CS262502B1 - Způsob submersní kultivace bakteriirodu Pseudomonas produkujících hydrolázu 7p-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny - Google Patents

Abstract

Řešeni se týká způsobu submersní jednorázové kultivace bakterií produkujících vnitrobuněčnou hydrolázu 7-beta~(4- -karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny pro přípravu 7-aminocefemsloučenin, zejména 7-aminocefalosporánové kyseliny, která je významným meziproduktem pro výrobu polosyntetických cefalosporinů. Způsob submersní kultivace spočívá v tom, že produkční kmeny, zejména z rodu Pseudomonas se v prvé fázi růstu kultivují v tekuté živné půdě obsahující organický zdroj asimilovatelného dusíku a v druhé fázi růstu se kultivují v tekuté živné půdě, obsahující dusíkaté komplexní substráty, s výhodou bílkovinné hydrolyzáty, doplněné dalším organickým zdrojem dusíku, například předsráženým kukuřičným extraktem, při kultivační teplotě 18 až 35 °C, vzdušnění 0,2 až 1,0 objemu vzduchu na objem živné půdy.

Description

Vynález se týká způsobu submersní kultivace bakterií z rodu Pseudomonas k enzymové přeměně 7-beta-acylaminocefemsloučenin na 7-aminocefemsloučeniny, zejména 7-beta-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny (dále jen glutaryl-7-ACK) na 7-aminocefalosporánovou kyselinu (dále jen 7-ACK).

Způsobem submersní jednorázové kultivace produkčních buněk bakterií z rodu Pseudomonas podle předmětného postupu je získána, po oddělení buněk z fermentační kapaliny, biomasa s vysokou aktivitou hydrolázy 7-beta-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny (dále jen hydroláza glutaryl-7-ACK), která je pak využitelná pro jednorázovou enzymovou konverzi glutaryl-7-ACK na 7-ACK, která slouží jako farmaceuticky významný meziprodukt pro výrobu polosyntetických cefalosporinů, zejména cefazolinu a cefalotinu.

Je známo několik produkčních mikroorganismů, schopných syntézy uvedené specifické hydrolázy, jako Pseudomonas ovalíš, Comamonas (japonské patentové spisy č. 75 101 584, č. 7859095, č. 8 185 298 a č. 7 894 093), Bacillus, Arthrobacter, Alcaligenes (japonské patentové spisy č. 77 128 293 a č. 7 886 094). V čs. autorských osvědčeních č. 239 293 a č. 251 111 je používán kmen Pseudomonas sp. CCM 3 635 a CCM 3 987.

Glutaryl-7-ACK, resp. její deriváty, lze získat z cefalosporinů C, popřípadě z příslušných derivátů, bud chemicky (japonské patentové spisy č. 7 777 078 a č. 78 112 891), nebo enzymově působením nativních či imobilizovaných a permeabilizovaných buněk s aktivitou oxidázy D-aminokyselin (britský patentový spis č. 1 272 769, japonské patentové spisy č. 7 744 695, č. 7 688 694, č. 77 125 696 a č. 8 023 966).

Pro submersní kultivaci kmenů, producentů hydrolázy glutaryl-7-ACK, jsou nutné vhodné kultivační podmínky a vhodné substráty pro přípravu živných půd, zajištujících produkci enzymově aktivní biomasy. Je známo, že pro produkci buněk s uvedenou vnitrobuněčnou hydrolázou jsou jako součást živných půd používány dusíkaté komplexní substráty, např. pepton, kvasničný a hovězí extrakt a dále kasein nebo extrakt ze sušených ryb (Bonito extrakt) s doplňkem solí glutamové kyseliny (japonský patentový spis č. 75 101 584 a Agric. Biol. Chem. 452 225, 1981). Za použiti běžných komplexních substrátů (pepton, kvasničný a hovězí extrakt) je však dosahováno nízké produkce enzymu a navíc je nutná dlouhá kultivační doba pro dosažení maximální aktivity hydrolázy v buňkách (až 8 dni). Další substráty jsou hůře dostupné a vyžadují přídavky glutamátu.

Předmětný způsob kultivace bakteriálních buněk s aktivitou hydrolázy glutary-7-ACK od- . straňuje zmíněné nevýhody, nebot výchozí suroviny pro přípravu dusíkatých komplexních substrátů jsou výhodné z hlediska ceny a dostupnosti, nevyžadují přídavky solí glutamové kyseliny a při jejich použití jako složek živných půd je dosaženo maximum požadované enzymové aktivity za relativně krátkou dobu kultivace 27 až 48 hodin.

