DE1442206C3

DE1442206C3 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure

Info

Publication number: DE1442206C3
Application number: DE1965A0049770
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Tokio Araki; Tetsukazu Goto; Shiro Tokio Hayakawa; Takatsugu Yokohama Kawano; Hiroshige Kojima; Shuichi Nishio; Miyazaki Nobeoka; Takeyoshi Ohsawa; Mitsuru Shibukawa; Hideomi Takahashi
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1964-07-18
Filing date: 1965-07-17
Publication date: 1978-11-23
Also published as: DE1442206A1; DE1442206B2

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch aerobes Züchten von Biotin erfordernden, L-Glutaminsäure erzeugenden Bakterien in einem Kulturmedium, das als hauptsächliche Kohlenstoffquelle einen Anteil enthält, der aus Rohrzucker-Abfallmelassen und Rübenzucker-Abfallmelassen besteht, und das Biotin in einer größeren Menge enthält, als für das maximale Wachstum der Bakterien erforderlich ist, in Gegenwart von einem oder zwei oberflächenaktiven Mitteln.

Ein derartiges Verfahren ist aus der belgischer Patentschrift 6 35 600 bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren sind schon zu Beginn der Fermentation die Oberflächenmittel im ursprünglichen Kulturmedium, d. h. bereits vor dem Einimpfen des Mikro-Organismus, und damit vor dem Wachstum des Mikroorganismus bereits vorhanden. Wie sich gezeigt hat, sind die Ausbeuten der L-Glutaminsäure beim bekannten Verfahren relativ niedrig, so daß ein industrieller Einsatz nicht möglich ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure der eingangs genannten Art zu schaffen, bei dem die Ausbeute erheblich verbessert ist, so daß der Einsatz des Verfahrens im industriellen Maßstab möglich ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß während des anfänglichen Stadiums der logarithmischen Wachstumsperiode der Bakterien eine Komponente, die aus einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel vom Polyoxyäthylen-Fettsäureester-Typ eo oder einem kationischen Oberflächenmittel vom Alkylaminsalz-Typ besteht, zugefügt wird, und daß zu einer passenden Zeit zwischen dem mittleren Stadium und dem Endstadium des logarithmischen Wachstums der Bakterien ein kationisches oberflächenaktives Mittel vom Alkylaminsalz-Typ zugefügt wird.

Geeignete oberflächenaktive Mittel vom nichtionischen Typ sind das Polyoxyäthylenmonostearat, das Polyoxyäthylenmonopalmitat, das Polyoxyäthylenmonomyristat. Geeignete oberflächenaktive Mittel vom kationischen Typ sind das Decylamin, das Laurylamin, das Myristylamin, das Palmitylamin. Wenn diese oberflächenaktiven Mittel allein in einem Herstellungsverfahren in industriellem Maßstab verwendet werden, ist die Anreicherung an L-Glutaminsäure sehr niedrig.

Die Tabelle zeigt die Beziehungen zwischen den im Kulturmedium vorhandenen Mengen an Biotin und den dabei erzeugten Mengen an L-Glutaminsäure.

Tabelle	Biotins	L-Glutaminsäure (g/dl)	4,13
Wirkungen des	Menge an	Bacterium	4,81
	Getestetes	M. ammoniaphilum	5,68
	C.	melassecola ATCC 15354	7,25
Vorhandenes		4,53	8,67
Biotin		5,38	8,55
0	7,11
5	8,43
10	9,52
20	9,27
50
100

Bemerkung

Die Ergebnisse wurden nach 35stündigem Züchten unter denselben Bedingungen, wie sie anschließend in Beispiel 5 beschrieben werden, erhalten.

Die Fermentation wird daher bei der Erfindung in einem Kulturmedium durchgeführt, das Biotin in einer größeren Menge enthält, als es für das maximale Wachstum der verwendeten Bakterien erforderlich ist. Bei Nichterfüllen dieser Bedingung ergibt sich bei dem Zweistufen-Zugabesystem der oberflächenaktiven Mittel der Erfindung kein befriedigendes Ergebnis.

Bevorzugt werden Polyoxyäthylen-Fettsäureester, die aus Fettsäuren mit 14-18 Kohlenstoffatomen und Polyoxyäthylenteilen mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 200-1500 bestehen. Bevorzugte Alkylamin-Salze enthalten Alkylgruppen mit 10-18 Kohlenstoffatomen.

