclavat de son de maïs (MB), le sécrétome de ladite souche contient outre lesdites cellulases (EC 3.2.1.4). cellobiose déshydrogénases (EC 1.1.99.18) et xylanases (EC 3.2.1.8), des cellobiohydro- lases (en particulier les GH7 CBH de séquences SEQ ID NO : 1. 2, 3, 4 et 5) et une cellobiose déshydrogénase (en particulier la CDU de séquence SEQ ID NO : 6).
Lorsque la culture de la souche CNCM 1-4844 est effectuée en présence de cellulose cristalline (avicel. AVI), le sécrétome de ladite souche contient outre lesdites cellulases (EC 3.2.1.4), cellobiose déshydrogénases (EC 1.1 .99.18), xylanases (EC 3.2.1.8), des cellobiohydrolases (en particulier les GH7 CBH de séquences SEQ ID NO : 1. 2, 3, 4 et 5), une cellobiose déshydrogénase (en particulier la CDH de séquence SEQ ID NO : 6) et des polysaccharide monooxygénases (en particulier les PMO de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10. 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 1 ). Les autres constituants du milieu de culture sont les constituants usuels des milieux pour la culture des basidiomycètes qui sont connus en eux-mêmes de Γ homme du métier. Classiquement, ces constituants peuvent comprendre outre la source de carbone, des minéraux, des oligo-éléments et des vitamines.
A titre d'exemple, un milieu de culture pour la souche CNCM 1-4844 comprend ou est constitué d'une source de carbone inductrice de la production d'enzymes lignocellulolytiques {e.g., maltose, autoclavat de son de maïs, paille de blé, résidu d'hydrolyse de paille de blé ou cellulose cristalline), d'agar-agar et de sels minéraux.
Avantageusement, la culture de la souche CNCM 1-4844 est effectuée en milieu liquide et comprend, outre la souche CNCM 1-4844, du maltose (par exemple à raison de 2,5 g.l"1 de maltose) et une source de carbone inductrice de la production d'enzymes lignocellulolytiques telle que du papier filtre de cellulose (contenant de la cellulose cristalline), un autoclavat de son de maïs, de la paille de blé ou des résidus d'hydrolyse de paille de blé (par exemple à raison 15 g.l"' basé sur la matière sèche).
Le sécrétome de la souche CNCM 1-4844 peut être obtenu à partir d'une culture de cette souche par simple séparation des cellules et du surnageant de culture, qui contient les protéines sécrétées. Ce surnageant peut être utilisé tel quel, ou après simple filtrat ion pour le débarrasser des débris cellulaires. Toutefois, il est généralement préférable de le concentrer par exemple par diafiltration. Les protéines constituant le sécrétome peuvent également être récupérées par précipitation au sulfate d'ammonium.
La présente invention a également pour objet une préparation multi-enzymatique isolée contenant une fraction du sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 tel que défini ci-dessus, comprenant une cellobiohydrolase (CBH ; EC 3.2.1.176), une cellobiose déshydrogénase (CDU ; EC 1.1.99.18) et éventuellement une polysaccharide monooxygénase (PMO ; appartenant à la famille AA9).
Avantageusement, ledit sécrétome à partir duquel ladite fraction est obtenue est susceptible d'être obtenu à partir d'une culture de la souche CNCM 1-4844 effectuée en présence de cellulose cristalline.
Selon un mode de réalisation préféré de cette préparation multi-enzymatique contenant une fraction du sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844, elle comprend au moins une cellobiohydrolase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 1 , 2, 3 4 et 5, la cellobiose déshydrogénase de séquence SEQ ID NO : 6 et éventuellement au moins une polysaccharide monooxygénase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 7, 8. 9, 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 11. Avantageusement, cette préparation multi-enzymatique contenant une fraction du sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 comprend les 12 enzymes de séquences SEQ ID NO : 1 à 10, 12, 13 et l'enzyme comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 1 .
Ladite fraction du sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 peut être obtenue en mettant en œuvre des méthodes connues en elles-mêmes de l'homme du métier. On peut citer par exemple la purification par chromatographie d'exclusion, échange d'ions, précipitation au sulfate d'ammonium.
La présente invention a également pour objet une préparation multi-enzymatique isolée comprenant au moins une cellobiohydrolase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 4, 5 et les enzymes présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 1 , 2, 3 4 ou 5, une cellobiose déshydrogénase présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6, et éventuellement au moins une polysaccharide monooxygénase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 12, 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 1 et les enzymes présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12 ou 13.
