Oblast techniky

Vynález se týká způsobu submerzní kultivace buněk s aktivitou G-penicilin amidasy, zejména buněk obsahujících plasmidy nesoucí gen pro syntézu G-penicilin amidasy.

Dosavadní stav techniky

G-penicilin amidasa (dále jen PAG) hydrolyzuje amidickou vazbu G penicilinu (benzylpenicilin) na 6-aminopenicilánovou kyselinu (6-APK), popřípadě amidickou vazbu deacetoxycefalosporinu G (N-fenylacetyl-7-aminodeacetoxycefalosporánová kyselina) na 7-aminocefalosporánovou 15 kyselinu (7-ADCK).

Jsou známy postupy kultivace bakterií s aktivitou PAG využívající komplexní složky živných půd jako kvasničné a kukuřičné extrakty, různé bílkovinné hydrolyzáty v kombinaci s induktorem enzymu - fenyloctovou kyselinou (patentový spis NSR č. 1 114 766, britské 20 patentové spisy č. 954 449 ač. 1 015 554). Použití komplexního média v kombinaci s glukosou a fenyloctovou kyselinou je uváděno též pro kultivaci kmenů nesoucí gen pro PAG na rekombinovaných plasmidech (Robas asp. Biotechnol. Bioeng. 41, 14-24, 1993; Lee aChang Biotechnol. Lett. 10, 787-792, 1988).

Použití syntetické, chemicky definované živné půdy, obsahující anorganický zdroj dusíku a jako zdroj uhlíku zkvasitelný sacharid (např. sacharosu), který je možno během fermentace přidávat ve více dávkách, pro kmeny s aktivitou PAG uvádí čs. autorském osvědčení č. 151 240. Je známo, že i za použití chemicky definovaných půd je však rychlost syntézy PAG značně zvýšena přídavky induktoru fenyloctové kyseliny, zejména při použití fenyloctové kyseliny jako jediného 30 zdroje uhlíku (Vojtíšek a Slezák, Folia Microbiol. 20, 289-297, 1975; Babu a Panda, Bioprocess Eng. 6,71-74, 1991).

Vzhledem ktomu, že syntéza PAG podléhá katabolické represi glukosou (ev. jinými sacharidy) a parciální represi acetátem, vznikající též při utilizaci glukózy (Vojtíšek a Slezák, Folia 35 Microbiol. 20, 298-306, 1975), byly v minulosti připraveny různé regulační mutantní kmeny méně citlivé ktéto represi (Robas asp., Biotechnol. Bioeng., 41, 14-24, 1993; čs. autorské osvědčení č. 188 631). Specifická aktivita PAG však bez fenyloctové kyseliny nedosáhla vysokých hodnot (40 U.g'¹ suché hmoty buněk) (Vojtíšek a Slezák, Folia Microbiol. 20, 289-297, 1975). Rekombinantní kmeny připravené z těchto mutantních kmenů jsou rovněž méně citlivé ke 40 katabolické represi a řada z nich, může syntetizovat PAG konstitutivně v nepřítomnosti fenyloctové kyseliny. Vlastnosti kmenů Escherichia coli nesoucí různé rekombinované plasmidy jsou uvedeny v čs. patentových spisech č. 278 516 a 278 847.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je způsob submersní kultivace buněk produkujících G-penicilin amidasu (PAG), zejména buněk Escherichia coli, obsahujících rekombinované plasmidy v minerální živné půdě obsahující jako zdroj asimilovatelného uhlíku zkvasitelný sacharid ajako zdroj dusíku 50 anorganickou sůl a minerální živné soli, který spočívá v tom, že se na počátku kultivace produkčního mikroorganismu v živné půdě obsahující rozpustné soli vápníku v koncentraci Ca2.10‘⁵ až 0,1 % hmotn. a/nebo uhličitan vápenatý v koncentraci 0,05 až 1 % hmotn. a rozpustné soli hořčíku v koncentraci Mg 0,001 až 0,05 % hmotn. upraví pH na hodnotu 7,3 až 8,0 a potom v průběhu kultivace se udržuje pH na hodnotě 6,0 až 7,5 za současného přidávání

