KR20220131858A - 신규 코니오차이타 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 높은 셀룰로스 분해 활성을 가지는 수탁번호 KACC 83039BP로 기탁된 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주, 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 이용한 셀룰로오스 분해방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주는 셀룰로스 분해효소를 생산할 수 있어서 셀룰로스 분해가 필요한 다양한 산업분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규 코니오차이타 속 균주 및 이의 용도{NOVEL CONIOCHAETA SP. MICROORGANISM AND USES THEREOF}
본 발명은 신규 코니오차이타 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은
셀룰로스(Cellulose) 분해 활성을 우수한 신규 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주 및 상기 균주를 이용한 셀룰로오스 분해방법에 관한 것이다.
미국과 EU 등 선진국은 향후 2017 ~ 2030년까지 휘발유 소비의 20 ~ 30%를 줄이고 바이오 연료 사용을 확대하겠다고 발표하였으며 현재 미국, 브라질과 같은 나라에서는 자국의 풍부한 바이오매스인 사탕수수 또는 옥수수를 원료로 한 바이오 에탄올이 이미 상용화되어 수송용 대체연료로 상당량 이용되고 있다.
이에 따라 제2세대 에너지 원료로 목질계 바이오매스가 부상되고 있으며 목질계를 이용한 바이오연료 제조에 관심이 고조되고 있다. 목질계 바이오매스는 한 해 100 ~ 500억 톤 정도 발생하고 재생 가능한 자원이라는 장점이 있지만, 성장 속도가 느리고 리그닌과 결합되어 있는 셀룰로스의 분해가 어렵다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 고효율의 셀룰로스 분해효소 개발연구는 필히 필요하며, 5 ~ 10년 내에 상용 가능할 것으로 기대되어 잠재력이 매우 큰 시장이라 할 수 있겠다. 특히, 바이오에너지 생산과정에 사용되는 당화효소는 세계 산업용 효소 시장의 11%를 형성하고 있어 목질 셀룰로스 분해효소의 가치가 새롭게 대두되고 있다.
셀롤로스란 β-(1, 4)-결합의 D-포도당 유닛으로 구성된 다당류를 말한다. 이는 식물 세포벽에서 주요한 구성 요소이자 지구상에 존재하는 가장 풍부한 탄소원이기도 하다. 미생물에 의해 셀롤로스를 분해한다는 것은 지구 탄소 재활용에 있어 중요한 사안이다. 셀롤로스 분해 미생물들은 엔도글루카나아제, 엑소글루카나아제, 베타-글루코시다아제, 및 보조적 효소들을 생산함으로써 셀룰로스의 β-1,4-글룰코시드 결합을 시너지 효과를 일으키며 포도당으로 효과적으로 분해한다. 이들 효소들은 종종 탄수화물 결합 도메인(carborhydrate binding domain; CBD)라고 칭해지는 부속적 모듈을 포함한다. CBD의 주 역할은 셀룰라아제의 촉매적 도메인을 좀 더 근접하게 셀룰로스 표면으로 이송함으로써 효과적 가수분해를 일으키는 데에 있다.
셀롤로스 분해효소들은 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 페니실리움 퍼니커로섬(Penicillium funiculosum) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)와 같은 균류를 이용한 실증형이나 상용화 규모로 생산되고 있다. 이 외에도 악시도더머스 셀루로이티커스(Acidothermus cellulolyticus ), 마이크로 모노스포라 비스포라(Micro monospora bispora), 바실러스(Bacillus) 속, 사이토페가(Cytophaga) 속, 스트렙토미스스 스텔코라리엄(Streptomyces stercorarium), 크로스트리디엄 더모셀럼(Clostridium thermocellum) 및 루미노코커스 앨버스(Ruminococcus albus) 등의 박테리아에서 생산되는 효소들이 이용될 수 있다.
이에 따라, 다양한 생물체로부터 분리된 셀룰라아제가 보고되고 있으며, 지금까지 셀룰라아제는 주로 세균과 곰팡이 등의 미생물로부터 분리된 것들이 많이 알려져 왔다. 이러한 셀룰라아제를 합성하는 유전자를 대장균에 재조합시켜 대량생산을 꾀하는 연구가 진행되고 있으나, 아직까지는 미흡한 단계에 있다(Eberhardt et al., Microbiology, 146:1999, 2000; Guiseppi et al., Mol . Microbiol , 2:159, 1988; Hagen et al., Gene, 150:163, 1994; Nakatani et al., Biosci . Biotechnol . Biochem, 64:1238, 2000; Takashima et al., J. Biotechnol , 67:85, 1999; Cornet et al., FEMS Miocrobiology Letters, 16:137, 1983; Gilkes et al., Journal of Biological chemistry, 259:10455, 1984).
