CS248705B2

CS248705B2 - Production method of the activator of the human tissue plasminogen

Info

Publication number: CS248705B2
Application number: CS833187A
Authority: CS
Inventors: David V Goeddel; William J Kohr; Diane Pennica; Gordon A Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1982-05-05
Filing date: 1983-05-05
Publication date: 1987-02-12
Also published as: GR79202B; IL68561A0; BR8302318A; AU1414283A; AR241654A1; DK174236B1; DD210303A5; GB2119804A; EP0093619B2; IL68561A; DE3316297A1; FR2526443B1; MY8700119A; HK88586A; EP0093619A1; ZW10483A1; PT76636A; PL152438B1; RO90639A; RO90639B

Description

Tento, vynález - - se týká způsobu výroby lidského - plasminogenového aktivátoru: odpovídajícího lidskému plasminogenovému aktivátoru, který se nachází v lidském - séru,. nebo. v tkáních, jeho nových forem' - ai prostředků a zvláště prostředků - a způsobů - jeho výroby jako- - homogenního preparátu a v terapeuticky významných množstvích.

Tento vynález je zčásti založen na objevu DNA sekvence a odvozené aminokyselinové sekvence lidského· plasminogenového aktivátoru. Tento- objev umožňuje - výrobu lidrského plasminogenového- aktivátoru aplb · kací technologie rekombinantní DNA. Dále umožňuje výrobu dostatečně kvalitního materiálu v dostatečných množstvích pro- to, aby se mohlo začít s testy na zvířatech a s klinickými testy a provádět tyto- testy, což je nutný předpoklad pro- jeho obchodní schválení, a překonává omezení související s dosud - používaných - způsobem- izolace - zahrnujícím výrobu - a - extrakci - z. existující bm nočné- struktury. Tento - vynález se. - týká, všech těchto uspořádání ve všech ohledech.

Publikace a další materiály, které jsou zde použity -pro ilustraci, pozadí - vynálezu, a ve speciálních případech i další detaily týkající se jeho praktického použití, jsou zde zahrnuty jako- odkazy.

Fibrinolytický systém je v dynamické rovnováze s koagulačním systémem, který uchovává nedotčené - otevřené, c.évníi řečiště. Koagulační systém skladuje fibrin jako matrici, která slouží k restauraci hemostatických podmínek. Fibrinolytický systém odstraňuje fibrinovou sít, jakmile je dosaženo hemostatické podmínky. Fibrinolytický proces je způsoben proteolytickým enzymem — plasminem, který se generuje z plasmového proteinového prekursoru — plasminogenu. Plasminogen se převádí na -plasmin aktivací -aktivátorem.

V -současné době jsou komerčně dostupné dva aktivátory, streptokinasa a urokinasa. Oba jsou určeny pro léčení akutních cévních onemocnění, jako je například infarkt myokardu, mrtvice, pulmonární embolie, trombosa hlubokých žil, ucpání (okluze) periferních arterií a jiné cévní trombosy. Souhrnně představují tyto nemoci hlavní nebezpečí - pro- zdraví člověka.

Etiologický základ těchto nemocí ukazuje buď na částečnou, nebo v horších případech na totální -okluzi - krevních cév krevním chuchvalcem — trombus nebo tromboembolus. Tradiční antikoagulační terapie, jakoje například terapie hepa-rinem a kumarinem, nezpůsobuje přímé zvýšení rozpustnosti trombu nebo tromboembolu. Shora uvedená trombolytická činidla, streptokinasa a urokinasa, mají praktické a efektivní použití. Jejich používání je však také značně omezeno. Žádné z nich nemá vysokou afinitu pro- fibrin; obě aktivují cirkulující a fibrin vázající plasminogen relativně nespecificky. Plasmin, který -se vytvoří v cirkulující krvi, je dost rychle neutralizován a je tak pro - užitečnou! trombolysu ztracen. Zbylý plasmin degraduje - několik' proteinů srážecího faktoru, například fibrinogen,

V a - Faktor VIII, a způsobuje tak; hemorhaničký potenciál (potenciál krvácení). Navíc je - streptok-inasa - silně antigenní. Pacienti s vysokým titrem protilátek odpovídají na léčení neúčinně a nebohou být. léčeni nepřetržitě.. Urokinasovái terapie jp drahá, protože urokinasa - se izoluje z· lidské' moče nebo z tkáňových kultur. V klinické; praxi se, proto - obecně nepoužívá. Urokinasa je dosud předmětem četných výzkumů;, jak je vidět-- z - odborné - - literatury (například USA patenty -č. 3 -355 361, 3 926 727, 4 029 767, 4 258 030, 4 271 150 - a evropská patentová přihláška; č.. 0 -037 687).

Takzvané- plasminogenové - aktivátory - by- ly izolovány z různých lidských - tkání, například z děložní tkáně, krve, séra a z buněčné - kultury, jako - je - popsáno v literatuře; Také jejich - složeni bylo v literatuře popsáno; - Plasminogenové aktivátory,, které jsou* odvozené - v těchto zdrojů, se na základě rozdílů v imunologických vlastnostech -děli naidvě - základní skupiny: - na - plasminogenové aktivátory urokinasového typu (u-PA) a na plasminogenové aktivátory tkáňového- typu - (t-PA). (Zkratky t-PA a u-PA byly navrženy na XXVIII Meeting of the International Commitee on Thrambosis and Hemos-tasis, Berga-mo,· Itálie, 27. července 1982.)

Nedávno byly identifikovány lidské melanomové linie, které sekretují t-PA. Charakterizace tohoto melanomového plasminogenového aktivátoru ukázala, že je jak imunologicky, - tak; ve- složení - aminokyselin nerozlišitelný od: plasminogenového aktivátoru, -který- byl: izolován - z - normální - lidské - tkáně:

Pradhktibyl· izolováni v relativné- oistéi formě; - byli charakterizován; a - bylo - zjištěno; - že: je; vysoce - účinným-, fibrinαlytickým· činidlem! (Wieirner/a - spol.rThe: Lancet, díl II, - č. 8 - - 254, str. 1018)'..

Některé^: studie.·’ v literatuře, v - nichž - byl. použit: vyčištěný- t-PA z - melanové' buněčné³linie,, prokázaly, že- tento - t-PA - má: vyšší: afinitu k: fibninu. než: plasminogenové aktivátory urokinasovéh^o typu. Intensivnější- výA zkumy· lidského. t-PA jako: potenciálního trombolytického.· činidla byly - zdražoványtím, že- se - v,- krvi,, tkáňových - extraktech;, v cévních perfusátech a v buněčných kulturách vyskytuje v extrémně nízkých koncentracích.

Rijken a Collen [J. Biol. Chem. 256, 7035 (1981)] popisují způsob izolace lidského t-PA ve íormě vhodné pro farmaceutické použití z lidské tkáně. -Tímto postupem však získali směs, která vedle připravované látky obsahovala balastní proteiny, se kterými se t-PA společně vyskytuje v původním prostředí. Technologií rekombinantní DNA podle předložené přihlášky vyná248705 lezu se však získá protein t-PA z hostitelské buňky jako je mikroorganismus nebo buněčná kultura. Aktivátor tkáňového plasminogenu získaný podle vynálezu je prakticky bez příměsy balastních proteinů.

Využití technologie rekombinantní DNA a podobných technologií by mohlo být nejúčinnější cestou získávání žádaných velkých množství vysoce kvalitního lidského plasminogenového· aktivátoru tkáňového typu (dříve nazývaného lidský plasminogenový aktivátor], který prakticky neobsahuje žádné další lidské proteiny (bílkoviny). Takové materiály by pravděpodobně vykazovaly bioaktivitu, která by umožnila jejich klinické použití při léčení různých kardiovaskulárních stavů a onemocnění.

Technologie rekombinantní DNA dosáhla stadia, kdy molekulární biologové jsou schopni rekombinovat různé DNA sekvence. Vznikají tak nové DNA entity, které jsou schopné produkovat hojná množství exogenního produktu v transformovaných mikrobech a v buněčných kulturách. V literatuře existují obecné prostředky a způsoby pro in vitro ligaci různých fragmentů DNA se zarovnanými nebo přečnívajícími konci. Získávají se tak potenciální expresní vektory použitelné pro transformaci příslušných organismů. Dochází tak k účinné syntéze žádaného exogenního produktu. Na základě individuálního produktu však zůstává tato· cesta značně nedokončená. Věda ještě nedosáhla takového· stupně, ve kterém by bylo možné předpovědět, zda lze do sáhnout úspěch. Ti, kteří dosáhli úspěšných výsledků, dosáhli toho bez patřičných experimentálních základů a se značným rizikem.

DNA rekombinace podstatných prvků, tj. počátek replikace, jedna nebo· více fenotypických selekčních charakteristik, expresní promotor, heterologní genový insert a zbylý vektor, se obvykle provádí mimo hostitelskou buňku. Výsledný rekombinantní replikace schopný expresní vektor nebo plasmid se do buněk zavádí transformací. Růstem transformantu se získávají velká množství rekombiuantního vektoru. Jestliže je gen patřičně vložen vzhledem k části, která ovládá transkripci a translaci kódované DNA informace, pak je výsledný vektor užitečný pro produkci polypeptidové sekvence, která je kódovaná vloženým genem. Tento proces se nazývá exprese. Výsledný produkt lze získat rozkladem (jestliže je to nutné] hostitelské buňky v mikrobiálním systému. Produkt se izoluje od dalších proteinů odpovídajícím čištěním.

Při praktickém využití technologie rekombinantní DNA může dojít k expresi úplně heterologního polypeptidu (tak zvaná přímá exprese) nebo· k expresi heterologního polypeptidu, který je napojen na část aminokyselinové sekvence homologního polypeptidu. V druhém případě je někdy předpokládaný bioaktivní produkt bioneaktivní, dokud se v extracelulárním prostředí neodštěpí napojený homologní/hetero-logní polypeptid.

Příprava buněčných a tkáňových kultur pro studium genetiky a buněčné fyziologie je dobře vypracována v odborné literatuře. Existují prostředky a způsoby pro· uchování permanentních buněčných linií, připravených postupnými seriálovými transfery z izoOvaných normálních buněk. Pro použití ve výzkumu se takové buněčné linie uchovávají na pevných nosičích v kapalném médiu nebo kultivaci v suspenzi, která obsahuje živiny. Postup pro přípravu ve velkém je zatím brzděn pouze mechanickými problémy. Další objasnění lze nalézt v odborné literatuře.

Biochemie proteinů · je pro biotechnologii nejen užitečná, ale i nutná. Buňky, které produkují žádaný protein, produkují také stovky dalších proteinů — endogenních produktů metabolismu. Tyto kontaminující proteiny a také další sloučeniny, pokud nejsou odstraněny od žádaného proteinu, by mohly být puo zvířata a pro · člověka toxické, kdyby byly · během terapeutického léčení podávány spolu s žádaným proteinem. Homogenní produkt, který je pro zamýšlené použití bezpečný, se získá aplikací dělicích postupů z oblasti biochemie proteinů na příslušný systém. Biochemie proteinů umožňuje také identifikaci žádaného produktu a jeho charakterizaci a zajišťuje, že buňky vyrábějí žádaný produkt věrně bez jakýchkoliv modifikací nebo· mutací. Biochemie proteinů je využívána také při biotestech, studiích stability a dalších procedurách, které je nutné před tím, než je možno podniknout úspěšné klinické studie, a před uvedením produktu na trh.

Tento vynález se dále týká v podstatě technologie rekombinantní DNA lze využít k úspěšné výrobě lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru (t-PA), s výhodou v přímé formě a v · množstvích dostatečných pro· to, aby bylo možno· začít a provádět testy na zvířatech a klinické testy, což je nutný předpoklad pro to, aby produkt mohl být schválen pro obchodní použití. Produkt — lidský t-PA je vhodný pro použití ve všech jeho formách při profylaktickém nebo terapeutickém léčení různých kardiovaskulárních stavů nebo nemocí člověka. V jednom z důležitých aspektů se tedy tento vynález týká způsobů léčení cévních poruch člověka použitím t-PA a jeho vhodných farmaceutických prostředků.

Tento· vynálezu se dále týká v podstatě čistého lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru. Systémy mikroorganismů nebo buněčných kultur modifikovaných podle způsobů genetického inženýrství umožňují výrobu lidského tkáňového plasminogenového· aktivátoru mnohem účinněji, než to kdy bylo možné. Tím umožňují i jeho, až dosud jenom ilusivní, komerční využití. Navíc, podle druhu hostitelské buňky, může být lidský tkáňový plasminogenový aktivátor ve srovnání s přirozeným materiálem glýkosylován do menšího nebo většího stupně. V každém případě však t-PA nebude obsahovat příměsi, které jej doprovázejí v rekombinantním buněčném prostředí.

Tento vynález se také týká expresních vektorů replikativní DNA nesoucích genové sekvence kódující lidský tkáňový plasminogenový aktivátor v takové formě, která je schopna exprese, a iriikrobiálních nebo buněčných kultur takto transformovaných kmenů nebo kultur, které jsou schopné vyrábět lidský tkáňový plasminogenový aktivátor. V dalším aspektu se tento vynález týká různých postupů použitelných pro přípravu shora uvedených genových sekvencí, DNA expresních vektorů, kultur kmenů mikroorganismů, buněčných kultur a jejich specifických uspořádání. Ještě dále se tento vynález týká přípravy fermentačních kultur shora uvedených mikroorganismů a buněk.

Obrázek 1 ukazuje elektroforesu na polyakrylamidovém gelu s 10% dodecylsulfátem sodným (SDS PAGE) proteinů značených ³⁵S-methioninem, které jsou vysrážitelné anti t-PA IgG po sekreci z melanomových buněk s a bez inhibitoru proteasy.

Obrázek 2 ukazuje elektroforesu imunoprecipitovaných translačních produktů mRNA frakcí odvozených od melan-omových buněk.

Obrázek 3 ukazuje hybridizační matrici 96 bakteriálních kolonií transformovaných cDNA za použití směsi ³²P značeného 14-meru jako sondy vztaženo na sekvenci 5 aminokyselin lidského t-PA.

Obrázek 4 je mapa restrikčních endonukleas celé délky cDNA lidského t-PA.

Obrázek 5a, 5b a 6c ukazuje sekvenci nukleotidů a odvozenou sekvenci aminokyselin celé délky cDNA lidskéeho t-PA.

Obrázek 6 je schematická konstrukce expresního plasmidu pdeltaRIPA⁰.

Obrázek 7 ukazuje výsledky testu íibrinolytické účinnosti buněk E. coli transformovaných působením pdeltaRIPA⁰ na fibrinové desce.

Obrázek 8 je HPLC peptidů z lidského t-PA štěpeného trypsinem.