Ein pH-Wert von 6-9 des Kulturmediums ist ausreichend; die besten Ergebnisse erhält man mit einem pH-Wert von 7-8. Als Züchtungstemperatur kann eine Temperatur ausgewählt werden, die innerhalb eines passenden Bereiches, der für gewöhnlich bei den herkömmlichen L-Glutaminsäure-Fermentationsverfahren verwendet wird, liegt. Zu dem gemäß der Erfindung gemäß dem Anspruch zu verwendenden Kulturmedium können 0,05-0,2 g/dl Polyoxyäthylen-Fettsäureester und 0,005-0,05 g/dl Alkylamin je nach dem Volumen des Kulturmediums zugegeben werden. Die Zeit zwischen dem ersten und dem zweiten Zusatz des oberflächenaktiven Mittels kann je nach Art der verwendeten Bakterien und den sonstigen Bedingungen zwischen 30 Minuten und 8 Stunden liegen. Der Stand des Wachstums der Fermentationsbakterien kann leicht durch Messung der optischen Dichte des Kulturmediums mit Hilfe eines Photozellen-Kolorimeters bestimmt werden.

Die L-Glutaminsäure erzeugenden Bakterien, die

in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, können die gleichen sein, wie sie bisher für die Herstellung dieser Säure verwendet wurden und schließen folgende Arten ein:

Microbacterium

Microbacterium ammoniaphilum
Microbacterium flavum var. glutamicum

Brevibacterium

Brevibacterium Dibalicutum

Micrococcus

Micrococcus glutamicus

Corynebacterium

Corynebacterium lilium
Corynebacterium carnae
Corynebacterium melassecola.

Es eignen sich alle L-Glutaminsäure erzeugenden Bakterien, welche Biotin als Wachstumsfaktor erfordern. Unter diesen ist Corynebacterium melassecola, welches eine starke Fähigkeit hat, Melassen in L-Glutaminsäure zu metabolisieren, besonders bevorzugt.

Die bakteriologischen Eigenschaften von Corynebacterium melassecola sind im »Manual of Microbiological methods by the Society of American Bacteriologist« (1957) beschrieben.

Als Stickstoffquelle können in dem vorliegenden Verfahren Harnstoff und Ammoniak bevorzugt verwendet werden. Solche anorganischen Salze, wie sie von dem fermentierenden Bakterium erfordert werden, z.B. Phosphate, Magnesium, Salz und Mangansalz, werden dem Kulturmedium in Abhängigkeit von der angewendeten Melasse zugesetzt. Die Zuckerquelle kann gleichzeitig oder nach und nach zu einem Kulturmedium zugegeben werden, währenddessen man eine optimale Konzentration davon aufrechterhält. Jedoch wird im Falle der Verwendung solcher L-Glutaminsäure erzeugender Bakterien, wie Corynebacterium melassecola und Mikrobakterium Ammoniaphilum ATCC 15354, die sukzessive Zuführung bevorzugt

Die Fermentation kann innerhalb von 30-60 Stunden beendet werden und man erreicht ein Verhältnis von L-Glutaminsäure an Zucker innerhalb von 30-38 Stunden von 60% und eine Konzentration an L-Glutaminsäure im Kulturmedium von etwa 8-9,5 g/dl innerhalb dieses Zeitraums. Nach Beendigung der Fermentation kann die L-Glutaminsäure von dem Kulturmedium durch Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens, z. B.durch eine Folge von Verfahrensschritten, in denen die bakteriellen Zellen von dem Medium entfernt werden, abgetrennt und konzentriert werden. Der pH-Wert kann mit Salzsäure auf 3,2 eingestellt werden und aus der konzentrierten Flüssigkeit können in einem Kühlschrank die rohen L-Glutaminsäurekristalle ausgefällt werden. Ein so erhaltenes Rohprodukt kann zur Erzielung eines reinen Produkts rekristallisiert werden.

Die vorliegende Erfindung ist vorteilhaft bei der Herstellung von L-GIutaminsäure in einem industriellen Maßstab unter Anwendung eines aeroben Zuchtverfahrens. Schwankungen in der L-Glutaminsäure-Ausbeute, die auf den Wechsel der Qualität der verwendeten Melassen zurückzuführen sind, treten nicht auf. Man gewinnt somit eine konstante Produktionsausbeute.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert

Beispiel 1

400 ml einer Keimkultur, die man durch die Züchtung von Mikrobakterium Ammoniaphilum ATCC 15354 in einem in der Tabelle angegebenen Keimmedium während 8 Stunden bei 30⁰C unter aeroben Bedingungen erhielt, wurden in das in der Tabelle angegebene Fermentationsmedium (etwa 98 μg/l Biotin-Gehalt), welches sich in einem 20 Liter-Fermentationsgefäß befand, eingebracht.

