CZ284178B6 - Způsob jednorázové příkrmové submersní kultivace buněk s aktivitou acylasy 7 ß-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny - Google Patents

Abstract

Způsob jednorázové příkrmové submersní kultivace buněk, zejména buněk Escherichia coli obsahujících rekombinované plasmidy, produkujících acylasu 7 .beta.-(4-karboxybutanamido)- cefalosporánové kysliny k enzymové přeměně 7 .beta..acylominocefem sloučenin na 7-aminocefem sloučeniny, který spočívá v tom, že se produkční mikroorganismus kultivuje v tekuté živné půdě obsahující organický zdroj asimilovatelného dusíku v množství 0,1 - 6,0 %, asimilovatelného uhlíku v množství 0,01 - 10,0 % a glutamovou kyselinu a/nebo deriváty glutamové kyseliny ve formě volné kyseliny a/nebo ve formě solí v koncentraci 0,1 - 3,0 %.ŕ

Description

Vynález se týká způsobu submerzní kultivace buněk s aktivitou acylázy 7p-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny k enzymové přeměně 7[3-acylaminocefem sloučenin na 7— aminocefem sloučeniny, jako je přeměna 7(3-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny (dále jen glutaryl-7-ACK) na 7-aminocefalosporánovou kyselinu (dále jen 7-ACK).

Dosavadní stav techniky

Acyláza či hydroláza 7[3-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny (dále jen acyláza glutaryl-7-ACK nebo jen acyláza) hydrolyzuje amidickou vazbu glutaryl-7-ACK, popřípadě jiné 7(3-acylaminocefem sloučeniny, jako je například adipyl-7-ACK, na 7-ACK. Tato slouží jako významný meziprodukt pro výrobu polosyntetických cefalosporinů.

Je známa řada produkčních mikroorganismů, syntetizujících acylázu gIutaryl-7-ACK. Produkční kmeny jsou zástupci různých rodů, jako Pseudomonas, Arthrobacter, Alcaligenes, Bacillus (japonské patenty č. 78 59 095, 81 85 298 a 78 94 093, evropské patenty EPA 482 844, 525 861; Binder et al., Applied Enviroment. Microbiol. 59, 3321-3326, 1993). Některé z nich mají též schopnost pomalou rychlostí štěpit přímo cefalosporin C na 7-ACK (EPA 283 218, EPA 475 652, japonské patenty č. 86 29 097, 87 48 379 a 87 48 380; Aramori et al., J. Ferm. Bioeng. 72, 227-231, 1991). Způsob kultivace těchto produkčních kmenů vychází z jejich základních genetických, biochemických a fyziologických charakteristik. Pro kultivaci jsou využívány komplexní složky živných půd, zejména s přídavkem induktoru glutarové kyseliny a eventuálně různých solí. Jako komplexní zdroje dusíku a uhlíku byly použity pepton, trypton, kukuřičný extrakt (CSL), kvasničný extrakt (yeast extrakt) a meat extrakt, jako zdroj uhlíku ještě organické kyseliny nebo jednoduché cukry. V čs. AO č. 262 502 a 251 111 jsou pro kultivaci Pseudomonas CCM 3987 s aktivitou acylázy glutaryl-7-ACK jako dusíkaté komplexní substráty používány bílkovinné hydrolyzáty mikrobiálního, živočišného a rostlinného původu, doplněné kukuřičným extraktem.

Pro kultivaci různých bakteriálních druhů a kmenů rozsáhlého rodu Pseudomonas mohou být požívány půdy doplněné různými aminokyselinami, mimo jiné též glutamátem sodným (Atlas R. M., Handbook of Microbial Media. CRC Press, 1993). Komplexní půdy doplněné glutamátem byly také použity pro izolaci a kultivaci některých kmenů Pseudomonas, produkujících acylázu glutaryl-7-ACK. V tomto případě, jako další komponenty živné půdy byly použity kasein aglutarová kyselina (japonský patent č. 75 101 584, evropský patent EPA 525 861; Ichikawa et al., Agric. Biol. Chem. 45, 2225-2229, 1981; Nikolov aDanielsson. Enzym. Microb. Technol. 16, 1031-1036, 1994). Pro konstitutivní mutantní kmen Pseudomonas sp. GK 16 byla pak použita půda s Bonito extraktem (extrakt ze sušených ryb).