이에, 본 발명자들은 높은 셀룰로오스 분해 활성을 가지는 신규 균주를 개발하고자 예의 노력한 결과, 신규 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주를 분리하고, 상기 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주가 높은 셀룰로스 분해 활성을 갖는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 셀룰로스 분해 활성을 가지는 신규 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주 및 그 배양액을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주의 배양을 통한 셀룰로스 분해효소의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조되는 셀룰로스 분해효소를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주, 상기 셀룰로스 분해효소 또는 상기 균주 배양액을 이용한 셀룰로스의 분해방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 셀룰로스 분해 활성을 가지는 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주(기탁번호: KACC 83039BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 i) 상기 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주를 배양하여 셀룰로스 분해효소를 생성시키는 단계; 및 ii) 상기 생성된 셀룰로스 분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰로스 분해효소의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주를 배양하여 얻은 셀룰로스 분해효소 및 셀룰로스 분해 활성을 가지는, 상기 균주의 배양액을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주, 상기 균주의 배양액 또는 배양 상층액을 포함하는 셀룰로스 분해용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주, 상기 셀룰로스 분해효소 또는 상기 균주의 배양액을 이용하여 셀룰로스를 분해하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주는 셀룰로스 분해 활성이 뛰어나, 목질바이오매스 효소 당화 뿐 아니라, 펄프·제지 산업, 세제공업, 농산물 가공 및 섬유 생산 등 다양한 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 신규 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주는 사과, 당근, 비트 및 혼합주스 등 다양한 과일음료 또는 채소음료에 포함된 당과 클로로겐 등 활성 성분을 장시간 동안 유지시킬 수 있어 다양한 과일음료 또는 채소음료 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주의 셀룰로스 분해 활성을 보여주는 그림이다.
도 2는 사과주스, 당근주스, 비트주스 및 혼합주스의 제조당일, 3일 후 및 10일 후 당과 클로로겐산의 함량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 사과주스, 당근주스, 비트주스 및 혼합주스에 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주(39)를 접종한 경우, 당과 클로로겐산의 함량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 사과주스, 당근주스, 비트주스 및 혼합주스에 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주(39)를 접종한 당일, 3일 후 및 10일 후 당과 클로로겐산의 함량 변화를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KACC 83039BP로 기탁된 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주를 제공한다.
본 발명에서는 상기 균주에 대해 염기서열을 분석하여 동정하였으며, 그 결과 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) 균주임을 확인하였으며, 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4라 명명하였고, 농업생명공학연구원에 2020년 12월 08일자에 기탁하여 2021년 01월 26일자로 기탁번호 KACC 83039BP를 부여받았다.
본 발명에서는 상기 균주에 대해 CMC 배지에 접종하여 배양한 후 Congo red로 염색하여 clear zone을 확인하여 셀룰로스 분해 활성을 확인하였으며, 그 결과 우수한 셀룰로스 분해 활성을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은
i) 상기 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주를 배양하여 셀룰로스 분해효소를 생성시키는 단계; 및
ii) 상기 생성된 셀룰로스 분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰로스 분해효소의 제조방법을 제공한다.
상기 배양은 셀룰로스(Cellulose), 글루코오즈(Glucose), 락토오즈(Lactose), 셀로바이오즈(Cellobiose), 카르복실메틸 셀루로오즈 나트륨(Carboxymethyl cellulose sodium salt; CMC), 자일란(Xylan), 볏짚, 아비셀(Avicel) 및 상수리로 구성된 군에서 선택되는 탄소원; 펩톤(Peptone), 이스트 익스트랙트(Yeast extract), 트립톤(Trypton), 콘 스팁 파우더(Corn steep powder), 요소(Urea), 이스트:펩톤=0.2:0.8 및 트립톤:이스트=0.7:0.3로 구성된 군에서 선택되는 질소원; 인산이수소칼륨(KH2PO4); 인산수소칼륨(K2HPO4); 및 황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 등을 포함하는 배지에서 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주를 배양하여 얻은 균주 배양액을 제공한다.
상기 균주 배양액은 셀룰로스 분해효소를 포함하고 있다.
또한, 본 발명은 상기 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주, 상기 균주의 배양액 또는 배양 상층액을 포함하는 셀룰로스 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주, 상기 셀룰로스 분해효소 또는 상기 균주의 배양액을 이용하여 셀룰로스를 분해하는 방법을 제공한다.
상기 셀룰로스는 셀룰로스 자체 뿐만 아니라, 볏짚, 목질계 바이오매스, 글루코오즈(Glucose), 락토오즈(Lactose), 셀로바이오즈(Cellobiose), 카르복실메틸 셀루로오즈 나트륨(Carboxymethyl cellulose sodium salt; CMC), 자일란(Xylan), 아비셀(Avicel) 및 상수리 등 셀룰로스를 함유하는 물질이나 재료를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 미생물 기탁
농업회사법인 배려이노베이션의 비트 주스에서 분리된 균주에 대해 염기서열을 분석하여 동정하였으며, 그 결과 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) 균주임을 확인하였으며, 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4라 명명하였고, 농업생명공학연구원에 2020년 12월 08일자에 기탁하여 2021년 01월 26일자로 기탁번호 KACC 83039BP를 부여받았다.