Zusammensetzungen des Kulturmediums

Keimmedium Fermentationsmedium

Rohrzucker-Abfall- 4,0 g/dl 3,5 g/l

melassen*)
(als Gesamtzuckerquelle)

Glukose - 3,5 g/dl

KH₂PO₄ 0,2 g/dl 0,25 g/dl

MgSO₄ ■ 7H₂O 0,05 g/dl 0,05 g/dl

MnSO₄ · 4H₂O - 0,0005 g/dl

FeSO₄ · 7H₂O - 0,0005 g/dl

Harnstoff 0,8 g/dl

pH wurde nach der 7,2 7,0

Sterilisation

eingestellt auf

*) Hergestellt in Java Island, der Biotin- und der Gesamtzuckergehalt betrugen 143 μg/100g bzw. 52 g/100 g.

Nach dem Einbringen des Keimmediums in das Fermentationsmedium wurden die Bakterien 46 Stunden lang unter aeroben Bedingungen bei 30°C gezüchtet, währenddessen man den pH-Wert des Mediums durch Einführung von Ammoniakgas bei 7,0 hielt. Etwa 4 ¹Ii Stunden nach Beginn der Züchtung (anfängliches Stadium der logarithmischen Wachstumsperiode, d. h. zu der Zeit, wenn die netto-optische Dichte im Fermentationsmedium einen Wert von 0,35 erreicht), wurde vorher sterilisiertes Polyoxyäthylenmonopalmitat als erster Zusatz in einer Konzentration von 0,10 g/dl zu dem Fermentationsmedium zugegeben, und etwa 1 Stunde später, d. h., bei einer netto-optischen Dichte von 0,65 wurde sterilisiertes Laurylaminacetat als zweiter Zusatz in einer Konzentration von 0,030 g/dl dem Medium zugesetzt. Da die Zuckerkonzentration in dem Medium auf ein Niveau von weniger als 1,5 g/dl abfiel, wurde kontinuierlich zu dem Medium eine gemischte Zucker-Versorgungslösung, die aus 25 g/dl Rohrzucker-Abfallmelassen-Lösung (als Gesamtzucker) und 25 g/dl Glukoselösung bestand, zugegeben. Nach Beendigung der Fermentation betrug die Menge an L-Glutaminsäure in der Fermentationsbrühe 8,89 g/dl. Die so erhaltene Fermentationsbrühe wurde dann filtriert, um die bakteriellen Zellen daraus zu entfernen, von 12 Liter auf 3 Liter konzentriert, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von Salzsäure auf 3,2 eingestellt. Durch Verwendung der sogenannten iso-elektrischen Punktmethode wurden 905 g rohe L-Glutaminsäurekristalle erhalten.

Vergleichsversuche, bei denen entweder nur der erste Zusatz oder nur der zweite Zusatz verwendet

wurden, führte man in derselben Art und Weise durch und fand in diesen Untersuchungen eine Anreicherung an L-Glutaminsäure, die 0,72 g/dl bzw. 2,78 g/dl betrug.

Beispiel 2

Corynebakterium Lilium NRRL B-2243 wurde entsprechend dem Beispiel 1 gezüchtet und das erhaltene keimmedium wurde in das Fermentationsmedium, welches die folgende Zusammensetzung hat, eingeimpft.

Zusammensetzung des Fermentationsmediums

Rohrzucker-Abfallmelassen*)	10,0 g/dl
(als Gesamtzucker)
KH₂PO₄	0,2 g/dl
MgSO₄ · 7H₂O	0,05 g/dl
(NH₄)₂SO₄	0,05 g/dl
FeSO₄ ■ 4H₂O	0,0005 g/dl
MnSO₄ · 4H₂O	0,0005 g/dl
pH	7,0

*) Es wurden dieselben Melassen, wie in Beispiel 1 beschrieben, benutzt.

Das Bakterium wurde dann unter aeroben Bedingungen bei 3O⁰C wie unter Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet.