S cílem zvýšení aktivity acylázy glutaryl-7-ACK původních přírodních i mutagenně šlechtěných kmenů byla připravena klonováním genu acylázy glutaryl-7-ACK řada kmenů, většinou Escherichia coli, obsahující rekombinované plazmidy, nesoucí příslušný gen. Pro přípravu těchto plazmidů je použito různých vektorů a způsobů konstrukce (Matsuda et al., J.Bacteriol. 169, 5815-5820, 1987; Aramori et.al., J.Ferm. Bioeng. 72, 232-2434, 1992 a 73, 185-192, 1992; evropské patenty EPA 482 844 a EPA 475 652). Za použití rekombinantních kmenů je dosahováno často mnohem vyšší specifické aktivity acylázy glutaryl-7-ACK. V čs. patentu č. 278 515 je uvedena příprava kmene Escherichia coli CCM 4229, obsahujícího rekombinovaný

- 1 CZ 284178 B6 plazmid pKS55, odvozený od vektoru pK.19 a kmene Pseudomonas sp. CCM 3987, přičemž specifická aktivita acylázy glutaryl-7-ACK byla zvýšena až pětkrát oproti rodičovskému kmeni.

Ve všech těchto případech jsou pro produkci buněk používány půdy, obsahující běžné dusíkaté komplexní zdroje (pepton. trypton, kvasničný extrakt). Podle způsobů konstrukce rekombinovaných plazmidů je používán v některých případech při kultivaci induktor IPTG (EPA 475 652). Všechny používané způsoby kultivace však vedou k poměrně malému výtěžku buněk, odpovídajícímu maximálně 4 g suché hmoty v 1 litru kultivační půdy. V evropském patentovém spisu EPA 504 798 je uvedena příprava rekombinantního kmene Escherichia coli, obsahujícího plazmid pCM145 (DSM 6409), a kultivace v živné půdě, obsahující komplexní dusíkatý zdroj, doplněný citrónovou kyselinou a různými anorganickými solemi. Kultivace probíhá za kontinuálního dávkování zdroje uhlíku a úpravy pH amoniakem. Pro produkci enzymu byl v průběhu exponenciální fáze růstu přidáván induktor IPTG.

Zatímco produkce enzymu přírodními a z nich odvozenými mutantními kmeny je nízká, mají kmeny, obsahující rekombinované plazmidy, nesoucí příslušný gen, podstatně lepší produkční možnosti, které lze dále rozvinout vhodným fermentačním postupem. Je zřejmé, že vhodně řízený fermentační postup v souvislosti s produkcí enzymu i buněk je významný z hlediska ekonomického. Produkční mikroorganismus a způsob kultivace tvoří doplňující se systém.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je způsob jednorázové příkrmové submerzní kultivace buněk s aktivitou acylázy glutaryl-7-ACK. zejména buněk Escherichia coli, obsahujících rekombinované plazmidy, v živných půdách, obsahujících aminokyseliny, zejména kyselinu glutamovou v koncentraci do 0,1 % hmotn., který spočívá v tom, že se produkční mikroorganismus kultivuje v tekuté živné půdě, obsahující organický zdroj asimilovatelného dusíku v množství 0,1 až 6,0 % hmotn. a asimilovatelného uhlíku v množství 0,01 až 10,0 % hmot, a glutamovou kyselinu a/nebo její deriváty ve formě volné kyseliny a/nebo ve formě soli v koncentraci 0,11 až 3,0 % hmot.. přičemž se v průběhu fermentace dávkuje asimilovatelný zdroj uhlíku, popřípadě dusíku, buď v dávkách nebo nepřetržitě, za současné regulace vzdušnění. Předmětný způsob je dále vyznačen tím, že se soli glutamové kyseliny mohou přidávat jednorázově na začátku nebo v dávkách v průběhu fermentace, s výhodou ve stacionární fázi růstu, nebo se místo glutamové kyseliny mohou použít její metabolické deriváty, jako je například pyroglutamová kyselina. Glutamovou kyselinu lze přidat jako sodnou sůl, lze však použít i draselnou či amonnou sůl nebo volnou kyselinu a její neutralizaci provést společně s úpravou pH živné půdy. Předmětný způsob je dále vyznačen tím, že se v průběhu fermentace reguluje parciální tlak kyslíku v mezích 2 až 60 %, s výhodou 15 až 20 %, a teplota v mezích 10 až 32 °C, s výhodou 28 °C.