< 실시예 2> 미생물의 셀롤로스 (cellulose) 분해 활성 확인
Coniochaeta cipronana BRF-B4를 국립농업과학원 KACC에서 받아 본 실험에 사용하였다. 균주를 30℃에서 Tryptic Soy Agar(TSA)(Difco, Sparks, MD, USA)에 배양하였다.
Cellulose 분해 유무를 확인하기 위해, 1% Carboxymethyl cellulose sodium salt(CMC)(Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Shiheung, Korea) 함유 TSA를 만들었다. 단일 콜로니를 CMC 배지에 접종하여 30℃, 48시간 동안 배양하였으며 0.1% Congo red(Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Shiheung, Korea)로 염색하였다. 20분 후, 1M NaCl(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)로 15분 동안 세척하였고 균 주위의 clear zone을 확인하였다.
실험 결과, 콜로니 주위로 clear zone이 관찰되었다. 콜로니 지름에 대한 clear zone 지름의 비율은 1.75로 나타났다. 이 결과를 통해 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주는 cellulose를 분해하는 균주라는 것을 알 수 있었다(표 1 및 도 1).
클리어 존 직경과 콜로니 직경의 비율
Sample Coniochaeta cipronana BRF-B4
Clear zone (A, cm) 1.05
Colony (B, cm) 0.6
Ratio of clear zone to colony (A/B) 1.75
*직경의 길이는 평균값으로 표현되었음.
<실시예 3> 미생물의 클로로겐산 및 당 유지 활성 확인
<3-1> 시료의 준비
비트 1Kg을 깨끗한 물에 세척한 뒤 껍질을 벗기고 200℃에서 1분간 구운 후, 착즙기를 이용하여 착즙하여 비트 착즙액을 얻었다. 이후 5℃의 저장고에서 3일 동안 저온 숙성 과정을 거친 후, 당근즙 및 사과즙을 첨가해 잘 섞어 혼합물을 제조하였다. 이때, 저온 숙성 비트즙, 당근즙 및 사과즙은 2 : 2 : 6의 중량 비율로 혼합하여 혼합주스를 제조하였다.
또한, 비트, 사과 및 당근을 각각 1Kg을 깨끗한 물에 세척한 뒤 껍질을 벗긴 후, 착즙하여 비트주스, 사과주스 및 당근주스를 각각 제조하였다.
<3-2> 미생물의 처리
상기 혼합주스, 비트주스, 사과주스 및 당근주스 각각 100 mg에 Coniochaeta cipronana BRF-B4 균주(기탁번호 KACC 83039BP) 균주를 농도별(0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg 및 8 mg)로 첨가한 후, 제조당일(2021. 12. 24), 3일 후(2021. 12. 27) 및 10일 후(2022. 01. 03) 각각 LC/PDA를 통해 클로로겐산(Chlorogenic acid) 및 LC/RI를 통해 당(Fructose, Glucose, Sucrose) 성분을 분석하였다.
비교를 위해, 상기 혼합주스, 비트주스, 사과주스 및 당근주스 각각 100 mg에 균주를 첨가하지 않은 시료에 대해, 제조당일, 3일 후 및 10일 후 각각 LC/PDA를 통해 클로로겐산 및 LC/RI를 통해 당 성분을 분석하였다.
<3-3> 미생물 농도 변화에 따른 성분변화 분석
균주를 첨가하지 않은 혼합주스, 비트주스, 사과주스 및 당근주스는 3일까지 클로로겐산 및 당을 일정 수준으로 유지하다가 10일에는 클로로겐산 및 당이 약 70% 감소하는 것을 확인하였다(도 2).
반면, 균주를 첨가한 혼합주스, 비트주스, 사과주스 및 당근주스는 약간의 차이는 있으나 전체적으로 10일까지 클로로겐산 및 당을 거의 유지하고 있는 것을 확인하였다(도 3).
또한, 균주 농도별 큰 차이는 없었으나 전체적으로 10일까지 클로로겐산 및 당을 거의 유지하고 있는 것을 확인하였다(도 4).
농업생명공학연구원 KACC83039BP 20201208

Claims (5)

  1. 수탁번호 KACC 83039BP로 기탁된 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주.
  2. 제1항에 있어서, 셀룰로스 분해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주.
  3. 셀룰로스 분해 활성을 가지는, 제1항의 균주의 배양액.
  4. i) 제1항의 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주를 배양하여 셀룰로스 분해효소를 생성시키는 단계; 및
    ii) 상기 생성된 셀룰로스 분해효소를 회수하는 단계;를 포함하는,
    셀룰로스 분해효소의 제조방법.
  5. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액 또는 배양 상층액을 포함하는 셀룰로스 분해용 조성물.
KR1020220035435A 2021-03-22 2022-03-22 신규 코니오차이타 속 균주 및 이의 용도 KR20220131858A (ko)

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