CZ282712B6 - Způsob submerzní kultivace buněk produkujících G-penicilin amidasu - Google Patents
Způsob submerzní kultivace buněk produkujících G-penicilin amidasu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ282712B6 CZ282712B6 CZ941616A CZ161694A CZ282712B6 CZ 282712 B6 CZ282712 B6 CZ 282712B6 CZ 941616 A CZ941616 A CZ 941616A CZ 161694 A CZ161694 A CZ 161694A CZ 282712 B6 CZ282712 B6 CZ 282712B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- concentration
- cultivation
- weight
- pag
- source
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 title claims abstract description 9
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 title claims abstract description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical class N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 9
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 6
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 6
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 claims description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 claims description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical class [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical class [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 102100026066 Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Human genes 0.000 description 27
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 14
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 7
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 7
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- -1 sucrose) Chemical class 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 101150089457 PAG gene Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 2-phenylacetic acid Chemical compound O[14C](=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000025174 PANDAS Diseases 0.000 description 1
- 208000021155 Paediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005275 alloying Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- NNQIJOYQWYKBOW-UHFFFAOYSA-N desacetoxycephalosphorin G Natural products S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C12 NNQIJOYQWYKBOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Způsob submerzní kultivace buněk produkujících G-penicilin amidasu v minerální živné půdě obsahující jako zdroj asimilovatelného uhlíku zkvasitelný sacharid a jako zdroj dusíku anorganickou sůl a minerální živné soli,který spočívá v tom,že se v průběhu kultivace kmene mikrorgasmu,zvláště Escherichia coli obsahující rekombinované plasmidy,přidává zkvasitelný sacharid v dávkách odpovídajícícg koncentraci 0,01% až 3% nebo kontinuelně v závislosti na spotřebě sacharidu,za současné úpravy pH v rozmezí 6,0 až 7,5 s výhodou 6,4 až 7,0 přídavkem alkálií,při zvýšeném pH 7,3 až 8,0 na počátku kultivace.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu submerzní kultivace buněk s aktivitou G-penicilin amidasy, zejména buněk obsahujících plasmidy nesoucí gen pro syntézu G-penicilin amidasy.
Dosavadní stav techniky
G-penicilin amidasa (dále jen PAG) hydrolyzuje amidickou vazbu G penicilinu (benzylpenicilin) na 6-aminopenicilánovou kyselinu (6-APK), popřípadě amidickou vazbu deacetoxycefalosporinu G (N-fenylacetyl-7-aminodeacetoxycefalosporánová kyselina) na 7-aminocefalosporánovou 15 kyselinu (7-ADCK).
Jsou známy postupy kultivace bakterií s aktivitou PAG využívající komplexní složky živných půd jako kvasničné a kukuřičné extrakty, různé bílkovinné hydrolyzáty v kombinaci s induktorem enzymu - fenyloctovou kyselinou (patentový spis NSR č. 1 114 766, britské 20 patentové spisy č. 954 449 ač. 1 015 554). Použití komplexního média v kombinaci s glukosou a fenyloctovou kyselinou je uváděno též pro kultivaci kmenů nesoucí gen pro PAG na rekombinovaných plasmidech (Robas asp. Biotechnol. Bioeng. 41, 14-24, 1993; Lee aChang Biotechnol. Lett. 10, 787-792, 1988).
Použití syntetické, chemicky definované živné půdy, obsahující anorganický zdroj dusíku a jako zdroj uhlíku zkvasitelný sacharid (např. sacharosu), který je možno během fermentace přidávat ve více dávkách, pro kmeny s aktivitou PAG uvádí čs. autorském osvědčení č. 151 240. Je známo, že i za použití chemicky definovaných půd je však rychlost syntézy PAG značně zvýšena přídavky induktoru fenyloctové kyseliny, zejména při použití fenyloctové kyseliny jako jediného 30 zdroje uhlíku (Vojtíšek a Slezák, Folia Microbiol. 20, 289-297, 1975; Babu a Panda, Bioprocess Eng. 6,71-74, 1991).