Obrázek 9 ukazuje konstrukci plasmidu kódujícího přímou expresi naturačního lidského t-PA v E. coli.

Obrázek 10 ukazuje výsledky testu fibrinolytické účinnosti lidského t-PA, který je produkován E. coli transformované pT-PAtrpl2, na fibrinové desce.

Obrázek 11 ukazuje konstrukci DHFR (mutant nebo divoký typ = divoký kmen) / t-PA kódující plásmidy, která je odvozená tak, že je vhodná pro transformaci do kultury buněk savčí tkáně.

Obrázek 12 je schematický diagram lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru vyrobeného způsobem, který je zde uveden později.

Termíny „lidský tkáňový plasminogenový aktivátor“ nebo „lidský t-PA“ nebo „t-PA“ tak, jak jsou používány v tomto spisu, znamenají lidský extrinsický plasminogenový aktivátor (tkáňového typu), který je vyráběn systémem mikrobiální nebo buněčné kultury, v bioaktivních formách obsahujících proteasovou část a odpovídající tkáňovým plasminogenovým aktivátorům, které jsou pro lidskou tkáň přirozené. Lidský tkáňový plasminogenový aktivátorový protein, který je zde vyráběn, je definován DNA genem a odvozenou sekvencí aminokyselin. Existuje několik přirozených alelických variací. Ty se mohou vyskytovat v jednotlivých produktech. Těmito variacemi je (jsou) například rozdílná (rozdílné) aminokyselina (aminokyseliny) v sekvenci nebo vynechání (delece), substituce, inserzce, inverse nebo adice aminokyseliny (aminokyselin) ve shora uvedené sekvenci. Místo a stupeň glykosylace závisí na povaze hostitelského buněčného prostředí.

Při použití technologie rekombinantní DNA lze připravovat různé deriváty lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru, různě modifikované jednou či více substitucemi, vynecháními (delecemi), adicemi nebo náhradami aminokyselin v místech řízené mutagenese příslušné DNA. Sem patří příprava derivátů, které si uchovávají podstatnou „kringlovou“ oblast a oblast serinové proteasy obecně charakteristické pro zde popsaný lidský tkáňový plasminogenový aktivátor, přičemž však mohou být modifikované jak shora popsáno. Všechny takové alelické variace a modifikace tvořící deriváty aktivátoru lidského tkáňového plasminogenu jsou zahrnutí v rozsahu tohoto vynálezu. V rozsahu tohoto vynálezu jsou rovněž zahrnuty odvozené lidské excentrické (tkáňového typu) plasminogenové aktivátory. U všech těchto derivátů zůstává zachována účinnost, která je charakteristická pro lidský tkáňový plasminogenový aktivátor.

Lidský tkáňový plasminogenový aktivátor se vyrábí 1. tak, že methionin je první aminokyselin (díky inzerci ATG iniciačního signálního kodonu do čela strukturního genu) nebo 2. tak, že methionin, který je normálně první aminokyselinou, je intracelulárně nebo extracelulárně štěpen nebo 3. tak, že spolu s jeho signálním polypeptidem nebo konjugovaným proteinem jiným než konvenční signální polypeptid, je signální polypeptid nebo konjugát specificky štěpen v intracelulárním nebo extracelulárním prostředí a nebo 4. přímou expresí v maturační formě bez toho, aby bylo nutné odštěpit jakýkoliv cizí nadbytečný polypeptid. Poslední uvedený způsob je zvláště důležitý tehdy, když daný hostitel nemůže nebo neúčinně odstraní signální peptid, po248705 kud expresní vektor je konstruován tak, že dochází k expresi tkáňového plasminogenového aktivátoru spolu s jeho signálním peptidem. V každém případě se však takto vyrobený lidský t-PA ve všech jeho formách izoluje a vyčistí do takového stupně, aby ho bylo možné použít pro· léčení různých cévních stavů nebo nemocí.

Dále, t-PA má íormy, které zahrnují jak jednoduchý, (1-chain) protein, tak dvouřetězový (2-chain) protein. Dvouřetězový protein je proteolyticky odvozen od jednořetězové sloučeniny. Podle teorie známé z literatury aj dvouřetězový protein je asociován s produkovaným fibrinem a b) k proteolytické konverzi jednořetězového na dvou řetězový materiál dochází v místě konverze plasminogenu na plasmin. Podle tohoto vynálezu je pro konverzi in vivo podáván jednořetězový protein, jak shora popsáno. Nebo se podává dvouřetězový protein, o kterém bylo prokázáno, že je rovněž účinný. Dvouřetězový protein se může připravit in vitro proteolytickou konverzí po tom, co došlo k produkci jednořetězového proteinu. Takzvaná „kringlová“ oblast je umístěna v horním vláknu od části serinové proteasy. Předpokládá se, že má důležitou funkci při vázání tkáňového plasminogenového aktivátoru k fibrinové matrici, tedy pozorovanou specifickou účinonst tohoto tkáňového plasminogenového aktivátoru na trombus. Podle tohoto vynálezu se vyrábí tkáňový plasminogenový aktivátor, který obsahuje enzymaticky aktivní část odpovídající přírodnímu materiálu. Termín lidský tkáňový plasminogenový aktivátor znamená produkty, které obsahují takovou část samotnou nebo· spolu s dalšími sekvencemi · aminokyselin až do úplné délky molekuly.

Nyní bychom mohli shrnout. Lidský t-PA má funkční definici. Je schopen katalyzovat konverzi plasminogenu na plasmin a vázat se na fibrin. Je klasifikován jako · t-PA na základě imunologických vlastností jak shora popsáno.

Pojem „v. podstatě čistá forma“, jestliže je používán k popisu stavu lidského t-PA vyráběného· podle vynálezu, znamená materiál, který neobsahuje proteiny nebo· jiné materiály, které se normálně vyskytují spolu s lidským t-PA, pokud je vyráběn ne-rekombinantními buňkami, tj. v jeho „přirozeném“ prostředí.

Pojem „DHFR protein“ znamená protein, který je schopen aktivity asociovaný s dihydrofolát-reduktasou (DHFR). Tento protein musí být produkován buňkami, které jsou schopné přežít v prostředí deficitním na hypoxanthin, glycin a thymidin (-HGT médium). Obecně lze říci, že buňky, kterým se dostává DHFR protein, nejsou schopné růst v tomto prostředí. A naopak, buňky, které obsahují DHFR protein, úspěšně rostou v tomto· prostředí.

Pojem „buňky citlivé na MTX“ znamená buňky, které nejsou schopné růst v prostře dí, které obsahuje inhibitor DHFR . metho, trexát (MTX). „Buňky citlivé na MTX“ jsou tedy buňky, které, pokud nejsou geneticky pozměněny nebo jinak doplněny, neporostou za obvyklých podmínek v obvyklém prostředí, jestliže koncentrace MTX je 0,2 ^g/ml nebo vyšší. Některé buňky, jako jsou například bakterie, nevykazují MTX citlivost, protože nejsou schopny propustit MTX dovnitř buňky, i když obsahují DHFR, který je na tuto drogu jinak citlivý. Obecně lze říci, že buňky, které obsahují jako DHFR protein „DHFR divokého typu“, budou citlivé na methotrexát, jestliže jsou pro MTX propustné nebo jestliže jsou schopné MTX absorbovat.

„DHFR divokého typu“ znamená dihydrofolát-reduktasu tak, jak ji obvykle nacházíme v příslušném organismu. DHFR divokého· typu je obvykle citlivý in vitro na nízké koncentrace methotrexátu.

Pojem „DHFR protein s malou vazebnou afinitou pro MTX“ má funkční definici. Znamená DHFR protein, který (po svém vzniku v buňkách) umožní růst buněk citlivých na MTX v prostředí, které obsahuje 0,2 pgl /ml nebo více MTX. Taková funkční definice závisí na snadnosti, s jakou organismus produkuje „DHFR protein s malou vazebnou afinitou pro MTX“ stejně jako· na proteinu samotném. Jak je však použito v kontextu tohoto vynálezu, taková rovnováha mezi těmito dvěma mechanismy by neměla způsobovat problémy. Důležitá je schopnost přežít tyto hladiny MTX. Není důležité, zda to bude díky zvýšené expresi produkovaného DHFR nebo díky vlastnímu přirozenému DHFR. Vhodný DHFR protein, který splňuje takovou definici, je popsán v USA patentové přihlášce č. 459 151 z 19. ledna 1983, která je zde uváděna jako odkaz.

Pojem „expresní vektor“ znamená vektory, které jsou schopné exprese takových DNA sekvencí, které jsou obsažené v tomto· vektoru a které jsou funkčně napojené na jiné sekvence schopné uskutečnit expresi předcházejících sekvencí. Zde je zahrnuto (ačkoliv to vždy není explicitně řečeno) i to, že tyto expresní vektory musí být schopny replikace v hostitelských organismech buď jako episomy, nebo jako· integrální část chromosomální DNA. Jestliže nejsou schopny replikace, pak nejsou expresní vektory funkční. Souhrnně lze říci, že pojem „expresní vektor“ je funkční definice; pod tento· pojem je jako specifická sekvence zahrnuta jakákoliv DNA sekvence, která je schopna uskutečnit expresi specifického DNA kódu v ní uloženého. Expresní vektory jsou v technologii rekombinantní DNA využívány často· ve formě „plasmidů“ (což jsou cirkulární dvouvláknové DNA smyčky), které ve vektorové formě nejsou vázány na chromosom. V této přihlášce jsou pojmy „plasmid“ a „vektor“ zaměnitelné,

2487Ď5 protože plasmid je nejobecnější formou vektoru. Tento vynálezu však také zahrnuje i takové další íormy expresních vektorů, které slouží jako· ekvivalentní funkce a které jsou známé odborníkům z odborné literatury.

Pojem „rekombinantní hostitelské buňky“ znamená buňky, které jsou transformovány vektory zkonstruovanými pomocí technologie rekombinantní DNA. Jak je zde uvede no, t-PA se zde získává pomocí transfor movaných buněk ve větších množstvích než množství téměř nezjistitelná, ve kterých je produkován netransformovanými hostiteli. Tkáňový plasminogenový aktivátor, který je vyráběn takovými transformovanými buňkami, lze pak označit jako „rekombinantní tkáňový plasminogenový aktivátor“.

Vektory a způsoby, které jsou zde popsány, jsou vhodné pro · použití v hostitelských buňkách mnoha prokaryotických a eukaryotických organismů.

Ovšem pro klonování DNA sekvencí při konstrukci vektorů použitelných podle tohoto· vynálezu, jsou výhodné prokaryoty. Zvláště užitečný je například E. coli K12 kmen 294 (ATCC č. 31446). Lze použít také jiné mikrobiální kmeny, jako jsou například E. coli B a E. coli X1776 (ATCC č. 31 537). Tyto příklady je však nutné brát spíše jako ilustrativní než omezující.

Pro· expresi se mohou použít také prokaryoty. Lze použít shora uvedené kmeny a dále také E. coli W3110 (F~, A— prototrofní, ATCC č. · 27 325), bacily jako Bacillus subtilus a další enterobakterie, jako je například Salmonella typhimurium nebo Serratia marcesans, a různé pseudomonové druhy.

Obecně se ve spojení s hostitelskými buňkami používají plasmidové vektory obsahující replikon a řídicí sekvence, které jsou odvozeny od druhů snášitelných s hostitelskými buňkami. Vektor obvykle nese replikační místo a dále sekvence nesoucí znak, které jsou schopné provádět fenotypickou selekci v transformovaných buňkách (tzv. marking sekvence). Například E. coli je typicky transformována plasmidem pBR322, který je odvozen od druhů E. coli [Bolivar a spol.: Gene 2, 95 (1977)]. Plasmid pBR322 obsahuje geny ampicilinové a tetracyklinové resistence; získávají se tak snadno prostředky pro identifikaci transformovaných buněk. Plasmid pBR322 nebo jiné mikrobiální plasmidy musí také obsahovat (nebo musí být modifikovány tak, aby obsahovaly) promotory, které mohou být mikrobiálními organismy použity pro· expresi jejich vlastních proteinů. Mezi promotory nejobecněji používanými při konstrukci rekombinantní DNA patří β-laktamasa (penicilinasa), laktosové promotorové sytémy [Chang a spol.: Nátuře 275, 615 (1978), Itakura a spol.: Science 198, 1056 (1977) a Goeddel a spol.: Nátuře 281, 544 (1979)] a tryptofanový (trp) promotorový systém [Gaeddel a spol.: Nucleic Acid Res. 8, 4057 (1980), patentová přihláška evropského· patentového úřadu (EPO č. 0 036 776].Ačkoliv tyto promotory jsou používány nejčastěji, byly objeveny a jsou využívány další mikrobiální promotory. Byly publikovány podrobnosti týkající · se jejich sekvencí nukleotidů. To umožňuje zručným odborníkům funkčně je ligovat s plasmidovými vektory [Siebenlist a spol.: Cell 20, 269 (1980)].

Vedle prokaryotů se mohou používat také eukaryotické mikroby, jako jsou například kvasinky. Z eukaryotických mikrobů se nejčastěji používají Saccharomyces cerevisiae nebo obyčejné pekařské kvasnice, i když i mnohé další kmeny jsou obecně dostupné. Pro· expresi v Saccharomyces se obvykle používá plasmid YRp7 [naprř.: Sstinchcomb a spol.: Nátuře 282, 39 (1979), Kingsman a spol.: Gene 7, 141 (1979), Tschenper a spol.: Gene 10, 157 (1980)]. Tento plasmid již obsahuje trpí gen; získá se selekční znak (markér) pro mutantní kmen kvasinek, které nemají schopnost růst v tryptofanu, například ATCC č. 44 076 nebo PEP 4-1 [Jones: Genetics 85, 12 (197*7)] Přítomnost trpí jako charakteristické části genomu kvasinkové hostitelské buňky je výhodná pro detekci transformace, která se provádí kultivací v nepřítomnosti tryptofanu.