Nach 24stündiger Züchtung befand sich die Menge der L-Glutaminsäure in dem Medium auf einem Niveau von 5,06 g/dl. In diesem Beispiel wurde das oberflächenaktive Mittel, das hauptsächlich aus PoIyoxyäthylenmonomyristat als erster Zusatz bestand, in einer Menge von 0,1 g/dl zu dem Medium zugesetzt, und zwar bei einer optischen Dichte von 0,30, d. h. während des anfänglichen Stadiums der logarithmischen Wachstumsperiode der Bakterien, und das oberflächenaktive Mittel, das hauptsächlich aus einem C,₆-Alkylaminhydrochlorid bestand, wurde als zweiter Zusatz zu dem Medium in einer Menge von 0,023 g/dl zugesetzt, und zwar bei einer optischen Dichte von 0,60, d. h. bei Erreichen des mittleren Stadiums der logarithmischen Wachstumsperiode.

Beispiel 3

Corynebacterium melassecola AS B-1285 (ATCC 17965) wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, vorgezüchtet und 400 ml der entstehenden Keimkultur wurden zu 10 Liter eines Fermentationsmediums, das sich in einem 20-Liter-Fermentationsgefäß befand und folgende Zusammensetzung hatte, zugegeben.

Zusammensetzung des Fermentationsmediums

Rohrzucker-Abfallmelassen 7,0 g/dl

(als Gesamtzucker)

KH₂PO₄ 0,25 g/dl

MgSO₄ · 7H₂O 0,05 g/dl

FeSO₄ · 4H₂O 0,0005 g/dl

MnSO₄ · 4H₂O 0,0005 g/dl

(NH₄)₂SO₄ 0,05 g/dl

Das Bakterium wurde dann 40 Stunden lang bei 33-35"C unter Rühren und unteraeroben Bedingungen gezüchtet, währenddessen durch Einführung von Ammoniakgas der pH-Wert in dem Medium bei 7,0 gehalten wurde. Bei einer optischen Dichte des Kulturmediums von 0,35 wurde sterilisiertes Polyoxyäthylenmonopalmitat als erster Zusatz in einer Konzentration von 0,1 g/dl zu dem Medium zugegeben und bei einer optischen Dichte von 0,65 wurde ein anderes oberflächenaktives Mittel, das hauptsächlich aus Myristylaminacetat bestand, als zweiter Zusatz in einer

ίο Menge von 0,038 g/dl zu dem Medium zugegeben. Während der Züchtung des Bakteriums wurde eine zuckerzuführende Lösung, die Rohrzucker-Abfallmelassen (45 g/dl Zuckerkonzentration) enthielt, kontinuierlich zu dem Medium zugegeben, da der Zucker

is auf ein Niveau von 2g/dl und darunter abfiel. Nach Beendigung der Fermentation betrug die Menge an L-Glutaminsäure in der Fermentationsbrühe 9,41 g/dl.

Beispiel 4

Dasselbe Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von Corynebacterium melassecola AS B-1285 (ATCC

17965) anstelle von Microbacterium ammoniaphilum.

In diesem Falle wurden 0,1 g/dl Polyoxyäthylenmonopalmitat bei einer optischen Dichte von 0,25 als erster Zusatz und 0,03 g/dl eines oberflächenaktiven Mittels, welches hauptsächlich Myristylaminbutyrat enthielt, bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,70 als zweiter Zusatz zugegeben. Nach 36stün-

jo diger Fermentation betrug die Menge an L-Glutaminsäure in der Fermentationsbrühe 6,25 g/dl.

Beispiel 5

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 wurde in einem Keimmedium, welches die unten angegebene Zusammensetzung hat, unter aeroben Bedingungen 8 Stunden lang bei 3O⁰C gezüchtet. 400 ml der entstehenden Keime werden dann in 10 Liter eines Fermentationsmediums, das die unten angegebene Zusammensetzung hat (54,4 Mikrogramm Biotingehalt) und sich in einem 20-Liter-Fermentationsgefäß befindet, eingeimpft und das Bakterium wurde unter aeroben Bedingungen 36 Stunden lang bei 30⁰C gezüchtet, währenddessen durch Einführung von Ammoniakgas der pH-Wert des Mediums auf 7,0 gehalten wurde.