- 1 CZ 282712 B6 zkvasitelného sacharidu v dávkách o koncentraci 0,01 až 3 % hmotn. a anorganického zdroje dusíku v množství, odpovídajícím koncentraci v mediu 0,01 až 3 % hmotn. zejména hydroxidu amonného. Vynález se týká kultivace zejména buněk obsahujících rekombinované plasmidy nesoucí gen pro PAG. Tyto rekombinantní kmeny produkují většinou PAG i bez přídavku fenyloctové kyseliny při současně snížené represi syntézy PAG zdroji uhlíku (např. glukosa, sacharosa, glycerol). Tyto vlastnosti zvýhodňuje předmětný vynález vhodně řízenou kultivací k dosažení maximální produkce PAG. Způsob submersní kultivace spočívá v použití syntetických, chemicky definovaných půd, obsahujících utilizovatelný zdroj uhlíku, s výhodou sacharid, a anorganický zdroj dusíku, přičemž se oba v průběhu kultivace vzhledem k eventuální a částečné represi dávkují, aby bylo dosaženo vysoké koncentrace buněk s vysokou aktivitou PAG. Vzhledem ktomu, že během utilizace zdroje uhlíku vznikají organické kyseliny (např. octová kyselina), které snižují pH pod optimální hodnotu a tím negativně ovlivňují růst, je žádoucí současná regulace pH. Vzhledem k tomu, že brzká regulace pH může negativně ovlivnit produkci enzymu je výhodnější zvýšit startovací pH média a nebo přidat CaCO₃, který zvyšuje pufrační kapacitu média. Pro produkci PAG je důležitá též vhodná koncentrace Mg²⁺iontů a nízká koncentrace Fe²⁺či Fe³⁺iontů. Výhodné je dávkovat zdroj dusíku ve formě hydroxidu amonného, čímž se současně udržuje optimální pH a potřebná hladina dusíku. Celý kultivační proces lze kombinovat sledováním parciálního tlaku kyslíku (pO₂) vyregulovaného tak, že rychlý a náhlý vzrůst pO₂ signalizuje zastavení růstu buněčné kultury z nedostatku zdroje uhlíku eventuelně dusíku. Po přidání další dávky potřebného zdroje a jeho pokračující utilizaci poklesne opět pO₂. Tímto způsobem lze dosáhnout vysoké koncentrace buněk s vysokou aktivitou PAG (to jest vysoké celkové a specifické aktivity PAG) a tudíž značně zvýšit výtěžnost enzymu a získat kvalitní buněčný materiál.

Postup kultivace lze použít zejména pro kmeny Escherichia coli obsahující rekombinované plasmidy nesoucí PAG gen, jako jsou např. kmeny obsahující plasmidy podle čs. patentového spisu č. 278 516 a čs. patentového spisu č. 278 847. Stejně tak lze kultivační postup použít pro různé producenty PAG neobsahující rekombinované plasmidy, zvláště se sníženou katabolickou represí vůči použitému zdroji uhlíku a bez potřeby induktoru. S výhodou lze použít kmen Escherichia coli CCM 4228 obsahující rekombinovaný plasmid pKA18. Popsaným způsobem kultivace lze dosáhnout bez přítomnosti fenyloctové kyseliny značné produkce PAG, přičemž je eliminováno nebezpečí občasných lysí buněčné populace v provozním měřítku farmaceutického průmyslu, ke kterým docházelo při indukci PAG fenyloctovou kyselinou (pravděpodobná genetická souvislost uvolnění profága při intenzivním přepisu genů).

Množství PAG bylo určováno v buňkách promytých 0,1 M fosfátovým pufrem pH 8,0 měřením počáteční rychlosti hydrolýzy penicilinu G v 0,05 M fosfátovém pufru o pH 8,0 při teplotě 37 °C v oblasti kinetiky nultého řádu. Produkt reakce 6-APK byl stanoven spektrofotometricky za použití p-dimethylaminobenzaldehydu (Balasingham et al. Biochim. Biophys. Acta 276, 250260, 1972). Jedna jednotka je takové množství enzymu, které odpovídá tvorbě jednoho mikromolu 6-APK za minutu. Specifická aktivita je definována jako U.g'¹ suché hmoty buněk.

Získanou suspenzi vysoce aktivních buněk lze použít buď ve formě separované buněčné pasty, nebo ve formě zahuštěné suspenze jako výchozí materiál pro výrobu imobilizovaných celých buněk či jejich částí po dezintegreci, nebo lze pastu či zahuštěnou suspenzi použít pro izolaci surového enzymu a jeho následnou imobilizaci a získat tak katalyzátory o vysoké aktivitě PAG s velkou účinností při štěpení G-penicilinu.

Dále je vynález doložen v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.

-2CZ 282712 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Byla připravena pevná a tekutá živná půda následujícího složení: 2 % glycerol,

0,4 % (NH₄)₂SO₄, 1,36 % KH₂PO₄, 0,3 % NaOH, 0,001 % FeSO₄.7H₂O, 0,005 % CaCl₂.6 H₂O, 0,2 MgSO₄.7H₂O, pH 7,2-7,3; sterilizace 30 minut při 1,2 atm. Pro pevnou půdu bylo toto médium doplněno 1,5 % agaru. K tekuté i pevné půdě byl asepticky přidán kanamycin v koncentraci 35 pg-ml'¹.