Jako dusíkatých komplexních substrátů lze s výhodou použít kyselých, alkalických nebo proteolytickým natrávením vzniklých bílkovinných hydrolyzátů, přičemž výchozím zdrojem jsou suroviny mikrobiálního živočišného a/nebo rostlinného původu, jako je např. keratin, sojová mouka, arašídová mouka, lepek nebo sladové klíčky. Pro přípravu živných půd lze hydrolyzáty doplnit dalším vhodným komplexním substrátem, jako je např. kvasničný nebo kukuřičný extrakt.

Předmětný způsob submersní kultivace bakterií spočívá v tom, že se v první fázi kultivuje produkční mikroorganismus v tekuté živné půdě, obsahující organický zdroj asimilovateIného dusíku v množství 0,5 až 1,5 g/litr^-2 živné půdy, který současně slouží jako zdroj uhlíku, jako je např. pepton, kukuřičný nebo kvasničný extrakt.

Předmětný způsob dále spočívá v tom, že v druhé fázi růstu se pak kultivace provádí v živné půdě obsahující bílkovinné hydrolyzáty doplněné dalším komplexním dusíkatým zdrojem, jako je kvasničný a kukuřičný extrakt s obsahem asimilovatelného dusíku 0,5 až 2,0 g.litr ² živné půdy.

Před přídavkem kyselých bílkovinných hydrolyzátů do živných půd lze hydrolyzáty neutralizovat přídavkem vhodných alkálií, např. hydroxidem sodným. Kukuřičný extrakt lze s výhodou použít v předsrážené formě, tj. po úpravě pH vodného roztoku kukuřičného extraktu v rozmezí hodnot pH 7,0 až 8,0, povařením a separací vzniklých sraženin, filtrací nebo centrifugací. Použití předem předsráženého kukuřičného extraktu eliminuje vznik sraženin při sterilizaci živných půd, které znečišťují biomasu s požadovanou aktivitou hydrolázy, separovanou po skončení kultivace ze živné půdy.

Předmětný způsob dále spočívá v tom, že se kultivace provádí za teploty 18 až 35 °C a vzdušnění 0,2 až 1,0 objemu vzduchu na objem živné půdy. Pro očkování živné půdy v druhé fázi růstu je výhodné použít kultury charakterizované jejím přechodem do stacionární fáze růstu.

Kultivace v druhé fázi je ukončena po dosažení maximální specifické aktivity uvedeného enzymu, načež se buňky separují odstředěním, čímž se získá enzymově aktivní biomasa, kterou lze jednorázově použít jako zdroj pro výrobu zmobilizovaných buněk podle čs. autorského osvědčení č. 231 458 a vzniklé částice zpevnit postupem podle čs. autorského osvědčení č. 251 111, či ji lze použít jako zdroje pro izolaci tohoto enzymu a popřípadě jeho následnou imobilizaci.

Pro předmětný způsob submersní kultivace lze použít produkční mikroorganismy z rodu Pseudomonas, s výhodou Pseudomonas sp. CCM 3 635 a Pseudomonas sp. CCM 3 987. Tyto kmeny syntetizují hydrolázu glutaryl-7-ACK v nepřítomnosti induktoru syntézy v živné půdě a nesyntetizují beta-laktamázy.

Množství této specifické hydrolázy bylo kvantitativně sledováno měřením počáteční rychlos ti hydrolýzy glutaryl-7-ACK v prostředí 0,lM fosfátovém pufru o pH 7,0 a teplotě 37 °C v oblasti enzymové kinetiky nultého řádu. Produkty reakce byly stanoveny spektrofotometricky za použití prdimethylaminobenzaldehydu (Balasingham a sp., Biochim. Biophys. Acta 276, 250, 1972) . Jedna jednotka (U) enzymové účinnosti hydrolázy glutaryl-7-ACK je takové množství enzymu, které odpovídá tvorbě jednoho mikranolu (1 ^umol) 7-ACK za minutu za výše uvedených podmínek reakce. Specifická aktivita je definována jako U.g ¹ suché hmoty buněk. 7-ACK byla sledována chromatograficky, za použití tenké vrstvy celulózy v systému n-propanol-voda (7:3) s ninhydrinovou detekcí (R^ 0,5) se semikvantitativním vyhodnocením na densitometru Vitatron TLD 100. Růst buněk během kultivace byl sledován měřením optické density kultury (OD) při vlnové délce 600 nm v 0,5 cm skleněných kyvetách po odstředění buněk, slití supernatantu a suspendování buněčného sedimentu v destilované vodě. Sušina buněk byla zjišťována gravimetricky.