Zusammensetzung des Kulturmediums

50	Rübenzucker- Abfallmelassen*) (als Gesamtzucker)	Keimmedium	Fermentations medium
⁵⁵ Glukose	4,0 g/dl	3,5 g/dl
KH₂PO₄	-	3,5 g/dl
MgSO₄ ■ 7H₂O	0,2 g/dl	0,2 g/dl
MnSO₄ ■ 4H₂O	0,05 g/dl	0,05 g/dl
⁶⁰ FeSO₄ · 4H₂O	-	0,0005 g/dl
Harnstoff	-	0,0005 g/dl
Biotin	0,8 g/dl	-
pH nach der ^b5 Sterilisierung	5 μg/l	50,0 (xg/dl
7,2	7,0

*) Der Biotingehalt der Melassen betrug 6,6jxg/100g und der Gesamtzuckergehalt der Melassen betrug 52 g/100 g.

Etwa 4"Λ Stunden nach Beginn der Züchtung (anfängliches Stadium der logarithmischen Wachstumsperiode der Bakterien), d. h. bei Erreichen einer netto-optischen Dichte des Kulturmediums von 0,30 wurde sterilisiertes Polyoxyäthylenmonopalmitat als erster Zusatz in einer Menge von 0,1 g/dl zu dem Medium zugesetzt und etwa eine Stunde später, d. h., bei einer optischen Dichte von 0,65, wurde vorher sterilisiertes Laurylaminacetat als zweiter Zusatz in einer Menge von 0,030 g/dl zugegeben. Da der Zuckergehalt des Kulturmediums auf 1,5 g/dl abfiel, wurde eine gemischte Zuckerversorgungslösung, die 25 g/dl Rübenzucker-Abfallmelassen (als Gesamtzucker) und 25 g/dl Glukose enthielt, kontinuierlich zu dem Fermentationsmedium zugegeben, um das angegebene Zuckerniveau in dem Medium aufrechtzuerhalten. Nach Beendigung der Fermentation betrug die Menge an L-Glutaminsäure in der Fermentationsbrühe 8,43 g/dl. Die entstehende Brühe wurde dann filtriert, um die bakteriellen Zellen zu entfernen, von 12 Liter auf etwa 3 Liter konzentriert und der pH-Wert des konzentrierten Filtrates wurde durch Zugabe von Salzsäure auf 3,2 eingestellt. Durch Verwendung der sogenannten iso-elektrischen Punktmethode erhielt man 901 g rohe L-Glutaminsäurekristalle.

Vergleichsversuche, die entweder nur den ersten oder nur den zweiten Zusatz der obengenannten oberflächenaktiven Mittel verwendeten, zeigten schlechte Ergebnisse: Der Versuch, bei welchem nur der erste Zusatz zugegeben wurde, ergab eine Ausbeute von 2,73 g/dl an Glutaminsäure und der Versuch, bei welchem nur der zweite Zusatz zugegeben wurde, ergab eine Ausbeute von 2,54 g/dl Glutaminsäure;

Beispiel 6

35

Die L-Glutaminsäure-Fermentation wurde in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt, jedoch wurde anstelle des Microbacterium ammoniaphilum Corynebacterium melassecola ASB-4821 (ATCC 17966) verwendet. In diesem Fall wurde Polyoxyäthylenmonostearat als erster Zusatz in einer Menge von 0,1 g/dl zu dem Medium zugesetzt, bei Erreichen einer optischen Dichte des Kulturmediums von 0,30 und ein Ci₄-Alkylaminhydrochlorid wurde als zweiter Zusatz in einer Menge von 0,035 g/dl zu dem Medium zugegeben bei Erreichen einer optischen Dichte des Kulturmediums von 0,65. Nach 36stündiger Fermentation betrug die Menge an L-Glutaminsäure in der Fermentatiönsbrühe 8,73 g/dl.

Beispiel 7

Die L-Glutaminsäure-Fermentation wurde in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt, jedoch wurde ein Corynebacterium melassecola ASB-4821 (ATCC 17966) verwendet.

