HU204557B - Process for producing uroquinase-type plasminogen activators - Google Patents

Process for producing uroquinase-type plasminogen activators Download PDF

Info

Publication number
HU204557B
HU204557B HU881922A HU192288A HU204557B HU 204557 B HU204557 B HU 204557B HU 881922 A HU881922 A HU 881922A HU 192288 A HU192288 A HU 192288A HU 204557 B HU204557 B HU 204557B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gly
yeast
ser
leu
lys
Prior art date
Application number
HU881922A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT46360A (en
Inventor
Bernd Meyhack
Jutta Heim
Rolf Buergi
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB878709081A external-priority patent/GB8709081D0/en
Priority claimed from IE329987A external-priority patent/IE81116B1/en
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of HUT46360A publication Critical patent/HUT46360A/hu
Publication of HU204557B publication Critical patent/HU204557B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány tárgya új eljárás fehérjék, pontosabban urokínáz típusú szerin-profeázok előállítására.
Az említett eljárás génsebészeti úton módosított élesztőtőrzseket használ. A találmány foglalkozik továbbá új urokináz típusú fehérjékkel, az említett fehérjéket kódoló DNS-ekkel,' a DNS-eket tartalmazó hibrid vektorokkal, az említett, génsebészeti úton módosított élesztőtörzsekkel, valamint az említett DNS-ek, hibrid vektorok és élesztőtörzsek előállításával.
Az urokináz vagy urokináz típusú plazminogén aktivátor (ezután csak „u-PA”-ként hivatkozunk rá) egy olyan szerin-proteáz, amely a plazminogént proteolitikus hasítással plazminná aktiválja. A plazmin egy hatékony proteáz, amely képes a vérrögők fibrinhálózatát lebontani, és így oldható lebontási termékeket létrehozni.
Az u-PA-t először emberi vizeletből izolálták, és ismert róla, hogy tenyésztett vesesejtek és néhány rákos sejtvonal is kiválasztja. Egyláncú molekulaként keletkezik (ezentúl ezt csak „scu-PA”-ként említjük) és a plazmin hatására proteolitikusan kétláncú formává alakítható (ezt ezentúl csak „tcu-PA-ként említjük), melyben a két lánc diszulfid-hídonkeresztül kapcsolódik egymáshoz. Az u-PA egyetlen glikozilezési helye Asn302-n van.
Mivel a scu-PA alacsonyabb aktivitással rendelkezik Jas molekulatömegű szintetikus szubsztrátumokkal szemben, ezért egészen mostanáig úgy gondolták, hogy az aktív teu-PA-enzímnek egy igazi proteolitikusan inaktív prekurzora. A legújabb eredmények azonban igazolták, hogy a scu-PA hatékonyan aktiválja a plazminogént plazminná, és a tcu-PA-nál lényegesen nagyobb szelektivitással rendelkezik a fibrin felé [lásd H; R. Líjnen et al., J. Bioi. Chem., 261,1253 (1986)].
A scu-PA meglepő fibrinolitikus aktivitásának és ! vérrőgspecifításának mechanizmusát tanulmányozták [Líjnen et al., supra; D.‘ Collen et al., J. Bioi. Chem., 261,1259 (1986)]. Kimutatták, hogy a scu-PAnem egy inaktív zimogén, hanem anélkül aktiválja a plazminogént, hogy előtte tcu-PA-vá lenne transzformálva. A z tcu-PA-tól eltérően a scu-PA-t kompetitíve gátolja egy még ismeretlen plazmakomponens, amely inhibíciót a fibrin vagy fibrinfragmensek állítják le a vérrögnél. Ennélfogva miközben a scu-PA in vivő körülmények között kering a vérben, nem aktiválja a plazminogént. 4 Fibrinolitikus aktivitása a megfelelő célra irányult marad. Ezzel szemben a tcu-PA képes aktiválni a plazminogént a keringési rendszeren belül bárhol, így nemkívánatos mellékhatásokhoz, például vérömlenyhez vezet. Ezek a tulajdonságok teszik a scu-PA-t az előnyös 50 urokináz típusú plazminogén aktivátorrá.
A rekombináns DNS-technolőgia segítségével most már lehetséges olyan fehérjéket, mint a scu-PA, ipari méretekben előállítani. A genomiális u-PA DNS [Riccio et al., Nucleic Acids Research, 13, 2159 (1985)], 55 valamint az u-PA cDNS [W. E. Holmes et al., Biotechnology, 3, 923 1985)] ismert szerkezetére alapozva a rekombináns DNS-technológiát használó eljárásokat írtak le az irodalomban scu-PA előállítására. így E.coliban való expressziét ír le W. E. Holmes et al. (supra), P.
Jacobs et al. [DNS 4,139 (1985)], Μ. E. Winkler et aL [Biochemistry, 25,4041 (1986)], M. Nagai et al [Gene,
36, 183 (1985)]; lásd még a 900 826 sorszámú belga szabadalmi bejelentést, a 61 181 377 sorszámú japán szabadalmi bejelentést, valamint a 92 182 sorszámú
EPA bejelentést. A scu-PA kifejeződését állati sejtekben~a 92 182 és 154 272 sorszámú EPA szabadalmi bejelentésben írják le. Azonban az összes ismert eljá-. rásnak komoly hibái vannak. Bebizonyosodott, hogy állati sejteket nagy mennyiségben tenyésztem nagyon nehéz, pedig ez az előfeltétele az ilyen sejtek által termelt fehérjék olcsó és gazdaságos előállításának. Az állati sejtek generációs ideje lényegesen hosszabb, mint a mikroorganizmusoké, így elnyújtott fermentáciÍ5 óra van szükség ahhoz, hogy megfelelően magas sejtsűrűséget érjünk el. Ezenkívül az állati sejtek tenyésztésekor elérhető sejtsűrűség lényegesen alacsonyabb, mint amit a mirkoorganizmusok nagy mennyiségben való tenyésztésekor általában elérnek. Ezenkívül a mikroorganizmusokkal összehasonlítva a tőrzsjavítás nagyon nehéz. Másik oldalát nézve a kérdésnek, az E.coli-ból származó fehérjekészítményekben gyakran találnak szennyező endotoxinokat. Ezeket drága és időigényes tisztítási lépésekben kell eltávolítani. Az E.coli által termelt fehérjék szükségszerűen glikozilezetlenek, mivel az E.coli-ban nem. található meg az az enzimrendszer, amely felelős a szénhidrátláncoknak a fehérjemolekula megfelelő helyeihez kapcsolásáért Ennélfogva a rekombináns scu-PA, eltérően a természetes
Q scu-PA-tól, glikozilezetlen, ha E.coli-ban állítják elő. Leírták, hogy az E.cóli által termelt scu-PA amorf, oldhatatlan fonnában található, a diszulfíd-hidak helytelen összekapcsolódása, valamint a fehéq'e rossz térbeli szerkezete miatt legalább egy plusz, nagy mennyi5 ségű oldószert igénylő szerkezetátrendező lépésre van szükség ahhoz, hogy biológiailag aktív fehérjét kapjunk (Μ. E. Winkler et al., supra).
Figyelembe véve az ismert eljárások hátrányait állandó igény van megjavított eljárásokra, amelyek lehe) tővé teszik a biológiailag aktív scu-PA nagy mennyiségben történő előállítását. A jelen találmány célja ilyen eljárás bemutatása.
Meglepetésszerűen jöttek rá, hogy ha az élesztősejteket olyan hibrid vektorral transzformálják, amelyben > a humán u-PA-t kódoló szakaszt egy élesztőgén szignálszakaszával kapcsolják össze, akkor az élesztősejtek olyan scu-PA-t termelnek, amelynek a biológiai aktivitása egyenértékű a természetes scu-PA-val és élesztőspecifikusan van glikozilezve. Említésre érdemes, hogy az élesztő scu-PA teljesen aktív, anélkül, hogy bármilyen in vitro szerkezetátrendező lépésre lenne szükség.
Ennek megfelelően a találmány tárgya eljárás humán egyláncú urokináz típusú plazminogén aktivátor vagy ennek mutánsa előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelő táptalajon olyan hibrid vektorral transzformáit élesztősejteket tenyésztünk, melyben egy élesztő expressziós kontrollszakasz van, valamint egy DNS-szegmens, amelyben az első DNS-szakasz egy szignálpeptidet kódol, és leolvasási fázisban van egy másik DNS-szakasszal, amely érett urokináz típusú
HU 204 557 Β plazminogén aktivátort vagy annak mutánsát kódolja, és ez a DNS-szakasz az említett expressziós kontroliszakasz transzkripciós kontrollja alatt áll, a harmadik eleme pedig egy élesztőgén transzkripciós terminációs szakasza, valamint az említett urokináz típusú plazminogén aktivátor vagy mutánsainak izolálása.
Az „érett urokináz típusú plazminogén aktivátort kódoló DNS-szakasz” szakkifejezés az u-PA összes ismert, vagy a humán genomból izolálható alléljára vonatkozik. Ezek a DNS-szakaszok nem tartalmaznak sempre-, sem pro-szakaszokat.
A scu-PA-mutánsok főleg azok, melyek a fehérjét proteáz rezisztenssé teszik. Ezek a scu-PA-mutánsok kovalensen módosítva vannak a proteolízis helyein, amely proteolízist a vérben található proteázok, úgymint a trombin és a plazmin végeznek, úgyhogy a mutánsok többé nem érzékenyek az ezeken a helyeken végbemenő proteázos hidrolízisre. A kiválasztott helyek közé tartozik a Lys 133-tól Lysl36-ig terjedő szakasz (az ezen a helyen történő hasítás okozza az úgyne- 20 vezett alacsony molekulatömegű formáját a scu-PAnak; vagyis a LUK-ot; lásd a 2. ábrát a kísérő rajzok között), az Arg 156-Phe 157 (érzékeny a trombin támadására) és a Lysl58-Ilel59 (az ezen a helyen bekövetkező plazminos hasítás hozza létre a tcu-PA-t). A megfelelő scu-PA megfelelő helyspecifikus aminosavszubsztitúcióval, inszercióval vagy delécióval rendelkeznek egy vagy több ilyen kiválasztott helynél. Azok 5 a mutánsok különösen előnyösek, amelyekben a kiválasztott helyeket képező aminosavak közül egy vagy több kimarad, vagy amelyben ezen aminosavak közül legalább az egyiket másik aminosavval helyettesítik, és a kapott mutánsok rezisztensek a proteolitikus táma10 dásra.
A scu-PA további mutánsaiban az egyetlen N-glikozilezési helyet, amely a 302-es helyen található Asn (Asn302-Ser-Thr) módosítják, úgy, hogy ezen a helyen a glikozilezés nem történhet meg. Jól ismert, hogy az 15 emlős sejtekben az N-glikozilezés előfeltétele az -AsnL-Thr (vagy Ser) tripeptidszekvencia előfordulása, amelyben az Asn az akceptor és L a húsz természetes aminosav bármelyike lehet, prolin vagy aszparaginsav kivételével, melyek megakadályozzák a glikozilezést.
A „scu-PA-fehérjék” eddig vagy ezután használt szakkifejezés magában foglalja a suc-PA-t, valamint annak mutánsait is.
A találmány fő tárgya eljárás az I általános képletű scu-PA-fehérjék előállítására.
Ser Asn Glu Leu His Gin Val
Pro Ser Asn Cys Asp > Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val -Ser Asn
Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe
Gly Gly Gin His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu
Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Alá Ser Thr Asp Thr Met
Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Alá Thr Val Leu Gin Gin
Thr Tyr His Alá His Arg Ser Asp Alá Leu Gin Leu Gly Leu Gly
Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn ' Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp
Cys Tyr Val Gin Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gin Glu Cys Met
Val His Asp Cys Alá Asp Gly X. X2 Pro Ser Ser Pro Pro Glu
Glu Leu Lys Phe Gin Cys Gly Gin Lys Thr Leu Arg Pro Yl Y2
Ya Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr He Glu Asn Gin Pro Trp
Phe Alá Alá Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr
Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Alá
Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr He Val
Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gin Gly Glu Met
Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu He Leu His Lys Asp Tyr Ser Alá
Asp Thr Leu Alá His His Asn Asp He Alá . Leu 1 Leu Lys Ile Arg
Ser Lys Glu Gly Arg Cys Alá Gin Pro Sei Arg Thr He Gin Thr
Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gin Phe Gly Thr Ser
Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Zj Ser z2 Asp Tyr Leu
Tyr Pro Glu Gin Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His
Arg Glu Cys Gin Gin Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr
Lys Met Leu Cys Alá Alá Asp Pro Gin Trp Lys Thr Asp Ser Cys
Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gin Gly Arg
Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Alá Leu
Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro
Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Alá Leu,
amelyben Xi és X2 (135, ill. 136 hely) egymástól fug- 55 getlenül Lys-t, bázikus aminosavtól különböző aminosavat, vagy kémiai kötést jelent; Yi (156 hely) jelentése Ag, bázikus aminosavtól különböző aminosav vagy kémiai kötés; Y2 (157 hely) jelentése Phe, savas aminosav vagy kémiai kötés; Y3 (158 hely) jelentése Lys bázikus amino- 60 savtól különböző aminosav vagy kémiai kötés; Zi (302 hely) jelentése élesztőspecifikusan glikozilezett Asn, vagy más aminosav; Z2 (304 hely) jelentése Thr, vagy bármely más, Ser-tői eltérő aminosav.
Az „aminosav” kifejezés az összes genetikailag kódolt aminosavat jelenti, úgymint a savas aminosavakat,
I
HU 204557 Β például a glutaminsavat és aszparaginsavat; a bázikus aminosavakat, például az arginint, lizint és hisztidínt; valamint a semleges aminosavakat, például az aszparagint, glutamint, glicint, alanint, Ieucint, izoleucint, szerint, treonint, tirozint vagy prolink
Hogy megelőzzük a glikozilezést az N-glikozilezési helyen, azért az N-glikozilezéshez szignálként felismert tripeptidszekvenciákat meg kell változtatni. Az Asn (Zi) és/vagy Thr (Z2) maradékoknak bármely aminosavval való felcserélése a fenti tripeptidszakaszban lehetetlenné teszi a glikozidos kötés kialakítását az adott helyen. Az egyszerűség kedvéért az N-glikozilezési hely módosítását nem fehérjeszinten végzik. Ehelyett a scu-PA-t kódoló gént előnyös módosítani oly módon, hogy az említett módosított génnek megfelelő gazdában való kifejezésével olyan mutáns scu-PA-t állítunk elő, amelyben az N-glikozílezési helyet oly módon változtatjuk meg, hogy ezen a helyen nem játszódhat le glikozilezés. Pontosabban, az aszparagint valinnal, leucinnal, izoleucinnal, alaninnal, vagy különösen glutaminnal helyettesítjük, a treonint pedig valinnal, metioninnalvagy'külőnösen alaninnal.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási formája olyan eljárásra vonatkozik, az I általános képletű vegyületek előállításában, melyben Xi jelentése Lys, Gly vagy Ser, X2 jelentése Lys, Yi jelentése Arg, Y2 jelentése Phe, Asp vagy Glu, Yj jelentése Lys, Zr jelentése Asn vagy Gin és Zz jelentése Thr,
Pontosabban a találmány szerinti eljárás a scu-PA, [Glyl35j-scu-PA, [Serl35]-scu-PA, [Aspl57]-scu- : PA, [Serl35,Aspl57I-scu-PA és [Glyl35,Aspl57]scu-PA előállítására vonatkozik, melyben az Asn302 .élesztőspecifikusan, az alkalmazott élesztősejtnek megfelelően van glikozilezve, valamint a [Glu302]scu-PA, [Glyl35,Aspl57,Gln302]-scu-PA és a < [Serl35,Aspl57,Gln3ö2]-scu-PA előállítására.
A találmány szerinti transzformált élesztőtőrzseket asszimilálható szenet, nitrogént és szervetlen sókat tartalmazó folyékony táptalajon tenyésztjük.
Különböző szénforrások használhatók. Előnyös 4 szénforrások például az asszimilálható szénhidrátok, . úgymint a glükóz, maltóz, mannitol vagy laktóz, vagy egy acetát, például a nátrium-acetát, mélyet egyedül vagy megfelelőkeveiékekben használhatunk. A megfelelő nitrogénforrások közé tartoznak például az aminosavak, úgymint a kazaminosavak, a peptidek és fehérjék, valamint lebontási termékeik, úgymint a íryptön, pepton vagy hűskivonatok, továbbá az élesztőkivonat, malátakivonat, kukoricalekvár, valamint az ammóniumsók, úgymint az ammónium-klorid, -szulfát vagy -nitrát, melyeket használhatunk egyedül, vagy megfelelő keverékekben. A használható szervetlen sók közé tartoznak például a szulfátok, kloridok, foszfátok, karbonátok, azaz ezeknek nátrium-, kálium-, magnéziumés kalciumsóí. A táptalaj tartalmazhat továbbá a növekedést segítő anyagokat. A növekedést segítő anyagok közé tartoznak például a nyomelemek, úgymint a vas, cink, mangán és hasonlók, vagy az egyes aminosavak.
A konstitutív promotort (pl. ADHT, GAPDH) tartalmazó hibrid plazmidokat tartalmazó élesztősejtek az <
említett promotorhoz csatolt u-PA-gént indukció nélkül fejezik ki. Ha azonban az u-PA-gén egy szabályozott promotor (például PGK vagy PHO5) kontrollja alá van helyezve, akkor á növesztő táptalaj összetételét úgy kell megváltoztatni, hogy a szükséges mRNS koncentrációja maximális szintet érjen el, azaz ha a ΡΉ.Ο5 promotort használjuk, akkor a növesztő táptalaj csak alacsony koncentrációban tartalmazhat szervetlen foszfátot ennek a promotomak a derepresszálása végett.