V dalším je vynález doložen v následujících příkladech provedení.

Příklad 1

Do 500ml varných baněk bylo přidáno 100 ml živné půdy tohoto složení: 1 % pepton, 0,5 % hovězí extrakt, 0,1 % kvasničný extrakt, 0,5 * chlorid sodný (pH 7,.2, obsah NHj-dusíku,

g.litr^-1 živné půdy). Baňky byly uzavřeny zátkami z buničité vaty a sterilizovány v autoklávu při 120 °C a 1,2 atm 20 minut. Poté byly zaočkovány kulturou kmene Pseudomonas sp. CCM3635 kličkou ze šikmého agaru a kultivovány na rotačním třepacím stroji (240.min ¹, výstředník 25 mm) při teplotě 28 °C po dobu 48 hodin. Potom bylo 5 ml narostlé kultury použito pro inokulaci 100 ml živné půdy v 500ml varných baňkách o složení: 5 % bílkovinného hydrolyzátů (komerční výrobek Vitana), 0,1 % kukuřičného extraktu, obsah NH₂~dusíku 1,5 g.litr ¹ živné půdy, pH 7,2, sterilizace při 120 °C a 1,2 atm 20 minut. Kultivace probíhala za stejných podmínek jako při růstu první generace inokula po dobu 45 hodin.

V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce hydrolázy glutaryl-7-ACK 80 U při nárůstu odpovídajícímu 3,2 g suché hmoty. Specifická aktivita byla 25 U.g^-1 suché hmoty buněk.

262502 ' 4

Příklad 2 g kukuřičného extraktu (60 4 suché hmoty) bylo suspendováno do demineralizované vody, pH bylo upraveno 404 roztokem hydroxidu sodného na hodnotu 7,6, roztok byl doplněn vodou do jednoho litru a zahříván 15 minut při 100 °C. Potom byly vzniklé sraženiny odstraněny filtrací. Do 500 ml varných baněk bylo přidáno 100 ml živné půdy následujícího složeni: 1 4 pepton, 25 ml roztoku předsráženého kukuřičného extraktu, pH půdy 7,2, obsah NH₀-dusíku 0,8 g.litr živné půdy. Banky byly uzavřeny zátkami z buničité vaty a sterilizovány při 120 °C a 1,2 atm 20 minut. Po zchlanutí byla půda asepticky zaočkována kulturou kmene Pseudomonas sp. CCM 3 987 kličkou ze šikmého agaru. Submersní kultivace probíhala na rotačním třepacím stroji 240.min ¹, výstředník 25 mm při 29 °C po dobu 24 hodin. Potom bylo 5 ml kultury použito pro inokulaci 100 ml živné půdy v 500ml varných baňkách následujícího složení:

4 bílkovinného hydrolyzátu (komerční výrobek Vitana), 50 ml roztoku předsráženého kukuřičného extraktu, obsah NHj-dusíku 1,5 g.litr ¹ živné půdy, pH půdy 7,4, sterilizace při 120 °C, 1,2 atm 20 minut.

Po 35 hodinách růstu bylo v jednom litru kultivační kapaliny dosaženo produkce hydrolázy glutaryl-7-ACK 250 U při nárůstu buněk 3,8 g suché hmoty. Specifická aktivita byla 65 U.g ¹ suché hmoty buněk.

Příklad 3

Do baňky o obsahu 2 litrů bylo přidáno 150 g sladových klíčků, 450 ml destilované vody a po rozmíchání bylo postupně přidáváno 60 ml 964 kyseliny sírové. Po protřepání byla směs zahřívána 4 hodiny při 120 °C a tlaku 1,2 atm v autoklávu. Po zchlazení bylo ke směsi přidáno 350 ml destilované vody a směs zfiltrována. materiál na filtru promyt 250 ml teplé destilované vody (60 °C) a filtráty byly spojeny.

Bylo připraveno inokulum kmene Pseudomonas sp. CCM 3 635 za stejných podmínek jako v příkladu 2. 5 ml narostlé kultury bylo použito pro inokulaci 100 ml živné půdy následujícího Složení: 20 ml připraveného hydrolyzátu sladových klíčků, 50 ml předsráženého kukuřičného extraktu, který byl připraven způsobem popsaným v příkladu 2, půda byla doplněna demineralizovanou vodou, pH půdy 7,2, sterilizace pří 120 °C 1,2 atm 20 minut. Baňky byly kultivovány na rotačním třepacim stroji za podmínek popsaných v příkladu 2 po dobu 48 hodin.