Avantageusement, cette préparation multi-enzymatique comprend les 12 enzymes de séquences SEQ ID NO : 1 à 10. 12, 13 et l'enzyme comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 1 .
Sauf précision contraire, l'alignement entre deux séquences peptidiqucs et le calcul des pourcentages d'identité sont effectués sur toute la longueur des séquences peptidiqucs à l'aide du programme d'ordinateur « needle » (NEEDLEMAN et WUNSCH. J. Mol. Biol, 48, 443-453, 1970) en utilisant les paramètres par défaut : « Matrix » : EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » : 0.5.
Avantageusement les cellobiohydrolascs présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4 ou 5 comprennent la séquence SEQ ID NO : 14 et sont de préférence des cellobiohydrolases de Laetisaria arvalis. La séquence SEQ ID NO : 14 contient les acides aminés conservés des cellobiohydrolases de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844.
Avantageusement, la cellobiose déshydrogénase présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 comprend la séquence SEQ ID NO : 15 et est de préférence une cellobiose déshydrogénase de Laetisaria arvalis. La séquence SEQ ID NO : 15 contient les acides aminés conservés des cellobiose déshydrogénases.
Avantageusement les polysaccharide monooxygénases présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 1 1, 12 et 13 comprennent la séquence SEQ ÏD NO : 16 et sont de préférence des polysaccharide monooxygénases de Laetisaria arvalis. La séquence SEQ ID NO : 16 contient les acides aminés conservés des polysaccharide monooxygénases de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844.
Les préparations multi-enzymatiques selon la présente invention telles que définies ci-dessus peuvent être utilisées pour la saccharification de la biomasse lignocellulosique, et notamment simultanément ou séquentiellement avec le sécrétome d'une souche de T. reesei.
En conséquence selon un mode de réalisation particulièrement préféré d'une préparation multienzymatique conforme à l'invention, elle contient une préparation multienzymatique telle que définie ci-dessus en mélange avec le sécrétome d'une souche de 71 reesei, et éventuellement une beta-glucosidase.
Ladite souche de T. reesei peut être par exemple une souche hypersécrétrice d'enzymes lignocellulolytiques telle que l'une des souches MCG77. MCG 80, RUT C30, et CL847 mentionnée ci-dessus. Il peut s'agir également d'une souche recombinante telle que celles décrites dans les Demandes Internationales WO 92/010581, WO 99/46362 ou WO 2010/029259.
Des méthodes de production du sécrétome de T. reesei sont bien connues en elles- mêmes de Γ homme du métier. A titre d'exemple, on citera le procédé décrit dans la Demande FR 2 555 603.
Le sécrétome de la souche CNCM 1-4844 ou ses fractions peut être mélangé avec celui d'une souche de T. reesei dans des proportions (en poids) : protéines du sécrétome de CNCM I-4844/protéines du sécrétome de T. reesei allant de 1/2 jusqu'à 5/3. Avantageusement ces proportions vont de 1/2 à 1/1.
La présente invention a également pour objet un procédé de production de sucres fermentescibles, et notamment de glucose, à partir d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse dudit substrat à l'aide d'une préparation multienzymatique conforme à l'invention, avantageusement à l'aide d'une préparation contenant le sécrétome de la souche CNCM 1-4844 ou ses fraction en mélange avec le sécrétome d'une souche de T. reesei telle que définie ci-dessus. Le substrat lignocellulosique peut être issu de n'importe quel matériau riche en iignocellulose, par exemple des résidus d'exploitation agricoles tels que les pailles de céréales, des résidus d'exploitation du bois, des matériaux issus de cultures dédiées telles que le miscanthus et le peuplier, des résidus de l'industrie papetière ou de toute autre industrie de transformation des matériaux cellulosiques et lignocellulosiques. Préalablement à l'hydrolyse, ce matériau est prétraité, comme décrit ci-dessus, pour obtenir le substrat lignocellulosique sur lequel sera effectuée l'hydrolyse. Le prétraitement est effectué de manière connue en elle-même de l'homme du métier, par exemple selon une des méthodes indiquées plus haut. Une méthode de prétraitement particulièrement préférées est l'explosion à la vapeur en conditions acides. Les conditions de ce prétraitement (quantité d'acide, pression, et durée) sont des conditions classiques, connues en elles-mêmes de l'homme du métier.
L'hydrolyse enzymatique sera généralement effectuée à une température de 30°C à 50°C, de préférence entre 37 et 45°C, et à un pH généralement compris entre 4,5 et 5.5.
