JPH0514556B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明はＬ−アラニンの製法に関し、更に詳し
くはＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有
する微生物のアラニンラセマーゼ活性を除去し、
該微生物を用いてＬ−アラニンを製造する方法に
関する。 （従来の技術） Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素はＬ−アス
パラギン酸のみに作用してＬ−アラニンと炭酸ガ
スとを生成する反応を触媒する酵素である。 従来、上記Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
を利用するＬ−アラニンの製造法としては、Ｌ−
アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生
物を基質であるＬ−アルパラギン酸またはその塩
含有培地に培養する方法や該微生物の生産した酵
素を基質に作用させる方法等多数知られている。
しかしながら、一般に微生物の細胞壁の構成成分
としてＤ−アラニンが必須であるため、これらの
微生物は同時にアラニンラセマーゼ活性を有する
ことが知られており、Ｌ−アラニンの生成と共に
Ｄ−アラニンも副生してくる。従つてＬ−アスパ
ラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物を用
いて光学純度の高いＬ−アラニンを効率よく製造
するためには該微生物のアラニンラセマーゼ活性
発現を阻止する必要がある。 しかしながら現在知られている酵素を酸処理す
る方法（特開昭57−132882）では、低PHにおける
タンパク変性を引き起すため、アラニンラセマー
ゼ活性は抑えられるがＬ−アスパラギン酸β−脱
炭酸酵素活性も共に抑えられるためＬ−アラニン
の生成量が低下するという難点があつた。 （本発明が解決しようとする問題点） 上記の従来技術のもつている欠点を解決し、低
PHによるタンパク変性を防ぎながらアラニンラセ
マーゼ活性を抑え光学純度の高いＬ−アラニンの
製造法を確立することにある。 （問題点を解決するための手段） しかるに本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、
微生物の有するＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵
素活性には全く失活を与えることなく微生物のも
つアラニンラセマーゼ活性のみを選択的に失活さ
せ、同時に菌体内酵素であるＬ−アスパラギン酸
−β−脱炭素酵素の活性化を図る方法を見出し
た。 即ち、本発明によれば、Ｌ−アスパラギン酸β
−脱炭酸酵素活性を有する微生物又はその固定化
微生物をアルカリ処理することにより当該微生物
又は固定化微生物のアラニンラセマーゼ活性が除
去され、更にはこの様にして得られた微生物又は
固定化微生物にＬ−アスパラギン酸を作用させる
ことによりＬ−アラニンを製造することができ
る。 また、Ｌ−アスパラギン酸の変わりにDL−ア
スパラギン酸を用いれば、本発明の方法によりＬ
−アラニンとＤ−アスパラギン酸の混合物を製造
することもできる。 本発明方法において用いられるＬ−アスパラギ
ン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物としては
上記活性を有する微生物であればいずれも用いる
ことが出来、かかる微生物としては、例えばシユ
ードモナス・エスピーATCC19121、シユードモ
ナス・ダクネ−IAM1152、アセトバクター・ラ
ンセンスOUT8300、アクロモバクター・ペスチ
フアーIAM1446、アクロモバクター・ペスチフ
アーATCC2509，キサントモナス・ベゴニアエ
IAM1644、ブレビバクテリウム・インペリアル
ATCC8365、アースロバクター・ウレアフアシエ