A tenyésztést szokásos technikák alkalmazásával végezzük. A tenyésztési körülményeket, úgymint a hőmérsékletet, a táptalaj pH-ját és a fermentációs időt úgy választjuk meg, hogy a scu-PA-fehérjék maximális mennyiségben keletkezzenek. Egy kiválasztott élesztő5 törzs előnyösen aerob körülmények között nő rázás vagy keverés közben 25-35 °C között, előnyösen 28 ’C körül, 4-7 pH érték között, például körülbelül 5-ös pH-η, és körülbelül 20-50 óráig, előnyösen addig, amíg a scu-PA-fehérjék maximális mennyiségét el nem érjük.
A keletkező scu-PA-fehérje akkumulálódhat az élesztősejteken belül, vagy kiválasztódhat a periplazmatikus térbe. Abban az esetben, amikor az scu-PA-fehérje akkumulálódik a sejteken belül, akkor a scu-PA5 fehérje kinyerésének első lépése a fehérje kiszabadítása a sejt belsejéből. A legtöbb eljárásban a sejtfalat először glükozídáz enzimes emésztéssel eltávolítjuk. Ezt követően a kapott szferoplasztokat detergenssel, például Triton Χ-100-zal kezeljük. Egy másik eljárás 3 szerint mechanikai erők, úgymint nyíróerő (például X-press, French-press), vagy üveggyöngyökkel való rázatás alkalmas a sejtek feltárására. A kapott keverék scu-PA-fehérjetartalmát ismert eszközökkel megnöveljük, úgymint a legtöbb nem fehérjeszerű anyag eltávoi lítása polietilénimines kezeléssel, a fehérjék kicsapása ammónium-szulfáttal, gélelektroforézis, dialízis, kromatográfia, például ioncsere-kromatográfía, mérétkizárásos kromatográfia, HPLC vagy fordított fázisú HPLC, molekulaméret szerinti elválasztás megfelelő ' Sephadex-oszlopon. Az előtisztított tennék végső tisztítását elérhetjük affinitás-kromatográfiás eszközökkel, például antitest affinitás-kromatografiával, különösen monoklonális antitest affinitás-kromatografiával, monoklonális anti-u-PA antitesteknek oldhatatlan hordozóra való rögzítésével, amely módszer ismert az irodalomból, és hasonlókkal. Előnyösen felületaktív anyagot, főleg nemionos detergenst, úgymint Triton X-100at vagy Tween 80-at adunk a tisztítási lépésekben alkalmazott összes pufferhez, hogy megakadályozzuk a scu-PA-fehérjéknek az edények felületére való abszorpcióját, valamint hogy növeljük a stabilitását. A detergenst 0,01-1% végkoncentrációban használhatjuk.
Abban az esetben, amikor a scu-PA-fehérjét az élesztősejt kiválasztja a periplazmatikus térbe, akkor egy egyszerűsített eljárást lehet alkalmazni: A fehérjét sejtlízis nélkül lehet kinyerni, azaz a sejtfal olyan enzimatikus vagy kémiai anyagokkal, például tiol-reagensekkel vagy EDTA-val való kezelése nélkül, amely a sejtfal eíroncsolása révén teszi lehetővé a termelt scu4
HU 204 557 Β _ PA-fehérjének a sejtből való távozását. Abban az esetben, amikor a scu-PA-fehérje kiválasztódik a fermentlébe, akkor közvetlenül onnan nyerhető ki.
A használt gazdatörzstől, valamint tisztítási módszerektől függően a jelen találmány szerinti scu-PA-fehérjék a gazdasejtek által termelt proteolitikus aktivitás miatt kis mennyiségben szennyezettek lehetnek a megfelelő kétláncú formával. A kétláncú formát a kívánt egyláncú formától (scu-PA) az irodalomból ismert módszerekkel lehet elválasztani, úgymint a benzamidin-Sepharose-on való kromatográfiával [lásd Μ. E. Winkler et al., Biochemistry 25, 4041 (1986)].
Meglepő módon azt tapasztalták, hogy a jelen találmány szerinti scu-PA-fehérjék annyiban különböznek az E.coli-hó\ kinyert scu-PA-tól, hogy a természetes humán scu-PA biológiai aktivitását mutatják, anélkül, hogy bármilyen struktúraátalakító lépésre lenne szükség, valamint abban, hogy élesztőspecifikusan glikozilezve vannak az Asn302-nél. Az élesztőspecifikus glikozilezés következtében a találmány szerinti scu-PAfehérjék különböznek a tenyésztett vagy transzformált állati sejtekből izolálttól is, így újnak tekinthetők.
Ennek következtében a találmány vonatkozik az élesztőspecifikus glikozilezéssel rendelkező scu-PA-ra, valamint mutánsaira is, főleg a Saccharomyces cerevisiae-re specifikus glikozilezéssel rendelkezőkre.
A scu-PA-nak azok a mutánsai, melyekben a glikozilezési hely úgy van módosítva, hogy glikozilezés nem léphet fel, ennélfogva hasonlóan újak és a jelen találmány. további tárgyát képezik.
A találmány tárgyai továbbá azok az I általános képletű vegyületek is, melyekben Zi jelentése bármely, Asn-tól eltérő genetikusán kódolt aminosav, Z2 jelentése Thr, Xi, X2, Υι, Y2 és Y3 jelentése az I általános formula szerinti, valamint azok az I általános képletű vegyületek is, melyekben Zi jelentése Asn, Z2 jelentése bármely, Thr-tól és Ser-tői különböző, genetikusán kódolt aminosav, Xi, X2, Υι, Y2 és Y3 jelentése az I általános formula szerinti.
Különösen azok az I általános képletű vegyületek képezik a találmány oltalmi körét, melyekben Xi jelentése Lys, Gly vagy Ser, X2 jelentése Lys, Yi jelentése Arg, Y2 jelentése Phe, Asp vagy Glu, Y3 jelentése Lys, Zi jelentése Glu és Z2 jelentése Thr.
A jelen találmány szerinti legelőnyösebb vegyületek: scu-PA, [Glyl35]-scu-PA, [Serl35]-scu-PA, [Aspl57]-scu-PA, [Serl35,Aspl57]-scu-PA és a [Glyl35,Aspl57]-scu-PA, melyben az Asn302 élesztőspecifikusan glikozilezve van, továbbá a [Gln302]scu-PA, a [Glyl35,Aspl57,Gln302]-scu-PA és a [Serl35,Aspl57,Gln302]-scu-PA.
A jelen találmány szerinti transzformált élesztőtörzseket rekombináns DNS-technikával állíthatjuk elő, a következő lépésekben:
- a scu-PA-t vagy annak mutánsát kódoló struktúrgén előállítása,
- a kapott struktúrgén beépítése egy megfelelő vektorba,
- megfelelő gazdasejt transzformálása a kapott hibrid vektorral,
- a transzformált gazdasejtek elválasztása a transzformálatlan gazdasejtektől.
Az u-PA cDNS és a genomiális u-PA DNS nukleotidsorrendje ismert [W. E. Holmes et al., Biotechnology, 3, 923 (1985); A. Riccio et al., Nucleic Acids Research, 13, 2759 (1985)]. Ismerve az u-PA cDNS és a genomiális DNS szekvenciáját, az u-PA vagy ennek mutánsa struktúrgénjét az irodalomból ismert módon lehet előállítani. Az ilyen DNS-ek előállítására szolgáló módszerek közé tartozik a mRNS izolálása humán, scu-PA-t termelő sejtekből, úgymint humán karcinómasejtekből, embrióvesesejtekből, a kívánt mRNS kiválasztása, például megfelelő DNS-próbával hibridizálva, a mRNS-sel komplementer egyszálú DNS előállítása, utána kétszálú komplementer DNS (de cDNS) készítése belőle, vagy genomiális DNS izolálása humán sejtekből és a kívánt DNS-szakasz kiválasztása megfelelő DNS-próbát használva és ha szükséges, a kapott cDNS vagy genomiális DNS mutációja, vagy a struktúrgén előállítása kémiai szintézissel. A találmány szerinti struktúrgéneket előnyösen a mRNS-módszerrel állítjuk elő, és ha mutánsra van szükség,. akkor az előállított u-PA cDNS mutagenezisével. Ennek megfelelően az u-PA-mutánst kódoló stmktúrgént előállíthatjuk a nemkívánt aminosavmaradék (maradékok) kodon(jai)t tartalmazó DNS-darab kivágásával az érett u-PA-génből, és helyettesítve egy olyan DNS-szakasszal, ahol az említett kodon(oka)t a kívánt aminosava(ka)t kódoló kodonnal (kodonokkal) helyettesítjük, vagy a dezoxiribonukleotidok helyettesítését helyspecifikus mutagenezissel végezzük [cf. M. J. Zoller, et al., Methods Enzymol., 100,468 (1983), D. Botstein et al., Science, 229,1193 (1985)].
A jelen találmány szerinti hibrid vektorok tartalmaznak egy élesztő expressziós kontrollszakaszt, egy olyan DNS-szakaszt, amely a kódolószakasz előtt, és azzal leolvasási fázisban egy szignálpeptidet kódoló szakaszt tartalmaz, utána az érett urokináz típusú plazminogén aktivátort vagy annak mutánsát kódoló szakaszt, amely DNS-szakasz az említett expressziós kontrollszakasz transzkripciós szabályozása alatt áll, valamint egy olyan DNS-szakaszt, amely egy élesztőgén transzkripciós terminációs jelét tartalmazza.
Az élesztő expressziós kontrollszakaszai az élesztő, főleg a Saccharomyces cerevisiae genomiális DNS-éből származnak. Előnyösen egy erősen kifejeződő élesztőgén expressziós kontrollszakaszát használják a scu-PA kifejezésére. így a TRPI-gén, azADHI- vagy ADHII-gén, a savas foszfatáz (PHO5) gén promotora, az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH), a 3-foszfoglicerát-kináz (PGK), hexokináz, piruvát- dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerát-mutáz, piruvát-kináz triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz gének promotora, vagy az élesztő szexuális feromongénjeinek (az a, illetve α-faktort kódolják) promotora használható. Az is lehetséges, hogy hibrid promotorokat használunk, amelyek egy „felső” (upstream) aktiválószakaszt (UAS) tartalmaznak, egy élesztőgénből, és egy másik élesztőgénből „alsó” (downstream) promotorelemeket, beleértve egy funkcio5
I
HU 204557 Β nális TATA boxot, például az élesztő PHO5 génjének UAS-aiból és az élesztő GAPDH-génjeinek funkcionális TATA boxát tartalmazó downstream promotorelemekből álló hibrid promotor. A jelen találmány szerinti előnyös vektorok transzkripciós szabályozással rendelkező promotorokat tartalmaznak. Az ilyen típusú promotorok, például a PHO5 gén promotora és PHO5GAPDH hibrid promotor a növekedési körülmények változtatásával kibe kapcsolhatók. A PHO5 promotor működését például akarattal elnyomhatjuk, pusztán a szervetlen foszfát táptalajbeli koncentrációjának növelésével. A jelen találmány szerint további előnyös promotor a GAPDK-gén promotora, főleg ennek azok a funkcionális fragmentjei, amelyek a -550 és -180 sorszámú nukleotídoknál kezdődnek, pontosabban a -540, -263 vagy -198-as nukleötídnál és a GÁPDH-gén -5-ös nukleotidjánál végződnek.
A szignálpeptidet kódoló DNS-szakasz (a „szignálszekvencia”) előnyösen olyan eukarióta, például humán- vagy élesztőgénből származik, amely kiválasztódó polipeptidet kódol.
Megfelelő· szignálszekvenciák például a humángenomiális DNS-ből származó u-PÁ-szignálszekvencia, élesztő szignálszekvenciák, úgymint az élesztő invertáz, α-faktor, feromon peptidáz (KEX1), a „killer toxin” és a represszálható savas foszfatáz (PH05) gének szignál- és preproszekvenciái, valamint az Áspergillus awamori glükoamiláz szignálszekvenciája. Egy másik megoldás szerint fuzionált szignálszékvenciákat lehet készíteni, ha a használt promotorhoz természetesen kötődő gén szignálszakaszának egy részét (ha létezik), az n-PA-szígnálszekveücia egy részéhez ligáljuk. További szakaszok, úgymint pro- és spacer-szekvenciák, melyek vagy tartalmaznak, vagy nem specifikus proceszszálójeleket, szintén beépíthetők a konstrukciókba, hogy megkönnyítsük a prekurzonnolekulák pontos processzálását. Olyan, másképp fuzionált fehérjéket lehet előállítani, amelyek belső processzálójelzéseket tartalmaznak és lehetővé teszik a megfelelő érett fehérje keletkezését in vivő vagy in vitro. Aprocesszálójelek tartalmaznak például egy Lys-Arg maradékot, amelyet felismer a Golgi-membránban elhelyezkedő élesztő endopeptidáz. A jelen találmány szerinti előnyős szignálszakasz a
Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser He Leu Ala Ala Ser Leu Ala Ans Ala, képletú szignálpeptíd, melyet az élesztő PH05 génje kódol, a Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Be Ser Ala, képletű szignálpeptíd, melyet az élesztő invertáz génje kódol, és a Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser Asp Ser Lys Gly -képletű szignálpeptíd, melyet a humán u-PA génje kódol.
Élesztő transzkripciós terminációs jelet tartalmazó
DNS-szakasz előnyösen egy élésztőgén 3T végén lévő szakasza, mely megfelelő transzkripciós terminációs és políadenilezési jeleket tartalmaz. A megfelelő 3’ végen lévő szakaszok például a használt expressziós kontroliszakaszhoz természetesen kapcsolódó génből származnak. Az előnyős 3’ határolószakasz az élesztő PH05 génből származik.
A találmány szerinti hibrid plazmidok a promotor, a szignálszakasz, az u-PA-t vagy annak egy mutánsát kódoló DNS-szakasz, valamint a 3’ határolószakaszokon kívül további, fontos funkciókat betöltő. DNSszekvenciákat is tartalmaz, amelyek például az említett hibrid plazmidokkal transzformált sejtek szaporításában játszanak fontos szerepet. A további DNSszakasz(ok) származhatnak prokaíőta- és/vagy eukariótasejtekből és kromoszomális és/vagy extrakromoszomális DNS-szekvenciákat tartalmazhatnak. A további DNS-szakaszok származhatnak (vagy tartalmazhatnak) plazmid DNS-ből, úgymint baktérium vagy eukarióta DNS-ből, virális DNS-ből és/vagy kromoszomális DNS-ből, úgymint baktérium, élesztő vagy magasabb rendű eukarióta kromoszomális DNS-ből.
Az előnyös hibrid plazmidokban lévő kiegészítő DNS-szakaszok baktériumplazmidokból származnak, főleg a pBR322 vagy pUC19 szSnnazékBscfierichia coli plazmídokből, vagy α-bakteriofágból, élesztő 2 mikro35 nos plazmidból és/vagy élesztőkromoszomálís DNS-ból. A találmány szerinti előnyös plazmidokban a kiegészítő DNS-szakaszok egy élesztő replikációs origót és egy élesztőben szelektálható genetikai markert tartalmaznák. Egy élesztő replikációs origót, például egy autonóm replikálódó szekvenciát (ARS) tartalmazó hibrid plazmidot transzformálás után extrakromoszomálisan fennmaradnak az élesztősejtben és a mitózis során függetlenül replikálódnak. Az élesztői mikronos plazmid DNS-ével homológ szekvenciákat tartalmazó hibrid plazmidok is használhatók. Ezek a hibrid plazmidok rekombinálódnak a sejtben már jelen lévő élesztő 2 mikronos plazmidokkal vagy önállóan replikálódnak, ha a replikációs origó jelen van bennük. A 2 mikronos szekvenciák különösen alkalmasak nagy transzformációs hatásfokú, plazmidok készítésére és nagy kőpiaszámot biztosítanak. Ami az élesztőben szelektálható marker gént illeti, bármely olyan marker gén használható, amelynek fenotípxkus expressziőja megkönnyíti a transzformánsok szelekcióját. Az élesztőnél alkalmazható domináns markerek főleg az antibiotikum- rezisztenciát kifejezők, vagy az élesztő auxotróf mutánsok esetében azok a gének, amelyek kijavítják^ gazdasejtben lévő hibát. A megfelelő gének például rezisztenssé teszik a sejteket a G418 vagy hygromycin antibiotikumra, vagy prototrófiát biztosítanak egy
HU 204 557 Β élesztő auxotróf mutánsban, például az URA3, LEU2, HIS3 vagy TRP1 mutánsban.
A találmány szerinti hibrid plazmidokban jelen lévő kiegészítő DNS-szekvenciát előnyösen egy bakteriális gazda, főleg Escherichia coli replikációs origót és szelektálható genetikai markert is tartalmaznak. Vannak előnyös tulajdonságok, amelyek egy élesztő hibrid plazmidban egy E.coli replikációs origó és egy E.coli marker jelenlétéhez kapcsolódnak. Először is nagy mennyiségű hibrid plazmid DNS állítható elő E.coli növesztésével ás az abban való szaporításával, másodszor pedig a hibrid plazmidok könnyen készíthetők E.coliban, felhasználva az E.coli-ra alapozott klónozási technológia széles repertoárját. Az E.coli plazmidok, úgymint a pBR322 és a hasonlók mind E.coli replikációs origót, mind antibiotikum-rezisztenciát kódoló E.coli genetikai markert tartalmaznak, például tetraciklinés ampicillin-rezisztenciát, és előnyösen használhatók élesztő hibrid vektorok részeként.