Généralement le mélange réactionnel contient de 1 à 20% en poids de matière sèche de substrat lignocellulosique, et la préparation enzymatique conforme à l'invention est utilisée à raison de 5 à 30 mg par gramme de substrat (en poids de matière sèche).
La durée de l'hydrolyse enzymatique peut varier notamment selon la nature du substrat et la quantité de préparation enzymatique utilisée, et la température à laquelle est effectuée la réaction. Elle est généralement de 24 à 120h, de préférence 72h à 96h. Le suivi de l'hydrolyse peut être effectué par dosage des sucres réducteurs libérés et des sucres simples glucose et xylose.
Les sucres simples obtenus par le procédé conforme à l'invention peuvent être récupérés à partir de l'hydrolysat, en vue d'une utilisation ultérieure.
Alternativement, l'hydrolysat peut être utilisé directement pour la production d'alcool, notamment d'éthanol, par fermentation en présence d'un micro-organisme alcooligène.
La présente invention a donc également pour objet un procédé de production d'alcool, notamment d'éthanol, caractérisé en ce qu'il comprend la production, conformément à l'invention, d'un hydrolysat contenant des sucres fermentesciblcs à partir d'un substrat lignocellulosique. et la fermentation alcoolique de cet hydrolysat par un microorganisme alcooligène.
La fermentation alcoolique peut être effectuée, à la suite de l'hydrolyse enzymatique, dans des conditions classiques bien connues de l'homme du métier. Généralement on utilise un microorganisme alcooligène tel que la levure Saccharomyces cerevisiae ou la bactérie Zymomonas mobilis, et la fermentation est effectuée à une température comprise de préférence entre 30 et 35°C.
Alternativement, la fermentation alcoolique peut être effectuée simultanément à l'hydrolyse enzymatique, selon un procédé de saccharification et fermentation simultanées dit procédé SSF. Les conditions opératoires mises en œuvre dans ce cas pour l'hydrolyse enzymatique et la fermentation alcoolique diffèrent principalement de celles indiquées ci-dessus par la température et la durée de la réaction. La température est généralement de 28 à 40°C, et la durée de la réaction est généralement de 50 h à 300 h.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non limitatifs illustrant les propriétés et la composition de sécrétomes de la souche CNCM 1-4844, ainsi que des figures annexées :
Figure 1 : Profils électrophorétiques des sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844. SDS-PAGE (A) et CMC-zymogramme (B). 20 μg de chaque sécrétome ont été chargés sur gel. 1 -2. maltose; 3-4, MB; 5-6. AVI; 7-8, WS; 9-10, WS-R ; M. marqueur de taille.
Figure 2 : Caractérisation de l'activité enzymatique de CAZymes présentes dans des sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844 et de leur potentiel à améliorer la conversion de la paille de blé prétraitée. (A) Représentation du groupement des activités liées à la dégradation de la lignocellulose dans les sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844. Le degré d'activité sur différents substrats des sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844 obtenues en conditions de culture sur AVI. WS, WS-R et MB, et du sécrétome de T. reesei CL847 est représenté par une échelle de couleurs avec différentes nuances de gris. Cette Figure a été obtenue à l'aide du logiciel Multiexperiment Viewer (Saeed et al.. 2006). (B) Contribution des sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844 à la saccharification de la paille de blé explosée à la vapeur. L'hydrolyse de la biomasse a été réalisée avec les sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844 obtenues en conditions de culture sur AVI, WS, WS-R ou MB respectivement en association avec le cocktail enzymatique de T. reesei CL847. Le glucose libéré a été quantifié au plateau de saccharification correspondant à 30 \xg de CL847 ce qui représente l'activité de libération de sucre à 100% (Navarro et al.. 2010). Les valeurs sont les moyennes de six mesures indépendantes.
Figure 3 : Distribution des protéines identifiées par LC-MS/MS (annotation CAZy) dans les sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844 à partir de différentes conditions de culture (sur maltose, MB. AVI, WS ou WS-R). (A) Diagramme de Venn montrant la distribution des protéines sécrétées parmi les sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844. (B) profil de distribution d'enzymes dans les sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844. La taille de la barre indique le nombre de protéines sécrétées identifiées selon la classe d'enzyme (GI I. A A. PL, CE et protéines non CAZy).