V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce hydrolázy glutaryl-7-ACK 75 U a nárůstu buněk 3 g suché hmoty. Specifická aktivita byla 25 U.g ¹ suché hmoty buněk.

Přiklad 4

Bylo připraveno inokulum kmene Pseudomonas sp. CCM 3 987 v 500ml varných baňkách, obsahujících 100 ml živné půdy stejného složení a kultura vyrostla stejným způsobem, jak je popsáno v příkladu 2. 200 ml (2 baňky) připravené kultury první vegetativní generace bylo použito k aseptickému očkováni inokulačního tanku jak následuje:

V nerezovém tanku o objemu 150 litrů byl připraven roztok předsráženého kukuřičného extraktu tak, že 4,4 kg vlhké hmoty tohoto extraktu bylo rozpuštěno ve 100 litrech demineralizované vody, pH roztoku bylo upraveno 504 roztokem hydroxidu sodného na hodnotu pH 7,6 a objem doplněn pitnou vodou do 110 litrů. Roztok byl sterilizován 30 minut při 120 °C a 1,2 atm, potom byl ochlazen a přepuštěn na separátor Sharples a po oddělení sedimentu byl čirý supernatant přetlačen do zásobní nádoby.

Ve 1501itrovém nerezovém fermentačním tanku, který byl předem vyvařen a vypláchnut, opatřeném duplikátorem, jedním nerezovým turbinovým šestilopatkovým míchadlem o průměru 30 cm, vzdušnícím věncem a čtyřmi zarážkami, bylo připraveno 100 litrů živné půdy, následujícího složení: 1 4 pepton, 25 litrů výše uvedeného filtrátu předsráženého kukuřičného extraktu ml silikonového protipěnidla SAG 471 (Belgie). Půda byla doplněna na celkový objem 20 litrů pitnou vodou a pH živné půdy bylo za míchání upraveno 40% hydroxidem sodným na odnotu 7,2. Půda v tanku byla sterilizována 40 minut při teplotě 120 °C a tlaku 1,2 atm. oté byla půda ochlazena na teplotu 28 °C a tato teplota udržována termoregulací. Do sterilní ivné půdy v očkovacím tanku bylo aseptícky přilito 200 ml kultury první vegetativní generace i provedena kultivace při teplotě 28 °C, vzdušnění 0,5 objemu vzduchu na objem živné půdy >ři frekvenci míchání 300.min ¹. Během kultivace byl sledován růst kultury měřením optické lensity kultury. Při přechodu do stacionární fáze růstu kultury, ve 20. hodině kultivace,

3ylo inokulum vyrostlé v očkovacím tanku použito k očkování produkčního tanku.

Do 2501itrového nerezového tanku, který byl vybaven analogicky jako očkovací tank, s tím rozdílem, že na společné ose míchadla byla umístěna dvě šestilopatková míchadla a který byl vybaven pouze jednou zarážkou, bylo připraveno 150 litrů živné půdy následujícího složení:

% kyselého bílkovinného hydrolyzátu (komerční výrobek Vitana), 75 litrů předsráženého roztoku kukuřičného extraktu načerpaného z rezervní nádrže, 25 ml silikonového protipěnidla SAG 471. Celkový objem v tanku byl doplněn na 150 litrů pitnou vodou a pH živné půdy upraveno 40% roztokem hydroxidu sodného na hodnotu 7,4. Sterilizace půdy v tanku probíhala 40 minut při tepotě 120 °C a tlaku 1,2 atm.

Po ochlazení půdy bylo provedeno očkování sterilní živné půdy přepuštěním 7,5 litrů kultury narostlé v očkovacím tanku potrubím bezprostředně propařeným před inokulací (5 % inokula). Kultivace probíhala 30 hodin při teplotě 25 °C za stejných parametrů vzdušněni a míchání jako u očkovacího tanku. V průběhu kultivace byly odebírány vzorky ve čtyřhodinových intervalech, po 18. hodině kultivace ve dvouhodinových intervaiech pro stanovení aktivity enzymu (promytí sedimentu buněk 0,lM fosfátovým pufrem o pH 7,0), způsobem popsaným v popisu vynálezu a pro stanovení suché hmoty buněk (promytí sedimentu vodou).