A kiegészítő DNS-szakaszokat, amelyek például replikációs origót és genetikai markert tartalmaznak az élesztő- és baktériumgazdasejtek számára (lásd fent), továbbiakban a „vektor DNS”-ként említjük, melyek az élesztőpromotorral és a scu-PA-fehérjét kódoló szakasszal együtt a találmány szerinti hibrid plazmidot képezik.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási formájában olyan hibrid plazmidokra vonatkozik, melyek képesek önálló replikációra egy élesztőgazdatörzsben, szelektálható markerekkel rendelkeznek, tartalmaznak egy élesztő expressziós kontrollszekvenciát, egy olyan DNS-szakaszt, melynek az első része egy szignálpeptidet kódol, amely egy második, érett urokináz típusú plazminogén aktivátort vagy annak egy mutánsát kódoló DNS-szekvencia előtt van, azzal leolvasási fázisban, valamint egy élesztőgén transzkripciós terminációs szignálját tartalmazó DNS-szekvenciát, és az említett DNS-szakasz a transzkripciós start és terminációs jelekkel, valamint a transzlációs start és stop jelekkel az említett hibrid vektorban az említett expressziós kontrollszakasz szabályozása alatt áll úgy, hogy egy transzformált élesztőtörzsben kifejeződve az említett urokináz típusú plazminogén aktivátort vagy annak mutánsát termeli.
A jelen találmány szerinti hibrid vektorok a szakmában ismert módszerekkel készülnek, például egy élesztő expressziós kontrollszekvencia, egy szignálpeptidet kódoló régiót tartalmazó DNS-szakasz, az u-PA-t vagy annak egy mutánsát kódoló DNS-szekvencia, a 3 ’ határolószekvencia és a vektor DNS összekapcsolásával.
A hibrid plazmidok készítéséhez olyan térképezett cirkuláris vektor DNS, például baktériumplazmid DNS vagy hasonló (lásd fent), használható kényelmesen, amely legalább egy restrikciós hasítási hellyel, előnyösen kettő vagy több restrikciós hasítási hellyel rendelkezik. A vektor DNS már előnyösen tartalmaz élesztőés/vagy baktériumgazdában működő replikációs origót és marker géneket. A vektor DNS-t megfelelő restrikciós endonukleázzal hasítjuk. Az emésztett DNS-t az élesztő expressziós szabályozószakaszát tartalmazó DNS-szakasz(ok)hoz ligáljuk, az említett DNS-szakasz és DNS-szekvencia transzkripciós terminációs jeleket tartalmaz. Az említett DNS-fragmens(ek) kapcsolása előtt vagy után (vagy azzal egyidejűleg) is lehetséges replikációs origók és/vagy markerek bevezetése az élesztő- vagy baktériumgazda számára. A restrikciós és ligálási körülményeket minden esetben úgy kell megválasztani, hogy ne okozzanak zavart a vektor DNS és az expressziós szabályozószekvencia működésében. A hibrid vektor felépíthető lépésenként vagy két, az öszszes érdekes szekvenciát tartalmazó DNS-szakasz ligalásával. Különböző technikák használhatók a DNSszakaszok in vitro összekapcsolására. Tompa végeket (olyan DNS- duplex, ahol a végeken is megvan minden bázisnak a párja), melyeket bizonyos restrikciós endonukleázok állítanak elő, közvetlenül ligálhatjuk T4 DNS-ligázzal. Sokkal gyakoribb, amikor a DNS-szakaszokat egyszálú tapadós végeiken keresztül kapcsoljuk össze, és a kovalens kötést DNS-ligázzal, például T4 ligázzal hozzuk létre. Az ilyen egyszálú „tapadós végek”-et más típusú endonukleázokkal állíthatjuk elő, melyek lépcsős végeket eredményeznek (a DNS-duplex két szálát egymástól néhány nukleotid távolságban lévő különböző pontokon hasítják el). Egyszálú véget úgy is előállíthatunk, hogy terminális transzferáz használatával nukleotidokat adunk a tompa vagy ragadós végekhez („homopolimer farkazás”) vagy egyszerűen visszaemésztjük egy tompa végű DNS-szakasz egyik szálát egy megfelelő exonukleázzal, például λ-exonukleázzal. A tapadós végek előállításának további megközelítése az, hogy egy olyan kémiailag szintetizált kapcsoló (linker) DNS-t, amely egy tapadós véget képező endonukleáz felismerési helyét tartalmazza, összeligálhatjuk a tompa végű DNS-szakasszal, és a kapott DNSt a megfelelő endonukleázzal emésztjük.
A találmány szerinti hibrid vektor komponensei, úgymint az élesztőpromotor, az u-PA struktúrgénje vagy mutánsa, beleértve a szignálszekvenciát is, a transzkripciós terminátor, a replikációs rendszer, stb., előre meghatározott, a helyes működést biztosító rendben kapcsolódnak össze. A komponenseket általánosan ismert hasítási helyeken keresztül vagy szintetikus kapcsolómolekulákkal építjük össze, hog biztosítsuk a komponensek megfelelő orientációját és rendjét.
A szabadalom szerinti transzformált élesztőtörzseket ismert módon állítjuk elő, azaz egy élesztőtörzset olyan hibrid vektorral transzformálunk, amely élesztő expressziós kontrollszekvenciát, egy olyan DNS-szakaszt, amelyben az első, szignálpeptidet kódoló DNS-szakasz egy második DNS-szekvencia előtt, azzal leolvasási fázisban van, és az említett második, szekvencia érett urokináz típusú plazminogén aktivátort vagy annak mutánsát kódolja, amely DNS-szakasz az említett expressziós kontrollszakasz transzkripciós szabályozása alatt, valamint egy élesztőgén transzkripciós terminációs jeleit tartalmazó DNS-szekvenciát tartalmaz.
A megfelelő élesztő-gazdaszervezetek a Kluyveromyces, Candida, Pichia, Saccharomyces, Yarrowia, Torulopsis és rokon nemzetségbe tartoznak (lásd J. Lodder, The Yeasts, Amsterdam, 1971), de főleg a Saccharomyces cerevisiae törzsek közé.
HU 204 557 Β
Az élesztőgazdasejtek transzformálását a szakterületen ismert módszerekkel végezzük. Például a transzformációt elvégezhetjük a Hinnen és munkatársai által leírt módszerrel CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,1929 (1978)]. Ennek a módszernek három lépése van: 5
L. Élesztősejtfal teljes vagy részleges eltávolítása.
2. A „meztelen” élesztősejtek (szferoplasztok) kezelése a transzformáló DNS-sel PEG (polietilénglikol) és Ca2+-ionok jelenlétében.
3. A sejtfal regenerálása és a transzformált sejtek sze- 10 lekciója szilárd agarfelületen.
Előnyös módszerek:
ad 1. Az élesztő sejtfalát enzimatikusan távolítjuk el, különböző glükozidáz preparátumok alkalamzásával, úgymint csigagyomomedv (pl. Glusulase vagy Helica- 15 se) vagy mikroorganizmusokból nyert enzímkeverékekkel (pl. Zymolyase) ozmotikusán stabilizált oldatokban (pl. 1M szorbitol) ad 2. Az élesztőszferoplasztok összecsapódnak PEG jelenlétében és a citoplazmatikus membránok 20 helyi fúziója jön létre. A „fúziószerű” körülmények biztosítása igen fontos és számos élesztősejt diploid vagy éppen triploid lesz a transzformációs eljárás során. Olyan eljárásokat alkalmazhatunk, amelyek lehetővé teszik a fuzionált szferoplasztok szelekcióját a 25 ttanszformánsok dúsítására, azaz a transzformált sejteket könnyen kiszűrhetjük az előszelektált fúziós termékek közül.
X-ad 3. Mivel a sejtfal nélküli élesztősejtek nem osztódnak, ezért a sejtfalat regenerálni kell. A regenerálást 30 könnyen elvégezhetjük a szferoplasztoknak agarba ágyazásával. Például olvasztott agarba (körülbelül 50 °C) keverjük a szferoplasztokat. Az élesztő növekedési hőmérsékletére (kb. 30 °C) hűtve az oldatot, szilárd réteget kapunk. Az agarréteg szerepe az, hogy a 35 lényeges makromolekulák gyors diffúzióját, és ezáltal elvesztését a szferoplasztokból, megakadályozza, és ezzel megkönnyítse a sejtfal regenerálódását. A sejtfal regenerálódását azonban úgy is elérhetjük, (habár alacsonyabb hatékonysággal), hogy a szferoplasztokat 40 előre elkészített agarrétegre szélesztjük.
A regeneráló agart előnyösen úgy készítjük, hogy egyszerre tegye lehetővé a transzformált sejtek regenerálódását és szelekcióját. Mivel az aminosavak bioszintézisében szereplő enzimeket kódoló élesztőgéneket 45 használnak általában szelektív markerként, a regenerálást előnyösen élesztő minimál tápagaron végzik. Ha magas frekvenciájú regenerálásra van szükség, akkor a kőveíkezőkétlépéses eljárás az előnyős.
1. A sejtfalregenerálása gazdag komplett táptalajon, és 50
2. a transzformált sejtek szelekciója a sejteknek szelektív agarlemezekre való replikázásával.
Ha a hibrid vektor nem tartalmaz semmilyen marker gént, akkor a transzformált sejteket alternatív módszerekkel is azonosíthatjuk. Az ilyen módszerek közé tar- 55 tozik például a hibrid vektorban lévő szekvenciákkal homológ jelzett DNS-ffagmentekkel való in situ hibridizálás (lásd Hinnen et al. munkáját), az in situ immunassay, feltételezve, hogy a bejuttatott gén által termelt anyagra létezik antitest, vagy más olyan szelektáló 60 módszer, amely a transzformáló plazmid(ok) által kódolt géntermékeket méri.
Egy másik módszer szerint az élesztőt ko-transzformálhatjuk egy találmány szerinti hibrid vektorral, valamint egy második, élesztő genetikai markert tartalmazó vektorral. Ha a két különböző vektornak vannak közös DNS-szekvenciái (ezek lehetnek bakteriális szekvenciák), akkor rekombináció jön létre, amely fuzionált szelektálható hibrid molekulákat eredményez.
A találmány szerinti hibrid plazmídokat tartalmazó transzformált élesztősejtek scu-PA-t vagy mutánsait termelő képességét a szakmában ismert módszerekkel mutációval és szelekcióval javíthatjuk. A mutációt kiválthatjuk például UV-besugárzással vagy megfelelő kémiai reagensekkel. Különösen előnyős a proteáz deficiens mutánsok előállítása, főleg az élesztőmutánsoké, hogy elkerüljük a keletkező scu-PA vagy mutánsainak proteolitikus lebomlását a sejten belül. Amegfelelő mutánsokat ismert módszerekkel szelektálhatjuk és izolálhatjuk.
A scu-PA-fehérjék, melyeket a jelen találmány szerint nyerhetünk, főleg az új scu-PA-fehérjék, értékes farmakológiai tulajdonságokat mutatnak. Ezeket az ismert plazminogén aktivátorok analógiájára használhatjuk emberekben, a trombózis vagy egyéb olyan állapotok megelőzésére vagy kezelésére, ahol a plazminogén aktiválás mechanizmusán keresztül lokális fibrinolitikus vagy proteolitikus aktivitásra van szükség, úgymint aríerioszklerőzisban, miokardiális és cerebrális infarktusban, vénás trombózisban, íromboembóliában, posztoperáciős trombózisban, tromboflebitiszben és diabetikus vaszknlopátíában.
- A találmány vonatkozik továbbá olyan gyógyászati készítményekre, amelyek az aktív adalékanyag (scuPA vagy mutánsai) terápiásán hatásos mennyiségét tartalmazzák, együtt olyan szerves vagy szervetlen, szilárd vagy folyékony, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokkal, melyek alkalmasak parenterális, úgymint intravénás adagolásra és nem gátolják, bontják el az aktív adalékanyagokat
Ezek főleg infúziós oldatok, előnyösen vizes oldatok vagy szuszpenziók, és felhasználás előtt lehetséges előállítani ókét, például olyan liofilezett készítményből, mely az aktív adalékanyagot hordozóval együtt, úgymint mannitollal, laktózzal, glükózzal albuminnal és hasonlókkal együtt tartalmazza. A gyógyászati készítményt lehet sterilezni és ha szükséges, kísérőanyagokkal keverni, például tartósítószerekkel, stabilizálószerekkel, emulgeálószerekkel, szolubizálőszerekkel, pufferekkel és/vagy sókkal, úgymint nátrium-kloriddal, az ozmőzísnyomás szabályozására. A sterilezést kis pőrusméretű (0,45 pm vagy kisebb átmérőjű) szűrőkön való szűréssel lehet elérni, ami után a preparátumot szükség esetén Iiofílezni lehet. Antibiotikumokat is adhatunk hozzá, hogy ezzel is segítsünk megőrizni a sterilitást. A találmány szerinti scu-PA-fehérjét például 5% glükózt, valamint opcionálisan stabilizáló szereket és sókat tartalmazó sterilezetí oldatként formulázzuk.
A jelen találmány szerinti gyógyászati készítményeket egységdózisonként osztjuk szét, például ampullán8
HU 204 557 Β ként, melyek 1-2000 mg gyógyászatilag elfogadható hordozót és körülbelül 1-20 mg, előnyösen 3-15 mg aktív adalékanyagot (scu-PA vagy ennek mutánsai) tartalmaznak.
A betegségtől, valamint a beteg korától és állapotától függően, a körülbelül 70 kg-os beteg kezelésére beadott napi mennyiség 20-150 mg között van, előnyösen 45-100 mg 24 óránként.
A találmány foglalkozik még gyógyászati készítmény előállítására alkalmas eljárással, azzaljellemezve, hogy a jelen találmány szerinti biológiailag aktív fehéqét gyógyászatilag elfogadható hordozóval keveqük.
Az új fehérjék felhasználása az emberi szervezet megelőző és terápiás kezelésében is tárgya a jelen találmánynak.
A találmány foglalkozik még az új hibrid plazmidokkal, valamint az említett hibrid plazmidokkal transzformált élesztőtörzsekkel, valamint az előállításukat célzó eljárásokkal.
A találmány különös súllyal foglalkozik a scu-PAfehérjékkel, hibrid vektorokkal, a transzformált élesztőgazdasejtekkel és az előállításukat célzó eljárásokkal, amint azt a példákban ismertetjük.
Az ábrák rövid ismertetése
A következő kísérleti részben a jelen találmány különböző részeit írjuk le a kísérő ábrákra való hivatkozással, melyek a kővetkezők:
Az 1. ábra a humán u-PA cDNS restrikciós hasítási térképe.
A 2. ábra a humán u-PA cDNS nukleotidszekvenciáját és az abból következő aminosav-szekvenciát mutatja be. Az érett fehérje első aminosava alá van húzva.
A 3. ábra sematikusan mutatja pCSló plazmid előállítását.
A 4. ábra sematikusan mutatja az u-PA cDNS-t tartalmazó pCS16/UPA plazmid készítését.
Az 5. ábra sematikusan mutatja a pJDB207/PHO5I-UPA plazmid készítését (a használt rövidítések: SS szignálszekvencia; t transzkripciós terminátor; p promotor; L linker).
A 6. ábra a GAPDH-promotorrégió DNS-szekvenciáját mutatja.
A 7. ábra a p31GAPDL-IT plazmid készítését mutatja sematikusan.
A 8. ábra a jelen találmányban használt GAPDHgén promotorelemeit mutatja be.
A 9. ábra sematikusan mutatja a pJDB207/GAPDLI-UPA plazmid készítését.
A10. ábra sematikusan mutatja a pJDB207/GAPDLUPA plazmid készítését.
A 11. és 12. ábrák sematikusan mutatják a pDP38 plazmid készítését a pDP plazmidon keresztül.
A13. ábrán a találmány szerinti mutált u-PA-gének és mutáns scu-PA-fehérjék megfelelő aminosav-szekvenciáit látjuk.
A következő példák nem korlátozó jellegűek, csupán a jelen találmány illusztrálását szolgálják. A molekuláris biológiában jól ismert és alkalmazott műveleteket, így például az enzimes emésztést, ligálást, DNS-szintetizálást, tisztítást és hasítást stb. a példákban nem részletezzük, ezeknek ismertetése többek között a „Molecular Cloning-A Laboratory Manual” (kiadó: T. Maniatis et al., USA) kézikönyvben megtalálható.
Kísérleti rész
1. példa
Az u-PA-t kódoló szakaszt tartalmazó pCSlólUP plazmid előállítása
A) A pCSló plazmid előállítása (lásd 3. ábra) a pUN21 plazmid [B. Nilsson et al., Nucl. Acids Rés., 11, 8019-8030 (1983)], 1,5 kb méretű Pstl-BamHI fragmentjét, mely a lambda-fág cl-génjét és a tetraciklin rezisztenciagén egy részét tartalmazza, pUC18-ba [J. Norrander et al., Gene 26,101-106 (1983)] klónozzuk, PstI és BamHI enzimekkel való emésztés után. A kapott kiónt Pstl-gyel emésztjük. A 3’ túlnyúló véget T4DNS-polimerázos reakcióval eltávolítjuk [T. Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), 395. old.], majd a tompa végekhez Xhol linkért (5’-CCTGGAGG-3’ Biolabs) ligálunk. Xhol-gyes emésztés után a molekulát ligálással recirkularizáljuk. A ligáló elégy egy alikvot részét Ca2+-ionokkal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformálására használjuk. Az egyes ampicillinrezisztens kiónok DNS-ét elemezzük. A számos megfelelő klón közül egyet kiválasztva a pCS 16 jelet kapta.