Mezi vhodné promotorové sekvence kvasinkových vektorů patří promotory 3-fosfoglycerát-kinasy [Hitzeman a spol.: J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] nebo jiné glykolytické enzymy [Hess a spol.: J. Adv. Enzyme Reg. · 7, 149 (1968), Holland a spol.: Biochemistry 17, 4900 (1978)], jako· jsou například enolasa, glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasa, hexokinasa, pyruvát-dekarboxylasa, fosfofruktokinasa, glukoso-isomerasa a glukokinasa, glukoso-6-fosfát-isomerasa, 3-fosfoglycerát-mutasa, pyruvát-klnasa, triosefosfát-isomerasa. Při konstrukci vhodných expresních plasmidů se do 3‘sekvence (u které má dojít k expresi) expresního^ vektoru ligují také terminační sekvence asociované s · těmito geny. Tím se dosáhne polyadenylace mRNA a terminace. Jiné promotory, jejichž další výhodou je transkripce řízená podmínkami kultivace, jsou promotorové oblasti alkohol-dehydrogenasy 2, isocytochrom C, kyselé fosfatasy, degradativní enzymy související s metabolismem dusíku, shora uvedené glyceraldehy-3-fosfát-dehydrogenasy a enzymů, které jsou odpovědné za využití maltosy a galaktosy [Holland a spol.: Biochemistry 17, 4900· (1978)] Výhodným je jakýkoliv plasmidový vektor, který obsahuje promotor slučitelný s kvasinkami, počátek replikace a terminanční sekvence.

Vedle mikroorganismů mohou být jako hostitel použity kultury buněk, které jsou odvozeny od vícebuněčných (multicelulárních) organismů. V principu je použitelná jakákoliv kultura, ať jde o kulturu ob248705 ratlovců či ne. Největší zájem byl však o buňky obratlovců. Rozmnožování buněk obratlovců se v nedávných letech stalo rutinní záležitostí (tkáňová kultura] [„Tissue Culture“, Academie Press, editoři: Kruše a Patterson, 1973]. Příklady takových užitečných buněčných linií jsou VĚRO a HeLa buňky, CHO buněčné linie (vaječníky čínského· křečka] a W138, BHK, COS-7 a MDCK buněčné linie. Expresní vektory takových buněk obvykle obsahují (jestliže je to· nutné] počátek replikace, promotor umístěný do čela genu, u kterého má dojít k expresi, spolu s ribosomálními vazebnými místy, RNAsplicing místy, po-lyadenylačním místem a transkripční terminátorové sekvence.

Pro· použití v savčích buňkách jsou řídicí funkce expresních vektorů zajišťovány virovým materiálem. Například obvykle používané promotory jsou odvozeny · od polyomů Adenovirus 2 a nejčastěji Simian virus 40 (SV40). Promotory viru SV40 jsou zvláště užitečné, protože oba jsou snadno· z viru získávány jako fragment, který obsahuje také SV40 virový počátek replikace [Fiers a spol.: Nátuře 273, 113 (1978]], uvedený zde jako odkaz. Lze použít také menší nebo větší SV40 fragmenty s tím, že obsahují přibližně 250 bp sekvenci od Hind III místa ke Bgl I místu umístěnou ve virovém počátku replikace. Je také možné, a často žádoucí, používat promotorové nebo kontrolní sekvence normálně asociované s žádanou genovou sekvencí za předpokladu, že takové řídicí sekvence jsou slučitelné s hostitelskými buněčnými systémy.

Počátek replikace se může získat buď zkonstruováním vektoru, který obsahuje exogenní počátek, jako· například počátek odvozený od SV40, nebo od jiného virového (například Polyoma, Adeno, VSV, BPV atd. ] zdroje, nebo se může získat replikačním mechanismem chromosomu hostitelské buňky. Jestliže je vektor integrován do chromosomu hostitelské buňky, často postačuje druhý způsob.

Při výběru výhodné hostitelské buňky pro transfekci vektorů podle vynálezu, který obsahuje DNA sekvence kódující jak t-PA tak DHFR protein, je výhodné vybrat hostitele podle typu DHFR proteinu. Jestliže se použije DHFR protein divokého typu, pak se s výhodou vybere taková hostitelská buňka, která je na DHFR deficitní. Tím se umožní použít DHFR kódující sekvence jak znak (markér] pro úspěšnou transfekci v selektivním médiu s nedostatkem hypoxanthinu, glycinu a thymidinu. V tomto případě je příslušnou hostitelskou buňkou CHO buněčná linie deficitní na DHFR aktivitu, připravená a množená tak, jak je to· popsáno Urlaubem a Chasinem: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA] 77, 4216 (1980]. Tato citace je zde uvedena jako odikaz.

A naopak, jestliže se jako řídicí sekvence použije DHFR protein s nízkou vazebnou afinitou k MTX, pak není nutné používat buněk deficitních na DHFR. Jelikož mutant DHFR je resistentní na methotrexát, lze jako prostředky selekce použit média obsahující MTX za předpokladu, že hostitelské buňky samy jsou citlivé na methotrexát. Většina eukaryotických buněk, ikteré jsou schopné absorbovat MTX, je citlivá na methotrexát. Jednou z takových užitečných buněčných linií je CHO linie, CHO-K1 ATCC č. CCL 61.

Příklady, které jsou dále uvedeny, popisují použití E. coli s Iac a trp promotorovým systémem, použití CHO buněk jako hostitelských buněk a použití expresních vekktorů, které obsahují SV40 počátek replikace, jako promotor. Odborníci jsou však schopni použít analogických technik ke konstrukci expresních vektorů pro· expresi žádaných proteinových sekvencí v alternativních kulturách prokaryotických nebo· eukaryotických hostitelských buněk. .

Uspokojivá množství lidského t-PA jsou produkována buněčnými kulturami. Dalším propracováním za použití sekundární kódující sekvence se ještě dále zvyšují produkční hladiny. Sekundární kódující sekvence, která obsahuje dihydrofláHreduktasu (DHFR], která je ovlivňována externím regulačním parametrem, jako je methotrexát, umožňuje regulaci exprese regulací koncentrace methotrexátu (MTX].

Jestliže se jako hostitelské buňky používají buňky s nepříliš průchodnou membránou, pak se transfekce provádí precipitační metodou fosforečnanem vápenatým, jak popsali Graham a Van der Eb: Virology 52, 546 (1978]. Pro zavedení DNA do· buněk lze použít i jiné způsoby, jako je například injekce do jádra nebo protoplastové slinutí.

Jestliže se používají prokaryotické buňky nebo· buňky, které mají silnou buněčnou stěnu, pak výhodným způsobem transfekce je zpracování s· vápníkem, například s chloridem vápenatým, jak popisují Cohen F. N. a spol.: Piroc. Nati. Acad. Sci. (USA] 69, 2110 (1972].

Při konstrukci vhodných vektorů, které obsahují žádané kódovací a řídicí sekvence, se používá standardních ligačních technik. Izolované plasmidy nebo DNA fragmenty se rozštěpí, upraví a znovu se ligují v žádané formě, takže vytvoří žádaný plasmid.

Štěpení se provádí působením restrikčního enzymu (nebo restikčních enzymů] ve vhodném pufru. Obvykle se pracuje s asi 1 ug plasmidu nebo DNA fragmentu, asi 1 jednotkou enzymu v asi 20 μΐ pufrovaného roztoku (pulfry a množství substrátu pro· příslušné reštrikční enzymy jsou konkrétně uváděny výrobci]. Doba inkubace je asi jedna hodina při teplotě 37 °C. Po inkubaci se protein odstraní extrakcí fenolem a chloroformem a nukleová kyselina se z vodné frakce vysráží ethanolem.

Jestliže jsou žádány zarovnané konce.

pak se preparát zpracovává 15 minut při ^C'C s 10 jednotkami Polymerasy I (Klenowův fragment), extrahuje se fenolem a chloroformem a vysráží se ethanolem.

Rozdělení rozštěpených fragmentů podle velikosti se děje na 6% polyakrylamidovém gelu, jak popsali Goeddel D. · a spol.: Nucleic Acid Res. 8, 4057 (1980). Tato citace js zde zahrnuta jako odkaz.

Ligace přibližně ekvimolárních množství žádaných složek s vhodně upravenými konci se provádí způsobem, podle kterého se asi 10 jednotek T4 DNA ligasy zpracuje s 0,5 DNA (jestliže se jako složky používají rozštěpené vektory, pak se tyto rozštěpené vektory předzpracují s bakteriální alkalickou fosfatásou. Tím se zabrání jejich opětné ligacij.

Při analýze, kterou se potvrdí správnost sekvencí ve zkonstruovaných plasmidech, se ligační směsí transformuje E. coli K12 kmen 294 (ATCC č. 31 446). Vyberou se ty transformanty, které vykazují ampicilinovou nebo tetrscyklinovou resistenci. Z transformantů se připraví plasmidy a ty se analyzují restrikcí a/nebo sekvenováním způsobem podle Messinga a spol.: Nucleic Aclds Res. 9, 309 (1981) nebo způsobem podle Mixama a spol.: Methods in Enzymology 65, 499 (1980).

Sekvence kódující DHFR protein lze rozmnožit kultivací hostitelských buněk za přítomnosti přibližně 20 až 500 000 nM koncentrací methotrexátu, kompetitivního inhibitoru účinnosti DHFR. O^^last efetivní koncentrace velmi závisí na povaze DHFR genu, proteinu a na vlastnostech hostitele. Obecně nelze · stanovit horní a dolní limity. Mohou se použít i vhodné koncentrace jiných analog kyseliny listové nebo jiné sloučeniny, které inhibují DHFR. MTX sám je však výhodný, snadno dostupný a účinný.

Podstata výroby aktivátoru lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru podle vynálezu spočívá v tom, že se a) vyrobí replikabilní expresní vektor, který je schopen exprese sekvence DNA kódující aktivátor v hostitelské buňce řízeným připojením DNA, kódující aktivátor ve směru 3‘ od promotoru sekvence DNA. Hostitelské buňky zahrnují prokaryotické mikroorganismy jako E. coli, enterobakterie, eukaryotické mikroorganismy jako kvasinky a buněčné linie jako VĚRO, HeLa a CHO.

b) Kultura hostitelských buněk · se · transformuje vektorem za vzniku rekombinantních hostitelských buněk se zakotveným vektorem.

c) Rekombinantní hostitelské buňky se kultivují s následnou expresí sekvence DNA kódující aktivátor, za vzniku aktivátoru.

d) Aktivátor se izoluje z buněk nebo· ze živné půdy.

Dále je popsán detailní postup pro získání aktivátoru lidského tkáňového plasminogenu.

1. Lidské melanomové buňky, které aktivně produkují tkáňový •plasminogenový aktivátor, se kultivují do konfluence.

2. Pelety buněk takové buněčné kultury se extrahují za přítomnosti inhibitorů rlbonukleasy. Izoluje se všechna cytoplasmová RNA.

3. Na oligo-dT koloně se izoluje celková informační RNA (mRNA) v polyadenylované (ořme. Tato· mRNA se elekroforesou na agarovém gelu s kyselou močovinou frakcionuje podle velikosti.

4. Gelová frakce, která obsahuje specifickou RNA tkáňového plasminogenového aktivátoru, se identifikuje následujícím · způsobem: RNA z každé frakce se přenese na in vitro systém lysátu králičích retikulocytů a mikrosomů psí slinivky břišní. Výsledné translační produkty se imunoprecipitují specifickou ígG protilátkou lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru.

5. Příslušná RNA (21 až 24S) se převede na odpovídající jednoviáknovou komplementární · DNA (cDNA), z níž se získá dvojvláknová cDNA. Po poly-dC úpravě se vloží do vektoru, jako je například plasmid, který nese jednu nebo více fenotypických znaků (markérů).

6. Takto připravené vektory byly použity pro transformaci bakteriálních buněk. Získá se tak banka klonovaných cDNA. Připraví se soustava radioaktivně značených syntetických deoxynukleotidů komplementárních ke kodonům známých aminokyselinových sekvencí v t-PA, jako je například soustava 8 14-merů,

5‘^-dT(^(^(g)CA(^g }TA( C)TCCCA-3‘ (komplementární k sekvencím kódujícím známou (viz výše) aminokyselinovou sekvenci: tryptofan — glutamová kyselina — tyrosin — cystein — asparagová kyselina (W—E—Y—C—D)j. Tato soustava se použije jako· sonda pro kolonie v bance.

7. Z positivních cDNA klonů se izoluje plasmidová DNA, a ta se sekvenuje.

8. Sekvenovaná DNA kódující t-PA se pak upraví in vitro pro vložení do příslušného expresního vektoru. Takto upravený expresní vektor se použije pro transformaci příslušné hostitelské buňky, která se pak nechá růst v kultuře. Vyrobí se tak žádaný lidský tkáňový plasminogenový aktivátor.

9. Takto vyrobený lidský tkáňový plasminogenový aktivátor má v enzymatické serin-proteasové části asi 251 aminokyselinu a „kringle“ obsahující sekvenci, o které se předpokládá, že je zodpovědná za vázání fibrinu. Maturační protein spolu se signální presekvencí obsahuje celkem 562 aminokyseliny.

Při výrobě čistého· · t-PA se s úspěchem využívá předcházejícího postupu. Způsobem podle vynálezu se za využití další kódovací sekvence, která je citlivá na methotrexát, umožní produkovat kulturou hostitelských buněk antigenně účinný t-PA protein v množstvích větších než 0,1 pg v jedné buňce za den. Jestliže se použijí vhodné podmínky, lze získat množství větší než 20 pg na buňku za den. Jiným způsobem to lze říci takto: lze dosáhnout takové hladiny exprese genů, že hodnota aktivity t-PA je

9.10 “ ⁶ Ploughových jednotek na buňku za den, za vhodných podmínek více než 18 . . 10~-1 Ploughových jednotek na buňku za den.

Výhodným aspektem tohoto vynálezu je, že methotirexát, který je pro buňky schopné jej přijímat osudným, umožňuje růst buněk za přítomnosti řídicích hladin MTX zmnožením genu kódujícího DHFR kódující sekvenci [Schimke R. T. a spol.: Science 202, 1051 (1978), Biedler J. L. a spol.: Cancer Res. 32, 153 (1972), Chang S. E. a spol. Cell 7, 391 (1976)].

Důležitost tohoto aspektu spočívá v tom, že rozmnožení DHFR genu může způsobit rozmnožení asociovaných sekvencí, které kódují jiné proteiny. K tomu zřejmě dochází, jestliže asociavaným proteinem je antigen HBsAg [Christman J. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 79, 1815 (1982)], E. coli protein XGPRT [Ringold, Gordon a spol.: J. Molec. and Appl. Gen. 1, 165 (1981)] a endogenní sekvence z plasmidové kombinace DHFR/SV40 [Kaufman R. F. a spol.: j. Molec. Biol. 159, 601 (1982)].

Další mechanismy, které přispívají k methotrexátové resistenci, patří zeslabení vazebné afinity DHFR proteinu, takže je na methotrexát méně citlivý [Flitoff W. F. a spol.: Sómat. Cell Genet. 2, 245 (1976)], avšak zdá se, že i v tomto případě dochází k rozmnožení.