Na pevnou půdu v Petriho miskách byl vyočkován kmen z glycerolové konzervy, skladované při -20 °C, a misky byly inkubovány při 30 °C 48 hodin. Vyrostlým kmenem bylo kličkou zaočkováno 100 ml tekuté půdy v 500 ml varné baňce a tato inkubována na rotačním třepacím stroji (240 otáček . min.'¹, výstředník 25 mm), 24 hodin při 30 °C.

Ve skleněném fermentačním tančíku o objemu 5 litrů (vnitřní průměr 158 mm, výška 250 mm) vybaveném radiálním míchadlem s 6ti lopatkami o průměru 70 mm, byly připraveny 2 litry půdy o složení: 2 % glycerol, 0,2 % (NH^SOí, 1,36 % KH₂PO₄, 0,3 % NaOH, 0,5 % CaCO₃, 0,001 % FeSO₄.7H₂O, 0,005 % CaCl₂.6H₂O, 0,2 % MgSO₄.7H₂O, 0,015 % silikonového protipěnidla SAG 471, pH 7,2-7,3, sterilizace 40 minut, 1,2 atm. Roztoky MgSO₄, FeSO₄, CaCl₂ a CaCO₃ byly sterilizovány zvlášť.

ml inokula z baňky, připraveného způsobem jak je uvedeno výše, bylo asepticky přilito do sterilní živné půdy ve fermentačním tanku a provedena kultivace při teplotě 25 °C, vzdušnění 1 objem vzduchu na objem živné půdy při frekvenci míchání 400 otáček.min.'¹. Během kultivace byly postupně zvyšováno míchání až na 600 otáček.min.¹ a odebírány vzorky na stanovení optické density kultury, amoniakálního dusíku, suché hmoty buněk a aktivity PAG. Ve třech dávkách bylo v průběhu kultivace přidáno celkem 0,4 % (NH₄)₂SO₄. Kultivace probíhala 17 hodin. Hodnota pH kultury na konci fermentace byla 6,0. V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce PAG 4700 U a nárůstu buněk 8,3 g suché hmoty. Specifická aktivita byla 560 U.g’¹ suché hmoty buněk.

Příklad 2

Byla připravena kultura na pevném agaru a 10 baněk inokula Escherichia coli CCM 4228 (pKA18), jak je uvedeno v příkladu 1 s výjimkou toho, že tekutá půda pro inokulum byla obohacena předsráženým kukuřičným extraktem (250 ml.!’¹ živné půdy). Předsrážený kukuřičný výluh byl připraven následovně: 40 g kukuřičného extraktu (60 % suché hmoty) bylo suspendováno do demineralizované vody, pH upraveno 40 % roztokem NaOH na 7,6, roztok byl doplněn vodou do 1 litru a zahříván 15 minut při 100 °C. Vzniklé sraženiny byly odstraněny filtrací.

V nerezavém tanku o objemu 75 litrů (průměr 348 mm, výška 810 mm) vybaveném čtyřmi zarážkami, třemi radiálními míchadly se 6-ti lopatkami o průměru 122 mm umístěnými na 1 hřídeli (vzdálenost míchadel od sebe 170 mm, spodního ode dna 160 mm) aaeračním věncem o průměru 158 mm vzdáleným 40 mm ode dna, bylo připraveno 50 litrů živné půdy následujícího složení: 1 % glycerol, 0,4 % (NH^SOí, 1,36 % KH₂PO₄, 0,3 % NaOH, 0,5 % CaCO₃, 0,001 % FeSO₄.7H₂O, 0,003 % CaCl₂.6H₂O, 0,2 % MgSO₄.7H₂O, 0,015 % silikonového protipěnidla SAG 471. Po sterilizaci (40 min. 1,2 atm.) byly asepticky přidány roztoky MgSO₄, FeSO₄, CaCl₂ a CaCO₃ (sterilizace zvlášť) a pH za aseptických podmínek upraveno 40 % NaOH na hodnotu 7,6. Dále byly připraveny sterilní zásobní roztoky: 2,8 litrů 50 % (w/v) glycerolu (sterilizace 2 x 30 min., 1,2 atm) a 1 litr čpavkové vody ředěné 1:1.

-3 CZ 282712 B6

Po ochlazení půdy bylo provedeno očkování sterilní živné půdy 1 litrem inokula, které bylo získáno aseptickým slitím 10 baněk. Kultivace probíhala při teplotě 25 °C. Počáteční vzdušnění bylo 0,3 objemu vzduchu na objem živné půdy při frekvenci míchání 400 otáček . min.'¹. Během kultivace bylo měřeno pH, parciální tlak kyslíku (pO₂) a odebírány vzorky na stanovení optické density, amoniakálního dusíku, suché hmoty buněk a aktivity PAG. Při poklesu pO₂ k nule (cca od 10. hodiny kultivace byla postupně zvyšována frekvence míchání. Od 17. hodiny byly dávkovány přídavky glycerolu, odpovídající koncentraci v živné půdě 0,15 %. Při poklesu pH na hodnotu 6,6 bylo započato s regulací pH dávkováním čpavkové vody v rozsahu pH 6,3-6,6. Kultivace probíhala 21 hodin.