Způsobem podle předmětného vynálezu je dosažena technologie submerzní příkrmové kultivace (fed batch), která vede k produkci vysoké koncentrace buněk s vysokou aktivitou acylázv' glutaryl-7-ACK, a tudíž k vysokému výtěžku enzymu z kultivační půdy. Výhodné je použití rychle utilizovatelného zdroje uhlíku, jako je glycerol nebo glukóza, přičemž první dávku lze dát na počátku kultivace a kontinuální dávkování provádět až v druhé fázi kultivace. Tím je docíleno současné utilizace organických zdrojů a dusíku, což zabraňuje známé alkalizaci živné půdy při růstu na komplexních dusíkatých zdrojích. Na druhé straně je rovněž eliminováno okyselování půd, obsahujících rychle utilizovatelné zdroje uhlíku, hromaděním organických kyselin (např. kyseliny octové), které snižují pH pod optimální hodnotu a tím negativně ovlivňují růst. Tímto způsobem je docíleno vyváženého systému, který udržuje pH v rozmezí optimálních hodnot (6.8 až 8,0) pro růst i syntézu enzymu. Celý kultivační proces lze kontrolovat sledováním parciálního tlaku kyslíku (pO₂), regulovaného na základě toho, že vzrůst pO₂ signalizuje nedostatek zdroje uhlíku. Po přidání další dávky potřebného zdroje a jeho pokračující utilizaci poklesne opět pO₂. Občasné analýzy amoniakálního dusíku v půdě slouží ke zjištění a udržování jeho hladiny

-2 CZ 284178 B6 dodáním anorganického zdroje dusíku tak, aby systém reagoval pouze na nedostatek zdroje uhlíku a mohl být plně automatizovaný v souladu s fyziologickým stavem kultury.

Bylo zjištěno, že glutamová kyselina, použitá v kombinaci se submerzní příkrmovou fermentací, výrazně stimuluje produkci acylázy glutaryl-7-ACK u kmenů Escherichia coli, obsahujících rekombinované plazmidy, nesoucí gen pro acylázu glutaryl-7-ACK, a to až 3x celkovou aktivitu a 2x specifickou aktivitu. V tomto případě není nutno přidávat drahý IPTG jako induktor. S výhodou lze použít kmen Escherichia coli CCM 4229, obsahující rekombinovaný plazmid pKS55 ajeho deriváty, vzniklé delecí nekódujících oblastí. Obsah glutamové kyseliny v komplexních zdrojích dusíku může určovat kvalitu tohoto zdroje, co se týče produkce acylázy glutaryl-7-ACK. Naproti tomu pouhá přítomnost glutamátu ve fermentační půdě nevede bez příkrmové technologie k dostatečně aktivnímu produktu.

Množství acylázy glutaryl-7-ACK v buňkách, odstředěných, promytých 0,1 M fosfátovým pufřem pH 7,0 a suspendovaných do původního objemu tímtéž fosfátovým pufrem, bylo stanoveno měřením počáteční rychlosti hydrolýzy glutaryl-7-ACK v 0,1 M fosfátovém pufru o pH 7,0 při teplotě 37 °C a koncentraci glutaryl-7-ACK 0,5 % (hmota/objem). Za stejných podmínek byla stanovena volná acyláza glutaryl-7-ACK v čirém supematantu po odstředění buněk. Produkt reakce 7-ACK byl stanoven spektrofotometricky za použití p-dimethylaminobenzaldehydu (Balasingham a sp. Biochim. Biophys. Acta 276, 250-280, 1972). Jedna jednotka (U) enzy mové aktivity je množství enzymu, které odpovídá tvorbě jednoho mikromolu 7-ACK za minutu. Specifická aktivita je definována jako U.g‘^lsuché hmoty buněk. Pro zjišťování koncentrace amonných iontů byla použita metoda (Marham, Biochem. J. 36. 790 1942).