ンスIAM1658、エルビニア・アロイダエ
IAM1068号等が好適にあげられる。 これらの微生物は遊離菌体のまま用いることが
でき、該菌体をそれ自体公知の方法で固定化した
微生物であつてもよく、例えば光重合生樹脂、ポ
リアクリルアミドゲル、含硫多糖類ゲル（カラギ
ーナン、フアーセレラン等、コラーゲンゲル、ア
ルギン酸ゲル、ポリビニルアルコールゲル、寒天
ゲルで固定した微生物をいずれも本発明の目的に
用いることができる。上記の内光重合生樹脂によ
る場合は例えば特開昭58−187187号記載の通り微
生物菌体の水けん濁液に光重合生樹脂〔例えば
ENT−4000〕およびベンゾインエチルエーテル
を混合したのち光照射により重合せしめることに
より、固定化微生物が得られる。また、カラギー
ナン、フアーセレラン等の含硫多糖類による場合
は例えば特開昭53−6483号に記載の通り微生物菌
体をカラギーナン水溶液にけん濁し、このけん濁
液にゲル化剤（例えば第４周期以上のアルカリ金
属、アルカリ土類金属、アンモニウムイオン等）
を接触させるか冷却してゲル化させることにより
固定化微生物が得られる。含硫多糖類としては分
子内の硫酸基含量10W／Ｗ％以上、とりわけ硫酸
基含量12〜62W／Ｗ％のものを用いるのが好まし
い。その他、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、
ポリビニルアルコールゲル、寒天ゲル等による場
合も、それ自体公知の方法例えば特開昭51−
144780号、特開昭49−30582号、特開昭49−80285
号、特開昭51−133484号記載の方法に従つて当該
微生物を処理することにより容易に相当する固定
化微生物を得ることができる。これらの固定化微
生物は例えば立方体状（１辺約３mm程度）、球状
（直径約３mm程度）、繊維状（径約１mm程度）、膜
状あるいは板状等の適当な形状に成型すればつづ
いての処理操作を効率よく実施できるので好まし
い。 上記の如き微生物又は固定化微生物のアルカリ
処理は当該微生物又は固定化微生物をアルカリ溶
液中に浸漬するか又は当該微生物又は固定化微生
物を含有する液中にアルカリを加えることにより
実施できる。アルカリとしては、例えば苛性ソー
ダ、苛性カリ、水酸化カルシウム、水酸化アンモ
ニウム、炭酸ソーダ等の無機アルカリ、テトラヒ
ドロフラン、トリスヒドロキシメチルエタン等の
有機アルカリのいずれも用いることができる。こ
れらアルカリによる処理はPH８〜12、とりわけ
8.5〜10の条件下に実施するのが好ましく、又ア
ルカリは水溶液それ自体だけでなくアルカリ緩衝
液をも用いることができる。 微生物又は固定化微生物含有液中にアルカリを
加えて実施する場合には前記アルカリを上記PH範
囲となるようにアルカリの添加量を調整すること
により行なう。更に微生物又は固定化微生物のア
ルカリ処理は約０〜60℃、とりわけ約20〜50℃で
実施するのが好ましい。接触時間は微生物が遊離
菌体の場合約３分〜24時間、とりわけ約５分〜10
時間程度とするのが好ましく、固定化微生物の場
合には約10分〜５日間、とりわけ約１〜48時間程
度とするのが好ましい。 かくして得られたアラニンラセマーゼ活性の除
去された微生物又は固定化微生物にＬ−アスパラ
ギン酸またはその塩を作用させるとＬ−アラニン
が得られ、またDL−アスパラギン酸を作用させ
ると、Ｌ−アラニンが得られＤ−アスパラギン酸
はそのまま残る。ここでＬ−アスパラギン酸また
はDL−アスパラギン酸の塩としては、例えばそ
れらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、アンモニウム塩等が好ましい。酵素反応は、
０〜50℃の広い温度範囲で実施することができる
が、微生物の酵素の安定性を考慮して30〜40℃で
実施するのが好ましい。尚、上記酵素反応に際し
ては基質溶液にピリドキサールリン酸、ケト酸
（例えばピルビン酸、α−ケトグルタール酸等）
等を適宣添加することにより該酵素反応を一層促
進させることが出来、また更にコバルトイオン、