EXEMPLE : PROPRIÉTÉS ET COMPOSITION DES SÉCRÉTOMES DE LA SOUCHE CNCM 1-4844
Matériel et méthodes
Souches fongiques et cocktails enzvmatiques commerciaux
Les souches fongiques utilisées dans cette étude sont conservées sur pente gélosée MA2 (Extrait de malt 2% w/v) pour la souche de L. arvalis CNCM 1-4844, et sur pente gélosée MYA2 (Extrait de malt 2% et extrait de levure 0,1% w/v) pour la souche de T. reesei QM6a. Le cocktail ccllulolytique E508 XL-Pure, produit à partir de la souche industrielle de T. reesei CL847, a été obtenu auprès de l'Institut Français du Pétrole - Energies Nouvelles (IFPEN, France). Le cocktail SP188 (Novozymes, Bagsvaerd, Danemark) riche en activité β-glucosidase, est produit par une souche industrielle d'Aspergillus niger.
Croissance sur la biomasse et la cellulose
Tests de croissance sur différentes biomasses : Pour tester la capacité de la souche L. arvalis CNCM 1-4844 à croître en milieu solide sur paille de blé (WS) ou sur résidu de saccharification de paille de blé (WS-R), 5 g de biomasse sont stérilisés par autoclavage (30 min à 1 10°C) avant ajout de 15mL de milieu minimum (12 g/L NaN03, 2 g/L KH2P04;1 g/L KCL. 1 g/L MgS04) et 200 de solution de Vischniac (Vishniac and Santer, 1957). Les deux biomasses sont ensemencées avec des fragments mycéliens (5 rondelles de boite de Pétri broyées dans 1 mL de milieu minimum). Les cultures sont incubées 8 jours à 30°C en condition statique.
Tests de croissance et de dégradation de la cellulose : Les tests de dégradation de la cellulose par T. reesei QM6a et L. arvalis CNCM 1-4844 ont été réalisées dans du milieu minimum contenant pour I L : 10,72 g de K21 IP04, 5,24 g de KH2P04, 2g de (NH4)2S04, 0,5 mL d'une solution de Fer (1 mg FeS04 dans 1 ml HCI 0.01 M), l mL d'une solution de MgS04 (1M), 1 mL d'une solution de thiamine (lmg/mL), 5 mL d'une solution d'oligo- éléments (Takasuka et al , 2013). Une bandelette (10 cm x 1 cm) de papier filtre (cellulose. Whatman 3 M) est ajoutée comme seule source de carbone dans 7 mL de milieu minimum, inoculés avec les broyats mycéliens (5 rondelles de boite de Pétri broyées dans 1 mL de milieu minimum) de chaque champignon. Les cultures sont incubées durant 15 jours à 30°C sous agitation à 160 rpm. Conditions de cultures, et production des sécrétomes concentrés
Les cultures de champignons et la préparation des sécrétomes ont été effectuées comme décrit par Couturier et al. (2012) en utilisant 15 g.L"1 de différents substrats carbonés inducteurs : cellulose cristalline avicel (AVI), paille de blé (WS), résidu d'hydrolyse de paille de blé (WS-R), autoclavat de son de maïs (MB), ou 20 g.L"1 de maltose (Maltose) pour la condition standard. Les cultures, réalisées en duplicats, sont arrêtées à 10 jours après l'inoculation. Les surnageants sont filtrés au travers d'une membrane en fibre de verre GF/F de 0.7 μΜ (Whatman). Les filtrats obtenus sont concentrés sur membrane (po 1 y ether s u 1 fone) d'ultrafiltration de 10 kDa (Sartorius Stedim. Aubagne, France) puis dialyses dans un tampon Acétate de sodium 50 m M pi 14,8 (Sigma- Aldrich). Les protéines totales sont dosées dans chaque sécrétome par le réactif de Bradford (Biorad, France). Les sécrétomes concentrés sont aliquotés et conservés à -20°C.