Zdá se, že jak geny DHFR divokého typu, tak DHFR, které jsou na MTX resistentní, jsou díky jejich vlastní snížené vazebné kapacitě přítomností MTX množeny. V principu se tedy tento aspekt podle vynálezu týká vlivu množení DHFR sekvence na asociovaný protein kódující sekvence; vzniká tak regulační .mechanismus, který umožňuje zvýšenou expresi hladin t-PA sekvencí za přítomnosti MTX nebo díky předchozímu zpracování transformovaných buněk s MTX.

Následující příklady ilustrují, ale neomezují tento· vynález. Jako hostitelské buněčné kultury jsou v příkladech uvedeny E. coli hostitelská kultura a CHO buněčné linie, které jsou vhodné pro· sekvence kódující DHFR protein. Pro způsob podle tohoto vynálezu jsou však vhodné i jiné eukaryotické a prokaryotické buňky.

Obrázek 1 je autoradiogram 10% SDS polyakrylamidového gelu PAGE, který ukazuje imunoprecipitovaný [35S]-methioninem značený protein (proteiny) sekretovaný z lidských melanomových buněk během tříhodinového pulsu in vivo, za přítomnosti (řádka b) nebo · v nepřítomnosti (řádka a] inhibitoru proteasy aprotininu. Po imuno precipitaci specifickým IgG tkáňového· plasminogenového aktivátoru byly pozorovány tři pásy (řádka a) s molekulovými hmotnostmi přibližně б5 000, 63 000 a 35 000. V přítomnosti inhibitoru proteasy však nebyla pozorována přítomnost pásu o molekulové hmotnosti 35 000. Jestliže se použije· preimunní sérum (řádka c), neimunoprecipituje se žádný produkt. Nalevo od řádku a jsou uvedeny polohy a molekulové hmotnosti standardů 14C-značených proteinů.

Obrázek 2 ukazuje gslovou elektroíoresu imunoprecipitovaných translačních produktů RNA frakcí izolovaných z agarového gelu s kyselou močovinou. Hlavní pás· se vyskytuje ve · frakcích 7 a 8 *po přenosu za přítomnosti mikrosomů psí slinivky břišní a po následující imunoprecipitaci specifickým IgG t-PA. Tento· pás má molekulovou hmotnost přibližně 63 000. Velikost mRNA ve frakcích 7 a 8 je přibližně 21 až 24S. Polohy ribosomálních RNA znaků (markérů), které byly stanoveny po elektroforese na RNA močovinovém gelu a zviditelněny obarvením ethidium-bromidem, jsou označeny nad příslušnými gelovými řádky.

Obrázek 3 ukazuje hybridizační matrici 96 kolonií se

32P—diTC ( g)CA( θ)ΤΑ( jj)TCCA — — (VW-E—Y—C—D)-sondou. 96 individuálních transformantů bylo necháno růst na mikrotitrovací desce, přerazítkováno a necháno růst na nitrocelulózové membráně. Po· rozkladu (lyse) kolonií a fixaci bakteriální DNA byly filtry hybridizovány sondami 32P-14-meru (W—E—Y—C—D). Filtry byly promyty (aby se odstranila nehybridizovaná sonda) a exponovány na X-ray film. Tento autoradiogram představuje matrici získanou se 48 jednotlivými filtry (4 600 nezávislých kolonií). Příklad positivního cDNA klonu tkáňového plasminogenového aktivátoru na ‘filtru 25 je označen jako E10 (šipka).

Obrázek 4 je mapa restrikčních endonukleas celé délky cDNA lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru. Počet a velikost fragmentů, které se získají štěpením restrikčními endonukleasami, byl určen elektroforesou na 6% akryloamidových gelech. Polohy míst byly potvrzeny sekvencí nukleových kyselin (uvedených na obrázku 5). Kódovací oblast největšího otevřeného čtecího fragmentu je označena rámečkem. Šrafovaná oblast znamená domnělou signální peptidovou sekvenci, zatímco tečkovaná oblast znamená domnělou sekvenci maturačního tkáňového plasminogenového aktivátoru (527 aminokyselin]. 5‘ — konec mRNA je nalevo, 3‘ — konec je napravo.

Obrázky 5A,· 5B a 5C ukazují sekvenci nukleotidů a odvozenou sekvenci aminokyselin celé délky cDNA lidského tkáňového venční analýza všech hlavních maxim potvrdila správnou sekvenci aminokyselin lidského tkáňového plasminogenového· aktivátoru. Jednopísmenný kód aminokyselin v peptídech znamená následující aminokyse19 plasminogenového aktivátoru. Sekvence 35 aminokyselin (—35 až —1), která předchází maturační sekvenci, je uvedena jako nepřerušená sekvence. Předpokládá se, že tato sekvence 35 aminokyselin v sobě zahrnuje hydrofilní „pro“ sekvenci, která předchází serin (+1) maturačního proteinu, složenou z asi 12 až 15 aminokyselin a dále „konvenční“ hydrofobní signál (od 5‘ do —35). Tento typ pre-pro-struktury byl na sekretovaných proteinech popsán již dříve, například preproalbumin. Vezmeme-li v úvahu tuto teorii, pak všechny molekuly sekretovaného· tkáňového plasminogenového aktivátoru začínají serinem (AI) jako koncovou aminokyselinou (NH2-konec). Podle druhé · teorie by mohla být hydrofilní sekvence zahrnuta ve funkci tkáňového plasminogenového aktivátoru analogicky, jako to bylo· pozorováno pro plasminogen. Z amino-konce přirozeného plasminogenu (Glu-plasminogen; pojmenovaný podle aminokynokyseliny na amino-konci) lze odštěpit peptid o molekulové hmotnosti 10 000. Získá se tak menší molekula, s novým amino-koncem, označená jako Lys-plasminogen. Lys-plasminogen se snadněji aktivuje na plasmin a má také větší afinitu k fiibrinu (než Glu-plasminogen). Bylo ukázáno, že plasmin katalyzuje konversi Glu-plasminogenu na Lys-plasminogen. Tento typ kontrolního mechanismu má za výsledek mechanismus „positivní zpětné vazby“. Prvá množství vytvořeného· plasminu, kromě toho, že degradují fibrin, také generují molekuly plasminogenu, který se snadněji aktivuje a také se pevněji váže na substrát, při srovnání s přirozeným plasminogenem.

Důsledkem toho je rychlejší degradace fibrinu. Hydrofilní peptid tkáňový plasminogenový aktivátor by se mohl účastnit podobného· mechanismu, jeho štěpení by mělo za následek modifikaci vazby enzymu na 'fibrin. V každém případě se však sekvence 35 aminokyselin považuje za presekvenci maturačního proteinu.

Obrázek 6 je schematický diagram konstrukce expresního plasmidu tkáňového plasminového aktivátoru pdeltaRIPAo. Výchozí plasmid pPA25E10 se nejdříve rozštěpí Pst I. Izoluje se 376 bp (bp = pár bází, lépe pár nukleotidů) fragment, který se pak dále štěpí · tak, jak je to uvedeno na obrázku.

Obrázek 7 ukazuje výsledky testu fibrinolytické účiryiosti produktu exprese, získaného via pdelta-RIPA⁰ v transformovaných buňkách, na fibrinové desce.

Obrázek 8 je HPLC peptidů z tkáňového· plasminogenového aktivátoru štěpeného trypsinem (absorbance při 210 nm). Šipka ukazuje maximum, které odpovídá peptidů použitému pro konstrukci nukleotidové sondy pro· banku kolonií. Sekvence tohoto peptidu je: L—T—W—E—Y—C—D—D—V—P—

S—C—T—C—G—L. Sekvenční analýze byla podrobena rovněž další hlavní maxima. Sek-

líny:
Asp	D	kyselina asparagová
Thr	T	threonin
Ser	S	serin
Glu	E	gvselina glutamová
Pro	P	prolin
Gly	G	glycin
Ala	A	alanin
Cys	C	cystein
Val	V	valin
Met	M	methionin
Ile	I	isoleucin
Leu	L	leucin
Tyr	Y	tyrosin
Phe	F	fenylalanin
His	H	histidin
Lys	K	lysin
Arg	R	arginin
Trp	W	tryptofan
Gin	Q	glutamin
Asn	N	asparagin

Obrázek 9 ukazuje konstrukci plasmidu kódujícího přímou expresi maturačního· lidského· tkáňového· plasminogenového aktivátoru v E. coli. 50 pg plasmidu pPA17 se štěpí působením Sau 3AI, Hínc II a Hha I. Směs se elektroforezuje na 6% polyakrylamidovém gelu. Izoluje se přibližně 0,5 pg 55 bp Sau 3AI — Hha I fragmentu. Podobně se připraví a vyčistí 3 pg 263 bp Hha I — Nar I fragmentu, a to tak, že se z 80 ,ug klonu pPA25E10 nejdříve izoluje 300 bp Pst I — Nar I fragment a ten se pak rozštěpí působením Hha I. Štěpení probíhá jednu hodinu při teplotě 37 °C. Reakční produkty se izolují a elektroéluují na 6% polyakrylamidových gelech. Dva označené deoxyoligonukleotidy 5‘ dAATTCATGTCTTATCAAGT (I) a 5‘ GATCACTTGATAAGACATG (II) se syntetizují fosfotriesterovou metodou v pevné fázi [Crea a spol.: Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980)]. Sto pikomolů oligonukleotidu II se fosíoryluje ve 30μ1 reakci obsahující 60 mM Tris (pH = 8), 10 mM chloridu horečnatého, 15 mM ,β-merkaptoethanolu a 50 pCi [y32]ATP (Amersham 5 000 Ci/rnmol). Přidá se 12 jednotek T4 polynukleotid kinasy a reakce se nechá probíhat 15 minut při 37 °C. Přidá se jeden mlkrolit 10 mM ATP a 12 jednotek T4 kinasy. Reakce se nechá probíhat dalších 30 minut. Po extrakci fenolem a chloroformem se fosforylovaný oligomer II a 5‘-hydroxyl-ollgomer I spojí s 0,5 pg eluovaného 55 bp Sau 3AI — Hha I fragmentu a s 2 pg 263 bp Hha I — Nar I fragmentu a vysráží se ethanolem. Tyto fragmenty se ligují 4 hodiny za teploty místnosti· v 60 μΐ 20 mM Tris—Hcl (pH = 7,5), 10 mM chloridu hořečnatém, 10 mM dithiothreitolu, 0,5 mM

АТР а 1 000 jednotkách Т4 DNA ligasy. Směs se štěpí jednu hodinu 48 jednotkami Nar I, 20 jednotkami Eco RI a 40 jednotkami Bgl II (polymerace se eliminuje ligací kohesivním Sau 3AI koncem). Pak se podrobí elektroforese na 6% gelu. Elektroelucí se izoluje 338 bp produkt (přibližně 0,1 ,ag). Zbývající t-PA kgdující sekvence (aminokyseliny 111 až 528) se izolují jako 1645 bp fragment, který se získá štěpením plasmidu pPA25E10 působením destrikčních endonukleas Nar I a Bgl II. Plasmid pLelFAtrp103 je derivát plasmidu pLeIFA25 [Goeddel a spol.: Nátuře 287, 411 (1980)], v němž bylo odstraněno EcoRI místo vzdálené od LelF A genu [Gray a spol.: Nátuře 295, 503 (1982)]. Tri mikrogramy pLeIFAtrpl03 se štěpí 20 jednotkami EcoRI a 20 jednotkami Bgl II při 37 °C devádesát minut. Směs se elektrof ořezu je na 6% polyakrylamidovém gelu.

Elektroelucí se izoluje velký (asi 4 200 bp) vektorový fragment. Při konečné konstrukci se liguje 80 pg Eco RI — Bgl II pLelFAtrpl03 se 100 ng 1 645 bp Nar I — Bgl II fragmentu a 20 ng 338 bp Eco RI — Nar I fragmentu 10 hodin při teplotě místnosti. Tato ligační směs se použije pro transformaci E. coli K-12 kmen 294. Plasmidová DNA se připraví ze 37 těchto transformantů a rozštěpí se působením Eco RI. Deset z těchto plasmidů obsahovalo žádané EcoRI fragmenty se 600 a 472 páry nukleotidů (bp). DNA sekvenční analýza ověřila, že jeden z těchto plasmidů (pt-PAtrpl2) má žádanou nukleotidovou sekvenci na spojení mezi trp promotorem, syntetickou DNA a cDNA.

Obrázek 10 ukazuje výsledky testu fibrinolytické účinnosti lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru jako produktu exprese na fibrinové desce. Kultura E. coli W3110/pt-PAtrpl2 v Luria brothu obsahujícím 5 ^g/ml tetracyklinu byla po kultivaci pres noc zředěna v poměru 1 : 100 M9-médiem, které obsahuje 0,2 procenta glukosy, 0,5 procenta kasaminokyselin a 5 pg! /ml tetracyklinu. Buňky byly nechány růst při 37 °C až do A^o = 0,2. Pak se přidá indolylakrylová kyselina tak, aby konečná koncentrace byla 20 /íg/ml. Vzorky se centrifugu jí při A-550 = 0,5 až 0,6 (asi 2.10⁸ buněk/ml) a ihned se zmrazí. Buněčné pelety se suspendují v 6M hydrochloridu guanidinu při počtu 5 .10⁸ buněk/ml, 10 sekund se sonikují, 30 minut se inkubují při 24 ^CC pak se 4 hodiny dialyzují ve 25 mM Tris— HC1 (pH = 8,0), 250 mM chloridu sodného, 0,25 mM EDTA a 0,01 % Tweenu 80. Po dialyse se vzorky dvě minuty centrifugují při 13 000 g. Deset mikrolitrů supernatantu se analyzuje na přítomnost tkáňového plasminogenového aktivátoru. Následuje postup podle Granelli-Piperna a Reicha (J. Exp. Med. 148, 223), desky se inkubují 3,5 hodiny při 37 °C a rozložené (lysované) zóny se změří. Kvantitativní výsledky se získají srovnáním zředěními vyčištěného roztoku melanomového tkáňového plasminogenového aktivátoru.

Zdroj mRNA tkáňového plasminogenového aktivátoru. Byly používány lidské melanomové buňky (Bowes). Melanomové buňky byly kultivovány do konfluentních monovrstev ve 100 ml EME médiu (Earles Minimal Essential) s hydrogenuhličitanem sodným (konečná koncentrace 0,12 procent), 2 mM glutaminem a 10% teplem inaktivovaného zárodečného telecího. séra. Pro potvrzení toho, že melanomové buňky aktivně produkují lidský tkáňový plasminogenový aktivátor, byly lidské melanomové buňky kultivovány do konfluence ve 24 jamkách mikrotitrovací destičky. Kultivace byla prováděna buď za přítomnosti nebo v nepřítomnosti 0,33 μΜ inhibitoru proteasy aprotininu. Buňky byly promyty jednou fosforečnanem pufrovaným solným roztokem. Přidá se 0,33 ml média, které neobsahuje v séru methionin. Přidá se 75 pCi (³⁵S)-methioninu a buňky se labelují tři hodiny při 37. ^CC. Po třech hodinách se z média odstraní buňky a médium se zpracuje buď se specifickým IgG tkáňového plasminogenového aktivátoru nebo s preimunním sérem imunoprecipitací [Oppermann a spol.: Virology 108, 47 (1981)]. Imunoprecipitované produkty se elektroforezují na 10% SDS-akrylamidovém gelu. Deska gelu byla fixována, vysušena a podrobena fluorografii.