B) A pCSl 6IUPA plazmid előállítása
Az urokináz cDNS-t humán hep 3 sejtekből nyert mRNS-ből állítjuk elő (lásd T. Maniatis et al., i.m. 188-246). Az u-PA cDNS 1,3 kb méretű Smal-BamHI és 1 kb méretű BamHI-EcoRI fragmentjét a pUNÍ21 Smal, EcoRI helyére klónozzuk [B. Nilsson et al., Nucl. Acids Rés., 11 8019-8030 (1983)], így kapjuk a pcUK176 plazmidot. A humán u-PA cDNS-inszertum restrikciós térképét az 1. ábrán mutatjuk be. Az u-PAnukleotid szekvenciáját és az ebből következő aminosav szekvenciáját a 2. ábrán mutatjuk be. Az u-PA cDNS-inszertumot a pCSló plazmidban szubklónozzuk. A szubklónozott cDNS az 5’. nem transzlálódó régióban lévő Smal helytől (1. ábra) a 3’ nem transzlálódó régióban a 1439-1444 sorszámú nukleotidoknál (lásd 2. ábra) lévő PvuH helyig terjed.
pg pcUK176 plazmidot emésztünk BvuH-vel. A 379 bp méretű Pvull fragmentet a többi fragmenttől 1,5%-os agarózgélben választjuk el pH 8,3-as Trisz-borát-EDTA-pufferrel. A DNS-t elektroeluáljuk, DE52 (Whatman) ioncserés kromatográfiával tisztítjuk, majd etanollal kicsapjuk. 1,2 pg egyszálú Xhol linkért (5’CCTCGAGG-3’) foszforilezünk az 5’ végén, 10 percig 75 °C-on tartjuk, hagyjuk önmagával párosodni szobahőmérsékletre való hűlés közben, majd -20 °C-on tartjuk. A kinázzal kezelt kétszálú Xhol linkerből 0,9 pg-ot 80- szoros moláris felesleg mellett a pcUK176 plazmid tompa végű, 379 bp méretű Pviűl fragmentjéhez (lásd fenti) ligálunk 20 pl 60 mM Trisz-HCl (pH 7,5) 10 mM MgCE, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP és 400 egység T+DNS-ligáz (Biolabs) összetételű reakcióelegyben, 16 órán át 15 °C-on tartva az elegyet. A keveréket 10 percig 85 °C-on tartjuk. A fölöslegben lévő linker mo9
HU 204557 B ; 2 lekulákat 0,54 térfogatú izopropanolos kicsapással távolítjuk el, 10 mM EDTA és 300 mM nátrium-acetát (pH 6,0) jelenlétében, 30 percig szobahőmérsékleten _ tartva az elegyet. A DNS-t Xhol-gyel és BamHI-gyel emésztjük. Egy 121 bp méretű BamHT-XhoI fragmenst 5 izolálunk 1,5%-os agarózgélből, (Trisz-borát-EDTA, pH 8,3). 6 pg pcUK176 plazmidot emésztünk Smal és · BamHI enzimekkel. Egy 1,3 kb méretű, az u-PA-kódo- 4 lószekvencia legnagyobb részét tartalmazó Smal-BamHI fragmenst izolálunk. A 2,7 kb méretű vektorfrag- 10 menst izoláljuk. A DNS-fragmenseket elektroelúciőval nyerjük ki a gélből, majd etanollal kicsapjuk. 0,2 pmól 1,3 kb méretű Smal-BamHI fragmenst, 0,2 pmól 121 bp méretű BamHI-XhoI fragmenst- (a két fragmens együtt tartalmazza a teljes u-PA-kődolószekvénciát) és 15 0,1 pmól 2,7 kb méretű vektorfragmenst Iigálunk össze 10 pl térfogatú, 60 mM Trisz-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCIz, 5 mM DTT, 3,5 ATP és 400 egység TDNS-ligáz összetételű oldatban 15 ’C-on. A ligáló elegy egy és három mikroliteres alikvot részeit adjuk 100 pl 20 Ca2+-ionnal kezelt E.coli HB101 (DSM16Q7) sejtekhez. A transzformációt a leírás szerint végezzük. [A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)]. 12 ampicillinrezisztens telepet növesztünk 100 mg/1 ampicillintartalmú LB-táptalajon. A DNS-t 25 Holmes és munkatársai szerinti módszerrel izoláljuk . [Anal. Biochem., 114, 193 (1981)] és EcoRl, PvuH, valamint Xhol restrikciós emésztéssel elemezzük. A várt restrikciós fragmenseket tartalmazó, egyik Hónból származó plazmid DNS-t nevezzük pCSl6/UPA. 30
Ezzel-analőg módon a Smal helytől (1-6 sorszámú nukieotidok, 2. ábra) a PstI helyig (1637-1642 sorszámú nukieotidok, 2. ábra) terjedő urokináz eDNS-t szubklónozzuk a pCS 16 plazmidban. A pcUK176pIaz- ; midot PstI enzimmel emésztjük. A ragadós végeket 35 tompa végekké alakítjuk TiDNS-polimerázzaJ [Maniatis et al., idézett mű, 395. old.]. Az 1,2 kb méretű fragmenst izoláljuk. Xhol linkért adunk hozzá a fenti leírás szerint, A DNS-t BamHI és Xhol enzimekkel 5 emésztjük és egy 315 bp méretű BamHI-XhoI fragmenst izolálunk. Ebből a fragmensből 0,2 pikomólt f Iigálunk az 1,3 kb méretű Smal-BamHI fragmenthez, valamint a 2,7 kb méretű vektorfragmenthez (lásd fent). A ligáló elegyet használjuk Ca2+-ionokkal kezelt 10 E.coli HB 101 sejtek transzformálására. Az egyik klón kívánt restrikciós fragmenteket tartalmazó plazmid DNS-ét nevezzük pCS16/UPA-13.
Ez a plazmid tartalmazza az u-PA cDNS-inszertumot az 5’ nem transzlálódó régióban lévő Smal helytől 15 (1. ábra) a 8’ nem transzlálódó régióban az 1641-es pozíciónál lévő PstI helyig (2. ábra). A pCS16/UPA plazmidtőí való egyetlen eltérés a kiterjedt 3’ nem transzlálódó régió.
2.példa
A PHO5 promotortés azinvertáz szignálszekvenciát tartalmazóp31RlT-12plazmid előállítása r _ .j; AjAzinvertáz szignálszekvenciát kódoló oligodezoxiribonukleotid szintézise
Négy oligodezoxiribonukleotidot: 1-1,1-2,1-3,1-4, szintetizálunk DNS-szintetizátorral (Applied Biosystems 38OB modell). A védocsoportok eltávolítása után a szintetikus fragmenseket 8 M karbamidot tartalmazó 12%-os poliakrilamidgélen tisztítjuk. Sőmentes tiszta oligodezoxhibonukfeotídokat a Sep. Pák (Wafers Associates) felhasználásával állítunk elő. Ezek a fragmensek olyan duplexet képeznek, amely az invertáz szignálszekvenciát a gyakran használt élesztőkodonok felhasználásával kódolja.
; \ HingBI
EcoRl MetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu 1-1 5’AATTCATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTT 3’
1-2 3’GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5’
AlaGlyPheAlaAlaLysIleSerAla
1-3 5’GGCTGGTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTC 3’
1-4 3’ CAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5’
Hsai
Xhol
BJ Az invertáz szignálszekvencia szubklőnozása a p31 plazmidban a)Avekior előállítása
1,5 pg p31R/SS-TPAA2 DNS-t (EPA No. 143,081) 10 egység EcoRl enzimmel (Boehringer) emésztünk 50 pl, 10 mM Trisz-HCI-ot (pH 7,5) 6 mM MgCk-ot, 100 mM NaCl-ot, 6 mM merkapto-etanolt tartalmazó oldatban, egy. órán át 37 ’C-on. Miután hozzáadtunk 1 pl 2,5 M NaCI-ot, 10 egység Xhol enzimet (Boehringer) adunk az elegyhez és további egy órán át inkubáljuk 37 ’C-on. A 4,2 kb méretű vektort 0,8 %-os preparatív agarózgélből izoláljuk. A géldarabot Micro Colloidor-csőbe tesszük (Sartorius GmbH), 200 pl TE-vel bontjuk, majd elektroeluáljuk (elektroforetizáljuk mA-rel 50 percig). A TE-oIdatot összegyűjtjük, majd 2,5 térfogat abszolút efanoHal kicsapjuk, miután 0,1 térfogat 10·ΤΝΒ oldatot adtunk hozzá. Akicsapott DNS-t hideg 80%-os etanollal mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A DNS-t 6 pl TE-ben reszuszpendáljuk (4Öpmól/pl).
b) A áezoxiribonukleotidok (1-1,1-2,1-3,1-4) egymáshoz illesztése, kináz enzimmel való kezelése és a vektorral való Ugatása
A négy dezoxiribonukleotid mindegyikéből 10 pmólt 10 pl 0,5 M Trisz-HCl (pH 9)-ben tartalmazó oldatot vízfürdőn 5 percig 95 ’C-on inkubálunk. A vízfürdőt lassan, 5 óra alatt 30 ’C-ra hűtjük. Ehhez a párosított keverékhez
HU 204 557 Β adunk 2-2 pl-t 0,1 M MgClrból, 0,1 M NaCl-ból, 30 mM DTT-ből, valamint 4 mM ATP-ből és 8 egység (1 μΐ) polinukleotid-kinázt (Boehringer). A kinázreakciót egy óráig végezzük 37 °C-on. A párosított, kinázzal kezelt oligodezoxiribonukleotidokat és 60 pmól (1,5 μΐ) EcoRI-XhoI enzimekkel hasított p31R/SS-TPA2 vektort ligáljuk 400 egység TJONS-ligázzal (Biolabs) 14 °C-on, 17 órán át. A reakciót 10 perces 65 ’C-os inkubálással állítjuk le. Ennek a ligáló elegynek 10 pl-ét használjuk Ca2+-ionokkal kezelt E.coli HB 101 sejtek transzformálására [M. Dagert and S. D. Ehrlich, Gene, 56, 23-28 (1979)] 20 ampicillinrezisztens telepet izolálunk. A DNS-t a gyors izolálási módszerrel nyerjük ki [D. S. Holmes and M. Qugley, Anal. Biochem., 114, 193—197 (1981)]. A DNS-t EcoRI és Xhol enzimekkel emésztjük, radioaktívan jelöljük az EcoRI végen és 8 M karbamidot tartalmazó 5%-os poliakrilamidgélen analizáljuk, markerként radioaktívan jelölt HaeHI enzimmel hasított pBR322 plazmidot használva. Mind a 20 kiónból előállított plazmid DNS-ből a megfelelő csíkokat figyelhetjük meg. Egy klóm 100 pg/ml ampicillintartalmú 100 ml LBtáptalajon növesztünk. A plazmid DNS-t izoláljuk, és p31RIT-12 névvel látjuk el.
3. példa
A pJDB207ÍPH05-I-UPA plazmid (5. ábra) előállítása
A pJDB207/PHO5-I-UPA plazmid tartalmazza a PHO5 promotort, az invertáz szignálszekvenciát, az érett urokinázt kódoló szekvenciát és a PHO5 transzkripciós terminátort egymás utáni elrendezésben a pJDB207 élesztő expressziós vektorba klónozva.
pg pCS16/UPA plazmid DNS-t teljesen megemésztünk 40 egység EcoRI-gyel. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után az EcoRI-gyel emésztett DNS-t tovább hasítjuk Taql enzimmel 65 ’C-on. A kapott fragmenseket preparatív 1,2%-os agarózgélen választjuk szét. A 462 bp méretű Taql-EcoRI fragmenst elektroelúcióval izoláljuk a gélből és etanollal kicsapjuk.
A következő képletű oligodezoxiribonukleotid linkért (I) 5’-CTGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT - 3’ (II) 3’- TCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5’ a DNS-fragmens Taql helyére ligáljuk. A linker helyreállítja az érett u-PA (130-154-es nukleotidok, 2. ábra) kódoló szekvenciájának 5’ végét és létrehozza a leolvasási fázisban lévő fúziót az invertáz szignálszekvenciával. A linker 5’-CTGCA szekvenciája feltölti az invertáz szignálszekvencia Hgal hasítással keletkező megfelelő 3’ végét.
Az I és II oligodezoxinukleotidból 300-300 pmólt foszforilezünk és párosítunk. 5,25 pg (600 pmól) foszforilezett, kétszálú linker DNS-t 1,7 pg (6,5 pmól) 462 bp méretű Taql-EcoRI fragmenshez (lásd fent) ligálunk 175 pl, 60 mM Trisz-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2,1 mM ATP, 5 mM DTT és 800 egység T4DNSligázzal 15 ’C-on 16 órán át. AT»DNS-ligázt 10 percig 85 ’C-on tartva az elegyet inaktiváljuk. A linker feleslegét 10 mM EDTA, 30 mM nátrium-acetát (pH 6,0) jelenlétében 0,54 térfogat izopropanollal kicsapjuk. A DNS-t Pstl-gyel emésztjük. Egy 312 bp méretű fragmenst izolálunk, amely a linkért az u-PA-t kódoló DNS-szekvencia 436-os sorszámú nukleotidjáig terjedő szakaszhoz kapcsolva tartalmazza (PstI hely, lásd 2. ábra). A DNS-fragmenst elektroelúcióval tisztítjuk és etanollal kicsapjuk.
A pCS16/UPA plazmid DNS-t Xhol és PstI enzimekkel emésztjük. Egy 1007 bp méretű Pstl-Xhol fragmenst izolálunk és tisztítunk. Ez a fragmens tartalmazza az urokinázt kódoló szekvencia legnagyobb részét?
A p31RIT-12 plazmidot (lásd 2. példa) Sáli és Xhol enzimekkel emésztjük. Egy 882 bp méretű SallXhol fragmenst izolálunk a gélből elektroelúcióval, majd etanollal kicsapjuk. Ezt a fragmenst tovább emésztjük BamHl és Hgal enzimekkel. Egy 591 bp méretű BamHI-Hgal fragmenst izolálunk, amely tartalmazza a PHO5 poromotor régiót és az invertáz szignálszekvenciát.
A pJDB207/P#O5-TPA 18 plazmidot (lásd EPÁ No. 143,081 közzétéve: 1985. 05. 29-én) emésztjük BamHl és EcoRI enzimekkel. A 6,8 kb méretű vektorfragmenst izoláljuk 0,6%-os preparatív agarózgélből (Trisz-acetátpuffer, pH 8,2). A DNS-t elektroeluáljuk és etanollal kicsapjuk. Az összes DNS-fragmenst vízben szuszpendáljuk 0,1 pmól/pl koncenrációban. 0,2 pmól 591 bp méretű BamHI-Hgal fragmenst, 0,2 pmól 312 bp méretű HgalPstl fragmenst, 0,2 pmól 1007 bp méretű Pstl-Xhol fragmenst és 0,1 pmól 7,8 kb méretű BamHI-XhoI vektorfragmenst ligálunk össze 15 órán át, 15 °C-on 10 pl, 50 mM Trisz-HCl (pH Ifi), 10 mM MgCl2,5 mM DTT, 1 mM ATP és 400 egység TiDNS-ligáz összetételű oldatban. A ligáló keverékből egy mikrolitert használunk Ca2+ionokkal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformálására. 12 amp® telepet izolálunk és növesztünk 100 mg/1 ampicillintartalmú LB-táptalajban. A DNS-t a gyors izolálási módszerrel nyerjük ki [D. S. Holmes et al., Anal. Biochem., 114, 193 (1981)]. HindE és EcoRI enzimekkel emésztve a várt restrikciós fragmenseket figyelhetjük meg. Egy kiválasztott klónból plazmid DNS-t izolálunk és pJDB207/Pí/O5-I-UPA-nak nevezzük el.
4. példa
A pJDB207!PHO5-UPAplazmid készítése
A konstrukció készítése során a ΡΉΌ5 promotort, a PHO5 szignálszekvenciát kapcsoljuk leolvasási fázisban az érett urokináz és a PHO5 transzkripciós terminátorhoz, a pJDB207 élesztővektorba klónozva.
A következő képletű oligodezoxiribonukleotid linker (I) 5’-CCAATGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3’ (II) 3 ’ -GGTTACGTTCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5 ’
HU 204557 Β 2 nukleotidot (5’-CCAATGCA) tartalmaz a PH05 szignálszefcvenciából (egy belső Ball helytől a proceszszálási helyig) és egy fázisban lévő fúziót hoz létre az érett u-PAkódoIőszekvenciájával (130-I54-es nukleotid pozíciók, 2. ábra). A linkért apCS16/UPA462 bp mérető 5 Taql-EcoRI fragmensének Taql helyéhez ligáljuk (lásd 3. példa). A foszforilezést, párosítást és Egálást a 3. példa szerint végezzük. A DNS-t Ball és PstI enzimekkel emésztjük. Egy 315 bp mérető fragmenst izolálunk. A DNS-fragmens az u-PA-gén DNS-szekvenciáját tártál- 10 mázzá a 436-os helyen lévőPstI helyig (2. ábra).
A p31 plazmidot (lásd EPA No. 100 561) Ball és BamHI enzimekkel emésztjük, APHO5 promotort és a PH05 szignálszekvencia legnagyobb részét tartalmazó 584 bp mérető BamHt-BalI fragmenst izoláljuk. A 15 DNS-fragmenteket elektroelűciőval és DE52 kromatográfiával tisztítjuk, etanollal kicsapjuk és vízben szuszpendáljuk 0,1 pmól/μΐ koncentrációban.
pmól 584 bp mérető BamHT-BalT fragmenst, pmól 315 bp mérető BalI-PstE fragmentet, 0,2 pmól 20 1007 bp mérető Psü-Xhol fragmenst (lásd 3. példa) és 0,1 pmól 6,8 kb mérető BamHI-XhoI vektorfragmenst (lásd 3. példa) Egálunk össze és használunk E.coli HB101 sejtek transzformálására. 6 amp®. telepet izolálunk és növesztünk 100 mg/1 ampicillint tartalmazó LB- 25 táptalajban. Aplazmid DNS-t a gyors DNS-tísztítási eljárással állítjuk elő a BamHIZPstI kettős emésztéssel analizáljuk. A várt restrikciós fiagmensekkel rendelkező egyetlen klőnt kiválasztunk és a plazmid DNS-t pJDB207/PHO5-UPA-naknevezzük. 30 . 5. példa
ApJDB207IPHO5-SSUPAplazmid előállítása “ Ez a plazmid az urokináz gént saját szignálszekvenciájával a PHO5 promotor kontrollja alatt tartalmazza 35 a pJDB207 expresszíós vektorban.
pg pCS16/UPA-13 plazmid DNS-t (lásd 1. példa) teljesen megemésztünk 100 egység BglI enzimmel [7686 sorszámú nukleotidok, (2, ábra)]. Akapott 3 fragmentet 1%-os preparatív agarózgélen választjuk el Trisz-bo- 40 rát-EDTA-pufferben (pH 8,3). Az 1,7 kb mérető BgH fragmentet elektroeluáljuk és etanollal kicsapjuk.