Vzhledem ktomu, že syntéza PAG podléhá katabolické represi glukosou (ev. jinými sacharidy) a parciální represi acetátem, vznikající též při utilizaci glukózy (Vojtíšek a Slezák, Folia 35 Microbiol. 20, 298-306, 1975), byly v minulosti připraveny různé regulační mutantní kmeny méně citlivé ktéto represi (Robas asp., Biotechnol. Bioeng., 41, 14-24, 1993; čs. autorské osvědčení č. 188 631). Specifická aktivita PAG však bez fenyloctové kyseliny nedosáhla vysokých hodnot (40 U.g'1 suché hmoty buněk) (Vojtíšek a Slezák, Folia Microbiol. 20, 289-297, 1975). Rekombinantní kmeny připravené z těchto mutantních kmenů jsou rovněž méně citlivé ke 40 katabolické represi a řada z nich, může syntetizovat PAG konstitutivně v nepřítomnosti fenyloctové kyseliny. Vlastnosti kmenů Escherichia coli nesoucí různé rekombinované plasmidy jsou uvedeny v čs. patentových spisech č. 278 516 a 278 847.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je způsob submersní kultivace buněk produkujících G-penicilin amidasu (PAG), zejména buněk Escherichia coli, obsahujících rekombinované plasmidy v minerální živné půdě obsahující jako zdroj asimilovatelného uhlíku zkvasitelný sacharid ajako zdroj dusíku 50 anorganickou sůl a minerální živné soli, který spočívá v tom, že se na počátku kultivace produkčního mikroorganismu v živné půdě obsahující rozpustné soli vápníku v koncentraci Ca2.10‘5 až 0,1 % hmotn. a/nebo uhličitan vápenatý v koncentraci 0,05 až 1 % hmotn. a rozpustné soli hořčíku v koncentraci Mg 0,001 až 0,05 % hmotn. upraví pH na hodnotu 7,3 až 8,0 a potom v průběhu kultivace se udržuje pH na hodnotě 6,0 až 7,5 za současného přidávání
- 1 CZ 282712 B6 zkvasitelného sacharidu v dávkách o koncentraci 0,01 až 3 % hmotn. a anorganického zdroje dusíku v množství, odpovídajícím koncentraci v mediu 0,01 až 3 % hmotn. zejména hydroxidu amonného. Vynález se týká kultivace zejména buněk obsahujících rekombinované plasmidy nesoucí gen pro PAG. Tyto rekombinantní kmeny produkují většinou PAG i bez přídavku fenyloctové kyseliny při současně snížené represi syntézy PAG zdroji uhlíku (např. glukosa, sacharosa, glycerol). Tyto vlastnosti zvýhodňuje předmětný vynález vhodně řízenou kultivací k dosažení maximální produkce PAG. Způsob submersní kultivace spočívá v použití syntetických, chemicky definovaných půd, obsahujících utilizovatelný zdroj uhlíku, s výhodou sacharid, a anorganický zdroj dusíku, přičemž se oba v průběhu kultivace vzhledem k eventuální a částečné represi dávkují, aby bylo dosaženo vysoké koncentrace buněk s vysokou aktivitou PAG. Vzhledem ktomu, že během utilizace zdroje uhlíku vznikají organické kyseliny (např. octová kyselina), které snižují pH pod optimální hodnotu a tím negativně ovlivňují růst, je žádoucí současná regulace pH. Vzhledem k tomu, že brzká regulace pH může negativně ovlivnit produkci enzymu je výhodnější zvýšit startovací pH média a nebo přidat CaCO3, který zvyšuje pufrační kapacitu média. Pro produkci PAG je důležitá též vhodná koncentrace Mg2+iontů a nízká koncentrace Fe2+či Fe3+iontů. Výhodné je dávkovat zdroj dusíku ve formě hydroxidu amonného, čímž se současně udržuje optimální pH a potřebná hladina dusíku. Celý kultivační proces lze kombinovat sledováním parciálního tlaku kyslíku (pO2) vyregulovaného tak, že rychlý a náhlý vzrůst pO2 signalizuje zastavení růstu buněčné kultury z nedostatku zdroje uhlíku eventuelně dusíku. Po přidání další dávky potřebného zdroje a jeho pokračující utilizaci poklesne opět pO2. Tímto způsobem lze dosáhnout vysoké koncentrace buněk s vysokou aktivitou PAG (to jest vysoké celkové a specifické aktivity PAG) a tudíž značně zvýšit výtěžnost enzymu a získat kvalitní buněčný materiál.