Isolace informační RNA (mRNA) a frakcionace podle velikosti. Všechny RNA se z kultury melanomových buněk extrahují v podstatě tak, jak uvádějí Ward a s₍pol.: J. Virol. 9, 61 (1971). Buňky se centrifugací zpeletují. Pak se resuspendují v 10 nM chloridu sodného, 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5) a 1,5 mM chloridu hořečnatého. Buňky se rozloží přidáním NP-40 (na konečnou koncentraci jedno procento). Jádra se centrifugací zpeletují. Supernatant obsahoval všechnu RNA. RNA byla dále čištěna vícenásobnými extrakcemi fenolem a chloroformem. К vodné fázi se přidá chlorid sodný na 0,2 molární koncentraci. Pak se všechny RNA vysráží přidáním dvou objemů ethanolu. Chromatografií se mRNA vyčistí od ostatních RNA (na oligo-dT celulose) [Opipermann a spol.: Virology 108, 47 (1981)]. Typický výtěžek z 10 gramů kultury melanomových buněk byl 5 až 10 miligramů celkové RNA a 50 až 200 mikrogramů Póly (A) plus mRNA.

Frakcionace polyA⁺ mRNA (200 mikrogramů) [Aviv a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 69, 1408 (1972)] byla prováděna elektroforesou na močovino-agarových gelech. Deska agarového gelu [Lehrach a spol.: Bioc-hemistry 16, 4 743 (1977), Lynch a spol.: Virology 98, 251 (1979)] sestávala z 1,75 % agaru, 0,025 M citranu sodného (pH = 3,8) a 6 M močoviny. Elektrof oresa probíhala 7 hodin při 25 miliampérech a

4°C. Gel byl rozdělen žiletkou na frakce. Jednotlivé proužky byly roztaveny při 70 °C a extrahovány dvakrát fenolem a jednou chloroformem. Frakce byly vysráženy ethanolem, načež byly testovány in vitro· translací do lysátového systému králičích retikulocytů, Bethesda Research Lab. [Lodish a spol.: Am. Rev. of Biochem. 45, 40 (1976), Pelham a spol.: Eur. · J. Biochem. 43, 247 (1976)] a doplněny mikrosomy psí slinivky břišní následovně: Translace byla provedena za použití 25 /uCi [³⁵S]-methionlnu a 500 nanogramů RNA z každého proužku gelu v konečném objemu 30 μΐ, který obsahoval 25 mM HEPES, 48,3 mM chloridu draselného, 10 mM kreatin-Sosfátu, 50 mM každé z 19 aminokyselin, 1,1 mM chloridu horečnatého, 16,6 mM EDTA, 0,16 mM dlthiothreitolu, 8,3 mM heminu, 16,6 ^g/ml kreatin-kinasy, 0,30 mM chloridu vápenatého, 0,66 mM EGTA a 23,3 mM chloridu sodného.

Inkubace probíhala devadesát minut při třiceti stupních Celsia. Mikrosomální vzorky membrán psí slinivky břišní, které byly připraveny ze surových mikrosomů odstraněním ribosomů pomocí EDTA [Bloebel a spol.: J. Cell Biology 67, 852 (19715)], byly zpracovány s nukleasou, jak je popsáno v literatuře [Shields a spol.: J. Biol. Chemistry 253, 3 753 (1978)]; v translační směsi byly přítomny v konečné koncentraci 7 Až60 jednotek/ml. Translační produkty nebo imunoprecipitované translační produkty byly analysovány elektroforesou na 10% polyakrylamidových gelech v dodecylsulfátu sodném, jak bylo dříve v literatuře popsáno [Laemmli: Nátuře 227, 680 (1970)]. Nevybarvované desky gelu byly fixovány, vysušeny a podrobeny fluorografii [Bonner · a spol.: Eur. J. Biochem. 46, 83 (19^4)].

Výsledné translační produkty z každé frakce gelu byly imunoprecijpitovány specifickým IgG králičího' protilidského tkáňového plasminogenového aktivátoru. Ve frakcích číslo 7 a 8 (migrace 21 až 24S) byl pozorován pás jednoho hlavního imunoprecipitovaného polypeptidu s · molekulovou hmotností přibližně 63 000. Jestliže se pro imunoprecipitaci použije preimunní IgG, pak se tento pás neobjevuje. Z toho lze· usoudit, že tyto polypeptidy byly specifické na tkáňový plasminogenový aktivátor.

Příprava banky kolonií, které obsahují sekvence tkáňového plasminogenového aktivátoru. Pět mikrogramů mRNA na gelu rozdělené na frakce (mRNA z gelového proužku 7) se použije pro přípravu dvouvláknové cDNA standardními postupy [Goeddel a spol.: Nátuře 287, 411 (1980), Goeddel a spol.: Nátuře 281, 544 (1979), Wickens a spol.: J. Biol. Chem. 253, 2 484 (1978)]. Na 6% polyakrylamidovém gelu byla cDNA rozdělena na frakce podle velikosti. cDNA delší než 350 párů nukleotidů (125 ng) byla elektroeluována. Třicet nanogramů cDNA bylo nastaveno deoxy(C)-zbytky za použití deoxynukleotidyl-transferasy [Chang a spol.: Nátuře 275, 617 (1978)] a anelováno se 300' nanogramy plasmidu pBR322 [Bolivar a spol.: Gene 2, 95 (1977)], který byl upraven podobným způsobem deoxy(G)-zbytky na Pst I místě [viz výše Chang a spol.]. Anelovaná směs pak byla transportována do E. coli K12 kmen 294 (ATCC č. 31 446). Bylo získáno přibližně 4 600 transformantů.

Vyčištěný lidský tkáňový plasminogenový aktivátor byl získán podle postupu, který je uveden v odborné literatuře [Evropská patentová přihláška č. 0 041 766; Weímer W. a spol.: The Lancet, díl II., č. 8 254, str. 1018 (1981)].

Aby bylo možno zjistit oblasti, které jsou pro syntetické sondy nejvýhodnější, byly molekuly probrány následujícím způsobem:

Aby se proteiny daly štěpit trypsinem, byly zredukovány a převedeny na karboxymethyl-deriváty. Vzorek (2 ng] tkáňového plasminogenového aktivátoru se nejdříve dialyzuje s 0,01% Tweenem 80 přes noc při teplotě místnosti. Lyofilizovaný protein se pak rozpustí ve 12 ml 0,56 M Tris-HCl pu’íru (pH = 8,6), který obsahuje močovinu v 8M koncentraci a EDTA v 5mM koncentraci. Přidáním 0,1 ml j-merkaptoethanolu se zredukují disulfidové vazby. Tato reakce se provádí dvě hodiny při 45 °C v atmosféře dusíku. Zredukované disulfidy se alkylují na karboxymethylderivát přidáním 1,0 ml 1,4M jodoctové kyseliny v IN hydroxidu sodném. Po dvaceti minutách za teploty místnosti se reakce ukončí 18hodinovou dialysou v 0,1% Tweenu 80 za teploty místnosti. Produkt se lyofilizuje. Výsledný lyofilizovaný karboxymethylovaný protein se znovu rozpustí ve 3 ml 0,lM pufru fosforečnanu sodného (pH = 7,5). Přidá se trypsin (TPCK) v poměru 1:50. Štěpení probíhá při 37 °C. Podíly po· 0,1 . ml se odeberou po 3, 6 a 12 hodinách. Po 12 hodinách se přidá trypsin po druhé; po dvaceti čtyř hodinách se reakce zastaví tím, že se vzorek zmrazí (dokud ho nelze analyzovat na HPLC). Průběh· štěpení se určí analýzou odebraných podílů na SDS gelech. Bylo· zjištěno, že gely neobsahují žádaný pás peptidů, s výjimkou slabého pásu u podílu, který byl odebrán po třech hodinách. To znamená, že čtyřiadvacetihodinové zpracování bylo úplné a že tedy žádný velký peptid nezůstal nezreagován.

Vzorek (o objemu asi 0,5 ml) byl dvakrát nastříknut injekční stříkačkou do vysokorozlišovací kolony naplněné materiálem Altex C-8 ultrasphrrr o velikosti 5 μΐη. Pro· eluci se používá gradient acetonitrilu (jedno procento· až pět procent během prvých pěti minut, za dalších 100 minut stoupla koncentrace acetonitrilu z 5 na 35 procent a za dalších 30 minut ze 35 % na 50 %). V jedné ze dvou preparativních chromatografií byl eluát sledován při dvou vlnových délkách (210 nm a 280 nm). Poměr absorp248705 cí při dvou vlnových délkách byl použit pro označení peptidů, které obsahují tryptofan.

Maxima peptidů, které pravděpodobně obsahují tryptofan, nebo ta maxima, o kterých se dá z jakéhokoliv důvodu předpokládat, že obsahují tryptofan, byla sekvenována jako první. To umožnilo stanovit sekvence kolem většiny trýptofanů. Po sekvenování asi 25 nejlepších možných maxim peptidů vyplynul ze získaných dat předběžný model primární struktury tkáňového plasminogenového aktivátoru. Na základě těchto dat a na základě modelu bylo umístěno několik možných sond.

Identifikace bakteriálních klonů, které obsahují cDNA sekvence tkáňového plasminogenového aktivátoru. Kolonie se individuálně naočkují do jamek mikrotestovacích destiček, které obsahují LB [Miller: „Experiments In Molecular Genetics“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972), str. 431 až 433] a 5 ^g/ml tetracyklinu. Skladují se při —20 ^CC po přidání tolika dimethylsuMoxidu, abv jeho obsah byl sedm procent. Dvě kopie banky kolonií byly kultivovány na nitrocelulosových filtrech. DNA z každé kolonie byla fixována na filtr postupem podle Grunstein Hognesse [Grundstein a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 72, 3 961 (1975)].

Л Л C ³²P-Značená-TC( )CA( )TA( JTCCCA sonG G T da byla připravena [ze syntetického oligomeru (W—Ε—Y—C—D) směsi 14-merů] jak shora popsáno. Filtry obsahující 4 600 transformantů byly předhybridizovávány dvě hodiny za teploty místnosti v 50 mM fosforečnanu sodného o pH --= 6.8, 5 x SSC [Blin a spol.: Nucleic Acid Res. 3, 2 303 (1976)], 150 /.tg sonikované lososové spermální DNA, 5 x Denhardtově roztoku [Wahl a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 76, 3 683 (1979)], 10 % formamidu a pak byly hybridizovány 50.10⁶ impulsy za minutu značenou sondou ve stejném roztoku. Po inkubaci přes noc za teploty místnosti byly filtry promyty 3x za teploty místnosti v 6xSSC, pak byly promývány 30 minut v 0,1% SDS, jednak ve 2xSSC, načež byly exponovány 16 hodin na Kodak XR-5 X-ray film s kontrastním filtrem Dupont Lightning Plus.

Plasmidová DNA byla isolována rychlou metodou [Birnboim a spol.: Nucleic Acid Res. 7, 1 513 (1979)] ze všech kolonií, které vykazovaly positivní hybridizační reakci. cDNA inserty z těchto klonů byly po subklonování fragmentů do vektoru M13mp7 [Messing a spol.: Nucleic Acid Res. 9, 309 (1981)] sekvenovány podle Maxam Gilberta [Maxam a spol.: Methods in Enzymology 65, 499 (1980)]. Na obrázku 3 je filtr číslo 25 ukazující hybridizační matrici positivního klonu tkáňového plasminogenového aktivátoru. O cDNA insertu v klonu 25E10, srovnáním sekvence jeho aminokyselin s péptidovou sekvencí (viz níže) získanou z vyčištěného· tkáňového plasminogenového aktivátoru a produktu exprese v E.coli, jak je shora podrobněji uvedeno, bylo zjištěno, že je DNA kódující tkáňový plasminogenový aktivátor. cDNA insert klonu 25E10 plasmid pPa25E10 měl délku 2 304 párů nukleotidů (bp) s nej delší otevřenou čtecí oblastí kódující protein o 508 aminokyselinách (molekulová hmotnost 56 756) a obsahující 772 bp 3‘-netranslatovanou oblast. Tento cDNA klon nemá N-terminální kódující sekvence.

Přímá exprese klonu lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru v E.coli 50 ^g pPA25E10 (viz níže) bylo rozštěpeno působením Pst I (viz obrázek 6). Elektroforesou byl isolován 376 bp fragment na 6% polyakrylamidovém gelu. Elektroelucí byly z gelu isolovány přibližně 3 μg tohoto fragmentu, štěpeny 30 jednotkami Dde I jednu hodinu při 37 °C, extrahovány fenolem a chloroformem a vysráženy ethanolem. Výsledné Dde I přečnívající konce byly nastaveny na zarovnané konce přidáním 5 jednotek DNA polymerasy I (Klenowův fragment) a 0,1 mM dATP, dCTP, dGTP a dTTP к reakční směsi a inkubací po dobu 8 hodin při 4 °C. Po extrakci fenolem a chloroformem se DNA štěpí dvě hodiny působením 15 jednotek Nar I. Reakční směs se podrobí elektroforese na 6% polyakrylamidovém gelu. Isoluje se přibližně 0,5 μg žádaného 125 bp Nar I fragmentu se zarovnanými konci. Tento fragment kóduje aminokyseliny číslo 69 až 110 úplné délky maturačního proteinu lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru.

Přibližně 6 μg 1 645 bp Nar I — Bgl II fragmentu se připraví ze 30 μg plasmidu pPA25E10 štěpením 30 jednotkami Nar I a 35 jednotkami Bgl II 2 hodiny při 37 °C. Reakční směs se elektroforezuje na 6% polyakrylamidovém gelu.