Akövetkezőképleíő oEgodezoxiribonukleotid linker (I) 5’-AATTCGAnACCAATGAGAGCCCTGC-3’ (Π) 3’- ’ GCTAATGG’n’ÁCTCrCGGG -5J egy EcoRl hellyel rendelkezik, a PH05 5’ nemkódolő régió 8 nukleotidjához kapcsolva az ATG-kodon és az u-PA kódolószekvenciája 70-82-es sorszámú nukleotidja előtt, beleértve az ATG-kodont is. Alinkért a DNS BglI tapadós végeihez ligáljuk, a 3. példa szerint. ADNS-t EcoRl és PstI enzimekkel emésztjük.
Egy 380 bp mérető, az u-PA szignálszekvenciát és az érett u-PA-t kódoló szekvencia egy részét (a 436. nukleotidig, PstI hely, 2. ábra) tartalmazó fragmentet izolálunk.
Ap31R jelű plazmidot (lásdEPA 100 561 lajstromszámú szabadalmi leírás közzététele: 1984.02,15-én) BamΗΣ és EcoRl enzimekkel emésztjük, és a PH05 promotort tartalmazó 534 bp mérető BamHI-EcoRI fragmentet izoláljuk. A DNS-fragmenst elektroeluáljuk az agarőzgélből, DE52 kromatográfiával tisztítjuk, etanollal kicsapjukés 0,1 pmól/μΙ koncentrációban vízben óljuk.
. 0,2 pmól 534 bp mérető BamHI-EcoRI fragmenst, 02 pmól 380 bp mérető EcoRI-PstI fragmenst, 02 pmól 1007 bp mérető Pstl-Xhol fragmenst (lásd 3. példa) és 0,1 pmól 6,8 kb mérető BamHI-XhoI vektorfragmenst (lásd 3. példa) Egálunk össze, és transzformálunk vele Ca2+-ionokkal kezelt E.co/i HB101 sejteket 12 amp® telepet növesztünk 100 mg/1 ampicilBnt tartalmazó LBtáptalajban. ADNS-t a gyors DNS-izolálási eljárással kinyerjük, majd BamHI és EcoRl enzimekkel emésztve vizsgáljuk. Az egyik fclónből származó plazmid DNS-t kiválasztjuk és pJDB207/PHO5-SSUPA jelzéssel látjuk el.
A pJDB2Ö7RIPHO5-UPÁ plazmid előállítása Azéretturokináztkódoló szekvenciát a PH05 promotorhoz kapcsoljuk. Ez a plazmid nem tartalmaz szignálszekvenciát, mivel összehasonEtás céljából készült
A (I) 5’-AATTCATGAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT -3’ (Π) 3’- GTACTCGITAC1TGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5’ képlető oEgodezoxiribonukleotid linker egy ATGkodont, valamint az u-PA 130-154 sorszámú nukleotidjaít tartalmazza (lásd 1. ábra), melyek az érett urokináz Seri aminosaváig terjedő részt kódolja. Az oEgonukleotidokat foszforilezzük, összepárosítjuk és a pCS16/UPA plazmid (lásd 3. példa) 462 bp mérető Taql-EcoRI fragmenséhez Egáljuk. A DNS-t EcoRl és PstI enzimekkel emésztjük. Egy 315 bp mérető EcoRI-PstI fragmenst izolálunk, amely az ATG-kodon és az érett u-PA-t kódoló szekvencia egy részét tartalmazza, a 436-os helyzetben lévő PstI helyig (2. ábra).
A p31R plazmidot (lásd EPA 100 561 lajstromszámú szabadalmi leírás) BamHI-EcoRI enzimekkel emésztjük, majd az 534 bp mérető BamHI-EcoRI fragmenst preparatív 1,5%-os agarózgélből izoláljuk. Ez a fragmens tartalmazza a PH05 promotort.
Az össz-DNS-fragmenst elektroelúcióval izoláljuk, DE52 kromatográfiával tisztítjuk, etanoEal kicsapjuk, majd vízben oljduk 0,1 pmól/μΙ koncentrációban. Az 534bp méretőBamHI-EcoRI fragmensből, a 315 bp mérető EcoRI-PstI fragmensből és az 1007 bp mérető PstlXhol fragmensből (lásd 3. példa) egyaránt 0,2-0,2 pmőlt, valamint a 6,8 kh mérető BamHI-EcoRI fragmensből (lásd 3. példa) 0,1 pmólt Egálunk össze és transzformálunk Ca2+-ionokkal kezelt E.coli HB101 sejtekbe a szokásos módon. 8 db amp® telepet izolálunk és növesztünk 100 mg/1 ampicillint tartalmazó LB-táptalajban. Aplazmid DNS-eket izoláljuk és BamHI és EcoRl restrikciós enzimekkel emésztve vizsgáljuk. A várt restrikciós min12
HU 204 557 Β tázattal rendelkező plazmidot tartalmazó kiónt kiválasztjuk és a plazmidnak a pJDB207R/PHO5-UPA jelzést adjuk.
7. példa
Az élesztő GAPDH-gén klónozása a hozzátartozó konstitutív promotorral
a) Élesztőgénbank készítése
A vad típusú Saccharomyces cerevisiae S288C törzsből származó 30 pg összmennyiségű, nagy molekulatömegtf élesztőDNS-t [Μ. V. Olsen et al., J. Mól. Bioi. 132, 387 (1979)] 30 percig 37 ’C-on inkubáljuk 2 egység EcoRI metilázzal (New England Biolabs) 250 pl, a szállító által ajánlott összetételű EcoRI metilezőpufferben. A DNS-t etanollal kicsapjuk, feloldjuk 500 pl 25 mM TriszHCl (pH 85)2 mM MgCb összetételű oldatban (EcoRI* puffer) [H. Meyer, FEBS Lett., 90,341 (1979)] és EcoRI enzimmel emésztünk (Boehringer), amíg a DNS-fragmensek méreteloszlásának maximuma a 30-50 kb tartományban van a (lambda-DNS Xhol-es emésztésekor megfelelő méretű, 33 kb és 17 kb méretű markereket kapunk). Az EcoRI* körülmények között emésztett élesztő DNS-t méret szerint frakcionáljuk szacharózgradiensen [5-20%-os szacharóz 10 mM Trisz-HCl (pH 7,5), 1 M EDTA-oldatban] 6 órán át 38 000/perc fordulatszámmal S W40 rotorban. 30 db 0,4 ml-es frakciót szedünk a gradiens tetejéről. A 16-os frakció tartalmazza a 30-40 kb méretű DNS-fragmenseket. Az ebben a frakcióban lévő DNS-t (3 pg) etanollal kicsapjuk, majd 16 órán át 15 ’Con ligáljuk 15 pl össztérfogatban 1 pg pYcl kozmid vektorba [B. Hohn et al., „Genetic Engineering”, 2. kötet, 169. old., New York (1980)], melyet EcoRI-gyel linearizálunk. A ligálást 300 egység TtDNS-ligázzal végezzük (New England Biolabs), melyhez a szállító által leírt pufferrendszert használjuk. A DNS-t in vitro pakoljuk a lambda-fágba [B. Hohn, „Methods in Enzymology”, 68. kötet, 299. oldal, New York (1979)] és az összeállt fágokkal transzdukáljuk az E.coli HB101 törzset (DSM 1607) (rk Q, mi?, leu®, pro®, recA). A transzdukció hatásfoka: körülbelül 5000 ampicillinrezisztens telep per 1 pg pYcl vektor. 3000 amp® telepet izolálunk és külön növesztünk mikrotiterlemezeken LB-táptalajban [10 g Bacto-Tryptone (Difco) 5 g Bacto Yeast Extráét (Difco), 10 g NaCl], mely 100 pg/ml ampicillint tartalmaz.
b) Az élesztő GAPDH-gén izolálása
A fent leírt génbankot a következő összetételű szintetikus oligonukleotiddal: 5’-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3 ’ vizsgáljuk át [foszfotriészter-módszerrel készült: K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc., 97, 7327 (1975); J. F. M. de Rooij et al., Rcl. Trav. Chim. Pays-Bas, 98, 537 (1979)]. Az oligonukleotid 10 pg-ját kinázzal kezeljük, 10 pl gamma P—ATP (3000 Ci/mmól 10 pCi/pl Amersham) felhasználásával T4 polinukleotid kinázzal (Boehringer) 50 pl össztérfogatban, Maniatis és munkatársai leírása szerint [Molecular CIoning, Cold Spring Harbor Láb., 1982, 125. old.]. A telephibridizációt ugyanezen szerzők leírása alapján végezzük (312. oldal). A pozitív kiónokat autoradiográfiával azonosítjuk, Kodax X-5 röntgenfilm felhasználásával. A plazmid DNS izolálásával (lásd EPA No. 100 561) olyan hibrid kiónt kapunk, amely a GAPDH-t kódoló 2100 bp méretű Hindlll fragmenst tartalmazza [L P. Holland et al., J. Bioi. Chem., 254, 9839 (1979)]. A klónozott DNS valódiságának végső igazolása a DNS-szekvenálási kísérletekből származik, a fent említett nukleotidot a didezoxi szekvenálási protokollal kombinálva a G. F. Hong leírása szerint kétszálú DNS-re [Bioscience Reports, 1, 243 (1981)]. A klónozott GAPDH-génnek ugyanaz a szekvenciája, mint a pgap491-nek [Holland et al., J. Bioi. Chem., 255,2596 (1980)].
c) A GAPDH-promotor izolálása A 649 bp méretű Taql fragmenst, amely a GAPDHgén ATG-kodonjától számított -27-től a -675-ig terjedő nukleotidokat tartalmazza (lásd 6. ábra) úgy izoláljuk, hogy az említett hibrid plazmidot Taql-gyel emésztjük (New England Biolabs), a DNS-fragmenseket, 1,2%-os lágy agarózgélen választjuk el, majd a DNS-t forró fenollal extraháljuk. A Taql fragmenst a pBR322 Clal helyére klónozzuk: 1 pg pBR322-t három egység Clalgyel emésztünk (New England Biolabs), a szállító által előírt körülmények között. 300 ng fénolozott és hasított vektort körülbelül 300 ng inszert DNS-hez ligálunk (649 bp Taq fragmens), 200 egység T4DNS-ligázt használva 20 pl össztérfogatban. A transzformálást E.coli HB101 törzsbe végezzük, ampicillin-rezisztenciára szelektálva, a plazmid DNS-t izoláljuk, majd restrikciós enzimes emésztéssel analizáljuk [Taql,Dral]. A Taql fragmens orientációját a Dral restrikciós endonukleázt a plazmidokon lévő BamHI hasítási hellyel kombinálva határozzuk meg, és azt a plazmidot választjuk ki, amelyben a 675-ös Taql hely közel van a pBR322 Hindlll helyéhez. Ezt a pBR322/GAPDH jelű plazmidot BamHI enzim felhasználásával (New England Biolabs), linearizáljuk. A DNS-t 10 mM Trisz-ben (pH 8,0) oldjuk 0,5 pg/ml koncentrációban. 16 pg Sall-gyel emésztett DNS-t emésztünk 2 egység Bal31 exonukleázzal (BRL) 100 pl 20 mM Trisz (pH 8,0) 199 mM NaCl 12 mM MgCb, 12 mM CaCl2 és 1 mM EDTA összetételű oldatban. Az oldatból 1,2, 3, 4,5 és 6 percig tartó 30 ’C-os inkubálás után 2-2 pg DNS-t tartalmazó alikvot részeket veszünk ki, és azonnal összekeverjük 50 pl fenollal és 60 pl TNE-vel. Fenolkloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t 100 pg/ml koncentrációban oldjuk 10 mM Trisz-oldatban (pH 8,0). Hogy vizsgáljuk a Bal31-es exonukleázos emésztés mértékét, mindegyik időpontból származó mintából 0,5 pg DNS-t BamHI enzimmel emésztünk és 1,5 %-os agaróz-agaróz gélen vizsgáljuk Trisz-borát-pufferben (pH 8,3) (90 mM Trisz-HCl pH 8,3, 90 mM bórsav, 2,5 mM EDTA). Egyperces Bal31es emésztés során átlagosan 100 bp emésztődik le a fragmens mindkét végéről.
Bgffl linkereket (5’-GGAGATCTCC-3’) foszforilezünk, párosítunk és a Bal31-gyel kezelt DNS-fragmensekhez ligáljuk. A feleslegben lévő linkereket izopropanolos kicsapással távolítjuk el. A DNS-t BglH-vel emésztjük és közvetlenül cirkularizáljuk 5 pg/ml kon13
I
HU 204557 Β centrácíóban 20 μΐ össztérfogatban. A BaI31-gyeI rövidített Taql fragmens méretét restrikciós elemzéssel határozzuk meg (BglII és HindHI enzimekkel). Három kíónt választunk ki. Ezek olyan DNS-fragmenseket tartalmaznak, melyeknek hossza körülbelül 200 bp, 165 bp, illetve 650 bp, az ATG-kodontőI 5’ irányba nyúlnak bele a GAPDH-promotoiba. Mindhárom fragmens tartalmazza a 1ΆΊΑ boxot körülbelül a -140 bázisnál. Ezek a klőnok még tartalmazzák a replikációs origót a DNS pBR322 eredetű részében és pGAPDH-F, pGAPDH-E és pGAPDH-D jelzéssel hivatkozunk rájuk.
Hogy kiteq'esszük a GAPDH-promotorelemeket a
-27-es pozícióban lévő Taql helytől a közvetlenül
GAPDH-gén ATG-kodonja mellett található helyig, a következő szerkezetű két komplementer, szintetikus oligonukleotidot állítjuk elő.
5’ CGAATAAACACACATAAATAAAG 3’
3’ TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5’
Ezek az oligonukleotidok tartalmazzák az eredeti GAPDH-promotorszekvencíát a -26-os helytől a -5-ös helyig, a végen egy EcoRI hellyel. A pGAPDH-F, pGAPDH-E és pGAPDH-D plazmidokból 2-2 pg-ot emésztünk 6 egység Taql enzimmel 50 pl térfogatban, és á kapott elegyet fenolozzuk, etanollal kicsapjuk és 10 pl vízben oldjuk. A szintetikus oligonukleotidokat párosítjuk, mindegyik szálból 2 pl-t keverve össze 100 pl oldatban, melynek összetétele: 10 mM TriszHCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, majd az oldátőr3 percig 90 °C-on tartjuk, és lassan szobahőmérsékletre hűtjük (körülbelül 3 óra alatt). A Taql-gyel emésztett plazmidból egy pg-ot körülbelül hússzöros moláris feleslegben lévő párosított oligonukleotiddal keveq'ük össze 20 pl térfogatban és körülbelül 18 órán át Egáljuk 800 egység THJNS-lígázzal. A ligáz inaktiválása után az egész elegyet 3 egység BglII enzimmel emésztjük (New England Biolabs). A BglH-EcoRI fragmensek mérete körülbelül 200,265, illetve 540 bp.
1,5%-os lágy agarózgélen választjuk el őket, extraháljuk a gélből, majd etanollal kicsapjuk.
A p3IRIT12 plazmidot (lásd 2. példa) BamHI és EcoRI enzimekkel emésztjük. A 3,6 kb méretű nagy vektorfragmenst izoláljuk. Ezt a fragmentet használjuk a 200 bp, 265 bp és 540 bp méretű BglH- EcoRI GAPDH-promotorfragmensek klónozására. A Iigálás, transzformálás és plazmidizölálás körülményeit a fentiekben leírtuk. A megfelelő, helyes inszertumot tartalmazó plazmidokat p31GAPFL-IT, p31GAPEL-IT és p3ÍGAPDL~rr jelzéssel látjuk el (lásd 7. ábra).
A p31GAPFL-IT, pllGAPEL-IT és p31GAPDL-IT plazmidok BglH-EcoRI fragmenseinek DNS-szekvenciáját a 8. ábrán mutatjuk be.. Ezeknek a fragmenseknek a pontos mérete 202,267, illetve 544 bp.
8. példa
ApJDB207lGÁPDL-I-UPAplazmid készítése (9. ábra)
Ez a plazmid a GAPDH-D-promotort, az invertáz szignálszekvenciát, az érett urokinázt kódoló szekven25 ciát és a PHO5 transzkripciós terminációs szakaszt tartalmazza egymás mögé elrendezve a fenti sorrend szerint a pJDB207 ingázó vektorban.
A p31GAPDL-IT plazmid DNS-ét Sáli és Hindin . 5 .enzimekkel emésztjük. Egy 0,8 kb méretű Salí-HindHI fragmenst izolálunk 1%-os preparatív agarózgélből. Ez - a fragmens a GAPDH-D-promotort és az invertáz szignálszekvencia egy részét tartalmazza.
A PJDB207WÖ5-I-UPÁ plazmidot Hindin és 10 BamHI enzimekkel emésztjük. Az 1239 bp méretű HindlH-BamHI fragmens az invertáz szignálszekvencia másik részét, valamint az u-PA-t kódoló szekvencia legnagyobb részét tartalmazza. A pJDB207ZP77O5-IUPA DNS-t is Saíl és BamHI enzimekkel emésztjük. A 15 nagy 6,6 kb méretű vektorfragmenst 0,6%-os preparatív agarózgélből izoláljuk (Trisz-acetát-puffer, pH 8,2).