S PS- PAGE et zymogramme
Les gels d'électrophorèse SDS-PAGE sont préparés à 12% de polyacrylamide, et 10 ng de protéines totales sont utilisées. Les bandes protéiques sont colorées au bleu de Coomassie G250. En conditions dénaturantes, les masses moléculaires sont déterminées par comparaison aux étalons de masse moléculaire fournis par Amersham Pharmacia Biotech (Orsay, France). Pour visualiser les bandes protéiques possédant des activités cellulases, 0.2% de CMC (CarboxyMethylCellulose) sont incorporés aux gels avant polymérisation (Bey et al , 2011). Dans ce cas, les sécrétomes, contenant les protéines, sont mélangés au tampon de charge (3% SDS w/v, 10% glycérol w/v et 30 mM de tampon Tris-IICl pH 6,8) en l'absence d'agent réducteur, puis chauffés à 100°C pendant 1 minute. Après électrophorèse, les gels sont lavés à l'eau désionisée, puis saturés dans une solution de Triton X- 100 (2,5% v/v) pendant 1 heure à 4°C. Pour la détection d'activité cellulasc, les gels sont ensuite saturés dans un tampon sodium phosphate (lOOmM) pl i 5 à 45°C pendant 2 heures. Après incubation, les gels sont colorés au rouge Congo (0,1%) pendant 1 heure, puis décolorés avec une solution de NaCl (1M) pendant 1 heure. Les bandes protéiques possédant des activités cellulase sont révélées par l'absence de coloration.
Dosage des activités enzymatiques
Hydrolyse de substrats complexes : Pour chaque substrat utilisé, une suspension (ou solution) à 1% (w/v) dans un tampon acétate de sodium (50mM) pH4,8 est préparée, puis distribuée en microplaque 96 puits
Figure imgf000013_0001
Une gamme étalon de glucose (de 0 à 20mM) est additionnée dans la première colonne de la microplaque. Les plaques préparées sont congelées ainsi à -20°C jusqu'à leur utilisation. Les activités d'hydrolyse enzymatique sont réalisées avec un robot de criblage haut-débit (Freedom Evo TECAN, France) comme décrit par Navarro et al. (2010), utilisant 20 μΐ de chaque sécrétome, à différentes concentrations, pendant lh à 37°C sous agitation (1000 rpm). Les sucres réducteurs totaux, libérés par l'hydrolyse enzymatique, sont quantifiées par la méthode à l'acide di-nitro salicylique (DNS). Une unité d'enzyme est définie comme 1 μηιοΐε d'équivalent glucose libéré par m g de protéine et par minute.
Hydrolyse de substrats chromogéniques : Pour tous les substrats utilisés, les solutions sont préparées à 1 m M dans un tampon acétate (50mM) pH4,8 et distribuées en microplaque 96 puits (KK L/puits). Une gamme étalon de p-nitrophénol (de 0 à 0,2 mM) est additionnée dans la première colonne de la microplaque. Les plaques préparées sont ainsi congelées à -20°C jusqu'à leur utilisation. Les activités d'hydrolyse enzymatique sont réalisées avec 20 μΐ de chaque sécrétome, à différentes concentrations, pendant 30 minutes à 37°C sous agitation à 1000 rpm. Les réactions enzymatiques sont stoppées par l'ajout de 130 μΕ de tampon carbonate 1 M pH 1 1.5. Les quantités de p-nitrophénol libéré sont dosées au spectrophotomètre à 410 nm. Une unité d'enzyme est définie comme 1 μιηοΐε de p-nitrophénol libéré par mg de protéine et par minute. Sur le même principe, le substrat pCeî3 (Megazyme, Wicklow, Irlande) est utilisé selon les recommandations du fabricant.
Activité laccase et CDH : L'activité îaccase est déterminée selon la méthode décrite par Temp et Eggert ( 1999). La vitesse d'oxydation d'une solution de 500μΜ d'ABTS (Sigma-Aldrich) est suivie à 420nm dans du tampon sodium tartrate (50mM) pH4, à 30°C et pendant 30 secondes. L'activité CDH est déterminée en suivant la réduction de 0,2 mM 2.6-diehlorophénol indophénol (DCPIP, Sigma-Aldrich) dans du tampon acétate ( 0m M) pH 5, en présence de cellobiose ( 1 OmM) comme substrat. La réduction du DCPIP est suivie par spectrophotométrie à 520 nm pendant 1 minute (Bey et al, 201 1).
Hydrolyse enzymatique de la paille de blé : La capacité des sécrétomes à hydrolyser la paille de blé a été testée sur de la paille prétraitée en condition industrielle (explosion à la vapeur à pH neutre), fournie par l'IFPEN. Elle est constituée de 52% de cellulose, de 7% d'hémicellulose et de 35% de lignine. Les microplaques 96 puits ont été préparées préalablement comme décrit dans Navarro et al (2010). Les solutions enzymatiques à tester ont été déposées sur la plaque préparée, en complémentation du cocktail enzymatique E508 de T. reesei (30 g/mg), lui-même supplémenté en β-glucosidase (SP188, 60 mU/mg). Les sécrétomes sont testés à leur quantité maximale, soit 15 de chaque sécrétome. L'hydrolyse a été effectuée à 37°C sous agitation durant 24h. Après incubation, les échantillons ont été filtrés et les sucres réducteurs ont été quantifiés avec la méthode DNS. Les teneurs en glucose et xylose libéré sont dosées par chromatographie à échange d'ions (HPAEC-PAD, Dionex) sur une colonne CarboPac PA-1 (Dionex) selon la méthode décrite dans Couturier et al. (201 1 ).