Plasmid pdeltaRISRC je derivát plasmidu pSRCexl6 [McGrath a Levinson: Nátuře 295, 423 (1982)], v němž EcoRl místa vedle trp promotoru a vzdálená od SRC genu byla odstraněna opravou DNA polymerasy I [ Itakura a spol.: Science 198, 1 056 (1977)]. Do zbývajícího Eco RI místa, které bezprostředně přiléhá к Xba I místu, byl vložen doplňkový oligonukleotid AATTATGAATTCAT (syntetizovaný f osf otriesterovou metodou [Crea a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 75, 5 765 (1978)]. 20 μg pdeltaRISRC bylo úplně rozštěpeno působením Eco RI, extrahována fenolem a chloroformem a vysráženo ethanolem. Plasmid byl pak štěpen 100 jednotkami nukleasy Sl při 16 °C 30 minut ve 25 mM octanu sodného (pH = 4,6), 1 mM chloridu zinečnatého a 0,3 M chloridu sodného. Získají se ták zarovnané konce se sekvencí ATG. Po extrakci ‘fenolem a chloroformem a po vysrážení ethanolem se DNA štěpí působením Bam Hl. Produkt se podrobí elektroforese na 6% polyakrylamidovém gelu. Elektroelucí se isoluje velký (4 300 bp) vektorový fragment.

Expresní plasmid byl zkonstruován ligací 0,2 ^g vektoru, 0,06 ^g 125 bp Nar I fragmentu se zarovnanými konci a 0,6 <ug 1 645 bp Nar I — Bgl II fragmentu s 10 jednotkami T4. DNA ligasy po dobu 7 hodin za teploty místnosti. Shora zkonstruovaný plasmid byl použit к transformaci E.coli kmen 294 (ATCC č. 31 446) na ampicilinovou resistenci. Plasmid DNA připravený z 26 kolonií byl štěpen působením restrikčních endonukleas Xba I a Eco RI. Dvanáct z těchto plasmidů obsahovalo žádané 415 bp Xba I — Eco RI a 472 bp Eco RI fragmenty. Sekvenční analýzou DNA bylo ověřeno, že některé z těchto plasmidů měly ATG iniciační kodon správně umístěn na počátku aminokyseliny číslo 69 (serin). Jeden z těchto plasmidů — pdeltaRIPA* — byl testován. Bylo zjištěno, že produkuje žádaný tkáňový plasminogenový aktivátor (obrázek 7).

Příprava banky kolonií, které obsahují N-teirminální sekvence tkáňového plasminogenového aktivátoru probíhala následujícím způsobem: 0,4 ^g syntetického oligonukleotidu 5‘ TTCTGAGCACAGGGCG 3‘ bylo použito jako přiměř 7,5 ^g gelové frakce mRNA číslo 8 (viz níže) к přípravě dvouvláknové cDNA podle standardních postupů, které jsou uvedeny v literatuře [Goeddel a spol.: Nátuře 281, 544 (1979), Wickens a spol.: J. Biol. Chem. 253, 2 483 (1978)]. cDNA byla frakciono-vána podle velikosti na 6% polyakrylamidovém gelu. Frakce, které byly větší než 300 párů nukleotidů (bp) (36 ng), byly elektroeluovány. Pět nanogramů cDNA bylo nastaveno deoxy(C)zbytky za použití terminální deoxycytidyltránsferasy [Chang a spol.: Nátuře 275, 617 (1978)] a anelováno s 50 nanogramy plasmidu pBR322 [Bolivar a spol. Gene 2, 95 (1977)], který byl upraven podobným způsobem deoxy(G)-zbytky na Pst I místě (viz výše citace Chang a spol.). Anelovaná směs pak byla transformována do E.coli K12 kmen 294. Bylo získáno přibližně 1 500 transformantů.

Jižní hybridizace lidské genomové DNA: Ačkoliv reakce cDNA primeru byla provedena za použití syntetického fragmentu, který hybridizoval 13 párů nukleotidů N-terminálního klonu pPA25E10, pro vyhledávání cDNA klonů nebyly v této 29 bp oblasti (která obsahuje sekvence 16-meru) dostupné žádné vhodné restrikční fragmenty. Abychom mohli nějaký primer nastavených cDNA klonů, které obsahují N-terminální kódující sekvence tkáňového plasminogenového aktivátoru, identifikovat, bylo nutné isolovat genomový kmen lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru.

První stupeň tohoto procesu je dán skutečností, že v lidské genomové DNA je přítomen pouze jediný homologní gen tkáňového plasminogenového aktivátoru. Aby ho bylo možno určit, byla provedena jižní (Southernova) hybridizace. Podle tohoto postupu [Southern: J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)] se 5 ^g vysokomolekulární lidské lympocytové DNA [která se připraví podle Blina a spol.: Nucleic Acid Res. 3, 2 303 (1976)] úplně rozštěpí různými restrikčními endonukleasami. Směs se elektroforezuje na 1% agarových gelech [Lawn a spol.: Science 212, 1 159 (1981)] a blotuje se na nitrocelulosový papír (viz citace podle Southerna — výše). Z 5‘ konce cDNA insert PPA25E10 (230 bp Нра II — Rsa I fragment) se připraví ³²P-značená DNA sonda [Lawn a spol.: Cell 15, 1 157 (1978)], která se hybridizuje [Fritsch a spol.: Cell 19, 959 (1980)] na nitrocelulosovém filtru. Sonda byla hybridizována 40 hodin 35.10⁶ impulsy za minutu, načež byla promyta, jak je popsáno v literatuře [Fritsch a spol.: Cell 19, 959 (1980)]. Dvě endonukleasy daly po jednom hybridizačním DNA fragmentu: Bgl II (5,7 kbp) a Pvu II (4,2 kbp). Štěpením Hinc II byly získány dva fragmenty (5,1 kbp a 4,3 kibp). Závěrem lze říci, že z těchto dat vyplývá, že v lidském genomu je přítomen pouze jediný gen tkáňového plasminogenového aktivátoru, a že tento gen obsahuje alespoň jednu intervenující sekvenci.

Vyhledávání (screening) genů tkáňového plasminogenového aktivátoru v bance lidských λ fágů. Strategie, která se používá к identifikaci λ fugových rekombinantů, které jsou neseny geny tkáňového plasminogenového aktivátoru, spočívá ve stanovení homologie nukleotidů radioaktivní sondou připravenou z cDNA pPA?5E10 tkáňového plasminogenového aktivátoru. Jeden milión rekomblnantních. λ fágů byl vyset na DP 50 Sup F při hustotě 10 000 pfu/15 cm desky. Pro každou desku byly připraveny nitrocelulosové filtry pro prerazítkování způsobem podle Bentona a Davise popsanéso v literatuře [Benton a spol.: Science 198, 180 (1977)]. Ze 230 bp Нра II — Rsa I fragmentu umístěného ve vzdálenosti 31 párů nukleotidů od 5‘ konce plasmidů pPA25E10 byla standardním postupem [Taylor a spol.: Biochem. Biophys. Acta 442, 324 (1976)] připravena ³²P-značená DNA sonda. Každý nitrocelulosový filtr byl předhybridizováván při 42 °C 2 hodiny v 50 mM fosforečnanu sodném (pH = 6,5), 5 x SSC [Southern: J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)], 0,5 mg/ /ml sonikované lososové spermální DNA, 5 x Denhardtovým roztokem [Denhardt: Biochem. Biophys. Res. Comrn. 23, 641 (1966)], 50% formamidu a pak byl hybridizován 50.10⁶ impulsy za minutu značenou sondou ve stejném roztoku, který obsahoval 10 % dextransulfátu sodného [Wahl a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 76, 3 683 (1979)]. Po inkubaci přes noc při 42 °C se filtry promyjí čtyřikrát při 50 ^CC v 0,2 x SSC, 0,1% SDS 30 minut, jednou v 2xSSC za teploty místnosti a pak se přes noc exponují na Kodak XR-5 X-ray film s kontrastním filtrem Dup.ont Cronex. Hybridizací touto sondou bylo získáno celkem 19 klonů. Fágová DNA se připraví jak je v literatuře popsáno [Davis a spol.: Advanced Bacterial Genetics“, Cold Spring Harbor Laboratory, New York [197(8)] ze 6 rekombinantů. Pro přípravu Pvu II fragmentu [pro vyhledávání kolonií) byl vybrán λ klon C. з0 μξ DNA se štěpí jednu hodinu pří 37 °C působením restrikční endonukleasy Pvu II. Produkt se elektrofo-rezuje na 1,0% agarových gelech. Elektroelucí a vyčištěním se získá fragment se 4 200 páry nukleotidů, o kterém je z dřívější doby známo, že obsahuje sekvence tkáňového plasminogenového aktivátoru. Standardními postupy [Taylor a spol.: Biochem. Biophys. Acta· 442, 334 [1976)] hybridizací kolonií se připraví 32p značená sonda — jak shora popsáno.

Vyhledávání 5‘ sekvencí tkáňového plasminogenového aktivátoru v bance kolonií. Kolonie Se přenesou z desek. Nechají se růst na nitrocelulosových filtrech. DNA z každé kolonie se na filtru fixuje podle Grunstein-Hognesse [Proč. Nati. Acad. Sci. [USA) 72, 3 961 [19775]]. Ze 4,2 kbp Pvu II fragmentu z isolovaného λ genomového klonu tkáňového plasminogenového aktivátoru se podle postupu, který je uveden v literatuře [viz: Taylor a spol.: Biochem. Biophys. Acta 442, 324 [1976)], připraví ³2P-značená sonda.

Filtry, které obsahují 1 500 transformantů, ' se hybridizují 11.2 . 103 impulsů za minutu 32P-genomovým Pvu II ‘fragmentem. Hybridizace probíhala po dobu 16 hodin za podmínek popsaných Fritschem a spol. [Cell 19, 959 [1980)]. Filtry se řádně promyjí a exponují se 16 až 48 hodin na Kodak XR-5 X-ray film s kontrastním filtrem Dupont Lightnlng-Plus. G-enomovou sondou se zřetelně hybridizovalo osmnáct kolonií. Z každé z těchto kolonií byla isolována plasmi- . dová DNA, navázaná na nitrocelulosové filtry a hybridizována 32P__značeným syntetickým oligonukleotidem [16-mer) použitým pro původní reakci primeru. Z 18 klonů se jich sedm hybridizovalo kinasovým 16-merem. Po subklonování fragmentů do ml3mp7 [Messing a spol.: Nucleic Acids· Res. 9, 309 · [1981)] ukázala sekvenční analýza, že jeden klon [pPA17) obsahuje správnou 5‘ N-terminální oblast tkáňového plasminogenového · aktivátoru, vedoucí signální sekvenci a 84 bp 5‘ netranslovanou oblast. Ze dvou klonů, pPA25E10 a pPA17, byla stanovena úplná sekvence nukleotidů [obrázek 5) a restrikční mapa [obrázek 4) celé délky tkáňového plasminogenového aktivátoru.

Molekula přirozeného tkáňového plasminogenového aktivátoru má schopnost stabilizovat se 17 disulfidovými můstky [analogicky jako jiné serinové proteasy). Existují celkem čtyři možná N-glykosylační místa. Tři místa jsou umístěna v „kringlové“ oblasti u asnn7, asnm, asnzis a jedno místo se nachází v oblasti lehkého· řetězce u asmm. Za různé molekulární formy [tj. za vzorky o molekulové hmotnosti 65 000, respektive 63 000] mohou být odpovědné rozdíly ve struktuře oligosacharidových llgandů.

Rekonstrukce celé kódovací sekvence je možná, jestliže se využije místo restrikční endonukleasy Hha I, které se nachází v obou částečných klonech — pPA17 a pPA25E10. Z plasmidu pPA17 byl isolován 55 bp Sau3AI — Hhal restrikční fragment, který odpovídá aminokyselinám 5 až 23. Sau3AI restrikční místo bylo· umístěno do kodonu čtyři předpokládané maturační kódovací sekvence a bylo použito k odstranění oblasti kódující signální peptid. Z plasmidu pPA25E10 byl isolován také 263 bp Hhal — Narl fragment [kódující aminokyseliny · 24 až 110). Byly zkonstruovány dva syntetické deoxyoligonukleotidy, které restaurují kodony aminokyselin 1 až 4, zahrnují ATG translační iniciační kodon a vytvářejí Eco RI kohesivní terminus. Ligací těchto fragmentů vznikne 338 bp fragment kódující aminokyseliny 1 až 110. Tento fragment a 1 645 bp Narl — BglII fragment z pPA25E10 se pak ligují mezi ECoRI a BgLII místy plasmidu pLelFAtrp 103 [Gray a spol.: Nátuře 295, 503 [1982)]. Získá se tak expresní plasmid pt-PAtrpl2. K transkribci klonovaného t-PA genu dochází pod kontrolou 300 bp fragmentu trp operonu z Emoli, který obsahuje trp promotor, operátor a Shine-Dalgarnovu sekvenci trp leader peptidu, ale chybí leader peptidový ATG iniciační kodon [Goeddel a spol.: Na-tuře 287, 411 [1980)].

Nechá se růst E.coli K12 kmen W3110 [ATCC č. 27 325) obsahující plasmid pt-PAtrpl2. Připraví se extrakty pro testování Tibrinolytické účinnosti. Jednou z metod, která se používá pro měření aktivity tkáňového· plasminogenového aktivátoru, je test na fibrinové desce [Granelli-Piperno a spol.: J. Exp. Med. 148, 223], Podle této metody se měří množství vytvořeného plasmidu tak, že se změří množství fibrinu rozštěpeného plasminem na agarové desce, která obsahuje plasminogen a fibrin. · Plasmin dává jasné štěpné zóny na fibrinové desce. Plocha těchto zón odpovídá množství tkáňového plasminogenového aktivátoru ve vzorku. Když byly testovány na účinnost plasminogenového aktivátoru testem na fibrinové desce extrakty z pt-PAtrpl2 klonů, na deskách byly zřejmé štěpné zóny. Tato fibrinolytická účinnost je inhibována anti t-PA IgG, ale nikoliv preimunním IgG nebo anti-urokinasovým IgG. Žádná účinnost nebyla nalezena u extraktu, který byl připraven z buněk, které jako· kontrolu obsahovaly leukocytový interferonový plasmid pLeIFAtrplO3. Vyhodnocení je možné pomocí standardní křivky vyčištěného t-PA. Za pomoci této ‘křivky lze odhadnout, že bylo získáno přibližně 20 jednotek extrahované účinnosti na 10⁹ buněk [pro vy248705 čištěný t-PA; 90 000 Ploughových jednotek = 1 mg) (obrázek 10).