Postup kultivace lze použít zejména pro kmeny Escherichia coli obsahující rekombinované plasmidy nesoucí PAG gen, jako jsou např. kmeny obsahující plasmidy podle čs. patentového spisu č. 278 516 a čs. patentového spisu č. 278 847. Stejně tak lze kultivační postup použít pro různé producenty PAG neobsahující rekombinované plasmidy, zvláště se sníženou katabolickou represí vůči použitému zdroji uhlíku a bez potřeby induktoru. S výhodou lze použít kmen Escherichia coli CCM 4228 obsahující rekombinovaný plasmid pKA18. Popsaným způsobem kultivace lze dosáhnout bez přítomnosti fenyloctové kyseliny značné produkce PAG, přičemž je eliminováno nebezpečí občasných lysí buněčné populace v provozním měřítku farmaceutického průmyslu, ke kterým docházelo při indukci PAG fenyloctovou kyselinou (pravděpodobná genetická souvislost uvolnění profága při intenzivním přepisu genů).
Množství PAG bylo určováno v buňkách promytých 0,1 M fosfátovým pufrem pH 8,0 měřením počáteční rychlosti hydrolýzy penicilinu G v 0,05 M fosfátovém pufru o pH 8,0 při teplotě 37 °C v oblasti kinetiky nultého řádu. Produkt reakce 6-APK byl stanoven spektrofotometricky za použití p-dimethylaminobenzaldehydu (Balasingham et al. Biochim. Biophys. Acta 276, 250260, 1972). Jedna jednotka je takové množství enzymu, které odpovídá tvorbě jednoho mikromolu 6-APK za minutu. Specifická aktivita je definována jako U.g'1 suché hmoty buněk.
Získanou suspenzi vysoce aktivních buněk lze použít buď ve formě separované buněčné pasty, nebo ve formě zahuštěné suspenze jako výchozí materiál pro výrobu imobilizovaných celých buněk či jejich částí po dezintegreci, nebo lze pastu či zahuštěnou suspenzi použít pro izolaci surového enzymu a jeho následnou imobilizaci a získat tak katalyzátory o vysoké aktivitě PAG s velkou účinností při štěpení G-penicilinu.
Dále je vynález doložen v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.
-2CZ 282712 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Byla připravena pevná a tekutá živná půda následujícího složení: 2 % glycerol,
0,4 % (NH4)2SO4, 1,36 % KH2PO4, 0,3 % NaOH, 0,001 % FeSO4.7H2O, 0,005 % CaCl2.6 H2O, 0,2 MgSO4.7H2O, pH 7,2-7,3; sterilizace 30 minut při 1,2 atm. Pro pevnou půdu bylo toto médium doplněno 1,5 % agaru. K tekuté i pevné půdě byl asepticky přidán kanamycin v koncentraci 35 pg-ml'1.
Na pevnou půdu v Petriho miskách byl vyočkován kmen z glycerolové konzervy, skladované při -20 °C, a misky byly inkubovány při 30 °C 48 hodin. Vyrostlým kmenem bylo kličkou zaočkováno 100 ml tekuté půdy v 500 ml varné baňce a tato inkubována na rotačním třepacím stroji (240 otáček . min.'1, výstředník 25 mm), 24 hodin při 30 °C.
Ve skleněném fermentačním tančíku o objemu 5 litrů (vnitřní průměr 158 mm, výška 250 mm) vybaveném radiálním míchadlem s 6ti lopatkami o průměru 70 mm, byly připraveny 2 litry půdy o složení: 2 % glycerol, 0,2 % (NH^SOí, 1,36 % KH2PO4, 0,3 % NaOH, 0,5 % CaCO3, 0,001 % FeSO4.7H2O, 0,005 % CaCl2.6H2O, 0,2 % MgSO4.7H2O, 0,015 % silikonového protipěnidla SAG 471, pH 7,2-7,3, sterilizace 40 minut, 1,2 atm. Roztoky MgSO4, FeSO4, CaCl2 a CaCO3 byly sterilizovány zvlášť.
ml inokula z baňky, připraveného způsobem jak je uvedeno výše, bylo asepticky přilito do sterilní živné půdy ve fermentačním tanku a provedena kultivace při teplotě 25 °C, vzdušnění 1 objem vzduchu na objem živné půdy při frekvenci míchání 400 otáček.min.'1. Během kultivace byly postupně zvyšováno míchání až na 600 otáček.min.1 a odebírány vzorky na stanovení optické density kultury, amoniakálního dusíku, suché hmoty buněk a aktivity PAG. Ve třech dávkách bylo v průběhu kultivace přidáno celkem 0,4 % (NH4)2SO4. Kultivace probíhala 17 hodin. Hodnota pH kultury na konci fermentace byla 6,0. V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce PAG 4700 U a nárůstu buněk 8,3 g suché hmoty. Specifická aktivita byla 560 U.g’1 suché hmoty buněk.