A DNS-fragmenseket elektroelúcióval izoláljuk a gélből, DE52 kromatográfiával tisztítjuk, majd etanollal kicsapjuk. A 0,8 kb méretű Sall-Hindm fragmenst, 20 az 1239 bp méretű Hindni-BamHI fragmentet és a 6,6 kb méretű Sall-BamHI vektorfragmenst összeligáljuk, és Ca2+-ionokkal kezelt E.coli HBlOl sejteket transzformálunk az eleggyel. 6 amp® transzfoimánsból származó plazmid DNS-t Hindin és Sáli restrikciós enzimekkel emésztve vizsgáljuk. Az egyik klónból származó, és a várt restrikciós mintázatot mutató plazmidot pJDB 207/GAPDL-I-UPA jelöléssel látjuk el.
Egy analóg szerkezetben egy 493 bp méretű, a p31GAPFL-1T plazmidból származó SalI-HindlH fragmenst (lásd 7. példa) izolálunk és ligálásra használjuk. A kapott plazmid DNS-t pJDB207/GAPFL-I-UPA jelzéssel látjuk el.
Hasonló módon állítjuk elő a pJDB207/GAPEL-IUPA plazmidot.
9.példa
ApJDB207!GAPDL-UPAplazmid előállítása (10. ábra)
Tandem elrendezésben kiónozzuk a GAPDH-D-pro40 motort, a PHO5 szignálszekvenciát, az urokinázt kódoló szekvenciát és a PH05 transzkripciós terminációs szakaszt a pJDB207 élesztő ingázó vektorba.
pg_pJDB207/Pffi?5-UPApIazmid DNS-t BglH és Sáli enzimekkel emésztünk. A kapott két fragmenst 45 0,8%-os preparatív agarózgélen választjuk el pH 8,2-es Trisz-acetát-pufferben. A 7,6 kb és 1,1 kb méretű BglU-SalI fragmenseket izoláljuk. Az 1-1 kb méretű BgUI-SalI fragmenseket izoláljuk. Az 1-1 kb méretű fragmenst tovább emésztjük Dral enzimmel. Fenol50 klorofoimos extrakció és etanolos kicsapás után 3,2 pmól DNS-t ligálunk 100-szoros feleslegben lévő, kinázenzimmel kezelt és párosított oligodezoxiribonukleotid linkemel. Képlete
5’-AATTCGATTACCAATGTTT-3’
3’- GCTAATGGTTACAAA-5’ ebben egy EcoRI hely, az ATG-kodon előtti nemkódoló PHO5 5’ szakaszból 8 nukleotid, valamint a Dral enzim felismerési helyének egy része található.
HU 204 557 Β órás 15 ’C-os ligálás után a ligázt inaktiváljuk, a fölöslegben lévő linker molekulákat izopropanolos kicsapással eltávolítjuk (0,54 térfogat) 300 mM nátriumacetát (pH 6,0) és 10 mM EDTA jelenlétében. A DNS-t BglII és EcoRI enzimekkel emésztjük. Egy 326 bp méretű EcoRI-BglH fragmentet izolálunk.
A p31GAPDL-IT plazmidot Sáli és EcoRI enzimekkel emésztjük. Egy 0,75 kb méretű Sall-EcoRI fragmenst izolálunk.
Á DNS-ffagmenteket elektroelúcióval izoláljuk az agarózgélből, DE52 kromatográfiával tisztítjuk és etanollal kicsapjuk. 0,2 pmól 0,75 kb méretű Sall-EcoRI fragmenst, 0,4 pmól 326 bp méretű EcoRI-BglII fragmenst és 0,1 pmól 7,6 kb méretű Sall-BglII vektorfragmenst ligálunk össze 5,5 órán át 15 ’C-on tartva az elegyet. 1 pl ligáló elegyet használunk Ca2+-ionokkal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformálására. 10 amp® transzformánst felnövesztünk és plazmid DNS-t izolálunk belőlük. A DNS-eket EcoRI enzimmel emésztve analizáljuk. Az egyik klónból származó, várt restrikciós mintázatot mutató plazmid DNS-nek a pJDB207/GAPDL-UPA jelölést adjuk.
Analóg módon készítjük el a pJDB207/GAPFLUPA és a pJDB207/GAPEL- UPA plazmidokat.
10. példa
A pDP38 plazmid előállítása (11. és 12. ábra)
A Saccharomyces cerevisiae S288C törzsből mikronos kovalensen zárt, kör alakú DNS-t izolálunk, a sejtfalat 5 pg/ml Zymolyase enzimmel (100,00 egység/pg) emésztve 20 percig 37 ’C-on, majd a sejteket 2%-os SDS-sel lizálva. Ezután EDTA-t adunk hozzá 25 mM végkoncentrációban, cézium-kloridot 1,55 g/ml sűrűség beállításáig, etidium-bromidot mg/ml koncentrációban, és az oldatot ultracentrifugacsőbe tesszük. A plazmid DNS-t a kromoszomális DNS-től ultracentrifugálással választjuk el, 42 órán át 42 000/perc fordulatszámmal 15 ’C-on centrifugálva. A mikronos plazmid DNS-t injekciós tűvel leszívjuk a gradiensről. Az etidium-bromidot NaCl-dal telített izopropanollal távolítjuk el, végül a plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk. A tisztított plazmid DNS-t PstI enzimmel linearizáljuk és a pUC19 plazmid PstI helyére klónozzuk [J. Norrander et al., Gene, 26, 101 (1983)], így kapjuk a pDP31 plazmidot. A pJDB207 plazmidot KpnI és Hpal enzimekkel emésztjük. A kapott 0,55 kb méretű fragmentet tisztítjuk, és a pUC7/LEU2 plazmid 4,25 kb méretű KpnI-Hpal fragmensébe klónozzuk. A pUC7/LEU2 plazmid a pUC7 plazmidba [J. Vieira et al., Gene, 19, 259 (1982)] klónozva tartalmazza az élesztő genomiális LEU2 génjét hordozó 2,2 kb méretű Xhol-Sall fragmenst. [A. Andreadis et al., Cell, 31,319 (1982)]. Ennek eredményeképpen kapjuk a pDP30 plazmidot, amelyben az eredeti 2 mikron LEU2 fúziót, úgymint a pJDB207 plazmidnál a LEU2 gén és komplett terminátora elé helyezzük. A pDP30 plazmidot Hpal és Sáli enzimmel emésztjük, és a komplett LEU2 gént tartalmazó 1,85 méretű fragmentet tisztítjuk, majd a pDP31 plazmid 8,7 kb méretű Hpal-Sall fragmensébe klónozzuk. A kapott pDP33 jelű plazmidot HindlII enzimmel linearizáljuk 50 μΐ/ml etidium-bromid jelenlétében [M. Oesterlund et al., Gene, 20,121 (1982)], és az URA3 gént [M. Rose et al., Gene, 29, 113 (1984)] tartalmazó 1,17 kb méretű HindlH fragmenssel Egáljuk. Az URA3 gén pozitív inszercióját az E.coli pyrf törzsbe [M. Rose et al., id. mű] való transzformációval igazoljuk. így kapjuk a pDP34 plazmidot. A pDP34 plazmidot Sphl enzimmel emésztjük. A kapott 8,4 kb méretű fragmenst tisztítjuk, majd önmagával ligáivá kapjuk a pDP38 plaz-midot.
11. példa
A pDP38!GAPDL-I-UPA éspDP38IGAPDL-UPA plazmidok előállítása
A pDP38 jelű vektor (lásd 10. példa) tartalmazza a LEU2 és URA3 géneket, pBR322 szekvenciákat és az élesztő 2 mikronos DNS-ének egy részét. A pDP38 plazmidot BamHI enzimmel linearizáljuk. A kapott ragadós végeket Klenow DNS-polimerázzal feltöltjük (Maniatis et al., 113. oldal, id. mű). A DNS-t teljesen megemésztjük Sáli enzimmel és a nagy, 8,4 kb méretű fragmenst izoláljuk.
μg pJDB207/GAPDL-I-UPA plazmidot részlegesen emésztünk HindlII enzimmel (1 egységig DNS) 10 μg/ml etidium-bromid jelenlétében 28 percig 37 ’C-on. A reakciót EDTA hozzáadásával állítjuk le, 10 mM végkoncentrációban. A DNS tapadós végeit Klenow DNS-polimerázzal töltjük fel. A DNS-t tovább emésztjük SaU-gyel. Egy 2,2 kb méretű Sall[HindIII]/tompa végű fragmenst izolálunk.
A tisztított DNS-fragmenseket ligáljuk Ca2+-ionokkal kezelt E.coli HB101 sejtekbe transz formáljuk. 24 amp® telepet szaporítunk el. A plazmid DNS-t izoláljuk, majd EcoRI és SalI/HindlH restrikciós emésztéssel vizsgáljuk. Az egyik kiónból származó, a várt restrikciós fragmenseket eredményező plazmid DNS-t a pDP38/GAPDL-I-UPA jelzéssel látjuk el.
Analóg módon a pJDB207/GAPDL-UPA plazmidból teljes HindlH emésztés, Klenow DNS-polimerizációs reakció és Sáli enzimes emésztés után egy 2,2 kb méretű, SalI-[HindIII]/tompa végű fragmentet izolálunk. Ezt a fragmenst ligáljuk a fentiek szerint a pDP3 8 vektorba. Az egyik klónból származó DNS-t pDP38/GAPDL-UPA jelzéssel látjuk el.
Hasonló módon a pJDB207/GAPEL-I-UPA, a pJDB207/GAPEL-UPA és a pJDB207/GAPEL-UPA plazmidokból is izoláljuk a megfelelő 2,2 kb méretű, SalI-[HindHI]/tompa végű ffagmenteket. A fragmenseket tisztítjuk és pDP38-ba ligáljuk. A ligáló eleggyel E.coli HB 101 törzset transzformálunk.
A transzformálások után izolált megfelelő kiónokban lévő plazmidok a pDP38/GAPEL-T-UPA, pDP38/GAPFL-I-UPA, pDP38/GAPEL-UPA és pDP38/GAPFL-UPA jelzést kapják.
12. példa
A S. cerevisiae HT246 és GRF18 törzsek transzformálása
A Saccharomyces cerevisiae HT246 jelű törzset (a, leu2-3, few2-112, prb) [DSM2084]
HU 204557 Β 2 pJDB207/PHO5-UPA pJDB207/FHO5-I-UPA pJDB207/PHO5-SSUPA pJDB207R/PHO5-UPA pJDB207/GAPDL-UPA 5 pJDB207/GAPFL-UPA pJDB207/GAPDL-I-UPA plazmidokkal transzformáljuk, a Hinnen és munkatársai által leírt protokollt használva [Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 75,1929 (1978}]. A transzformált élesztőse}- 10 teket olyan élesztő minimál agaron szelektáljuk, amelyből hiányzik a leucin. Transzformált élesztőtelepeket izolálunk és a
Saccharomyces cerevisiae HT246/p JDB207/P/705-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pIDB207/Pí/6>5—I-UPA 15
Saccharomyces cerevisiaeH£246fpTDB2G7lPHO5-SSUPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207R/?fíö5-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pIDB207/GAPDL-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pIDB207/GAPFL-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/GAPDL-I-UPA 20 jelzésekkel látjuk el.
Hasonló módon transzformáljuk a Saccharomyces cerevisiae GRF18 (DSM3665) törzset is a fent említett plazmidokkal. A kapott transzformált élesztőtörzsek jelzése 25
Saccharomyces cerevisiae GRFI8/pJDB207/Pff(35-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18ípJDB207/PffO5-I-ÜPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/?//<95-SSUPA Saccharamyces cerevisiae GRF18/pIDB207R/PffO5-UPA Spceharomyces cerevisiae GRF18/pIDB2Q7/GAPDL-'UPA 30 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPEL-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPDL-l-UPA.
~ 13. példa 35
Á Saccharomyces cerevisiae HT350 törzs transzformálása
Saccharomyces cerevisiae HT350 törzset úgy állítjuk elő, hogy a Saccharomyces cerevisiae HT246 törzset (DSM4084) egy ura-3 deficiens törzzsel, pél- 40 dául a Saccharomyces cerevisiae HT285 (a, his3-ll, kis3-l5, leitl-3, leu2-112, ura3, pep4-3) törzzsel keresztezzük, melynek eredményeképpen a ΗΤ350 i törzsnél a következő genotípust kapjuk: a, his3-ll, his3—15, leu2-3, leul-112, ura3, prb, pep4-3. 45 i
A HT350 törzset a pFP38/GAPDL-I-UPA, í pDP38/GAPFL-I-UPA, pDP38/GAPEL-I-UPA, i
PDP387GAPDL-UPA, pDP38/GAPFL-UPA és ( pDP38/GAPEL-UPA plazmidokkal transzformáljuk, j
Hinnen és munkatársai módszerét (id. mű) használva. 50 s A transzformált élesztősejteket uracilmentes, leucin- 2 nal kiegészített minimál táptalajon szelektáljuk. Transzformált élesztőtelepeket izolálunk és e
Saccharomyces cerev£«űeHI350/pDP38/GAPDL-I-UPA 2
Saccharomyces cerevisiae HT350/pDP38/GAPFL-I-UPA 55 s
Saccharomyces cerevisiae HT350/pDP38/GAPEL-I-A 1
Saccharomyces cerevisiaeHT35Q[pDP3$IGAPT)lAUPA p
Saccharomyces cerevisiaeHT350/pOP38/GAPFL-UPA p
Saccharomyces cerevisiaeH1350fpDP38/GAPBL-UPA n jelzéssel látjuk el. 60 fi
14.példa
Transzformált élesztőseitek, transzformálása
A Saccharomyces cerevisiae HT246/pIDB2Q7/PHO5-UPA,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-l-UPA és ) Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207RÍPfíO5-I-UPA törzsek a'teljes PH05 promotort tartalmazzák, és a scn-PA expressziójához a promotor derepresszálására van szükség. ASaccharomyces cerevisiae HT246 transzD (Difco Yeast Nitrogén Base aminosavak nélkül, amelyhez 2% glükózt és 20 mg/1 L-hisztidint adunk) 50 ml-es Erlenmeyer-lombikban, 24 órán át 30 C-on rázatva, míg az 5-7· 107 sejt/ml sűrűséget elérjük. Az előtenyészet sejtjeit 0,9%-os NaCl-dal mossuk, és az előtenyészet sejtjei> nek20%-áthasználjuk50 ml, alacsony szervetlen foszfát koncentrációjú, a Difco Yeast Nitrogén Base recept szerint készített (aminosavak nélkül) minimál táptalaj oltására, amely 0,03 g/1 H^O-rOt, 10 g/1 L-aszparagint [QíH&SCk helyett] 20 g/1 glükózt és 1 g/I L-hisztidint ) tartalmaz. A tenyészeteket 30 ’C-on, 180/perc fordulatszámmal kevertetjük 48 órán át 1Ί08 sejt/ml (~ODéoo=4-5) végső sejtsúrűséget kapunk így.
Azok az élesztőtranszformánsok, amelyek különböző hosszúságú GAPDH-promotort hordozó plazmii dót tartalmaznak, konstitutíve fejezik ki a scu-PA-t.
A megfelelő pJDB207 származék plazmidokat tartalmazó transzformánsokat élesztő minimál táptalajon növesztjük előtenyészet készítése céljából. A mosott előtenyészeíet 50 ml komplex fő táptalajba oltjuk, melynek összetétele (g/1): pepton 5, élesztőkivonat 10, glükóz 20, szacharóz 40, (NHt)2SO4 3, KH2PO4 2, MgSCL 0,5, NaCl 0,1, CaCl2 0,1, biotin 10 jjg/l. Körülbelül 1·109 sejt/ml sejtsűrűséget (OD6oo”4Q-45) kapunk 48 órás inkubálás után, 30 ’C-on, 200/perc fordulatszámmal.
A megfelelő pDP38 származék plazmidokat tartalmazó transzformánsokat uracilmentes szelektálóközegben tenyésztjük. A sejteket 24 órán át növesztjük 30 ’C-on 180/perc fordulatszámmal rázatva a következő összetételű előtenyésztő táptalajon (g/1): kazaminosav 4,5, élesztőkivonat 6,5, szacharóz 20, glükóz 20, (NH4)2SO4 3,6, KH2PO4 1, MgS04 0,2, CaCI2 0,013 nyomelemek.
A mosott előtenyészet 10%-ávaI oltunk 50 ml szelektív fő táptalajt, melynek összetétele a kővetkező (g/1): YéastNitrogen Base (Difco, aminosavak nélkül) 5, L-aszparagin 7,5, kazaminsav 85, metil-etil-szulfonát 10, adenin 0,05, L-hisztidin 0,04, L-leucin 0,1, L-triptofán 1, Capantotenát 0,03, glükóz 30. Körülbelül 8*10® sejí/ml sejtsűrűséget (ODöoo~35) kapunk 48 órán át 30 ’C-on 200/perc fordulatszámmal inkubálva a tenyészetet
2-2 ml fermenüéből sejteket izolálunk 24 és 48 óra elteltével, 3000/perc fordulatszámmal 10 percig Falcon 2070 csövekben centrifugálva. A sejteket egyszer mossuk 0,9% NaCl-dal és centrifugáljuk. A sejtüledéket lízispufferben szuszpendáljuk [60 mM kálium-foszfát pH 7,4 4 mM Zwittergent (Calbiochem)]. A sejtszuszpenzióhoz 8 g üveggyöngyöt adunk (0,5-0,75 mm átmérőjű) és a szuszpenziót Vortex Mixerben [Scientifíc Instruments Inc. USA] teljes sebességgel 4-5*2 percig
HU 204 557 Β rázatjuk. Ezzel az eljárással a sejteknek több, mint 90%-át feltörjük. A sejttörmeléket és az üveggyöngyöket centrifugálással távolítjuk el (5 perc, 3000/perc, 4 °C). Közvetlenül a biológiai aktivitás vizsgálata előtt a felülúszót 500-szorosra hígítjuk 0,1 M Trisz- HCl (pH 7,4), 0,05% Tween 80, 0,1% borjúszérum-albumin összetételű oldatban.