Dále je vynález doložen v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Do 500 ml varných baněk bylo přidáno 100 ml živné půdy, obsahující kvasničný autolyzát (Imuna, Šarišské Michalany, SR) v množství 2 % (hmota/objem), a pH bylo upraveno na hodnotu 7,2. Baňky byly uzavřeny zátkami z buničité vaty a sterilizovány 30 minut při 120 °C. Po zchladnutí byl asepticky přidán roztok kanamycinu v koncentraci 0,05 mg.ml'¹ a živná půda byla očkována kličkou z čerstvé kultury Escherichia coli CCM 3987 (pKS 55), vyrostlé za 48 až 72 hodin při 30 °C na pevné LB půdě následujícího složení: trypton (Oxoid) 1 %, kvasničný extrakt (Oxoid) 1 %, agar (Oxoid) 1,5 %, pH 7,2, sterilizace půdy 30 minut při 120 °C, a do půdy zchladlé na 55 °C byl přidán kanamycin v koncentraci 0,05 mg.mr¹. Po zaočkování byly buňky inkubovány 24 hodin při 30 °C na rotačním třepacím stroji (240 otáček za minutu, výstředník 25 mm).

Ve fermentačním tanku CHEMAP AG (Switzerland CH-8708, Maennedorf) o objemu 14 1 (vnitřní průměr 221 mm, výška 400 mm), vybaveném čtyřmi zarážkami, dvěma čtyřlopatkovými (výše lopatky 20 mm, délka 19 mm) míchadly (šířka 74 mm) na společné ose a vzdušnící tryskou pod spodním míchadlem, bylo připraveno 10 litrů živné půdy následujícího složení: kvasničný autolyzát (Imuna) 2 %, glycerol 0,15 %, glutamát sodný 1,23 %, silikonové protipěnidlo SAG 471 0,01 % a pH 7,2 bylo upraveno roztokem 40% NaOH. Půda ve fermentoru byla sterilizována 35 minut při teplotě 120 °C. Dále byly připraveny sterilní zásobní roztoky pro příkrmy: 11 50 % glycerolu (hmota/objem) a 120 ml 30% (NH₄)₂SO₄ (hmota/objem) v destilované vodě.

Do sterilní živné půdy ve fermentačním tanku bylo asepticky přidáno 200 ml inokula (2 baňky) s přidaným 1 ml roztoku thiaminu (25 mg.ml¹) a provedena kultivace při teplotě 28 °C.

-3 CZ 284178 B6 vzdušnění 0,5 objemu vzduchu najeden objem živné půdy za minutu při frekvenci míchání 530 otáček za minutu. Během kultivace bylo měřeno pH a parciální tlak kyslíku (pO₂) a odebírány vzorky (první za 6 až 8 hodin a další vždy po dvou hodinách) na stanovení optické, aktivity acylázy, suché hmoty buněk a amoniakálního dusíku. Roztok glycerolu (50%, hmota/objem) byl přidáván v množstvích, odpovídajících 0,1% výsledné koncentraci glycerolu v živné půdě, a to v 17. a 19. hodině kultivace. Další glycerol byl přidáván při vzestupu ρθ₂. V průběhu fermentace byl pO₂ udržován regulací otáček pod hodnotou 20 %. Roztok síranu amonného (30%, hmota/objem) byl přidáván v množství, odpovídajícím 0,015% výsledné koncentraci NH4+ v půdě v případě, že koncentrace amoniakálního dusíku klesla pod 100 mg.r¹. Hodnota pH se bez úpravy v průběhu fermentace pohybovala v rozmezí hodnot 6,8 až 7,6. V 70. hodině kultivace bylo dosaženo produkce 5600 U buněčné acylázy glutaryl-7-ACK v 1 litru fermentační kapaliny (aktivita promytých buněk) a 700 U volné acylázy glutaryl-7-ACK na 1 litr odstředěného supematantu. Nárůst buněk odpovídal 16,4 g suché hmoty.Γ¹ a specifická aktivita odpovídala 341 U.g'¹ suché hmoty buněk.