Příklad 2
Byla připravena kultura na pevném agaru a 10 baněk inokula Escherichia coli CCM 4228 (pKA18), jak je uvedeno v příkladu 1 s výjimkou toho, že tekutá půda pro inokulum byla obohacena předsráženým kukuřičným extraktem (250 ml.!’1 živné půdy). Předsrážený kukuřičný výluh byl připraven následovně: 40 g kukuřičného extraktu (60 % suché hmoty) bylo suspendováno do demineralizované vody, pH upraveno 40 % roztokem NaOH na 7,6, roztok byl doplněn vodou do 1 litru a zahříván 15 minut při 100 °C. Vzniklé sraženiny byly odstraněny filtrací.
V nerezavém tanku o objemu 75 litrů (průměr 348 mm, výška 810 mm) vybaveném čtyřmi zarážkami, třemi radiálními míchadly se 6-ti lopatkami o průměru 122 mm umístěnými na 1 hřídeli (vzdálenost míchadel od sebe 170 mm, spodního ode dna 160 mm) aaeračním věncem o průměru 158 mm vzdáleným 40 mm ode dna, bylo připraveno 50 litrů živné půdy následujícího složení: 1 % glycerol, 0,4 % (NH^SOí, 1,36 % KH2PO4, 0,3 % NaOH, 0,5 % CaCO3, 0,001 % FeSO4.7H2O, 0,003 % CaCl2.6H2O, 0,2 % MgSO4.7H2O, 0,015 % silikonového protipěnidla SAG 471. Po sterilizaci (40 min. 1,2 atm.) byly asepticky přidány roztoky MgSO4, FeSO4, CaCl2 a CaCO3 (sterilizace zvlášť) a pH za aseptických podmínek upraveno 40 % NaOH na hodnotu 7,6. Dále byly připraveny sterilní zásobní roztoky: 2,8 litrů 50 % (w/v) glycerolu (sterilizace 2 x 30 min., 1,2 atm) a 1 litr čpavkové vody ředěné 1:1.
-3 CZ 282712 B6
Po ochlazení půdy bylo provedeno očkování sterilní živné půdy 1 litrem inokula, které bylo získáno aseptickým slitím 10 baněk. Kultivace probíhala při teplotě 25 °C. Počáteční vzdušnění bylo 0,3 objemu vzduchu na objem živné půdy při frekvenci míchání 400 otáček . min.'1. Během kultivace bylo měřeno pH, parciální tlak kyslíku (pO2) a odebírány vzorky na stanovení optické density, amoniakálního dusíku, suché hmoty buněk a aktivity PAG. Při poklesu pO2 k nule (cca od 10. hodiny kultivace byla postupně zvyšována frekvence míchání. Od 17. hodiny byly dávkovány přídavky glycerolu, odpovídající koncentraci v živné půdě 0,15 %. Při poklesu pH na hodnotu 6,6 bylo započato s regulací pH dávkováním čpavkové vody v rozsahu pH 6,3-6,6. Kultivace probíhala 21 hodin.
V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce PAG 5 050 U při nárůstu 7,2 gramů suché hmoty buněk. Specifická aktivita byla 701 U.g'1 suché hmoty buněk.
Příklad 3
Byla připravena kultura kmene Escherichia coli CCM 4228 (pKA 18) na šikmém agaru způsobem, jak je uvedeno v příkladu 1. Dále bylo připraveno 10 baněk inokula způsobem, jak je uvedeno v příkladu 2 s tím rozdílem, že půda obsahovala namísto glycerolu 1 % sacharosy.