Analyse protéomique semi-quantitative des sécrétomes concentrés : 20 x de protéines des sécrétomes sont insérés dans un mini-gel d'électrophorèse SDS-PAGE (4- 12% Bis-Tris, Invitrogen, France). Après une courte migration ( 1 cm), les protéines sont colorées au bleu de Coomassie (Bio-rad, Marnes-la-Coquette, France) puis récupérées en découpant 1 à 2 bandes de 2mm de largeur. Après une digestion trypsique standard, les extraits peptidiques obtenus sont séparés par CLITP sur colonne Cl 8, puis chaque peptide est analysé par spectrométrie de masse (Q-exactive, Thermo Scientific). Les peptides sont ionisés et détectés complets ou après fragmentation. L'identification des protéines est réalisée par comparaison des peptides identifiés (en spectrométrie de masse) aux peptides théoriques obtenus après trypsinolyse in silico des données transcriptomiques, réalisée par le programme X! Tandem Cyclone (http://www.thegpm.org). Seules les protéines avec au moins 2 peptides uniques identifiés sont validées.
Résultats
Croissance sur la biomasse et la cellulose
La souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 a été identifiée après sélection de souches de champignon pour leur capacité à dégrader efficacement la biomasse lignocellulosique. La souche CNCM 1-4844 a également été sélectionnée pour sa capacité à croître rapidement non seulement sur la paille de blé (WS) mais aussi sur un résidu d'hydrolyse de paille de blé (WS-R) résultant d'une explosion à la vapeur dans des conditions acides ainsi que pour sa capacité de saccharification en association avec un cocktail d'enzymes de la souche Trichoderma reesei CL847 (Berrin et al. , 2012). Le mycélium de L. arvalis CNCM 1-4844 colonise entièrement la paille de blé ou le résidu de paille de blé après seulement 4 jours d'incubation lorsque la souche CNCM 1-4844 est cultivée sur boite de pétri directement sur la biomasse solide comme seule source de carbone. L. arvalis CNCM 1-4844 est aussi capable de croître et de dégrader complètement la cellulose à partir d'un milieu minimal contenant des bandes de papier filtre en tant que seule source de carbone. Par comparaison, dans ces mêmes conditions, la souche de Trichoderma reesei QM6a est capable de croître sur des bandes de papier filtre mais aucune dégradation n'est visualisée après 10 jours d'incubation. Caractérisaîion de l 'activité enzymatique du sécrétome de L. arvalis CNCM 1-4844 La composition du système de dégradation de la lignocellulose de la souche CNCM 1-4844 induit par différentes sources de carbone (son de maïs [MB], cellulose cristalline avicel [AVI], paille de blé [WS] et résidus d'hydrolyse de paille de blé [WS-R]) a été évaluée par SDS-PAGE, analyse de zymogramme ainsi que par détermination de l'activité des enzymes liées à la dégradation de la paroi cellulaire végétale. L'analyse qualitative des profils électrophorétiques de sécrétomes de la souche CNCM 1-4844 induits en utilisant différentes sources de carbone a révélé une bonne reproductibilité entre les réplicats biologiques (Figure 1). Ces sécrétomes ont donc été mis en commun pour le reste de l'étude.
La croissance sur AVI et WS a donné les meilleurs rendements de sécrétion de protéines avec 71 et 74 mg de protéines totales par litre de culture, respectivement, alors qu'en condition de culture sur maltosc (contrôle) le rendement de sécrétion est de 0,8 mg de protéine totale par litre de culture.
Les activités des enzymes de la souche CNCM 1-4844 agissant sur la cellulose et rhémicellulose ont été mesurées dans chaque sécrétome et comparées au cocktail enzymatique industriel de T. reesei CL847. Les activités endoglucanase, cellobiohydrolasc (CB1 I) et xylanase maximales ont été mesurées en condition de culture sur AVI. tandis que les activités β-glucosidase, β-mannanasc et pectinase les plus élevées ont été mesurées en condition de culture sur WS, WS-R et MB respectivement (Figure 2). De manière surprenante les activités cellulase étaient jusqu'à 7,5 fois plus élevées que celles présentes dans le cocktail enzymatique industriel de référence de la souche T. reesei CL847 (voir Tableau 1 ci-dessous).