Sekvenční analýza byla založena na Edmanově degradaci [Edman a spol.: European J. Biochem. 1, 80 (1967)]. Vzorek byl dán do kelímku Beckmanova sekvenátoru 890B nebo 890C. Jako nosič byl v kelímku použit Polybren™ (poly-N.N.N^NMetramethyl-N-trimethylen-hexamethylen-diamonium-diacetát). Sekvenátor byl opatřen vymrazovačem a některými změnami v programu, které měly redukovat pozadí maxim. Činidla, pufr Quadrol, fenylisothiokyanatan a heptafluormáselná kyselina, byly Beckmanova sekvenčního stupně. Spojené Edmanovy cykly byly převedeny na 2-anilino-5-thiazolinové deriváty. 1-Chlorbutan byl vysušen pod dusíkem. Ke 2-anilino-5-thiazolinonu se pak přidá l,0N kyselina chlorovodíková (ve vodě). Zahřátím na 70° Celsia po dobu 10 minut se směs převede na 3-fenyl-2-thiohydantoin (ΡΊΉ-derivát). PTH-Aminokyselinový zbytek se pak rozpustí v 50% vodném acetonitrilu a nastříkne se na reversní fázi vysokotlakého kapalinového chromatografu. Jednotlivé PTH-aminokyseliny byly pak identifikovány srovnáním s retenčními časy standardní směsi PTH-aminokyselin (která byla dána dokonversní nádobky a zpracována stejným způsobem jako cyklus v sekvenátoru).

Dále jsou uvedeny testy detekce exprese tkáňového plasminogenového aktivátoru. Nejdříve bude uveden přímý test tvoření plasminu, pak nepřímý test.

Citlivým testem tkáňového· plasminogenového aktivátoru může být sledování konverse plasminogenu na plasmin, která je katalyzována tkáňovým plasminogenovým aktivátorem. Plasmin je enzym, na který existují chromogenní substrátové testy.

Tyto testy jsou založeny na proteolytickém odštěpení tripeptidu z chromoíorové skupiny. Rychlost štěpení je· přímo úměrná jak specificitě, tak koncentraci testované proteasy. Test je založen na stanovení množství plasminu vytvořeného inkubací roztoku plasminogenu s roztokem tkáňového plasminogenového aktivátoru. Čím větší je množství aktivátoru, tím větší množství plasminu vznikne. Plasmin se měří tak, že se zjišťuje štěpení chromogenního substrátu S2251 (získaného -od Kabi Group, lne., Greenwich, CT).

Provedení přímého testu je následující: Vzorek se smíchá s 0,10 -ml plasminogenu o koncentraci 0,7 mg/ml [v 0,05M Tris HC1 (pH · = 7,4) obsahující 0,012M NaCl). Objem roztoku -se upraví na 0,15 ml. Směs se inkubuje 10 minut při 37 °C. Při-dá se 0,35 ml S2251 (l,0mM roztok ve shora uvedeném pufru). V kultivaci se pokračuje dalších 30 minut při 37 °C. Reakce se ukončí přidáním ledové kyseliny octové (25 mikrolitrů). Vzorek se centrifuguje. Měří se absorbance při 405 nm. Srovnáním se standardním urokinasovým roztokem se vyhodnotí aktivita.

Podmínky testu · pro detekci úplné délky tkáňového plasminogenového aktivátoru se modifikují přidáním fibrinogenu (0,2 mg) k roztoku. Fibrinogen stimuluje účinnost tkáňového plasminogenového- aktivátoru, což má za důsledek poněkud zvýšenou hladinu účinnosti. Účinnost byla vyhodnocována v Ploughových jednotkách, přičemž 90 000 Ploughových · jednotek znamená účinnost, kterou má 1 mg vyčištěného tkáňového plasminogenového aktivátoru.

Byl rovněž vyvinut citlivý test účinnosti tkáňového plasminogenového· aktivátoru jako nepřímý test plasminu, respektive tvorby plasminu [Granelli-Piperno a spol.: J. Exp. Med. 148, 223], Tento· test je založen na stanovení tvorby plasminu tak, že se měří rozsah štěpení fibrinu plasminem (na agarové desce, která -obsahuje fibrin a plasminogen). Plasmin dává na fibrinové desce jasně štěpné zóny. Plocha těchto· zón je úměrná množství tkáňového plasminogenového aktivátoru · ve vzorku.

Při postupu podle Granelli-Pipema a Reicha [J. Exp. Med. 148, 223] se desky inkubují 3,5 hodiny při 37 °C. Měří se zóny. Kvantitativní vyhodnocení testu se provede stanovením srovnání se standardním urokinasovým roztokem.

Stanovení účinnosti tkáňového· plasminogenového aktivátoru. Kolonie E.coli obsahující plasmin (pdeltaRIPA“) se naočkuje do testovací zkumavky, která obsahuje 5 ml růstového média LB s 20 ^g/ml ampicilinu. Buňky se nechají růst přes noc při 37 ^C|C. Část této kultury se zředí v poměru 1: 100. do 300 ml média M9, která obsahuje 20· <g/ /ml ampicilinu.

Buňky se kultivují v kultivačních baňkách čtyři hodiny při 37 ^CC — výsledná absorbance při 550 nm je 0,419. Přidá se indolylakrylová kyselina na koncentraci 30 <g/ml. Buňky inkubují 90 minut — výsledná absorbance při 550 nm je 0,628. Buňky se odcentrifugují. Resuspendují se v 0,8 ml 0,01M Tris o pH = 8,0, obsahující 0,01 M EDTA. Výsledná suspenze se rychle míchá 18 hodin za teploty místnosti. Vzorek se odcentrifuguje. Supernatant se testuje na účinnost tkáňového plasminogenového aktivátoru.

Pro expresi pt-PAtrpl2 viz detailní popis pod legendou k obrázku 10.

V tabulce 1 a 2 jsou uvedeny výsledky testů účinnosti plasminogenu v příslušných extraktech E.coli. Účinnost závisí na přítomnosti plasminogenu (tabulka 1). Tato účinnost není ovlivňována preimunním králičím sérem, ale je značně inhibována antisérem tkáňového plasminogenového aktivátoru odvozeného od vyčištěných melanomových buněk. [Rijken a spol.: J. Biol. Chem. 256, 7 035 (198:1)]. (Tabulka 1 a 2.) To znamená, že extrakci E.coli produkují plasminogen aktivující účinnost, která je inhibována protilátkami tkáňového plasminogenového· aktivátoru.

je přidáno preimunní sérum a ve třetí jsou

Obrázek 7 ukazuje výsledek testu fibrinolytické účinnosti na fibrinové desce. K prostřední řadě koncentrací zleva doprava se přidá standardní množství urokinasy: ·0,24, 0,14, '0,10, 0,05 a 0,0! Pioughovy jednotky. Spodní řada jsou vzorky přírodního· tkáňového plasminogenového aktivátoru se ' stejným množstvím enzymu v každé jamce. Jamky zleva doprava obsahují tkáňový plasminogenový aktivátor, anti-plasminogenový aktivátor s· preimunním sérem a tkáňový plasminogenový aktivátor s protilátkou tkáňového plasminogenového aktivátoru. Každá jamka · obsahuje ' (v horní řadě) · 8 μΐ E.coli extraktů rekombinantního tkáňového plasminogenového aktivátoru. První jamka obsahuje samotný extrakt, ve druhé jamce přidány protilátky tkáňového plasminogenového aktivátoru. Je zřejmé, že preimunní sérum neovlivňuje přirozený nebo rekombinantní tkáňový plasminogenový aktivátor a ' že protilátky tkáňového · plasminogenového 'aktivátoru inhibují účinnost jak přírodního tkáňového plasminogenového aktivá toru, tak účinnost tkáňového plasminogenového aktivátoru isolovaného z E.coli extraktů. Vztaženo na urokinasové standar dy — extrakty obsahují nepatrně méně než

2,5 Ploughovy jednotky v 1 ml. Tat-o hod nota je srovnatelná s hodnotou 1,3 Ploughovy jednotky 'v 1 ml v tabulce 1 .

V tabulkách 1 a 2 jsou uvedeny výsledky shora popsaných testů.

TABULKA 1

Plasminogenová účinnost E.coli extraktů kultur, které obsahují pdeltaRIPA

vzorek	A405	procento účinnosti¹	vypočteno Ploughových jednotek/ml
extrakt [bez plasminogenu)	0,043	(OJ
extrakt	0,451	(100J	1,3
extrakt s preimunním sérem	0,477	106	—
extrakt s protilátkami t-PA	0,079	9	— .

Procento účinnosti se vypočte tak, že od získané hodnoty se odečte kontrolní pokus (0,043j a zbytek se vydělí hodnotou získanou pro extrakt

TABULKA '2 vzorek

Plasminogenová účinnost E.coli extraktů kultur pt-PAtrpl2

Aá()5· procento účinnosti

0,657

0,665

0,059 extrakt extrakt s preimunním sérem extrakt s protilátkami t-PA (100)

101

Obrázek 10 ukazuje výsledky testu na fibrinové desce, které byly provedeny s 'extrakty z 101 íermentační kultury E. coli, která obsahuje plasmid schopný exprese tkáňového plasminogenového aktivátoru. Fibrinolytická účinnost extraktu obsahujícího tkáňový plasminogenový aktivátor je ukázána na obrázku 10 jamkou a. Tato fibrinolytická účinnost je inhibována anti t-PA IgG (c), nikoliv však preimunnímJgG (bj nebo antl-urokinasovým IgG (d). Žádná účinnost nebyla pozorována u extraktu připraveného z buněk, které obsahují jako kontrolu leukocytový interferonový plasmid pLelFAtrplOS (h).

Konstrukce vektoru pro produkci t-PA za použití DHFR proteinu s nízkou vazebnou afinitou k MTX. Do expresního plasmidu, který obsahuje· mutant DHFR s nízkou vazebnou afinitou k MTX, se vloží sekvence kódující lidský tkáňový plasminogenový aktivátor (t-PA) [což je popsáno v doprovázející přihlášce USA č. 459 151 ze dne 19. ledna 1983, odpovídající evropské patentové přihlášce č. 117 060, která je zde uvedena jako odkaz) obrázek li).

Následujícím tři fragmenty z následujícím postupem (víz způsobem byly připraveny překrývajících se plasmidů pPA25E10, pPA17 a pt-PAtrp!2: Plasmid pPA17 se rozštěpí působením Dde I, doplní se Kienowovou DNA polymerasou 1 a rozštěpí se účinkem Pst 1. Isoluje se tak fragment s přibližně 200 páry nukleotidů obsahující 5‘ terminální t-PA sekvenci. Druhý t-PA fragment se získá štěpením pt-PAtrpl-2 působením Pst I a Nar I. Isoluje se fragment, který obsahuje přibližně 310 bp. Třetí t-PA fragment se získá štěpením pPA25E10 působením Nar I a Bgl II. Isoluje se fragment s · přibližně 1 645 bp, který vedle většiny t-PA kódující oblasti obsahuje některé 3‘ netranslované sekvence.

Plasmid pE342, který poskytuje expresi

HBV povrchového antigenu (také někdy označovaný jako· pHBs348-E), · byl popsán Levinsonem a spol.: patentová přihláška čís.

326 980 ze 3. prosince 1981, odpovídající evřopské patentové přihlášce č. 73 656. Tato přihláška je zde zahrnuta odkaz. Stručně — počátek viru SV40 (Simian) byl isolován po rozštěpení SV40 DNA působením HindlII. Přidáním konvertoru (AGCTGAATTC) se HindlII konce převedou na EcoRI konce. Tato DNA se rozštěpí účinkem Pvu II. Přidají se RI linkery. Následuje štěpení účinkem EcoRI. Elektroforesou a elektroelucí na polyakrylamidovém gelu se isoluje 348 bp fragment přemosťující počátek a ten se klonuje v pBR322. Expresní plasmid pHBs348-E se zkonstruuje klonováním 1 986 bp fragmentu získaného· EcoRI a BG1II štěpením HBV („Animal Virus Genetics“, kap. 5, Acad. Press, New York (1980)], (který přemosťuje gen kódující HBsAg) do plasmidu pML [Lusky a spol.: Nátuře 293, 79 (1981)] v EcoRI a BamHI místech (pML je derivát pBR322 s vynechanými eliminačními sekvencemi, které inhibují replikaci plasmidu v buňkách opic). Výsledný plasmid (pRI-Bgl) se pak linearisuje EcoRI. Do EcoRI místa pRI-Bgl se zavede 348 bp fragment představující oblast počátku SV40. Tento fragment lze vložit s jakoukoliv orientací. Jelikož tento fragment kóduje oba SV40 promotory vedle počátku replikace, k expresi HBV genů může dojít pod kontrolou kteréhokoliv promotoru podle orientace (pod kontrolou prvého promotoru dochází k expresi pHBS348-E representujícího HBs). Plasmid pE342 se modifikuje částečným štěpením účinkem Eco Rl, doplněním rozštěpeného místa Klenowovou DNA polymerasou I a zpětnou ligací plasmidu. Tím se odstraní Eco Rl místo předcházející SV40 počátek v pE342. Výsledný plasmid, který je označen jako pE34.2del.ta Rl, se rozštěpí působením Eco Rl, doplní se Klenowovou DNA polymerasou I a znovu se rozštěpí působením Bam HI. Po elektroforese na akrylamidovém· gelu se elektroeluuje přibližně 3 500 bp fragment, extrahuje se fenolem a chloroformem a vysráží se ethanolem jak shora uvedeno.

Takto připravený p342E 3 500 bp vektor se spolu se shora popsanými t-PA fragmenty, které obsahují přibližně 2 160 bp, ligují standardními způsoby. Byl isolován a charakterizován plasmid, který obsahuje tři t-PA kódující fragmenty v příslušné orientaci. Získaný plasmid byl označen pE342-t-PA. Tento plasmid byl rozštěpen restrikční endonukleasou Sac II a produkt byl zpracován s bakteriální alkalickou fosfatasou (BRL). Pro· získání DHFR sekvence (spolu s kontrolními sekvencemi její exprese) se štěpením plasmidu pEHER působením SacII získá 1 700' bp fragment [pEHER je i^lasmid, který expresí poskytuje mutantní DHFR, jak popisuje USA patentová přihláška č. 459 151], Tento fragment se liguje s plasmidem pE342-t-PA. Vytvoří se tak plasmid pETPAER400, který je analogický s pEHER až na to, že HBsAg kódující oblast byla nahrazena cDNA sekvencemi z t-PA.

Exprese a amplifikace· t-PA sekvence se provádí tak, že se pETPAER400 (pETPER) transSektuje způsobem podle Grahama a Van der Eba jak do dhfr~ CHO-DUX Bil buněk, tak do' DHFR+ CHO-K1 (ATCC CCL61) buněk. Transformované dhfr buňky byly selekciovány růstem v médiu deficitním na glycin, hypoxanthin a thymidin. Transformované DHFR+ buňky byly vybrány růstem ve více než ΙϋϋηΜ MTX. Kolonie, které rostly v příslušném selekčním médiu, byly isolovány pomocí klonovacích kruhů a rozmnoženy ve stejném prostředí na několik generací.