V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce hydrolázy glutaryl-7-ACK 190 U při nárůstu buněk 3,8 g suché hmoty. Po 30 hodinách submersní kultivace byl celý objem fermentační kapaliny přepuštěn a buňky separovány na odstředivce Sharples. Získaný sediment byl dále promyt 50 litry demineralizované vody.

Ze 150 litrů fermentační kapaliny bylo získáno 2,5 kg vlhké buněčné pasty o sušině 22,5 % a specifické aktivitě 50 U.g^-1 suché hmoty buněk, tj. 562 g sušiny buněk o celkové aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 28 100 U.

g promyté buněčné pasty bylo smíseno s 90 ml roztoku 1 % glutaryl-7-ACK (obsah účinné látky 95,5 %), získaný smísením 9 g glutaryl-7-ACK s 50 ml 0,lM fosfátového pufru o pH 7,0, dávkováním 1,1M roztokem hydroxidu sodného za míchání a nepřetržitého upravování pH, které bylo udržováno na hodnotě 7,0, a doplnění týmž pufrem na celkový objem 90 ml. Směs byla inkubována za míchání při teplotě 37 °C 2 hodiny. Po této době byla provedena separace buněk z reakční směsi odstředěním a v supernatantu stanovena koncentrace 7-ACK, která odpovídala 80 % teorie konverze.

Příklad 5

V nerezovém tanku o objemu 1 m³ byl připraven roztok předsráženého kukuřičného extraktu tak, že 18 kg kukuřičného extraktu bylo rozpuštěno ve 420 litrech demineralizované vody, pH roztoku bylo upraveno 40% roztokem hydroxidu sodného na hodnotu pH 7,6 a suspenze doplněna pitnou vodou na celkový objem 450 litrů a dále zpracován stejným způsobem jako v příkladu 4.

Byla připravena kultura první vegetativní generace inokula kmene Pseudomonas sp. CCM 3 987 a druhá vegetativní generace v očkovacím tanku za podmínek a způsobem, které jsou uvedeny v příkladu 4.

Do 1 m³ nerezového tanku, který byl vybaven duplikátorem, dvěma míchadly se šesti lopatkami o průměru 35 cm, umístěnými na společné ose ve vzdálenosti 120 cm a čtyřmi zarážkami.

bylo připraveno 800 litrů živné půdy následujícího složení: 5 % kyselého bílkovinného hydrolyzátu (komerční výrobek Vitana), 400 litrů předsráženého roztoku kukuřičného extraktu načerpaného z rezervní nádrže a 135 ml silikonového protipěnidla SAG 471. Objem byl doplněn na 800 litrů pitnou vodou. Oprava pH a sterilizace živné půdy byla provedena způsobem uvedeným v příkladu 4.

Po ochlazení půdy bylo provedeno očkování sterilní živné půdy v produkčním tanku tlakovým přepuštěním předem propařeným potrubím 40 litrů kultury druhé vegetativní generace z počátku stacionární fáze růstu, tj. ve 20. hodině kultivace (5 % inokula). Submersní kultivace a její sledování bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 4. Kultivace trvala 30 hodin.

V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce hydrolázy glutaryl-7-ACK 160 U při nárůstu 3,7 g suché hmoty buněk. Po separaci buněk stejným způsobem jako v příkladu 4 bylo získáno z 800 litrů fermentační kapaliny 12,18 kg vlhké buněčné pasty o sušině 23 % a specifické aktivitě 43,2 U.g suché hmoty buněk, tj. 2 801 g sušiny buněk o celkové aktivitě 121 003 U.

Hydrolýza roztoku glutaryl-7-ACK byla prováděna stejným způsobem jako v přikladu 4. Konverze glutaryl-7-ACK na 7-ACK byla 85 % teorie za 2 hodiny.

Příklad 6

Byl připraven kyselý hydrolyzát arašídové mouky následujícím způsobem. K 17,5 litrům pitné vody bylo přidáno 2,5 litru technické kyseliny sírové (96%) ia 3,75 kg arašídové mouky. Suspenze byla hydrolyzována 8 hodin za míchání při teplotě 120 °C a 1,2 atm. Po této době byla hydrolyzovaná suspenze neutralizována 40% roztokem hydroxidu sodného na hodnotu pH 7,0 a doplněna na objem 50 litrů pitnou vodou. Stejným způsobem jako v příkladu 4 byl připraven roztok předsráženého kukuřičného extraktu.