In diesem Falle wurde ein Fermentationsmedium bo verwendet, das folgende Zusammensetzung hatte:

Zusammensetzung des Fermentationsmediums

7,0 g/dl
30 (xg/dl

Rübenzucker-Abfallmelassen
(als Gesamtzucker)

Biotin

65 KH₂PO₄
MgSO₄ ■ 7H₂O
FeSO₄ · 4H₂O
MnSO₄ · 4H₂O
(NH₄J₂SO₄

0,2 g/dl
0,05 g/dl
0,0005 g/dl 0,0005 g/dl 0,05 g/dl

Als oberflächenaktives Mittel wurde bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,25 Polyoxyäthylenmonomyristat in einer Menge von 0,1 g/dl dem Medium zugegeben und bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,54 wurde ein C₁₆-Alkylaminhydrochlorid in einer Menge von 0,032 g/dl zu dem Medium zugegeben. Die in diesem Beispiel verwendete Zuckerversorgungslösung enthielt Rübenzucker-Abfallmelasse in einer Menge von 45 g/dl als Gesamtzucker. Nach 40stündiger Fermentation betrug die Menge an L-Glutaminsäure in der Fermentationsbrühe 7,3 g/dl.

Beispiel 8

In diesem Beispiel wurden Keim- und Fermentationsmedien mit folgender Zusammensetzung verwendet:

	Keimmedium	Fermentations-
		medium
Rohrzucker-	4,0 g/dl	3,5 g/dl
Abfallmelassen*)
(als Gesamtzucker)
Glukose	-	3,5 g/dl
Harnstoff	0,8 g/dl	-
KH₂PO₄	0,20 g/dl	0,20 g/dl
Magnesiumsulfat	0,05 g/dl	0,05 g/dl
Ammoniumsulfat	-	0,05 g/dl
Mangansulfat	-	0,0005 g/dl
Eisensulfat	-	0,005 g/dl

*) Hergestellt in Java Island, der Biotingehalt betrug 170 μg/ 100 g und der Gesamtzuckergehalt betrug 52 g/100 g.

200 ml der bakteriellen Suspension von Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 (O.D. = 1,0) wurden zu 10 Liter eines Keimmediums, welches sich in einem 20-Liter-Fermentationsgefäß befand, züge; geben und das Bakterium wurde unter Rühren und unter aeroben Bedingungen 8 Stunden lang gezüchtet. 400 ml der so erhaltenen Kultur wurden dann in 10 Liter des Fermentationsmediums (114 ^g/1 Biotingehalt), die sich in einem 20-Liter-Fermentationsgefäß befanden, eingeimpft und das Bakterium wurde 36 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 33 und 35°C gezüchtet, in dem der pH-Wert des Mediums durch kontinuierliche Einführung von Ammoniakgas in das Medium bei 7,0 gehalten wurde. Etwa 4,5 Stunden nach Beginn der Züchtung (anfängliches Stadium der logarithmischen Wachstumsphase der Bakterien) bei Erreichen einer optischen Dichte im Kulturmedium von etwa 0,35, wurde sterilisiertes C^-AIkylaminacetat als erster Zusatz in einer Menge von 0,015 g/dl zu dem Fermentationsmedium zugegeben und etwa eine Stunde später bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,65 wurde sterilisiertes C_M-Alkylaminacetat als

809 647/2

zweiter Zusatz in einer Menge von 0,020 g/dl zugegeben. Da der übrigbleibende Zuckergehalt in dem Medium auf 1,5 g/dl und darunter abfiel, wurde eine gemischte Zuckerversorgungslösung, die 25 g/dl Rohrzucker-Abfallmelasse (als Gesamtzucker) und 25 g/dl Glukose enthielt, kontinuierlich zu dem Medium zugegeben. Nach Beendigung der Fermentation lag die Menge an L-Glutaminsäure in dem Medium auf einem Niveau von 8,76 g/dl. Die entstehende Fermentationsbrühe wurde filtriert, um die bakteriellen Zellen zu entfernen, von 12 Liter auf etwa 3 Liter konzentriert und der pH-Wert wurde mit Salzsäure auf 3,2 eingestellt, um 905 g rohe L-Glutaminsäurekristalle zu erhalten.

Vergleichsversuche, bei denen entweder nur der erste oder nur der zweite Zusatz der obenerwähnten oberflächenaktiven Mittel benutzt wurden, zeigten schlechte Ergebnisse: Beim Versuch, bei dem nur der erste Zusatz zugegeben wurde, erhielt man eine Ausbeute von 2,11 g/dl L-Glutaminsäure, und beim Versuch, bei dem nur der zweite Zusatz zugegeben wurde, erhielt man eine Ausbeute von 2,72 g/dl L-Glutaminsäure.