V nerezovém tanku o objemu 75 litrů se stejným vybavením jako v příkladu 2, bylo připraveno 50 litrů půdy stejného složení jako pro přípravu inokula (tj. zdroj uhlíku 1 % sacharosa), avšak bez kanamycinu. Pro tento účel bylo předem připraveno 12,5 litru předsráženého kukuřičného extraktu způsobem, jak je popsáno v příkladu 2. Po ochlazení půdy bylo provedeno za aseptických podmínek očkování živné půdy 1 litrem inokula získaným aseptickým slitím 10 baněk. Kultivace v očkovacím tanku probíhala za podmínek vzdušnění 0,3 objemu vzduchu na objem půdy při míchání 300 otáček za minutu a teplotě 28 °C. Během kultivace byl sledován růst kultury měřením optické density. Při přechodu do stacionární fáze kultury v 17. hodině kultivace byla kultura vyrostlá v očkovacím tanku použita pro očkování produkčního tanku.
Do 300 litrového nerezového tanku (průměr 490 mm, výška 1460 mm) vybaveném 4 zarážkami, třemi radiálními míchadly se 6 lopatkami o průměru 190 mm umístěnými na 1 hřídeli (vzdálenost míchadel od sebe 250 mm, spodního ode dna 85 mm) a aeračním věncem vzdáleným 50 mm ode dna, bylo připraveno 180 litrů půdy následujícího složení: 1 % sacharosa, 0,4 % (NH4)2SO4, 1,36 % KH2PO4, 0,4 % NaOH, 0,1 % CaCO3, 0,001 % FeSO4.7H2O, 0,003 % CaCl2.6H2O, 0,2% MgSO4.7H2O, 0,015 % silikonového protipěnidla SAG 471, pH 7,6-7,8, sterilizace 40 minut, 1,2 atm. Dále byly připraveny sterilní zásobní roztoky: 15 litrů 50 % roztoku sacharosy, 0,25 litrů 15 % roztoku NH4C1, 6 litrů čpavkové vody (ředěné 1:1).
Po ochlazení půdy bylo provedeno za aseptických podmínek očkování 4 litry kultury z inokulačního tanku. Počáteční vzdušnění bylo 0,33 objemu vzduchu na objem živné půdy při míchání 150 otáček . min.1. Kultivace probíhala při teplotě 25 °C. Během kultivace bylo měřeno pH, parciální tlak kyslíku (pO2) a odebírány vzorky na stanovení optické density, amoniakálního dusíku, suché hmoty buněk a aktivity PAG. V 17. hodině kultivace byl přidán NH4CI v koncentraci odpovídající 0,02 % v živné půdě a bylo započato s dávkováním sterilního roztoku sacharosy ze zásobní lahve v případě náhlého vzrůstu pO2, přičemž dávky odpovídaly konečné koncentraci sacharosy v živné půdě 0,15 %. Od 19. hodiny kultivace bylo regulováno pH v rozmezí 6,4-6,6. Kultivace probíhala 34 hodin.
V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce PAG 14 050 U a nárůstu 15 gramů suché hmoty buněk, specifická aktivita byla 937 U.g’1 suché hmoty buněk.
-4CZ 282712 B6
Příklad 4
Kultivace Escherichia coli CCM 4228 (pKA18) byla provedena způsobem jako v příkladu 3 s tím rozdílem, že dávkování sacharosy bylo prováděno nepřetržitě v mikrodávkách automaticky řízených podle změn pO2 (dávkování při pO2 nad 7 %). Kultivace probíhala 42 hodin. V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce PAG 21 800 U a nárůstu 22,4 gramů suché hmoty buněk. Specifická aktivita byla 973 U.g'1 suché hmoty buněk.