75. példa
A biológiai aktivitás meghatározása A scu-PA amidolitikus aktivitását közvetlenül mérhetjük a Kabi (Kabi Vitrum, Stockholm, Svédország) S-2444 szintetikus tripeptid kromogén szubsztrátjával (pyro-Glu-Gly-Arg-pNA). A Lysl58-nál és/vagy Lysl36-nál hasított tcu-PA-tartalom meghatározása céljából a vizsgálatot az előállító előírásai szerint végezzük (plazminaktiválás nélkül). A scu-PA-nak plazminaktiválásra van szüksége amidolitikus aktivitásának meghatározása előtt, és a közvetlen mérés következő módosításához vezet; 100 μΐ scu-PA-tartalmú mintát (lásd 14. példa) előinkubálunk 0,01 egység humán plazminnal (Boehringer Mannheim, NSZK) 60 percig 37 ’C-on. 5 nemzetközi egység aprotinint adunk hozzá (Boehringer Mannheim, NSZK) és az elegyet további 10 percig 100 hőmérsékleten inkubáljuk, mielőtt a kromogén szubsztrátot (S-2444) hozzáadjuk.
— Az aktivitás számszerűsítését a WHO urokináz standarddal (66/46-os minta) összehasonlítva végezzük és nemzetközi egységekben (I.U.) fejezzük ki. A kereskedelemben kapható Ukidan preparátumot (Serono, Freiburg, NSZK) figyelembe véve, a humán vizeletből izolált nagy tisztaságú urokináz specifikus aktivitás 70 000-100 0001.U?mg fehéqe.
' A scu-PU-tartalmat mérhetjük plazminogén aktiváló hatása alapján is, az S-2251 jelű szintetikus tripeptidszubsztrát felhasználásával (Kabi Vitrum, Stockholm, ' Svédország). A mérést az előállító (Kabi Vitrum) előírásai szerint végezzük scu-PA-tartalmú mintákkal, mint plazminogén aktivátorral streptokináz helyett.
Az élesztőfermentlevekben jelen lévő antigén mennyiségét a „dot-blot” hibridizálási eljárással becsüljük meg (Bio-Rad, Richmond, USA). A kimutatáshoz poliklonális nyúl antihumán vizeleturokináz-antitestet használunk.
A fermentáció 24. órájában veszünk mintákat és a
14. példában leírt módon előkezeljük. A plazminogén aktiváló aktivitást (a szubsztrát S-2251) különböző plazmidok és 2 különböző törzs esetében az 1. táblázatban mutatjuk be.
1. táblázat
Plazmid gazda szelekció S-2251 aktivitás I.U72-107 sejt
pJDB207R/PNO5-UPA HT246 leu 0
pJDB207/PHG5-SSUPA HT246 leu 2,2
pJDB207/PÍ7O5-I-UPA HT246 leu 10
pJDB207/P77G5-UPA HT246 leu 1,4
Plazmid gazda. szelekció S-2251 aktivitás
I.U/2«107sejt
pJDB207/GAPDL-UPA HT246 leu 9
pDP38/GAPDL-I-UPA HT350 leu 3
pDP38/GAPDL-I-UPA HT350 - ura 5,7
pDP38/GAPFL-I-UPA HT350 leu 0,4
pDP38/GAPFL-I-UPA HT350 ura 3,4
Az S-2251 a Kabi Vitrum (Svéd) cég által gyártott D-valil-leucin-lizin-p-nitroalanid-dihidroklorid kromogén szubsztrát kereskedelmi jelölése.
A három különböző módszerrel meghatározott aktivitások összehasonlítását a 2. táblázatban adjuk meg.
A pJDB207/GAPDL-I-UPA plazmidot tartalmazó HT246 törzs 48 órás fermentálása után kapott teljes térfogati titereket (per ml fermentlé) mutatjuk be.
2. táblázat I.U./ml fermentlé
Aktivitás S-2444 plazmin nélkül S-2444 Aktivitás plazminnal S-2251 „Dot-blot” (becslés)
25,8 215 1670 · kb. 1000
Az eredmények azt mutatják, hogy élesztőben akkor kapjuk a legjobb scu-PA termelést, ha a hibrid DNS tartalmaz egy élesztő szignálszekvenciát is, például a PHO5 vagy az invertáz szignálszekvenciáját. Az eredmények azt mutatják továbbá, hogy a scu-PA különböző élesztőgazda-háttérben is kifejeződik, és a szelektív körülmények között végzett fermentáció (vagy alacsony szervetlen foszfáttartalmú táptalajon vagy uracilszelekcióval) viszonylag magasabb specifikus aktivitáshoz vezet az OD-ra vonatkoztatva.
A kifejeződő terméknek körülbelül 90%-a scu-PA, amit a Kabi Vitrum (Svéd) cég. által gyártott S-2444 szubsztráton (piroglutamil-glicil-arginin-p-nitroanilidhidroklorid) plazminaktivitással vagy anélkül végzett aktivitásmérések mutatnak. A dot-blot vizsgálat azt mutatja, hogy a jelen lévő antigén mennyisége nem haladja meg lényegesen a mért biológiai aktivitás mennyiségét. Tehát az élesztőrekombináns scu-PA-nak is olyan a térbeli szerkezete, mint a genomiális scu-PA-é.
16. példa
A scu-PA kinyerése élesztó’sejtekbó'l (30 1. fermentlé)
A Saccharomyces cerevisiae HT246 (pJDB207/GAPDL-I-UPA törzset ugyanolyan körülmények között növesztjük, mint a Saccharomyces cerevisiae GRF28/pJDB207/GAPFL-HIR törzset a hirudin előállítása során (lásd EPA No. 225 633). A
HU 204557 Β sejtekben lévő scu-PA-tartalmat (feltárás után lásd 14. példa) az indirekt amídolitikus méréssel határozzuk meg, az S-2251 szubsztrátot használva (lásd 15. példa). 48 őrás inkubálás után a sejteket Sharple centrifugával (Appareils Centrifuges, Rueil, Francé) centrifugálva gyűjtjük össze és azonos térfogatú Iizáló pufferben szuszpendáljuk (200 mM K2HPO4, 0,2% Tween 80). A sejteket ezután üveggyöngymalomban tárjuk fel (Dyno-Mill, KDL, Bachofen AG, Basel; 4500 rpm, 18 I/h). A szuszpenziőt ötszörösére hígítjuk 150 mM NaCl-dal, 0,05% Tween 80-nal, majd a sejttörmeléket 0,6% polietilénimin jelenlétében 4 ’Con centrifugálással ülepítjük SB7-47 Westfalia-szeparátorban. Az enyhén zavaros felülúszőt Zetapor Cartridge-on szűrjük át (0,22 pm pórusméret), és pHját 1 N sósavval 6,05-re állítjuk. 1 kg ülepített élesztősejthez 11 gyorsátfolyású S-Sepharose katíoncserélőt adunk és a szuszpenziót 4 ’C-on 1 órán átkeveríetjük. A gyöngyöket ezután egy 9 cm átmérőjű oszlopba visszük át és egy 50 mM nátrium-foszfát (pH 7,0), 150 mM NaCl, 0,05% Synperonic összetételűoldattal mossuk. A scu-PA-t 30 ml/perc áramlási sebességgel eluáljuk, ugyanilyen összetételű, de 250 mM NaCI-t tartalmazó pufferrel. A scu-PA-t tartalmazó frakciókhoz (a direkt amídolitikus módszerrel mérve, lásd 15. példa) KonKanavalin A Sepharose-t adunk (Pharmacia) (1 ml géI/0,2 mg scu-PA) és a szuszpenziót 45 percen át 4 ’C-on kevertetjük. 1 M NaCl, 10 mM nátrium-foszfát (pH 7,0) 0,05%· Synperonic-oldattal történő mosás után a gyöngyöket 4,4 cm átmérőjű oszlopba visszük át és a scu- PA-t 0,8 M metil-alfa-D-mannopiranozid, 150 mM NaCl, mM nátrium-acetát (pH 4,0), 0,05% Synperonic összetételű oldattal eluáljuk 11/h áramlási sebességgel. A scu-PA-t tartalmazó frakciókhoz antiurokináz 35 IgG-Sepharose-t adunk humán vizeletből izolált urokináz ellen készített poliklonális nyúl antitest (IgGfrakció) és 4 ’C-on 45 percig kevertetjük. A gyöngyöket ezután egy 2,2 cm átmérőjű oszlopra visszük át, majd mossuk egy 1M NaCl, 10 mM nátrium-foszfát 40 (pH 7,0), 0,05% Synperonic összetételű oldattal. A scu-PA-t ezután 1 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk egy 0,1 M glicin-HCl (pH 2,4), 0,05% Synperonic összetételű pufferrel. A scu-PA-t tartalmazó frakciók pH-ját 6,0-ra állítjuk 1M NaOH-dal. 45
Ebben az állapotban az összaktivitás 25-30%-a tcuPA, amint azt a direkt amídolitikus vizsgálattal ki lehet mutatni (lásd 15. példa). ·'
Az antitestoszlopról lejövő oldatot egy Mono-S-oszlopra visszük (1 ml térfogat, Pharmacia), melyet 50 mM 50 nátrium-foszfát (pH 6,0) 0,05% Synperonic összetételű pufferrel hozunk egyensúlyba. Az egyensúlyozó püfferrel való mosás után az scu-PÁ-t az egyensúlyozó pufferból és a B pufféiból [összetétele 500 mM NaCl, 50 mM nátrium-foszfát (pH 7,0) 0,05% Synperonic] készült lép- 55 csőszerű gradienssel eluáljuk 1 ml/perc átfolyási sebességgel. Ezzel az eluálással két aktív csúcsot kapunk, az egyik csúcs az első lépésnél, 30%-os B pufferkoncentrácíőnál eluálódik, a második 55%-os B pufferkoncentrácrónál. Adirekt amídolitikus vizsgálat felfedte, hogy a 30% 60
B-nél eluálódó frakcióban a tcu-PAmég magas koncentrációban van jelen, míg az 55% B-nél eluálódó frakcióban csak 1-3% tcu-PA található.
Az ily módon előállított élesztő scu-PA SDS-poliak5 rilamid gélelektroforézissel vizsgálva nem redukáló körülmények között egy kb. 51 KD molekulatömegű, egyetlen csíkként vándorol. A kapott scu-PA tisztasága kb. 95%, amint azt a direkt amídolitikus vizsgálattal meg lehet ítélni (lásd 15. példa), valamint a redukáló 10 körülmények között végzett SDS-poIiakrilamid gélelektroforézissel.
17. példa
Az élesztő scu-PA glikozilezettségi állapota 15 A glikozilezettséget I125 konkanavalin-A felülrétegzési vizsgálattal határozzuk meg elektroforézis után. A konkanavalin-A egy növényi Iektin, amely specifikusan felismeri a mannózcsoportokat. Az élesztőből tisztított scu-PA-t, valamint az u-PA standard Ukidant (Se20 rono, Freiburg NSZK) 10%-os gélen elektroforetizáljuk. A fehérjéket ezután a gélhez kötjük 30 perces 7% ecetsavas kezeléssel. A gélt ezután a következő összetételű lektinpufferrel mossuk:
0,15MNaCl
50 mM Trisz-HCl pH 7,4
0,5 mM CaCI2
0,5mMMnCk
A mosást addig végezzük; míg a pH el nem éri a kb. 7,3 értéket. A gélre ezután óvatosan rétegezzük a 3 mg 30 hemoglobint, 100 pg konkanavalin-A-t és 2 pCi I12í konkanavaün-A-t tartalmazó Iektinpuffert.
Egy minden szempontból az előzővel azonos gélt az említett keverékkel rétegzünk, de ez a keverék 0,2 M alfa-metil-mannozidot is tartalmaz. 3 órai párosított levegőjű kamrában való inkubálás után a géleket alaposan mossuk lektinpufferben, megszántjuk, majd röntgenfilmmel exponáljuk. Alfa-metil-mannozid nélkül mind az Ukidan, mind az élesztő scu-PA festődik F25 konkanavalinnal. Molekulatömegük lényegében azonos. Alfa-metil-mannozid jelenlétében, amely a Iektin kötődésének kompetitív inhibitora, a humán vizeletből izolált urokináz eltűnik, míg az élesztő scu-PA még látható. Ez azt mutatja, hogy az élesztő scu- PA glikozilezve van, és glikozüezettsége eltér a humán vizeletből izolált urokinázétól.
18. példa
A: scu-PA további tisztítása
Scu-PA-oIdatot (lásd 16. példa) dializálunk egy 0,05 M Trisz-HCl (pH 8,0) 0,05% Tween 80, 0,05 M NaCl-oldattal szemben, majd egy 3 ml-es benzamidin-Sepharose-oszIopra töltjük (Pharmacia, Ubbsal, Svédország) és mossuk 1 M NaCl-t tartalmazó TriszHCl (pH 8,6) pufferrel. Az átfolyó eluátumból a scuPA-t teljesen vissza lehet nyerni, míg a melléktermékként keletkező tcu-PA-t 1 M L-arginint tartalmazó 0,05 M Trisz-HCl (pH 8,0) pufeirel leoldhatjuk az oszlopról. A kapott scu-PA tisztasága nagyobb 98%-náI.
HU 204 557 Β
19. példa
Az urokináz-B lánca glikozilezési helyének [Asn302] mutációja
a) Az u-PA Pstl-BamHI fragmentjét M13 mpl8 fágba klónozzuk. A pJDB207/PHO5-I-UPA plazmid (lásd 5
3. példa) az urokináz teljes kódolóorigóját tartalmazza.
A DNS-t PstI és BamHI enzimekkel hasítjuk. Az urokinázgénből származó 886 bp méretű Pstl-BamHI fragmens tartalmazza a glikozilezési helyet [Asn302] az 1033-1041 sorszámú nukleotídoknál. Egy másik, ha- 10 sonló méretű fragmenst tovább hasítunk BstEII-vel. A 886 bp méretű Pstl-BamHI fragmentet 0,8%-os preparatív gélből izoláljuk. Az M13 mpl8RF-DNS-t PstI és BamHI enzimekkel hasítjuk. A 7,3 kb méretű fragmenst preparatív 0,8%-os agarózgélből izoláljuk. A 15 DNS-fragmenseket elektroeluáljuk az agarózgélből, DE52 kromatográfiával tisztítjuk, majd etanollal kicsapjuk.
0,1 pmól 7,3 kb méretű Pstl-BamHI vektort és 0,2 pmól 886 bp méretű Pstl-BamHI u-PA-fragmentet Egálunk össze. 1 és 3 μΐ-t használunk a ligáló elegyből Ca2+-ionokkal kezelt E.coli JM109 sejtek transzformálására az Amersham által publikált, „Ml3 cloning and sequencing handbook” című kézikönyv alapján. 12 színtelen tarfoltot izolálunk és egyszálú DNS-t izolálunk [J. Messing, Methods in Enzymology, 101,21—78 (1983)]. Az egyszálú DNS-t arra használjuk, hogy részlegesen kétszálú DNS-t készítsünk az M13 univerzális primer párosításával és Klenow-polimerázzal való kiterjesztésével. A reakcióterméket fenol-kloroformmal extraháljuk és a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS-t PstI és BamHI enzimekkel hasítjuk. Egy 886 bp méretű fragmens jelzi, hogy az u-PA-fragmenst klónoztuk az Ml3 mpl8 vektorba. Egy kiónt tovább analizálva a beépített szakasz helyességét szekvenálással igazoljuk. A kiónt M13 mp18/UPA jelzéssel látjuk el.
b) A glikozilezési hely mutációja Asn302-nél.
302 | Asn| Ser Thr
M13 mpl8 inszert: 3’....AAA CCT TTT CTC TTA AGA TGG CTG ATA...5’ (értelmetlen szál) mutagén primer W: 5’-GGA AAA GAG CAA TCT ACC GAC-3’ mutált 5’....TTT GGA AAA GAG CAA TCT ACC GAC TAT...3’ értelmes szál 1024 |GÜn] 1044 szekvenáló CTGCCCTCGATGTATAACG primer 967 985
A mutagenizáló és szekvenáló primereket a foszforamidit módszerrel szintetizáljuk [Μ. H. Caruthers. Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (ed. H. G. Gassen and A. Láng), Verlag Chemie, Weinheim, NSZK] AppEed Biosystem Model 38OB szintetizátorok.
Egyszálú templát DNS-en végzett in vitro mutagenezist a T. A. Kunkel által leírt módszerrel hajtjuk végre [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82,488-492 (1985)]. Uraciltartalmú egyszálú templát DNS-t egy növekedési ciklusban álEthatunk elő az E.coli RZ1032 (duf, ung') törzzsel.
100 pmól W mutagén oEgonukleotid prímért foszforilezünk 20 μΐ 50 mM Trisz-HCl (pH 7,5) 10 mM MgCE, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP összetételű oldatban 20 egység T4 pohnukleotid kinázzal (Boehringer). 30 perces 37 °C-os inkubálás után a reakciót az elegy 10 percig 70 ’C-on való tartásával állítjuk le.
0,3 pmól uraciltartalmú M13 mpI8/UPA templát DNS-t 10 pmól foszforilezett W mutagén oligodezoxiribonukleotid primerrel és 10 pmól M13 univerzális szekvenáló primerrel inkubálunk 30 μΐ 10 mM TriszHCl (pH 8,0), 10 mM MgCh összetételű oldatban. Az oldatot 80 ’C-ra hűtjük és egy vízfürdőben hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni.
c) Hosszabbító-ligáló reakció
A fenti párosított mintához 10 μΐ enzim-dNTP-keveréket adunk, amely a 4 dNTP-ből 1-1 mM-t tartalmaz, valamint 10 mM Trisz-HCl-t (pH 8,0), 10 mM MgCEot, 20 mM DTT-t, 1 mM ATP-t, 400 egység T4DNS-Egázt (Biolabs, 400 U/μΙ) és 6 egység Klenow DNS-polimerázt (Boehringer, őU/μΙ). Éjszakán át 15 ’C-on inkubáljuk az elegyet.
d) E.coli BMH71 sejtek transzformálása
A Egáló keveréket TE-pufferrel 200 μΐ-re hígítjuk, 0,1, 1 és 10 μΐ-t adunk a hosszabító-ligáló elegyből kompetens, Ca2+-ionokkal kezelt E.coli BMH71 (DSM3413) sejtekhez (Kunkel, id. mű). 30 percig jégen tartjuk a sejteket, majd hővel kezeljük (3 perc 42 ’C) és visszahelyezzük 0 ’C-ra. A sejteket felülrétegző agarban E.coli JM101 indikátorsejtekkel együtt szélesztjük.
tarfoltot izolálunk, és E.coli JM109 (DSM3423) sejteket fertőzünk velük. A fágokat a felülúszóból izoláljuk PEG-kicsapással. Az egyszálú DNS-t fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással izoláljuk. A templát DNS-eket TE-ben szuszpendáljuk.