Rübenzucker-	4,0 g/dl	3,5 g/dl
Abfallmelassen*)
(als Gesamtzucker)
Glukose	-	3,5 g/dl
MnSO₄ · 7H₂O	0,05 g/dl	-
Biotin	5 μg/dl	50 μg/dl
KH₂PO₄	0,2 g/dl	0,2 g/dl
Harnstoff	0,8 g/dl	-
Magnesiumsulfat	-	0,05 g/dl
Ammoniumsulfat	-	0,05 g/dl
Mangansulfat	-	0,0005 g/dl
Eisensulfat	-	0,0005 g/dl

*) Der Biotingehalt betrug 57,5 μg/l und der Zuckergehalt betrug 54 g/100 g. Diese Rübenzuckerabfallmelassen wurden, wenn nicht anders angegeben, in den hierauf beschriebenen Beispielen verwendet.

Eine bakterielle Suspension von Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 wurde zu 10 Liter einer Keimkultur, die sich in einem 20-Liter-Fermentationsgefäß befand, zugegeben und das Bakterium wurde unter Rühren und unter aeroben Bedingungen 8 Stunden lang gezüchtet. 400 ml der so erhaltenen Kultur wurden dann in 10 Liter Fermentationsmedium, das sich in einem 20-Liter-Fermentationsgefäß befand, eingeimpft und das Medium wurde unter Rühren und unter aeroben Bedingungen 36 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 31 und 34°C gezüchtet, währenddessen durch kontinuierliche Einführung von Ammoniakgas in das Medium der pH-Wert des Mediums bei 7,0 gehalten wurde. Bei Erreichen einer optischen

Beispiel 9

Es wurden Keim- und die Fermentationsmedien mit folgenden Zusammensetzungen verwendet:

Keimmedium Fermentationsmedium

Dichte des Mediums von 0,35 wurde sterilisiertes Ci₄-AIkylamin(myristylamin)acetat als erster Zusatz in einer Menge von 0,010 g/dl zu dem Kulturmedium zugegeben und danach, bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,65, wurde sterilisiertes C₁₂-Amin(laurylamin)acetat als zweiter Zusatz in einer Menge von 0,025 g/dl zugegeben. Da der Zuckergehalt in dem Medium auf ein Niveau von weniger als 2 g/dl abfiel, wurde eine gemischte Zuckerversorgungslösung, die aus Rübenzucker-Abfallmelassen und Glukose (1 : 1 als Zucker) bestand, kontinuierlich zu dem Medium zugegeben. Nach Beendigung der Fermentation betrug die Menge an L-Glutaminsäure in der Fermentationsbrühe 8,57 g/dl, welches einer 56,7 %igen Ausbeute gegenüber dem verwendeten Zucker als Rohmaterial entspricht. Nach Entfernung der bakteriellen Zellen wurde 1 Liter des so erhaltenen Filtrates auf etwa 300 ml konzentriert und anschließend, wie in Beispiel 8 beschrieben, behandelt, um 76 g rohe L-Glutaminsäurekristalle zu ergeben.

Beispiel 10

In diesem Beispiel wurde das Fermentationsmedium, das folgende Zusammensetzung hat, verwendet:

Rübenzucker-Abfallmelassen
(als Gesamtzucker)

KH₂PO₄

Magnesiumsulfat
Ammoniumsulfat
Mangansulfat
Eisensulfat

Biotin

Fermentationsmedium

7,0 g/dl

0,2 g/dl
0,05 g/dl
0,05 g/dl
0,0005 g/dl
0,0005 g/dl
40 μg/l

Die L-Glutaminsäure-Fermentation wurde in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren durchgeführt, jedoch unter Verwendung von Corynebacterium melassecola ASB-4821 (ATCC 17966) anstelle von Microbacterium ammoniaphilum. In diesem Fall wurde 1 g C^-Alkylaminacetat zu dem Medium zugegeben bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,30. Anschließend wurden 2,5 g C₁₆-Alkylaminhydrochlorid zugegeben bei Erreichen einer optischen Dichte des Mediums von 0,65. Nach Vollendung der Fermentation enthielt das Medium 7,76 g/dl L-Glutaminsäure.