Příklad 2

Byla připravena kultura na pevném agaru a inokulum v buňkách stejným způsobem, jak je uvedeno v příkladu 1. Ve stejném fermentoru, jak je uvedeno v příkladu 1, byla připravena stejná živná půda, s tím rozdílem, že místo glycerolu obsahovala 0,05 % glukózy. Byly připraveny sterilní zásobní roztoky jako příkrmy: 2 litry 25% roztoku glukózy a 200 ml 30% síranu amonného. Kultivace probíhala za stejných podmínek jako v příkladu 1, stím rozdílem, že v průběhu kultivace byl dávkován roztok glukózy tak, aby koncentrace glukózy v živné půdě po přidání odpovídala 0,05 %. Síran amonný byl dávkován obdobným způsobem jako v příkladu 1. Hodnota pH se bez úpravy během celé fermentace pohybovala v rozmezí hodnot 6,9-8,0. V 70. hodině kultivace bylo dosaženo produkce 5050 U buněčné acylázy v 1 litru fermentační kapaliny (aktivita promytých buněk) a 94 U volné acylázy na 1 litr odstředěného supematantu. Nárůst buněk odpovídal 14 g suché hmoty.l'¹ a specifická aktivita odpovídala 360 U.g’¹ suché hmoty buněk.

Příklad 3

Byla připravena kultura na pevném agaru a inokulum v buňkách stejným způsobem, jak je uvedeno v příkladu 1, s tím rozdílem, že živná půda pro přípravu inokula obsahovala kvasničný autolyzát (Imuna) v koncentraci 3 % namísto 2 %. Ve stejném fermentoru, jak je uvedeno v příkladu 1, bylo připraveno 10 1 živné půdy s0,05% glukózy jako v příkladu 2. Byly připraveny sterilní zásobní roztoky jako v příkladu 2. Kultivace probíhala stejným způsobem, jako v příkladu 2, stím rozdílem, že v 18., 20., 21. a22. hodině byly přidány první dávky glukózy tak, aby koncentrace odpovídala 0,05 % glukózy v živné půdě, a poté bylo nasazeno řízené automatické dávkování glukózy v případě vzestupu pO₂ nad nastavenou hranici 15%. Tímto způsobem dávkování se pomocí menších a častějších dávek glukózy docílilo jemnější regulace pO₂. Hodnoty pH se bez úpravy v průběhu celé fermentace pohybovaly v rozmezí hodnot 6,8 až 7,8. V 54. hodině kultivace bylo dosaženo produkce 5150 U buněčné acylázy v 1 litru fermentační kapaliny (aktivita promytých buněk) a 100 U volné acylázy na 1 1 odstředěného supematantu. Nárůst buněk odpovídal 12,7 g suché hmoty.1'¹ a specifická aktivita odpovídala 405 U.g'¹.

-4CZ 284178 B6

Příklad 4

Byla připravena kultura inokula stejným způsobem jako v příkladu 3. Pro kultivaci byl použit stejný fermentor a živná půda jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že namísto glutamátu sodného živná půda ve fermentoru obsahovala 0,88 % L-pyroglutamové kyseliny (Fluka). Substance při přípravě půdy byla rozpuštěna zvlášť, neutralizována 20% roztokem NaOH a přidána před sterilizací k ostatním složkám živné půdy. Podmínky fermentace a způsob dávkování glukózy byly voleny jako v příkladu 3. V 60. hodině kultivace bylo dosaženo produkce 4000 U buněčné acylázy v 1 1 fermentační kapaliny (aktivita promytých buněk) a 80 U volné acylázy na 1 1 odstředěného supematantu. Nárůst buněk odpovídal 11 g suché hmoty.I'¹ a specifická aktivita odpovídala 363 U.g'¹ suché hmoty buněk.

Příklad 5

Byla připravena kultura na pevném agaru stejným způsobem, jak je uvedeno v příkladu 1. Do 500 ml varných baněk bylo přidáno 50 ml živné půdy obsahující kvasničný extrakt (Ohiy) v množství 3 % (hmota/objem) a pH bylo upraveno na hodnotu 7,2. Sterilizace baněk, způsob očkování a kultivace byl stejný jako v příkladu 1.

Ve fermentačním tanku CHEMAP AG, popsaném v příkladu 1, bylo připraveno 10 1 inokulační půdy, obsahující kvasničný extrakt (Ohiy) 3 %, glukosu 0,05 %, glutamát sodný 1,23 % a silikonové protipěnidlo SAG 471 0,01 %,. Hodnota pH živné půdy byla upravena na 7,2 roztokem 40% NaOH a půda byla sterilizována 35 minut při teplotě 120 °C. Sterilní zásobní roztoky pro dávkování byly připraveny stejně, jako v příkladu 2. Do sterilní živné půdy ve fermentačním tanku bylo asepticky přidáno 200 ml inokula (4 baňky), přidán 1 ml roztoku thiaminu (25 mg.ml¹) a provedena kultivace při teplotě 28 °C, vzdušnění 0,5 objemu vzduchu na jeden objem živné půdy za minutu při frekvenci míchání 530 otáček.min¹. Během kultivace bylo měřeno pH a parciální tlak kyslíku (pO₂). Kultivace byla ukončena po 24 hodinách, kdy se začal projevovat vzrůst pO₂.