Při amplifikaci se buňky dávají do prostředí obsahujícího 5.104, 103, 2,5 . 10⁵, 5 . . 105 _a 103nM MTX, a to několikrát. Buňky se přenesou na lOcm desky při velmi nízké hustotě buněk (102 až 103 buněk na desku). Výsledné kolonie se isolují.

Exprese t-PA v transfektovaných amplifikovaných koloniích se mohou s výhodou testovat podobnými způsoby jak shora uvedeno.

Současná aplifikace DHFR a t-PA sekvencí se testuje isolací DNA z konfluentních monovrstev amplifikovaných kolonií následujícím způsobem: Konfluentní monovrstvy na 150mm deskách se promyjí 50 ml sterilního PBS a rozloží se přidáním 5 ml 0,1% SDS, 0,4 M CaClž a 0,1 M EDTA o pH = 8. Po pěti až deseti minutách se směs odstraní, extrahuje se fenolem a chloroformem a vysráží se ethanolem. DNA se resuspenduje v 1 ml (na 150mm desku) lOmM Tris-HC1 o pH = 8 a lmM EDTA (TE), přidá se 0,1 mg/ml RN-asy a roztok se inkubuje třicet minut při 37 °C. Pak se přidá SDS na 0,1% koncentraci a pronasa (Sigma) (0,5 mg/ml). Po 3 až 16 hodinách inkubace při 37 °C se roztok opět extrahuje lenolem, chloroformem a vysráží se ethanolem. DNA pelet se resuspenduje v 0,5 ml vody a pak se štěpí restrikčními enzymy. Přibližně 5 až 10 pg rozštěpené DNA se elektroforezuje na agarosovém gelu [1 procento agarosy v Tris-acetátovém pufru (40 mM Tris, 1 mM EDTA, pH upraveno kyselinou octovou na 8,2)] [Crouse a spol.: J. Biol. Chem. 257, 7 887 (182)]. Když bromfenolová modř projde asi 2/3 délky gelu, gel se odstraní a obarví se ethidium-bromidem. DNA (kterou lze zjistit pod ultrafialovým světlem) se přenese na nitrocelulosový papír postupem podle Southerna [J. Mol. Biol. · 98, 503 (1975)]. Filtry se pak hybridizují sondou připravenou ze 1 700 bp SacII fragmentu plasmidu pEHER (připraveného a hybridizovaného jak shora uvedeno) nebo z přibližně 1 970 bp Bgl II fragmentu plasmidu pETPER.

Plasmid, který obsahuje DNA sekvenci kódující DHFR divokého typu, pETPFR, byl zkonstruován podobně jako plasmid pETPER. Tato konstrukce byla zde již dříve popsána až na to, že místo plasmidu pEHER jako zdroje pro genovou sekvenci DHFR proteinu, se použije plasmid pE342.HBV.E400.D22, který je popsán - v Genentech Docket č. 100/ /92, USA přihlášce -č. 459 152 z 19. ledna 1983, odpovídající evropské - patentové přihlášce č. 117 058, zahrnuté zde jako· -odkaz. Plasmidy pE342.HBV.E400.D22 a pEHER jsou stejné až na rozdíl v jednom - páru . bází mezi DHFR divokého typu a mutantem. Výsledný plasmid -pETPFR je tedy analogický plasmidu pETPER ve všech směrech- s výjimkou DNA sekvence kódující DHFR -divokého - typu, který je zaměněn mutantním DHFR.

K transfekci buněk CHO deficitních na DHFR (Urlau-b a Chaisnj způsobem - podle Grahama a Van der Eba (vysrážení fosforečnanem vápenatým] byl použit pETPFR. Jednadvacet kolonií, které vyrostly na selektivním -médiu (-HGTJ, bylo- testováno detekcí tvorby -plasminu [rozštěpení fibrinu na agarové -desce, která -obsahuje fibrin a plasminogen, jak popisují Granelli-Piperno a spol.: J. Exp. Med. 148, 223 (1978)].

Čtyři nejsilnější positivní klony byly pak testovány na tvorbu plasminu (kvantitativně), jak shora popsáno.

Bylo zjištěno, že čtyři testované klony vykazují shodnou nebo- srovnatelnou sekreci t-PA do prostředí - (stanoveno jako - počet jednotek na - buňku na den). Subklony byly připraveny - transferem inokula ze - dvou klonů na oddělené - -desky, které obsahovaly

-HGT médium. Pro další analýzu byly použity dva z výsledných subklonů — 18B a 1.

Shora uvedené -subklony byly naneseny na - lOOmm desky - v množství 2.10⁵ buněk na desku v 50nM MTX, aby se podpořila ampliííikace; ty buňky, - 'které přežily (když byly testovány jak shora popsáno), daly ve všech případech asi desateronásobné množství účinnosti tkáňového plasminogenového aktivátoru ve srovnání s neamplifikovanými buňkami. Pro další studie byly vybrány dva z těchto- klonů. Tyto dva klony byly pojmenovány 1-15 a 18B-9.

Subklon 1-15 byl dále amplifikován tak, že se vyseje - 2 . 10⁵ buněk na lOOmm -desky, které obsahují 500 nM MTX. Test takto upravených buněk ukázal, že se dosáhlo- dalšího zvýšení produkce t-PA (asi 3x). Shora uvedeným kvantitativním testem byly získány hladiny 7.104 jednotek na buňku za den. Část, těchto- buněk byla udržována za přítomnosti 10 OOOnM MTX. Subklony 1-15 a 18B-9 byly dále- testovány po tom, co- byly udržovány přibližně 1 až 2 měsíce za podmínek uvedených v tabulce Г.

TABULKA 1‘ buněčná linie podmínky růstu ng t-PA/buňku/den+

1-15500	500nM MTX	28,5.10-3
1-1^E^í^00	500nM MTX	26,0.10-3
1-15500	(-HGT médium, žádný - MTX)	8,3.1Ο-3
1-15500	(-HGT médium, žádný MTX)	18,0.1Ο-3
l-15ooooo	10 uM MTX	29,3.10-3
l-15ooooo	10 μΜ MTX	49,0.10-3
18B-9	50nM MTX	14,3.10-3
18B-9	50nM MTX	14,4.103
18B-9	(-HGT médium, žádný -MTX)	14,13.10-3
18B-9	(-HGT médium, žádný MTX)	14,4.10“3
1	(-HGT médium, žádný MTX)	10.10-3
1	(-HGT médium, žádný MTX)	0,7.10-3

+ t-PA v kultivačním prostředí byl kvantitativně testován radioimunotestem - následujícím způsobem: Vyčištěný t-PA a vyčištěný jodovaný t-PA (indikátor, tracer), odvozený od melanomových buněk . - se seriálově zředí na koncentraci v rozmezí -od 12,5 do- 400 ng/ml v pufru, který obsahuje fosfátový -solný roztok o- pH = 7,3, 0,5 - % - . hovězího serumalbuminu, 0,01 - -% - Tweenu 80 a 0,02 % azidu sodného. Příslušně- . zředěné vzorky média, které mají být testovány, se přidají k radioaktivně značeným indikátorům (proteinům). Antigeny se nechají inkubovat přes noc za teploty místnosti za přítomnosti IgG frakce králičího anti t-PA antiséra ve zředění 1: 10 000. Komplex protilátka -antigen se sráží dvě hodiny za teploty místnosti na anti-králičí IgG Immunobeads (Bio-Rad). Po vyjasnění (přidáním solného roztoku) a centrifugaci (2 000 g, °C, 10 minut) se -supernatant odstraní. Změří se radioaktivita sraženin. Koncentrace se stanoví srovnáním s referenčním roztokem.

Buněčné linie znamenají následující: Buněčná linie „1“ znamená neamplifikovaný klon z původní řady čtyř klonů. Buněčná linie -,,1-1550o“ znamená amplifikovaný subklon buněčné linie „1“, který byl amplifikován nejdříve v 50nM MTX - za vzniku buněčné linie „1-15“, a ta byla dále amplifikována - v 500nM MTX -za vzniku buněčné linie - - „1-15500“. Linie „l-15ioooo“ znamená subklon „USeco“, který byl dále amplifikován za přítomnosti 10 OoOnM MTX. Buněčná linie 18B-9 je subklon jednoho z původních čtyř klonů, který byl amplifikován na 50nM MTX.

Všechny amplilikované buňky vykazují

24879$ zvýšené hladiny produkce t-PA ve srovnání $ neamplifikovanými bunWnými kuiwtam-l. Dokonce i neamplifikovaná kultura produkuje větší množství než 0,5 pg/bfku/den; amplifikací se 'dosáhne produkčních hladin až 50 'pg/buňku/den.

Sloučeniny podle tohoto •vynálezu mohou být formulovány známými způsoby. Vyrábějí se tak 'farmaceuticky účinné prostředky, které obsahují lidský· tkáňový 'plasminogenový aktivátor podle tohoto vynálezu ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem a pojivém. Vhodná pojivá a jejich formulace, včetně 'dalších lidských proteinů, například lidského sérumaibuminu, jsou popsána například v „Renfengtons Science'“ (E. W. Martin); tato publikace je zde zahrnuta jako odkaz. Takové prostředky budou obsahovat efektivní množství 'proteinu spolu s vhodným množstvím pojivá. Vyrobí se tak farmaceuticky přijatelné prostředky vhodné pro efektivní podávání hostiteli.

Například lidský tkáňový plasminogenový aktivátor podle tohoto vynálezu může být podáván parenterálně pacientům, kteří trpí kardiovaskulárními nemocemi nebo stavy. DáVka a dávkování může odpovídat tomu, co se dnes běžně klinicky používá u jiných kardiovaskulárních· a trombolytických činidel, např. 440 IU/kg tělesné hmotnosti jako intravenosní první dávka s následující intravenosní infusí v množství 440 IU/kg/ /hod. po dobu 12 hodin u pacientů trpících pulmonární embolií.

Příkladem dávky v podstatě homogenního lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru v parenterální formě je nádobka s obsahem 25 OíM IU aktivity tkáňového plasminogenového aktivátoru, 25 mg manitolu a 45 mg chloridu sodného. Pro intravenosní podávání se smíchá s 5 ml sterilní vody pro injekce, s vhodným objemem' 0,9 proč, chloridu 'sodného pro injekce a nebo s 5⁰/o dextrosou pro injekce.

Struktura zvláštního uspořádání lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru, připraveného podle tohoto vynálezu, byla studována podrobněji jak objasněním sekvencí kódujících geny tak technikami biochemie proteinů. Předpokládaná struktura, podle současných 'znalostí, je ilustrována na obrázku 12.

Collen a spolupracovníci (Rijken a spol.: J. Biol. Chem. '256, 7 035 (1981)] ukázali, že dvouřetězový lidský tkáňový plasminogenový aktivátor vzniká proteolytickým štěpením jednořetězové 'molekuly na dva polypeptidy, které jsou spojeny disulfidovými můstky. Tato práce dovoluje závěr, že těž

4« ký řetězec (o molekulové hmotnosti 30 '882] je odvozen od NHž- konce molekuly a lehčí řetězec (o molekulové hmotnosti 28 126) obsahuje COOHkowec molekuly, z N-termiháliiího sekvenování dvou-řetězové molekuly vyplývá, že dvouřetězová forma vzniká Štěpením jednoduché vazby mezi argininem a isoieucinem (viz šipkou označené místo na obrázku 12).

Primární struktura části oblasti těžkého řetězce lidškého tkáňového plasminogenového aktivátoru (obrázek 12) ukazuje Vysoký Stupeň sekvenční hotnologie š „kringlovým oblastmi piasm^i^r^r^g^e^nu (sottrup-jensen a spol.: „PTOgress 'in Clvemiical Fibrlnolysls and Thermoly-šs“, díl '3., Raven Press, New York, strana '191 ,<11978] ] a prottombinu (Holiand a spol.: Biochemistry 17, 4 990 (1978); Bostian a spol.; Proč. Nati. Aoatí. Sel. ' (USAJ 77, 4 50'4 (1980) ]. „Kringlová“ oblast znamená charakteristickou strukturu tři 'disulfldů, která byla původně objevena v „profaigmentu protrombinu, poprvé podrobně popsaného Magnussenem a spol. [Magnussen a spol.: „Proteolysis and 'řhysiological Regulation“, jed.: Ribhons a spol.), Academie Press, New York, str. 203 (1976); Magnussen a spol.: „Proteases and Biological Control“, Cold Spring ' Harbor Laboratory, New Y^irk, str. 123 (1975)]. Z primární sekvence jsou zřejmě dvě tak zvané „kringlové“ oblasti (každá o 82 aminokyselinách), které jsou do vysokého stupně Pomologické s pěti „kringlovými“ oblastmi jHasminogenu. Zbývajících 91 aminokyselin má malou homologii s konvenční „kringlovou“ Obastí. Lze však spekulovat s tím, že tato oblast může také zaujmout strukturu s násobnými disulfidovými vazbami, protože se zde nachází 11 dalších cysteinových Zbytků.

Katalytické místo lehkého řetězce lidského t-PA, tak zvaná oblast setinové proteasy, stejně j&ko v jiných serinůvých enzymech, je nejpravděpodobněji tvořena histidinovým;22, asparagovým37i a serinovňm778 zbytkem. Sekvence aminokyselin, 'které obklopují tyto zbytky, je velmi homoiogní s odpovídajícími částmi jiných setinových protneš, jako jsou například trypsin, protrombin a plasminogen.

Je třeba poznamenat, že odkazy jsou vybrány vzhledem ke Speciálním výhodným uspořádáním. Tomu je nutno rozumět tak, že tento vynález je konstruován tak, že není omezen speciálními výhodnými uspořádáními, ale pouze zákonným rozsahem připojeného předmětu vynálezu.

Claims

1. Způsob výroby aktivátoru lidského tkáňového plasminogenu, vyznačující se tím, že

a) se vyrobí replikabilní expresní vektor, který je schopen exprese sekvence DNA kódující aktivátor lidského tkáňového plasminogenu v hostitelské buňce zahrnující prokaryotické hostitelské buňky jako E.coli, enterobakterie, eukaryotidké mikroorganismy jako kvasinky a buněčné linie, jako VĚRO, HeLa a CHO řízeným připojením DNA, kódující aktivátor ve směru 3‘ od promotoru sekvence DNA,

b) se kultura hostitelských buněk transformuje vektorem za vzniku rekombinant ních hostitelských buněk se zakotveným vektorem,

c) se rekombinantní hostitelské buňky kultivují s následnou expresí sekvence DNA kódující aktivátor za vzniku aktivátoru a dj se aktivátor izoluje, 'z buněk nebo ze živné půdy.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se zralý aktivátor lidského tkáňového plasminogenu vyrobí přímou expresí.

3. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se použije expresní vektor, který obsahuje sekvenci DNA umožňující expresní amplifikaci.