Beispiel 11

Die L-Glutaminsäure-Fermentation wurde in Übereinstimmung mit dem im Beispiel 8 beschriebenen Verfahren durchgeführt, jedoch wurde Corynebacterium melassecola ASB-1285 (ATCC 17965) verwendet. In diesem Fall wurde C|₄-Alkylamin(myristylamin)hydrochlorid bei Erreichen einer optischen Dichte des Mediums von 0,30 als erster Zusatz in einer Menge von 0,010 g/dl zu dem Medium zugegeben und anschließend bei Erreichen einer optischen Dichte des Mediums von 0,60 wurde Myristylaminacetat in einer Menge von 0,025 g/dl zugegeben. Nach Beendigung der Fermentation betrug die Menge

an L-Glutaminsäure
8,81 g/dl.

in der Fermentationsbrühe

Beispiel 12

Die L-Glutaminsäure-Fermentation wurde in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt, jedoch wurde Corynebacterium melassecola ASB-1285 (ATCC 17965) bei einer Züchtungstemperatur von 33-35"C verwendet. In diesem Fall wurde Polyoxyäthylenstearylamin als erster Zusatz in einer Menge von 0,010 g/dl bei Erreichen einer optischen Dichte des Mediums von 0,30 dem Medium zugegeben.

Danach wurde Myristylaminacetat als zweiter Zusatz in einer Menge von 0,025 g/dl bei Erreichen einer optischen Dichte des Mediums von 0,70 zugegeben. Nach Beendigung der Fermentation betrug die Menge an L-Glutaminsäure in der Fermentationsbrühe 7,85 g/dl.

In der folgenden Tabelle sind zum Vergleich die Ausbeuten angegeben, welche nach den Beispielen 1 bis 5 in der belgischen Patentschrift 6 35 600 erzielt wurden.

Tabelle

Nummer Stamm
des
verwendeten
Kulturmediums*)

Belgisches Patent 6 35 600

oberflächenaktives
Mittel (am Fermentationsanfang
zugegeben)

L-GA-Anreicherung im
Endfermentationsmedium

Emanon 3115
0,2 g/dl.

Brevi-

bacterium

divaricatus

Micro- Tween 40
bacterium 0,05 g/dl,
glutamicus

g/dl
3,90

g/dl
5,63

Nummer Stamm	Belgisches Patent 6 35 600
des
ver	oberflächenaktives L-GA-Anrei-
wendeten	Mittel (am Fer- cherung im
Kultur	mentationsanfang Endfermenta-
mediums*)	zugegeben) tionsmedium

Micro-

bacterium

glutamicus

Microbacterium

Emanon 3115 0,15 g/dl

Newpoul PE 0,10 g/dl

flavum var. TX-1177 glutamicus 0,03 g/dl

g/dl

4,54

g/dl 4,98

*) Die Kulturmedien entsprechen den Beispielen 1 bis der in der belgischen Patentschrift 6 35 600 angegebenen Kulturmedien; die Nummer des berücksichtigten Beispiels wird in der ersten Spalte der vorliegenden Tabelle angegeben.

Anmerkungen:

»NONIONP-6«
»ACETAMIN 24«
»EMANON« 3115«

»TWEEN 40«

»NEWPOUL PE 64«

»TX-1177«

Polyoxyäthylenmonopalmitat Laurylaminacetat

Polyoxyäthylenmonostearat (Polyoxyäthylenglykolmonostearat)

Polyoxyäthylensorbitanmonopalmitat

Polyoxyäthylenphenyläther (aus dem Beispiel 5 der BE-PS 6 35 600)

Poly(oxyäthylen) (oxypropylen)-glykol (aus der Tabelle der Seite 1, Erwiderung vom 7. August 1974) betainiertes Polyoxyäthylenstearylamin.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch aerobes Züchten von Biotin erfordernden, L-Glutaminsäure erzeugenden Bakterien in einem Kulturmedium, das als hauptsächliche Kohlenstoffquelle einen Anteil enthält, der aus Rohrzucker-Abfallmelassen und Rübenzucker-Abfallmelassen besteht und das Biotin in einer größeren Menge enthält, als für das maximale Wachstum der Bakterien erforderlich ist, in Gegenwart von einem oder zwei oberflächenaktiven Mitteln, dadurch gekennzeichnet, daß während des anfänglichen Stadiums der logarithmischen Wachstumsperiode der Bakterien eine Komponente, die aus einem nichtionischen, oberflächenaktiven Mittel vom Polyoxyäthylen-Fettsäureester-Typ oder einem kationischen, oberflächenaktiven Mittel vom Alkylaminsalz-Typ besteht, zugefügt wird, und daß zu einer passenden Zeit zwischen dem mittleren Stadium und dem Endstadium des logarithmischen Wachstums der Bakterien ein kationisches, oberflächenaktives Mittel vom Alkylaminsalz-Typ zugefügt wird.