Ve 300 litrovém nerezovém tanku (průměr 490 mm, výška 1460 mm) vybaveném čtyřmi zarážkami, aeračním věncem a třemi radiálními míchadly se šesti lopatkami, umístěnými na jednom hřídeli (vzdálenost míchadel od sebe 250 mm, vzdálenost prvního míchadla ode dna 85 mm) bylo připraveno 180 1 živné půdy o složení: kvasničný extrakt (Ohiy) 2%, glutamát sodný 1,23 %, glukóza 0.05 % a silikonové protipěnidlo SAG 471 0,01 %. Hodnota pH půdy byla upravena na 7,2 a půda byla sterilizována 2x20 minut při 120 °C. Po ochlazení na 28 °C byl přidán sterilní roztok thiaminu (0,5 g, sterilizován filtrací).

Do sterilní živné půdy ve fermentačním tanku byly propařeným potrubím asepticky přidány 4 1 kultury, narostlé v očkovacím tanku, a provedena kultivace při 28 °C, vzdušnění 0,5 objemu vzduchu na jeden objem živné půdy za minutu při frekvenci míchání 200 otáček za minutu a přetlaku 0,2 bar. Během kultivace byl měřen pO₂ a pH a odebírány vzorky pro stanovení optické denzity, aktivity acylázy, suché hmoty a amoniakálního dusíku. Roztok 25% glukózy byl přidáván zpočátku v dávkách 400 ml a poté automaticky způsobem, popsaným v příkladu 3. Stejným způsobem, jako v příkladu 1, byl udržován pO₂ a provedeno přikrmování síranem amonným. Hodnota pH během celé kultivace se pohybovala v rozmezí hodnot 7,8 až 8,2. V 66. hodině kultivace bylo dosaženo produkce 6722 U buněčné acylázy v jednom litru fermentační kapaliny (aktivita promytých buněk) a 400 U volné acylázy na 1 litr odstředěného supematantu. Výtěžek buněk odpovídal 16,5 g suché hmoty a specifická aktivita acylázy byla 407 U.g’¹ suché hmoty buněk.

- 5 CZ 284178 B6

Příklad 6

Byla připravena kultura inokula 1.generace v baňkách a 2.generace inokula v očkovacím tanku jako v příkladu 5. V 330 1 nerezovém tanku, vybaveném zařízením, jak je popsáno v příkladu 5, byla připravena živná půda jako v příkladu 5, s tím rozdílem, že půda obsahovala kvasničný extrakt (Ohiy) v koncentraci 3 % (namísto 2 %) a neobsahovala žádný glutamát. Způsob krmení glukózou a síranem amonným ze zásobních roztoků a řízení kultivace bylo provedeno podle příkladu 5, s tím rozdílem, že ve 46. hodině fermentace byl asepticky přidán roztok glutamátu sodného tak, že jeho výsledná koncentrace ve fermentační půdě činila 0,15 %, a v 55. hodině bylo sníženo vzdušnění na 0,25 objemu vzduchu najeden objem fermentační tekutiny za minutu a míchání na 150 otáček za minutu. Hodnota pH se bez úpravy v průběhu celé kultivace pohybovala v rozmezí hodnot 7,2 až 8,0. V 51. hodině kultivace bylo dosaženo produkce 4723 U buněčné acylázy v 1 litru fermentační kapaliny (aktivita promytých buněk) a 305 U volné acylázy v 1 litru odstředěného supematantu. Nárůst buněk odpovídal 15,5 g suché hmoty.f¹ a specifická aktivita acylázy byla 305 U.g 'suché hmoty buněk. V 64. hodině kultivace bylo dosaženo produkce 3352 U buněčné acylázy v 1 litru fermentační kapaliny (aktivita promytých buněk) a 2677 U volné acylázy v 1 litru odstředěného supematantu.