Tableau 1 : Principales activités de clivage des glucides du cocktail enzymatique de T. reesei CL847 et des sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844 induits avec de la cellulose cristalline avicel (AVI), du son de maïs (MB), de la paille de blé (WS) ou des résidus d'hydrolyse de paille de blé (WS-R). Les activités enzymatiques sont exprimées en IJ.mg"1. n.d., aucune activité n'est détectée. pGlc, para-nitrophényl^-D-glucose ; pLac, para- nitrophényl-P-D-lactose ; pCel, para-nitrophényl-P-D-cellobiose ; pCeI3, para-chloro- phényl-β-D-glucotriose ; DCPIP, 2,6-dichIoro-phénoI-indophénol; CMC, carboxyméthyl cellulose ; pXyl. para-nitrophényl-P-D-xylose ; pAra, para-nitrophényl- -L-arabinose ; pGal. para-nitrophényl-[3-D-galactose ; pMan, para-nitrophényl-P-D-mannose ; BirchX, Xylane de bouleau ; WheatX, arabinoxylane de blé ; M an. Mannane ; GalMan, Galactomannan ; AraGal, Arabinogalactan. T. reesei L, arvalis CNCM 1-4844
Substrat
CL847 MB AVI WS WS-R pGlc 0.22 ±0.00 0.04 ± 0.00 0.08 ± 0.00 0.26 ± 0.00 0.15 ±0.00 pLac 0.04 ±0.01 n.d. 0.05 ± 0.00 0.01 ± 0.00 0.02 ±0.01 pCel 0.06 ±0.00 n.d. 0.06 ±0.00 0.04 ± 0.00 0.02 ± 0.00 pCel3 10.46 ±0.53 0.86 ± 0.03 13.80 ±0.30 10.10 ±0.32 8.96 ± 0.33
DCPIP n.d. 0.06 ±0.11 0.84 ± 0.07 1.38 ±0.25 1.44 ±0.04
CMC 0.33 ± 0.02 n.d. 2.46 ± 0.08 0.93 ± 0.03 1.94 ±0.12
0.010 ±
Avicel 0.010 ±0.005 n.d. 0.075 ± 0.004 n.d.
0.003
pXyl 0.01 ±0.00 n.d. 0.01 ±0.00 0.01 ±0.00 n.d.
pAra 0.03 ± 0.00 0.48 ±0.01 0.01 ±0.00 0.09 ± 0.00 0.03 ±0.01 pGal n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
pMan n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
Pectine 0.12 ±0.00 6.73 ± 0.03 6.33 ±0.16 0.77 ± 0.06 3.06 ±0.09
BirchX 0.94 ±0.04 0.10 ±0.01 5.4 ±0.51 4.39 ±0.02 3.79 ±0.10
WhcatX 1.59 ±0.03 0.35 ±0.02 9.71 ± 0.80 5.93 ±0.61 6.78 ± 0.02
Man 0.01 ±0.00 0.06 ±0.01 1.63 ±0.08 1.10 ±0.04 3.23 ± 0.23
GalMan 0.02 ± 0.00 0.31 ± 0.06 3.99 ±0.03 2.22 ±0.10 6.88 ± 0.53
Arabinane 0.01 ±0.00 0.14 ±0.01 0.06 ± 0.02 0.23 ± 0.02 0.05 ±0.01
AraGal 0.01 ±0.00 0.11 ±0.05 n.d. n.d. n.d.
Laccase n.d. 0.04 ± 0.02 n.d. 0.01 ±0.00 n.d.
La capacité des sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844 à améliorer la conversion de la paille de blé prétraitée a été évaluée. La libération de glucose à partir de paille de blé explosée à la vapeur a été quantifiée au plateau de saccharification en utilisant le cocktail enzymatique de T. reesei CL847 supplémenté en β-glucosidase (SP188) comme référence. Des expériences ont été effectuées en utilisant chaque sécrétome de L arvalis CNCM 1-4844 en combinaison avec le cocktail enzymatique de T. reesei CL847 supplémenté en β-glucosidase. Parmi les quatre sécrétomes testés, celui induit en condition de culture sur AVI se distingue des autres par l'amélioration de la libération de glucose de 26% (Figure 2).