V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce PAG 5 050 U při nárůstu 7,2 gramů suché hmoty buněk. Specifická aktivita byla 701 U.g'¹ suché hmoty buněk.

Příklad 3

Byla připravena kultura kmene Escherichia coli CCM 4228 (pKA 18) na šikmém agaru způsobem, jak je uvedeno v příkladu 1. Dále bylo připraveno 10 baněk inokula způsobem, jak je uvedeno v příkladu 2 s tím rozdílem, že půda obsahovala namísto glycerolu 1 % sacharosy.

V nerezovém tanku o objemu 75 litrů se stejným vybavením jako v příkladu 2, bylo připraveno 50 litrů půdy stejného složení jako pro přípravu inokula (tj. zdroj uhlíku 1 % sacharosa), avšak bez kanamycinu. Pro tento účel bylo předem připraveno 12,5 litru předsráženého kukuřičného extraktu způsobem, jak je popsáno v příkladu 2. Po ochlazení půdy bylo provedeno za aseptických podmínek očkování živné půdy 1 litrem inokula získaným aseptickým slitím 10 baněk. Kultivace v očkovacím tanku probíhala za podmínek vzdušnění 0,3 objemu vzduchu na objem půdy při míchání 300 otáček za minutu a teplotě 28 °C. Během kultivace byl sledován růst kultury měřením optické density. Při přechodu do stacionární fáze kultury v 17. hodině kultivace byla kultura vyrostlá v očkovacím tanku použita pro očkování produkčního tanku.

Do 300 litrového nerezového tanku (průměr 490 mm, výška 1460 mm) vybaveném 4 zarážkami, třemi radiálními míchadly se 6 lopatkami o průměru 190 mm umístěnými na 1 hřídeli (vzdálenost míchadel od sebe 250 mm, spodního ode dna 85 mm) a aeračním věncem vzdáleným 50 mm ode dna, bylo připraveno 180 litrů půdy následujícího složení: 1 % sacharosa, 0,4 % (NH4)₂SO₄, 1,36 % KH₂PO₄, 0,4 % NaOH, 0,1 % CaCO₃, 0,001 % FeSO₄.7H₂O, 0,003 % CaCl₂.6H₂O, 0,2% MgSO₄.7H₂O, 0,015 % silikonového protipěnidla SAG 471, pH 7,6-7,8, sterilizace 40 minut, 1,2 atm. Dále byly připraveny sterilní zásobní roztoky: 15 litrů 50 % roztoku sacharosy, 0,25 litrů 15 % roztoku NH₄C1, 6 litrů čpavkové vody (ředěné 1:1).

Po ochlazení půdy bylo provedeno za aseptických podmínek očkování 4 litry kultury z inokulačního tanku. Počáteční vzdušnění bylo 0,33 objemu vzduchu na objem živné půdy při míchání 150 otáček . min.¹. Kultivace probíhala při teplotě 25 °C. Během kultivace bylo měřeno pH, parciální tlak kyslíku (pO₂) a odebírány vzorky na stanovení optické density, amoniakálního dusíku, suché hmoty buněk a aktivity PAG. V 17. hodině kultivace byl přidán NH4CI v koncentraci odpovídající 0,02 % v živné půdě a bylo započato s dávkováním sterilního roztoku sacharosy ze zásobní lahve v případě náhlého vzrůstu pO₂, přičemž dávky odpovídaly konečné koncentraci sacharosy v živné půdě 0,15 %. Od 19. hodiny kultivace bylo regulováno pH v rozmezí 6,4-6,6. Kultivace probíhala 34 hodin.

V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce PAG 14 050 U a nárůstu 15 gramů suché hmoty buněk, specifická aktivita byla 937 U.g’¹ suché hmoty buněk.

-4CZ 282712 B6

Příklad 4

Kultivace Escherichia coli CCM 4228 (pKA18) byla provedena způsobem jako v příkladu 3 s tím rozdílem, že dávkování sacharosy bylo prováděno nepřetržitě v mikrodávkách automaticky řízených podle změn pO₂ (dávkování při pO₂ nad 7 %). Kultivace probíhala 42 hodin. V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce PAG 21 800 U a nárůstu 22,4 gramů suché hmoty buněk. Specifická aktivita byla 973 U.g'¹ suché hmoty buněk.

Průmyslová využitelnost

Způsob fermentace podle vynálezu lze využít k přípravě meziproduktů pro výrobu antibiotik tzv. polosyntetických penicilinů ev. cefalosporinů.

PATENTOVÉ NÁROKY