Příklad 7

Bylo připraveno inokulum a 101 půdy s glutamátem ve fermentoru CHEMAP AG způsobem jako v příkladu 2. Kultivace byla prováděna jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že nebylo v jejím průběhu použito žádných příkrmů. Hodnota pH během kultivace vzrůstala až na hodnotu 8,9 ve 30. hodině, a poté byla kultivace ukončena. Produkce buněčné acylázy byla 1520 U v 1 litru fermentační kapaliny (aktivita promytých buněk), nárůst buněk odpovídal 6,6 g suché hmoty.f¹ a specifická aktivita byla 230 U.g'¹.

Příklad 8

Do 500 ml varných baněk bylo přidáno 100 ml živné půdy o složení: pepton 1 %, předsrážený kukuřičný extrakt (CSL) odpovídající 0,6% suché hmoty a protipěnidlo SAG 471 0,01%. Hodnota pH byla upravena 40% roztokem NaOH na 7,2. Baňky byly uzavřeny zátkami z buničité vaty a sterilizovány 30 minut při 120 °C. Předsrážený kukuřičný extrakt byl připraven následovně: 10 g vlhké hmoty kukuřičného extraktu (60% suché hmoty) bylo rozpuštěno ve 400 ml destilované vody ve 2 1 Erlenmayerově baňce, pH bylo upraveno na 7,6 40% roztokem NaOH a suspenze byla zahřívána na 100 °C. Poté byla suspenze částečně ochlazena a vzniklé sraženiny odstraněny filtrací. Čirý filtrát byl doplněn na 500 ml. Při přípravě půdy byl předsrážený extrakt ředěn 1:1. Před kultivací byl do půdy přidán roztok kanamycinu (sterilizace filtrací) v koncentraci 0,05 mg.mf¹ půdy. Připravená tekutá živná půda (10 baněk) byla použita pro přípravu inokula. Očkování a příprava inokula bylo provedeno způsobem jako v příkladu 1.

V nerezovém tanku o objemu 75 litrů (průměr 350 mm, výška 810 mm) vybaveném duplikátorem, 4 zarážkami, aeračním věncem, třemi radiálními míchadly se šesti lopatkami o průměru 120 mm, umístěnými na jednom hřídeli (vzdálenost míchadel od sebe 250 mm, spodního ode dna 85 mm) byl připraven roztok předsráženého kukuřičného extraktu tak, že 500 g vlhké pasty (60 % suché hmoty) bylo rozpuštěno ve 20 litrech vodovodní vody a přidáno 1,3 g silikonového protipěnidla SAG 471 0,01 %. Hodnota pH byla za míchání upravena na 7,6 50% roztokem

NaOH (hmota/objem) a suspenze byla zahřívána na 100 °C po dobu 15 minut. Po částečném ochlazení byla suspenze odstředěna na průtokové odstředivce Sharpless. Po oddělení sedimentu bylo celé množství čirého supematantu přeneseno zpět do očkovacího tanku, smíseno s 500 g peptonu a hodnota pH upravena na 7,2 a objem na 50 litrů. Takto připravená půda, obsahující pepton 1 % a předsrážený CSL, odpovídající 0,6 % suché hmoty, byla sterilizována 40 minut při

-6 CZ 284178 B6 teplotě 120 °C. Poté byla půda ochlazena na teplotu 28 °C. Do sterilní živné půdy byl asepticky přidán 1 1 připraveného inokula a provedena kultivace při teplotě 28 °C, vzdušnění 0,5 objemu vzduchu najeden objem živné půdy za minutu při míchání 330 otáček, min'¹ a přetlaku 0,2 bar. Během kultivace, která probíhala 16-18 hodin, byl sledován růst kultury měřením optické denzity, pH a pO₂.