Byla připravena kultura první vegetativní generace kmene Pseudomonas sp. CCM 3 987 a druhá vegetativní generace inokula téhož kmene v očkovacím tanku stejného vybavení, při stejném složení půdy a způsobu provedení jako v příkladu 4.

Do 2501itrového nerezového produkčního tanku, vybavení jako v příkladu 4, bylo připraveno 150 litrů živné půdy stejného složení rovněž jako v příkladu 4, avšak místo bílkovinného hydrolyzátu bylo přidáno 37,5 litrů kyselého hydrolyzátu arašídové mouky. Submersní kultivace probíhala po dobu 48 hodin za jinak stejných podmínek uvedených v příkladu 4.

V jednom litru kultivační kapaliny bylo dosaženo produkce hydrolázy glutaryl-7-ACK 80 U při nárůstu buněk 3,5 g suché hmoty buněk. Výtěžek vlhké buněčné pasty ze 150 litrů kultivační kapaliny po separaci byl 2,25 kg o sušině 23 % a specifické aktivitě 22,8 U.g ¹ suché hmoty buněk, tj. 517,5 g sušiny buněk o celkové aktivitě 11 799 U. Konverze roztoku glutaryl-7-ACK na 7-ACK za podmínek reakce uvedených v příkladu 4 probíhala 4 hodiny s výsledkem 78 % teorie.

Příklad 7 kg sladových klíčků bylo suspendováno v 90 litrech demineralizované vody a po rozmíchání bylo postupně přidáváno 12 litrů kyseliny sírové (96%). Směs byla za míchání zahřívána 4 hodiny při 120 °C a 1,2 atm. Po ochlazení bylo přidáno 70 litrů vody a obsah přepuštěn a z filtrován. Materiál byl na filtru promyt 50 litry teplé pitné vody ( 60 °C) a filtráty byly spojeny a neutralizovány 40% roztokem hydroxidu sodného na hodnotu 7,0. Stejným způsobem jako v příkladu 4 byl připraven roztok předsráženého kukuřičného extraktu.

Byla připravena první a druhá vegetativní generace inokula kmene Pseudomonas sp. CCM 3 987 způsobem stejným jako v příkladu 4. Způsob a postup submersní kultivace včetně použitého fermentačního zařízení byl rovněž stejný jako v příkladu 4. Kultivace však probíhala po

Ί dobu 48 hodin v živné půdě, ve které namísto bílkovinného hydrolyzátu Vitana byl použit kyselý hydrolyzát sladových klíčků v koncentraci 20 %, tj. 30 litrů na 150 litrů živné půdy.

V jednom litru kutlivační kapaliny bylo dosaženo produkce hydrolázy glutaryl-7-ACK 150 U při nárůstu buněk 3 g suché hmoty. Výtěžek vlhké buněčné pasty po separaci ze 150 litrů kultivační kapaliny byl 1,87 kg o sušině 23 % a specifické aktivitě 50 U.g ⁴ suché hmoty buněk, tj. 430 g sušiny buněk o celkové aktivitě 21 500 U.

Enzymová konverze glutaryl-7-ACK na 7-ACK za reakčních podmínek uvedených v příkladu 4 byla 80 % teorie.

Claims (2)

1. Způsob submersní jednorázové kultivace bakterií rodu Pseudomonas produkujících hydrolázu 7-beta-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny, vyznačující se tím, že se v první fázi růstu kultivuje produkční mikroorganismus v tekuté živné půdě, obsahující organický zdroj asimilovatelného dusíku v množství 0,5 až 1,5 g.litr ⁴ půdy a v druhé fázi růstu se kultivuje v tekuté živné půdě obsahující dusíkaté komplexní substráty, s výhodou bílkovinné hydrolyzáty mikrobiálního, živočišného a/nebo rostlinného původu, doplněné dalším organickým zdrojem dusíku, s výhodou roztokem kukuřičného extraktu vzniklého předsrážením za varu při pH 7,0 až 8,0 a následnou separací sraženiny, při množství asimilovatelného dusíku 0,5 až 2,0 g.litr^-^ živné půdy, při kultivační teplotě 18 až 35 °C, vzdušnění 0,2 až 1,0 objemu vzduchu na objem živné půdy, přičemž očkování z prvé fáze růstu se s výhodou provádí při přechodu kultury do stacionární fáze růstu.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako produkční mikroorganismus použijí bakteriální kmeny z rodu Pseudomonas, s výhodou Pseudomonas sp. CCM 3 635 nebo Pseudomonas sp. CCM 3 987.