Průmyslová využitelnost
Způsob fermentace podle vynálezu lze využít k přípravě meziproduktů pro výrobu antibiotik tzv. polosyntetických penicilinů ev. cefalosporinů.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (1)
- Způsob fermentace podle vynálezu lze využít k přípravě meziproduktů pro výrobu antibiotik tzv. polosyntetických penicilinů ev. cefalosporinů.PATENTOVÉ NÁROKYZpůsob submerzní kultivace buněk produkujících G-penicilin amidasu, zejména buněk Escherichia coli, obsahujících rekombinované plasmidy v minerální živné půdě obsahující jako zdroj asimilovatelného uhlíku zkvasitelný sacharid a jako zdroj dusíku anorganickou sůl a minerální živné soli, vyznačující se t í m , že se na počátku kultivace produkčního mikroorganismu v živné půdě obsahující rozpustné soli vápníku v koncentraci Ca 2.10‘5 až 0,1 % hmotn. a/nebo uhličitan vápenatý v koncentraci 0,05 až 1 % hmotn. a rozpustné soli hořčíku v koncentraci Mg 0,001 až 0,05 % hmotn. upraví pH na hodnotu 7,3 až 8,0 a potom v průběhu kultivace se udržuje pH na hodnotě 6,0 až 7,5 za současného přidávání zkvasitelného sacharidu v dávkách o koncentraci 0,01 až 3 % hmotn. a anorganického zdroje dusíku v množství odpovídajícím koncentraci v médiu 0,01 až 3 % hmotn. zejména hydroxidu amonného.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ941616A CZ282712B6 (cs) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | Způsob submerzní kultivace buněk produkujících G-penicilin amidasu |
| SK1457-94A SK279771B6 (sk) | 1994-07-04 | 1994-11-30 | G-penicilínamidázu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ941616A CZ282712B6 (cs) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | Způsob submerzní kultivace buněk produkujících G-penicilin amidasu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ161694A3 CZ161694A3 (en) | 1996-01-17 |
| CZ282712B6 true CZ282712B6 (cs) | 1997-09-17 |
Family
ID=5463549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ941616A CZ282712B6 (cs) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | Způsob submerzní kultivace buněk produkujících G-penicilin amidasu |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ282712B6 (cs) |
| SK (1) | SK279771B6 (cs) |
-
1994
- 1994-07-04 CZ CZ941616A patent/CZ282712B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-11-30 SK SK1457-94A patent/SK279771B6/sk unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ161694A3 (en) | 1996-01-17 |
| SK279771B6 (sk) | 1999-03-12 |
| SK145794A3 (en) | 1996-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cole | Hydrolysis of penicillins and related compounds by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli | |
| Frengova et al. | Effect of temperature changes on the production of yeast pigments co-cultivated with lacto-acid bacteria in whey ultrafiltrate | |
| CA2049958A1 (en) | Enzymatic production of 7-amino cephalosporanic acid | |
| US4418146A (en) | Preparation of D-N-carbamyl-α-aminoacids and micro-organisms for carrying out this preparation | |
| US4248967A (en) | Enzymic complexes adapted to convert racemic hydantoins into optically active aminoacids, and their applications | |
| SU974817A1 (ru) | Способ получени L-треонина | |
| US4745059A (en) | Process for the preparation of L-phenylalanine | |
| CZ282712B6 (cs) | Způsob submerzní kultivace buněk produkujících G-penicilin amidasu | |
| Lee et al. | Mass production of thermostable D‐hydantoinase by batch culture of recombinant Escherichia coli with a constitutive expression system | |
| US3116218A (en) | Process for the production of penicillin-splitting enzyme preparations | |
| RU2174558C1 (ru) | Способ получения l-аспарагиновой кислоты | |
| RU2132384C1 (ru) | Способ получения лимонной кислоты | |
| RU2729410C1 (ru) | Промышленный способ микробиологического синтеза фермента пенициллин g ацилазы escherichia coli | |
| KR20010102256A (ko) | Ｌ-소르보스의 제조 방법 | |
| US3293141A (en) | Fermentation process for producing l-tryptophan | |
| US6455730B1 (en) | Preparation of dicarboxylic acid monoesters from cyanocarboxylic acid esters | |
| CN113789311A (zh) | 一种(r)-3-氨基丁酸的合成与纯化方法 | |
| Vining et al. | Cephamycin production and isopenicillin N synthetase activity in cultures of Streptomyces clavuligerus | |
| JP2007531535A (ja) | ニトリルヒドラターゼ−生成菌株ロドコッカス属ロドクロウスｍ３３の培養方法 | |
| RU2053292C1 (ru) | Штамм бактерий alcaligenes eutrophus - продуцент белковой биомассы | |
| US4042460A (en) | Method for producing glucose isomerase | |
| RU2186850C2 (ru) | Способ получения лимонной кислоты | |
| CZ284178B6 (cs) | Způsob jednorázové příkrmové submersní kultivace buněk s aktivitou acylasy 7 ß-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny | |
| SU1362021A1 (ru) | Штамм бактерии ЕSснеRIснIа coLI ВКПМ В-3420 - продуцент L-треонина | |
| SU1239146A1 (ru) | Способ получени бактериальных амилаз |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20140704 |