Analyse protéomique de sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844
Pour déterminer la composition des sécrétomes de L. arvalis CNCM 1-4844 pendant sa croissance sur maltose. MB. AVI, WS ou WS-R, une chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) a été réalisée sur 10 jours de culture. Dans l'ensemble, 171 protéines ont été détectées de manière certaine et identifiées par comparaison avec une base de données résultant du transcriptome de L. arvalis.
Les sécrétotnes des cinq conditions de culture diffèrent en taille de 22 protéines détectées pour la condition de culture sur maltose jusqu'à 129 protéines identifiées pour la condition de culture sur WS. Le rapport entre les protéines G H. AA, PL et CE était assez similaire entre les conditions de culture sur MB, AVI, WS et WS-R avec un ensemble de 12 protéines commun à tous les sécrétomcs (Figure 3) comprenant deux cel lobiohydrolases (GH7 CBI I) putatives et une oxydase à cuivre putative (AA5 1 ). Seules deux protéines étaient spécifiques à la condition de culture sur AVI alors que 13, 29 et 10 protéines étaient spécifiques aux conditions de culture sur MB, WS et WS-R respectivement (Figure 3). Il est intéressant de noter que (i) les cinq GH7 CBI I (SEQ ID NO : 1 , 2, 3 4 et 5) ont été identifiées avec la CDU (SEQ ID NO : 6) dans toutes les conditions de culture sauf sur maltose, (ii) les deux protéines identifiées uniquement dans les conditions de culture sur AVI sont de fonction inconnue, (iii) parmi les 12 protéines communes aux conditions de culture AVI, WS et WS-R, 7 présentent un module de liaison aux carbohydrates de la famille 1 (CBM 1 ) et (iv) la laccasc putative (AA1_1) n'a été identifiée que pour la condition de culture sur WS.
Pour la condition de culture sur AVI, L. arvalis CNCM 1-4844 produit un séc rétome riche en enzymes agissant sur la cellulose dont sept polysaccharide monooxygénases (SEQ ID NO : 7, 8. 9. 10, 1 1. 12, 13). Ce sécrétome stimule de façon significative le cocktail enzymatique T. reesei pour la conversion de la biomasse.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Préparation multi-enzymatique isolée contenant des cellulases, cellobiose déshydrogénases et xylanases, caractérisée en ce qu'elle contient le sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 susceptible d'être obtenu à partir d'une culture de ladite souche CNCM 1-4844 effectuée en présence d'une source de carbone inductrice de la production d'enzymes lignocellulolytiques.
2. Préparation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la source de carbone contient de la cellulose.
3. Préparation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite source de carbone inductrice est choisie parmi le papier filtre de cellulose, les pailles ou les sons de céréales et les fractions ou résidus de pailles ou sons de céréales, ou leurs mélanges.
4. Préparation multi-enzymatique contenant une fraction du sécrétome de la souche Laetisaria arvalis CNCM 1-4844 défini à l'une quelconque des revendications 2 ou 3, comprenant une cellobiohydrolase. une cellobiose déshydrogénase et éventuellement une polysaccharide monooxygénase.
5. Préparation selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une cellobiohydrolase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5, la cellobiose déshydrogénase de séquence SEQ ID NO : 6 et éventuellement au moins une polysaccharide monooxygénase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 7. 8, 9, 10, 12 et 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 1 .
6. Préparation multi-enzymatique comprenant au moins une cellobiohydrolase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5 et les enzymes présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 1. 2, 3, 4 ou 5, une cellobiose déshydrogénase présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6, et éventuellement au moins une polysaccharide monooxygénase choisie parmi les enzymes de séquences SEQ ID NO : 7. 8, 9, 10, 12, 13 ou comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 1 et les enzymes présentant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13.
7. Préparation multi-enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle contient en outre le sécrétome d'une souche de Trichoderma reesei.
8. Utilisation d'une préparation multi-enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la saccharification d'un substrat lignocellulosique.
9. Procédé de production de sucres fermentescibles à partir d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend Fhydrolyse dudit substrat à l'aide d'une préparation multienzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
10. Procédé de production d'alcool à partir d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend la production d'un hydrolysat contenant des sucres fermentescibles par un procédé selon la revendication 9, et la fermentation alcoolique dudit hydrolysat par un micro-organisme alcooligène.
1 1. Utilisation de la souche Laetisaria orvalis CNCM 1-4844 pour l'obtention d'une préparation multi-enzymatique contenant des cellulases, des ccllobiose deshydrogénases et des xylanases.
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