ニツケルイオン等の２価金属イオンを添加すると
微生物の酵素活性の安定性を高めることが出来
る。 上記において、遊離の微生物を用いる場合の反
応はバツチ法で実施するのが好ましい。又、固定
化微生物を用いる場合の反応は使用する固定化微
生物が水に不溶性であるため、バツチ法によるの
みならずカラム法によつて連続的に実施すること
が出来る。例えばカラム法による場合、該固定化
微生物をカラムに充填し、このカラムにＬ−アス
パラギン酸、DL−アスパラギン酸またはそれら
の塩を有する溶液を適当な速度で導通すればＬ−
アラニンのみ、あるいはＬ−アラニンとＤ−アス
パラギン酸とを含む流出液が得られる。なおこの
場合、酸素反応により生成する炭酸ガスのカラム
内への滞留を避けるため基質溶液はカラム下部よ
り上部に向けて流すのが好ましい。またバツチ法
による場合、該固定化微生物を上記基質溶液にけ
ん濁し、かく拌する如き方法によりＬ−アラニン
のみあるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギン酸
とを含む反応液が得られる。この場合には反応終
了液から固定化微生物をろ過あるいは遠心分離す
る如き方法により取得すれば再びこれを反覆使用
することができる。これらの方法において、基質
としてDL−アスパラギン酸またはその塩を用い
る場合Ｌ−アラニンとＤ−アスパラギン酸とを含
む溶液が得られるが、これらの両者は例えば直接
晶析法、イオン交換樹脂処理等の公知の単離精製
操作を適宜組合せることのより容易に分離採取す
ることができる。上記反応を実施するにあたつて
反応進行率は固定化微生物の量、温度、反応時
間、基質の流速その他により影響される。例えば
カラム法による場合は使用する固定化微生物の量
に従い基質溶液の導通速度を、またバツチ法によ
る場合はその反応時間を適当に調整することによ
り反応進行率を100％にまで高める至適条件を見
出すことも容易である。 （作用及び効果） 以上の如く、本発明方法は(1)Ｌ−アスパラギン
酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物をアルカリ
処理するという極めて簡単な操作で該微生物のア
ラニンラセマーゼ活性を完全に除去できること。
(2)アルカリ処理により菌体内酵素であるＬ−アス
パラギン酸−β−脱炭酸酵素が活性化されるこ
と。(3)該方法は遊離の微生物にも固定化微生物に
もともに適用できること。(4)又、一旦除去される
アラニンラセマーゼ活性は長期間酵素反応を実施
しても再び出現することがないこと。(5)更にアラ
ニンラセマーゼ活性の除去された微生物を公知の
方法で固定化してもその得られる効果には何ら変
りがない等、種々のすぐれた特徴及び効果を有す
るものである。又、本発明方法によりアラニンラ
セマーゼ活性の除去された微生物あるいは固定化
微生物を用いてＬ−アスパラギン酸からＬ−アラ
ニンを製造すれば生成物中にDL−アラニンが含
まれていないので再結晶等後処理が不要であり、
この点からも本発明方法はＬ−アスパラギン酸の
工業的に極めてすぐれた製造方法となるものであ
る。 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明
する。 実施例 １ 下記により調製した微生物を用いてＬ−アスパ
ラギン酸からＬ−アラニンを生成させ、その際副
生するＤ−アラニン生成物を比較した。 (1) 微生物の調製 （本発明方法による微生物の調製） フマール酸0.5ｇ／dl、大豆蛋白加水分解物
（全窒素6.4ｇ／dl）1.8ml／dl、KH₂PO₄0.1
ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O0.1ｇ／dl、大豆油0.5
ｇ／dlおよびオレイン酸0.5ｇ／dlを含む溶液
をPH6.5に調整後、500ml容肩付フラスコに50ml
分注し、115℃で10分間殺菌した。 この倍地に、ブイヨン寒天倍地で30℃にて24
時間生育させたシユードモナス・エスピー