Ve 300 litrovém nerezovém tanku, popsaném v příkladu 5, byl připraven roztok předsráženého kukuřičného extraktu následujícím způsobem. 9 kg vlhké hmoty CSL bylo rozpuštěno ve 140 litrech vodovodní vody, pH bylo upraveno 50% roztokem NaOH na 7,6 a přidáno 22 g SAG 471. Obsah fermentoru byl zahříván 15 minut při 100 °C. Po částečném ochlazení byla suspenze centrifugována na průtokové odstředivce Alfa-Laval a získaný čirý supematant byl přenesen do rezervní nádrže a poté zpět do fermentoru. K supematantu bylo přidáno 0,3 kg glycerolu a 2,46 kg glutamátu sodného, pH upraveno na 7,2 a objem na 196 litrů. Půda byla sterilizována 2x20 minut při 120 °C. Po ochlazení na 28 °C byl přidán sterilní roztok thiaminu (0,5 g, sterilizace filtrací). Dále byly připraveny sterilní zásobní roztoky pro příkrmy: 18 litrů 50% glycerolu (hmota/objem) v destilované vodě (sterilizace 40 minut při 120 °C) a 1,2 litru 30% roztoku síranu amonného (sterilizace 30 minut při 120 °C).

Očkování sterilní živné půdy bylo provedeno přepuštěním 4 1 kultury, narostlé v očkovacím tanku, potrubím bezprostředně před inokulací sterilizovaným párou. Kultivace probíhala za podmínek, popsaných v příkladu 5, s tím rozdílem, že byl dávkován 50% roztok glycerolu (první dávka 400 ml, pak automatické dávkování řízené podle pO₂). Hodnota pH se po celou dobu fermentace pohybovala v rozmezí hodnot 7,0-7,8. V 65. hodině kultivace bylo dosaženo produkce 5800 U buněčné acylázy v 1 litru fermentační kapaliny (aktivita promytých buněk) a 450 U volné acylázy v 1 litru odstředěného supematantu. Výtěžek buněk byl 14,3 g suché hmoty.r¹ a specifická aktivita 405 U.g^suché hmoty buněk.

Příklad 9

Příprava 1. a 2. generace inokula v baňkách a inokulačním tanku a příprava média ve fermentačním tanku o objemu 300 1 byly provedeny jako v příkladu 8, s tím rozdílem, že živná půda nebyla doplněna glutamátem sodným. Jednorázová příkrmová kultivace probíhala způsobem jako v příkladu 8. Hodnota pH se během celé fermentace pohybovala v rozmezí 6,9-8,0. V 54. až 68. hodině kultivace bylo dosaženo produkce 2000-2200 U buněčné acylázy (aktivita promytých buněk) a 200 U.l'¹ volné acylázy v 1 litru čirého odstředěného supematantu. Výtěžek buněk odpovídal 8,5-12 g suché hmoty.!'¹ a specifická aktivita byla 220 U.g'¹ suché hmoty buněk.

Průmyslová využitelnost.

Způsob podle vynálezu lze využít ve farmaceutickém průmyslu zejména k přípravě polosyntetických cefalosporinů.

Claims (5)

1. Způsob jednorázové příkrmové submerzní kultivace buněk, zejména buněk Escherichia coli, obsahujících rekombinované plazmidy, produkujících acylázu 7β-(4—karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny k enzymové přeměně 7[3-acylaminocefem sloučenin na 7-aminocefem sloučeniny v živných půdách, obsahujících aminokyseliny, zejména kyselinu glutamovou v koncentraci do 0,1 % hmotn., vyznačený tím, že se produkční mikroorganismus kultivuje v tekuté živné půdě, obsahující organický zdroj asimilovatelného dusíku v množství 0,1 až 6,0% hmotn. , asimilovatelného uhlíku v množství 0,01 až 10,0% hmotn. a glutamovou kyselinu a/nebo deriváty glutamové kyseliny ve formě volné kyseliny a/nebo ve formě soli v koncentraci 0,1 až 3,0 % hmotn.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se anorganický asimilovatelný zdroj uhlíku, popřípadě dusíku, přidává do živné půdy v dávkách, popřípadě nepřetržitě za současné regulace vzdušnění.

3. Způsob podle nároků la2, vyznačený tím, že se glutamová kyselina a/nebo deriváty glutamové kyseliny ve formě volné kyseliny a/nebo ve formě solí přidávají na začátku, nebo v průběhu fermentace v exponenciální nebo stacionární fázi růstu.

4. Způsob podle nároků laž3, vyznačený tím, že se namísto glutamové kyseliny a/nebo derivátů glutamové kyseliny používají dusíkaté zdroje s jejím vysokým obsahem.

5. Způsob podle nároků 1 až 4, vyznačený tím, že se v průběhu fermentace reguluje parciální tlak kyslíku v rozsahu 2 až 60 % a teplota v rozsahu 10 až 32 °C.