SU798165A1 - Способ получени рибонуклеазы - Google Patents

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно, к способу получения рибонуклеазы.

Известен способ получения рибонук- , леазы, предусматривающий культивиро- . вание ее продуцента -. бактерий вида Bacillus subt-itis на питательной среде, содержащей источники азота, < фосфора, минеральные соли и крахмал.'. . в качестве источника углерода [11.

Недостатками известного способа являются низкая активность фермента и большая продолжительность процесса культивирования.

Цель изобретения - повышение ак- 15 тивности фермента и сокращение времени культивирования.

Указанная цель достигается тем, что в качестве продуцента рибонуклеазы из вида BaciKCus subtitis ис- 20 пользуют штамм Bacillus subtiEis ЦМПМ В - 1611. При этом культивирование продуцента осуществляют на пита тельной среде следующего состава, г/л: 25

Крахмал картофельный осахаренный 100-140

Гидролизат микробной биомассы 13-17

КСе или К₂50д. 0,27-0,33

2п9О₄ 0,009-0,011

Вода Остальное,

Штамм Bacittus subbiti^ ЦМПМ В — 1611 хранится в коллекции культур ВНИИ генетики й селекции.промышленных микроорганизмов.

Характеристика штамма.

Культурально-морфологические приз наки.

На сусло-мясо-пептонном агаре колонии довольно крупные, до 15 мм в диаметре, сухие,кожистые морщинистые, края колоний сильно изрезаны, поверхность колонии покрыта сероватобелым налетом, в агар колонии не врастают. На картофельном агаре пленка культуры тоньше и сильно врастает в агар. На ломтиках картофеля культура образует мощную пленку серого цвета, сильно складчатую. Выделяет значительное количество бурого пигмеи та, в ломти картофеля врастает слабо. Пузырьков со слизью нет. На пшеничных отрубях культура дает очень богатый рост в виде шаровидных серовато-белых скоплений по всей толщине среда. На глюкозном агаре культура растет по всему уколу с образованием газа.

Клетки поверхностной культуры соединены в длинные филаменты, при глу-. ' бинном культивировании встречаются’ как одиночные клетки, так и соединенные попарно или по четыре. Размер клеток; диаметр 0,6-0 ,Ijt, ,длина 1,5. Диаметр спор не превышает диаметра клетки, споры расположены эксцентрально, но ближе к центру, чем* резко отличаются от спор многих других штаммов того же вида, имеющих вид ''спичечной головки'¹.

Физиолого-биохимические свойства.

Молоко пептонизирует без подкисления. Желатину разжижает. Казеин и крахмал гидролизует.

Отношение к углеводам: арабинозу, галактозу, клюкозу, ксилозу,рамнозу, дульцит, маннит, сорбит, мальтозу, лактозу, сахарозу, декстрины, крахмал ассимилирует без предпочтения.

Нитраты восстанавливает.

На среде Кларка образует ацетилметилкарбинол.

Хорошо растет при 25-42°С, оптимальная температура роста 37°С.

Культура является аэробом, в отсутствии кислорода подвергается ’'анаэробному лизису''.

При глубийном культивировании на питательных средах, содержащих органические источники углерода, азота и минеральные соли, штамм синтезирует следующие ферменты: комплекс бактериолитических ферментов, |3 глюканазу, маннаназу, хитиназу, нейтральную протеазу, РНКазу, сС-амилазу, каталазу.

Пример 1. 120 г картофельного крахмала,суспендируют в 500 мл водопроводной воды, добавляют 0,2 г амилосубти.цина ГЗХ и нагревают взвесь при постоянном перемешивании до 80°С, периодически проверяя реакцию крахмала с йодом. Осахаривание заканчивают по достижении красно-коричневой окраски.