（Pseudomonas.sp.）ATCC19121を１白金耳植
菌し、30℃にて16時間振盪培養した。培養終了
後苛性ソーダを加えPHを9.5に調整し37℃で１
時間放置した。 （対照微生物の調製） 苛性ソーダ処理をしない以外は上記と同様に
して微生物を調製した。 (2) 実施方法 上記で得られた微生物各１ｇを、10^-4Mピリ
ドキサールリン酸を含む1ML−アスパラギン
酸アンモニウム水溶液（アンモニアでPH5.0に
調整）70mlを入れた200ml容三角フラスコに加
え37℃にて振とう反応させ反応中の全アラニン
量とＤ−アラニン量を経時的に測定した。 尚、全アラニン量の測定はロイコノストツ
ク・チトロボラムATCC8081を用いるバイオア
ツセイにより行ない、Ｄ−アラニン量の測定は
豚賢より調製したＤ−アミノ酸オキシダーゼを
作用させ生成したピルビン酸をヒドラゾンとし
て測定する方法で行なつた。 (3) 結果 結果は表１に示す通りであり本発明方法によ
り調製した微生物はＤ−アラニンを全く生成し
ないのに対し対照の微生物は20時間目における
Ｄ−アラニン生成量が約25％に達することが認
められた。

【表】 実施例 ２ 下記より調製した固定化微生物を用い反応を実
施し反応終了液中のＤ−アラニン生成量を比較し
た。 (1) 固定化微生物の調製 （本発明方法による固定化微生物の調製） 実施例１(1)と同様の倍地を500ml容坂口フラ
スコ10本に50ml宛分注しこれにシユードモナ
ス・エスピーATCC19121を植菌した。30℃で
16時間振とう培養したのちこれに苛性カリを加
えPHを10.0に調整し30℃で１時間放置した。こ
れに酢酸を加えPH5.0に調整したのち遠心分離
することによりシユードモナス・エスピー菌体
10ｇ（湿重量）を集めた。 0.05M酢酸バツフアー（PH５）25mlに光重合
性樹脂ENT−400010ｇおよびベンゾイルエチ
ルエーテル100mgを溶解した溶液に上記菌体10
ｇを投入した。混合した後、透明フイルム上に
流し込み、300〜400nmの近紫外線を表裏に３
分づつ照射した。得られた重合物を５×５mmの
大きさに切断し固定化シユードモナス・エスピ
ーを得た。 （本発明方法の固定化微生物の調製） 上記と同様の倍地、菌体を用いて上記と同様
に30℃で24時間振とう培養したのち遠心分離し
てシユードモナス・エスピー菌体10ｇ（湿重
量）を集めた。 この菌体を用い上記固定化操作を行ない固定
化シユードモナス・エスピーを得た。このゲル
を10ｍML−アスパラギン酸を含む0.2M炭素ソ
ーダ緩衝液（PH10.0）260ml中に浸漬し30℃に
て24時間放置した。その後0.05M酢酸バツフア
ー（PH５）で洗浄することにより固定化シユー
ドモナス・ダクネーを得る。 （対照微生物の調製） 上記本発明方法による微生物と同様にして
調製した。固定化微生物を以後何ら処理するこ
となく用いた。 (2) 実験方法 固定化シユードモナス・エスピー40ｇをそれ
ぞれ実容200mlの撹拌型反応器に入れ、10^-4M
ピリドキサールリン酸を含む1ML−アスパラ
ギン酸アンモニウム溶液（アンモニアにてPH
6.0に調整）になるように添加し、37℃で20時
間反応したその反応液の全アラニンとＤ−アラ
ニン濃度を測定した。 尚、全アラニン量およびＤ−アラニン量の測
定は実施例１と同様にして行なつた。 (3) 結果 結果は下記表２に示す通りであり、本発明方
法により調製した固定化微生物はＤ−アラニン
を全く生成しないのに対し、対照の固定化微生
物は約７％のＤ−アラニンを生成することが認
められた。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有
   する微生物またはその固定化微生物をアルカリ処
   理した後、アラニンラセマーゼ活性の除去された
   当該微生物または固定化微生物にＬ−アスパラギ
   ン酸若しくはDL−アスパラギン酸、またはそれ
   らの塩を作用させることを特徴とするＬ−アラニ
   ンの製造法。