В 500 мл водопроводной воды растворяют 0,3 г калйя сернокислого и 0,01 г сернокислого цинка, добавляют 15 г сухого ферментативного гидролизата биомассы метанокисляющих бактерий^тщательно ,размешивают полученную взвесь, затем добавляют раствор осахаренного крахмала, вновь перемешивают среду и устанавливают pH 6,8 с помощью 10% раствора НаОН. Питательную среду разливают по 100мл в колбы емкостью 750 мл и стерилизуют в течение часа при давлении 0,5ат, После охлаждения среду засевают водной суспензией поверхностной культуры В· subtit-js В-1611, выращенной на ломтях картофеля в течение суток при 37°С.

Колбы с засеянной средой инкубируют на качалке при 37^еС в течение 2 0ч· По.окончании инкубации pH культуральной жидкости 4,6 активность pH

Казы 5200 ед/мл. Активность фермента сохранялась в течение 10 дней при хранении культуральной жидкости при температуре 5°С.

Пример 2 . В чан оборудованный мешалкой и водяной рубашкой, наливают 75 л водопроводной воды и при перемешивании добавляют 18 кг картофельного крахмала и 60 г амилосубтилина ГЗХ. Суспензию крахмала нагревают при перемешивании до 75°С и выдерживают при этой температуре 10 мин до момента перехода крахмала в эритродекстрины. Раствор осахаренного крахмала передают в ферментер емкостью 250 мл вносят 0,2 л подсолнечного масла в качестве пеногасителя и стерилизуют компонент 30 мин при 135°С.

В чан с мешалкой наливают 45 л водопроводной воды, вносят 2 кг сухого ферментативного гидролизата БВК, 0,045 кг КСЕ и 0,0015 кг сернокислого цинка, тщательно размешивают : взвесь и передают в сателлит ферментера. (Стерилизуют 30 мин при 135°С.

После охлаждения до 60°С содержимое сателлита передают в ферментер, среду охлаждают до температуры 40°С, устанавливают pH 7 с помощью водного аммиака.

Питательную среду засевали водной суспензией культуры B-Subb-it-is В-1611, выращенной в колбе на пшеничных отрубях в течение 2 сут при 37°С.

Выращивание в ферментере проводят при 37 ± 1°С, постоянном перемешивание и аэрации 8-10 м ^/ч, продолжительность выращивания 18 ч. В процессе выращивания pH культуральной жидкости не регулируют. По окончании процесса pH культуральной жидкости составляет 4,3, активность pH Казы 6800 ед/мл, объем культуральной жидкости 150 л. Активность pH Казы в культуральной жидкости оставалась постоянной в течение 7 дней при 510°С.

Предлагаемый способ получения рибонуклеазы позволяет увеличить активность фермента в культуральной жидкости до 5200-6800 ед/мл, что в 3 раза выше по .сравнению с известным способом при одновременном сокращении продолжительности выращивания продуцента.

Claims (2)

1. Клетки поверхностной культуры сое динены в длинные филаменты, при глубинном культивировании встречаютс  как одиночные клетки, так и соединен ные попарно или по четыре. Размер клеток: диаметр О ,6-0 ,7ум, ,длина 1,5 . Диаметр спор не превышает д аметра клетки, споры расположены экс центрально, но ближе к центру, чем резко отличаютс  от спор многих других штаммов того же вида, имеющих ви спичечной головки . Физиолого-биохимические свойства Молоко пептонизирует без подкислени . Желатину разжижает. Казеин и крахмал гидролизует. Отношение к углеводам: арабинозу галактозу, клюкозу, ксилозу,рамнозу дульцит, маннит, сорбит, мальтозу, лактозу, сахарозу, декстрины, крахмал ассимилирует без предпочтени . Нитраты восстанавливает. На среде Кларка образует ацетилметил карбинол . Хорошо растет при 25-42°С, оптимальна  температура роста . Культура  вл етс  аэробом, в отсутствии кислорода подвергаетс  анаэробному лизису . При глубийном культивировании на питательных средах, содержащих органические источники углерода, азота и минеральные соли, штамм синтезирует следующие ферменты: комплекс бактериолитических ферментов, р глюканазу , маннаназу, хитиназу, нейт ральную протеазу, РНКазу, сС-амилазу каталазу. Пример 1. 120 г картофельного крахмала,суспендируют в 500 мл водопроводной воды, добавл ют 0,2 г амилосубти ина ГЗХ и нагревают взвес при посто нном перемешивании до периодически провер   реакцию крахмала с йодом. Осахаривание заканчивают по достижении красно-коричневой окраски. В 500 мл водопроводной воды раствор ют 0,3 г кали  сернокислого и 0,01 г сернокислого цинка, добавл ют 15 г сухого ферментативного гидролизата биомассы метанокисл ющих бактерий .тщательно ,размешивают полученную взвесь, затем добавл ют раствор осахаренного крахмала, вновь перемешивают среду и устанавливают рН 6,8 с помощью 10% раствора NaOH. Питательную среду разливают по 100мл в колбы емкостью 750 мл и стерилизуют в течение часа при давлении 0,5ат После охлаждени  среду засевают водной суспензией поверхностной куль туры В. Bubtit-is В-1611, вь1ращенной на ломт х картофел  в течение суток при 37С. Колбы с засе нной средой инкубиру ют на качалке при в течение 20ч по.окончании инкубации рН культураль ной жидкости 4,6 активность рН Казн 5200 ед/мл. Активность фермента сохран лась в течение 10 дней при хранении культуральной жидкости при температуре 5°С. Пример 2 . /В чан,оборудованный мешалкой и вод ной рубашкой, наливают 75 л водопроводной воды и при перемешивании добавл ют 18 кг картофельного крахмала и 60 г амилосубтилина ГЗХ. Суспензию крахмала нагревают при перемешивании до 75°С и выдерживают при этой температуре 10 мин до момента перехода крахмала в эритродекстрины. Раствор осахаренного крахмала передают в ферментер емкостью 250 мл внос т 0,2 л подсолнечного масла в качестве пеногасител  и стерилизуют компонент 30 мин при 135с. В чан с мешалкой наливают 45 л водопроводной воды, внос т 2 кг сухого ферментативного гидролизата БВК, 0,045 кг КСЕ и 0,0015кг сернокислого цинка, тщательно размешивают ; взвесь и передают в сателлит ферментера . (Стерилизуют 30 мин при 135°С. После охлаждени  до содержимое сателлита передают в ферментер, среду охлаждают до температ фы , устанавливают рН 7 с помощью водного аммиака. Питательную среду засевали водной суспензией культуры В.subtitle В-1611, выращенной в колбе на пшеничных отруб х в течение 2 сут при . Выращивание в ферментере провод т при 37 ± 1°С, посто нном перемешивание и аэрации 8-10 , продолжительность выращивани  18 ч. В процессе выращивани  рН культуральной жидкости не регулируют. По окончании процесса рН культуральной жидкости составл ет 4,3, активность рН Казы 6800 ед/мл, объем культуральной жидкости 150 л. Активность рН Казы в культуральной жидкости оставалась посто нной в течение 7 дней при 5Предлагаемый способ получени  рибонуклеазн позвол ет увеличить активность фермента в культуральной жидкости до 5200-6800 ед/мл, что в 3 раза выше по .сравнению с известным способом при одновременном сокращении продолжительности выращивани  продуцента. « Формула изобретени  1, Способ получени  рибонуклеазы., предусматривающий культивирование ее продуцента - бактерий вида Вас 1 lus 5иЪЪ1Е1в на питательной среде, содерЖсццей источники азота, фосфора, минеральные соли и крахмал в качестве источника углерода, отличающ и и с   тем,что,с целью повышени  активности фермента и сокращени  времени культивировани ,в качестве продуцента рибонуклеазы. из вида BaciE.-

   Eu5 subtitle используют штамм Ъак л E-US c,.i5ЦМПМ В-1611.
2. 2. Способ по п. 1,отлича ющ и и с   тем, что культивирование продуцента осуществл ют на питательной среде следующего состава, г/л:

   Крахмал картофельный

   осахаренный100-140

   Гидролизат микробной

   13-17 0,27-0,33 0,009-0,011 Остальное

   Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

   l.NisVtimura S.Bacittus t-ibonucbease Proceedings in nucteic acid re5eqrc1i Ne w jork-l.ohdott,1966.56-63.