Az AAT-kodon (Asn302) CAA-kodonná (Gln302) való mutációját egy klón esetében bizonyítjuk a DNSszekvencia meghatározásával az említett szekvenáló primerrel, a láncleálUtó módszert alkalmazva [F. Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463-67 (1977)]. A mutáció eredményeképpen az u-PA aminosav-sorrendjében a 302. helyen lévő Asn Gln-re cserélődik és ezzel eliminálódik az urokináz egyetlen glikozilezési helye. A W jelzi a gEkozilezési hely mutációját az u-PA B láncában (Asn302—>Gln302). Más mutációt nem találtunk az u-PA-t kódoló szekvenciában. A pozitív klón jele M13 mpl8/UPA-W.
HU 204557 Β 2
7(1 péMn ’ kötésnél alacsony molekulatőmegű urokinázt eredméA [Lysl 35] mutációja Giy-re . < nyez. A kétbázisos hasítási helyet elűnináljuk, a
A scu-PA proteolitikus hasítása a Lys 135-Lys 136 [Lysl35]-nek glicmrevaló in vitro mutáltatásával.
\ - 135 136 - _· - - ·· ÍLyslLys . ; M13 mp!8 inszert 37...ACG CGT CTA CCT ZT77TTC GGG AGG ÁGA.....5’ (értelmetlen szál) ' ·- ' · ~ mutagén primer LG 5’-GCA GAT GGA GGT AAG CCC TCC-3’ mutált értelmes 5’.;..TGC GCA GAT GGA GGT AAG CCCTCC TCT.....3’ szál - - - 523 |Gly | 543
Az in vitro mutagenezis módszerét a 19. példában írjuk le. A mutált értelmes egyszálú láncot izoláljuk.· Az AAA kőd (Lysl35) GGT kódoló (Gly) való mutációját DNS-szekvenálással igazoljuk, az univerzális M13 primer felhasználásával (Biolabs). A [Lysl35]-+Gly mutáció eredményeképpen az urofcínáz-Á láncának 135-ös aminosavánál lévő proteolitikus hasítási helyet elimináljuk. Az egyik mutált DNS-t tartalmazó kiónt M13 mp!8/UPA- LG jelzéssellátjuk el.
is r 21. p élda
A [Lysl35]-^Ser mutáció
A [Lysl 35] aminosav szerűmé mutáltatását a 20. példával analóg módon végezzük.
135136 . CT Lys - : : <
M13 mpl8 inszert 3’....A.CG CGT CTA CCT 77T TTC GGG AGG AGA.....5’ · (értelmetlen szál) ' - ' ' · · mutagén primer LS 5’-GCA GAT GGA AGT AAG CCC TCC-3’ · · mutált értelmes -5’.....TCG CGA GAT GGA AGT AAG CCC TCC TCT.....3’ ; ·· szál 7 '523 . (Ser) - ' -543 · -Az AAA-kodon (Lysl35) AGT-kodonná (Ser) való 22. példa mutációját egyszálú templát DNS-szekvenálásával iga- 30 A [Phe 157]Asp mutáció zoljuk, az M13 univerzális primer felhasználásával. A Az egyszálú u-PA-t kétszálú u-PA-vá a plazmín alahelyes mutációt tartalmazó egyik kiónt ' M13 kítja át a Lysl58-Hél59 kötés proteolitikus hasításával.
mpl8/ÜPA-LS jelzéssel látjuk el. ' ' Atrombin az Argl56-Phel57 kötést hasítja. Hogy megelőzzükascu-PAproteolitikushasításátplazmin35 nal és trombinnal, a [Phel57]-etAsp-re mutáljuk.
156 157 158 159 · ' Arg |Phe| Lys Be ’
M13 mpI8 ínszert: 3’...GA GAC TCC GGG GCG AAA TTC TAA TAA CCC CC...5’ (értelmetlen szál) mutagén primer P ' 5’- G AGG CCCCGC' GAC AAT ATT ATT G -3’ mutált értelmes 5’...CT CTG AGG CCC CGC GAC AAG ATT ATT GGG GG...3’
A TTT-kodon (PheI57) mutációját GAC-kodonná (Asp 157), DNS- szekvenálással igazoljuk, az MI3 univerzális primer felhasználásával (Biolabs). A [Phel57J-+Asp mutáció eredményeként eliminálódik a trombin proteolitikus hasítási helye a 156-os aminosavnál és a plazmin proteolitikus hasítási hely a 158-as aminosavnál az egyszálú urokinázban, A mutált DNS-t tartalmazó egyik kiónt M13 mpl8/UPÁ-P jelzéssel látjuk el.
23. példa
A [Gln302] mutáció átvitele azMI3 Hónról az élesztó' expressziős egységre
Az M13 mpl8/UPA-W az aminosavszekvenciában egyetlen változást (Ghr302) kódoló mutáns DNS-inszertumot tartalmaz, amely eliminálja a glikózilezési
Asp helyet az urokináz B láncában. A mutációt tartalmazó DNS-fragmenst átvisszük az élesztő pJDB207/BHO5I-UPAexpressziós plazmidba.
A pJDB2O7/PH05-I-UPA plazmidot Sáli és BamHI enzimekkel hasítjuk. A 6,6 kb méretű vektorfragmenst izoláljuk. Ez az u-PÁ-génnek a 3’ végét tartalmazza az 1323-as pozíciónál levő BamHI helytől (1. ábra) az 1441-es helyig (PvuH hely a hozzáadott Xhol lihkerrel), valamint a PH05 transzkripciós terminációs jelet.
A pJDB2O7/RH05-I-UPA plazmidot Sáli és PstI enzimekkel hasítjuk.- Az 1,2 kb méretű Sall-PstI fragmenst izoláljuk és elekíroelúcíóval kinyerjük a gélből. A DNS-fragmens apBR323 SalI-BamHI szekvenciáját tartalmazza, a />/705 promo tort, az invertáz szignálszekvenciát, valamint az u-PA-kódplószekvenciát a PstI helyig.
HU 204 557 Β
RF-DNS-t (replikativ formát) izolálunk az M13 mpl8/UPA-W-ból flásd 19. példa) a gyors DNS-izolálási módszerrel [D. S. Holmes et al., Analyt. Biochem., 114,193-197 (1981)]. 5 pg DNS-t emésztünk BamHl és Pstl enzimekkel. 2 pg RN-áz (Serva) hozzáadása után 5 percig 37 ’C-on inkubáljuk és a 886 bp méretű Pstl-BamHI fragmenst 0,89-es preparatív agarózgélból izoláljuk. A DNS-fragmenst elektroeluáljuk és etanolban kicsapjuk. A DNS-fragmens az AAT-+CAA mutációt tartalmazza az 1033-1035-ös nukleotidpozícióban (Asn302—>Gln) az urokináz-B láncban. 0,2 pmól 886 bp méretű Pstl-BamHI fragmenst és 0,1 pmól 6,6 kb méretű Sall-BamHI vektorfragmenst ligálunk össze. Kompetens, Ca2+-ionokkal kezelt E.coli HB101 sejteket transzformálunk.
ampicillinrezisztens transzformánst elszaporítunk. Plazmid DNS-t izolálunk és EcoRl, valamint HindHI emésztésekkel vizsgálunk. A mutáció (W) a glikozilezési helyen elrontja az EcoRl hasítási helyet az 1032-1037-es nukleotidpozícióknál. A mutációt tartalmazó egyik plazmidot pJDB207/P77O5-I-UPA-W jelöléssel látjuk el.
Analóg módon az Ml3 mpl8/UPÁ-P, Ml3 mpl8/UPA-LG és M13 mpl8/UPA-LS plazmidok Pstl-BamHI fragmenseit használjuk a pJDB207/Ptf O5-I-UPA-P, a pJDB207/7WO5-I-UPALG és pJDB207/PHO5-I-UPA-LS plazmidok készítésére.
24. példa
A pJDB207/PHO5-I-UPA-LGP plazmid készítése
A scu-PA protolitikus hasításának megelőzésére a 135-ös aminosavpozícióban lévő mutációt (Lys->Gly) és a 157-es aminosavpozícióban lévő mutációt (Phe->Asp) kombináljuk a pJDB207/PHO5-I-UPA-LGP jelű plazmidban.
A pJDB207/PHO5-I-UPA-LG plazmidot (23. példa) Sáli és Ball enzimekkel hasítjuk. A Sall-Ball fragmens tartalmazza a pBR322 Sall-BamHI szekvenciáját, a PHO5 promotort, az invertáz szignálszekvenciáját és az u-PA-t kódoló szekvenciát a Ball helyig, benne a Gly315 mutációval.
A pJDB207/P77OJ-I-UPA-P plazmidot (lásd 23. példa) Ball és BamHl enzimekkel emésztjük. A 0,7 kb méretű Ball-BamHI fragmens az u- PA-t kódoló szekvenciának egy belső fragmense, amely az Asp 157 mutációt tartalmazza.
Az 1,3 kb méretű Sall-Ball fragmenst, a 0,7 kb méretű Ball-BamHI fragmenst és a 6,6 kb méretű SallBamHI vektorfragmenst (23. példa) összeligáljuk. Kompetens E.coli HB101 sejteket transzformálunk a ligáló eleggyel. A transzformánsokból plazmid DNS-t izolálunk, majd restrikciós emésztéssel és DNS- szekvenálással analizáljuk. A várt nukleotidszekvenciájú, a Gly 135 és Aspl57 mutációkat kódoló egyik kiónt szelektáljuk és pJDB207/PHO5-I-UPA-LGP jelzéssel látjuk el.
Hasonló módon állítjuk elő a pJDB207//WO5-IUPA-LSP plazmidot is a pJDB207/P77O5-I-UPA-LS plazmid Sall-Ball fragmentjének felhasználásával.
25. példa
A [Gly 135 Aspl 57,Glu302]-u-PA-t kódoló pJDB207tPHO5-l-UPA-LGPWplazmid készítése Az u-PA-aminosav szekvenciájában a 135, 157 és
302 pozíciókban lévő három mutáció kombinációjával kapjuk a [Giyl35,Aspl57,Glu302]-u-PA-t. Ebben az új urokinázmolekulában a 135-ös (Lys—>Gly) ás 157-es (Phe-+Asp) helyen lévő proteolitikus hasítási helyeket, valamint a 302-es (Asn->Gln) helyen lévő glikozilezési helyet elimináltuk.
A pJDB207//W5-I-UPA-LGPW az urokinázmutánst kódolja és a következő módon állítható elő:
A pJDB207/PHO5-I-UPA-LGP plazmidot Sáli és Xhol enzimekkel emésztjük. A 2,2 kb méretű SallXhol fragmentet izoláljuk, elektroeluáljuk az agarózgélből, DE52 kromatográfiával tisztítjuk és etanollal kicsapjuk. Ez a DNS-fragmens három MstI helyet tartalmaz a PHO5 promotorban és az u-PA-szekvenciában. 3 pg 2,2 kb méretű Sall-Xhol fragmenst részlegesen emésztünk 3 egység Mstl-gyel 1 órán át 37 ’C-on. A reakciótermékeket 0,8%-os agarózgélen elválasztjuk és az 1,7 kb méretű Sall-MstI fragmenst izoláljuk, majd elektroeluáljuk a gélből. A DNS-fragmens tartalmazza a pBR322 Sall-BamHI szekvenciáját, a PHO5 promotort, az invertáz szignálszekvenciáját, valamint az u-PA-t kódoló szekvenciát a 935-ös pozícióban lévő MstI helyig.
pg M13 mpl8/UPA-W RF-DNS-t flásd 19. példa) emésztünk BamHl és MstI enzimmel. 2 pg NR-áz (Serva) hozzáadása után 5 percig 37 ’C-on inkubáljuk az elegyet, majd a 387 bp méretű Mstí-BamHI fragmenst izoláljuk 0,8%-os preparatív agarózgélből. Á DNS-fragmensí elektroeluáljuk és etanollal kicsapjuk. A fragmens az AAT-+CAA mutációt tartalmazza az 1033-1035 nukleotidpozícióknál (Asn302-+Glu) sz urokináz-B láncában.
Az 1,7 kb méretű Sall-MstI fragmenst, a 387 bp méretű Mstí-BamHI fragmenst és a 6,6 kb méretű Sall-BamHI vektorfragmenst (23. példa) összeligáljuk. E.coli HB101 kompetens sejteket transzformálunk a ligáló elegy egy alikvot részével. Az amp® transzformánsok plazmid DNS-ét izoláljuk, majd HindíII és EcoRl restrikciós emésztéssel és DNS-szekvenálással vizsgáljuk. A várt nukleotidszekvenciájú u-PA-inszertumot tartalmazó egyik kiónt, amely a Glyl35, Aspl57 és Glu302 mutációkat tartalmazza, kiválasztjuk és pJDB207/P77O5-I-UPA-LGPW jelzéssel látjuk el,
Analóg módon állítjuk elő a pJDB207/PHO5-IUPA-LSPW plazmidot és a pJDB207/PHO5-I-UPALSP plazmid Sall-MstI fragmensének felhasználásával.
26. példa
A Saccharomyces cerevisiae HT246 és GRF18 törzsek transzformálása és a transzformált törzsek tenyésztése
A Saccharomyces cerevisiae HT246 és GRF18 törzseket a pJDB207//W5-I-UPÁ-W pJDB207/PHOJ-I-UPA-P pJDB207/P77O5-I-UPA-LG
HU 204 557 Β 2 pJDB207/PHO5-I-UPA-LS pJDB207/Pffö5-I-UPA-LGP pJDB207/PffO5-I-UPA-LSP pJDB207/PHÖ5-I-UPA-LGPW pJDB207/PHO5-I-UPA-LSPW plazmidokkal transzformáljuk, a Hinnen és munkatársai által leírt transzformációs protokollt használva [Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 75, 1929 (1978)]. A transzformált élesztősejteket leucinmentes élesztő minimál táptalajon szelektáljuk. Különálló transzformált élesztőtelepeket izolálunk, és a következő jelzésekkel latjukéi.
Saccharomyces cerevisiae HT24ő/pJDB207/P/7O5-I-UPA-W Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-P Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/P77O5-I-UPA-LG Saccharomyces cerevisiae HT24ó/pJDB207/P/7O5-I-UPA-LS Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-LGP Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-LSP Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/P77O5-I-UPA-LGPW' Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHö5-I-UPA-LSPW Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHÖ5-I-UPA-W Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P£fö5-I-UPA-P Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHü5-I-UPA-LG Saccharomyces cerevisiae GKFl8/pTDB2Q7/PHO5-L-lTPA-LS Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHö5-I-UPA-LGP Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHö5-I-UPA-LSP Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHÖ5-I-UPA-LGPW Saccharomyces cerevisiae GBF18ípJDB207/PIíO5-l-UPA-LAPW.
A törzseket a 14. példában leírtakkal analóg módon tenyésztjük. A scu-PA-mutánsfehérjéket a 16. vagy 18. példában leírtakkal analóg módon izoláljuk.
27. példa
Első gyógyászati készítmény parenterális adagolásra
Parenterális adagolásra alkalmas oldatot úgy készítünk, hogy 3 mg tisztított scu-PA-t, 25 mg mannitot és 45 mg nátrium-kloridot oldunk 5 ml steril vízben és e kapott oldatot megfelelő térfogatú 5%-os giükőzöldattal keverjük el.' Az oldatot 0,22 pm pórusáímérőjű membránszürőn átszűrve sterilezzük.
28. példa Második gyógyászati készítmény parenterális adagolásra (diszperzió injekcióhoz)
163 mgszőjalecitint (szójabab-foszfatíd NC95, előállító Nattermann, Köln, NSZK; tisztaság 90-96%; zsírsavösszetétel: linolsav 61-71%, linolénsav 4-7%, olajsav 6-13%, palmitinsav 10-15%, sztearinsav 1,535%) és 92,7 mg tiszta nátrium-glikolátot oldunk 7525 ml steril vízben. Az oldat pJ-ját 7,4-re állítjuk 1 N nátrium-hidroxiddal, 10 mg liofilezett scu-PA-t adunk hozzá. Az elegyet addig keveqük, amíg tiszta oldatot kapunk. Az oldatot 0,22 pm pőrusméretű membránon átszűrve sterilezzük és ampullákba töltjük.
Aktív adalékként scu-PA-mutánsokat tartalmazó gyógyászati készítményeket a 27. és 28. példákban leírtakkal analóg módon állítunk elő.
A mikroorganizmusok letétbehelyezése A következő mikroorganizmus törzsek vannak letétbe helyezve a DSM-nél (Deutsche Sammlung von Mikroorganizmen) (* Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen ** Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig) 1 * Saccharomyces cerevisiae ΉΤ246: Április 15, 1987;DSM4084;
** Escherichia coli HB101/pCS16: Október 23, 1987; DSM4294;
** Escherichia co/iHBlÖl/p31R/SS-TPAA2: Október 23,1987; DSM4295;
** Escherichia coli HB101/pcUK176: Október 23, 1987; DSM4290;
** Escherichia coli JM109/pDP38: Február 19, 1988.DSM4414.
(A letétbe helyezés időpontja és a letéti sorszám van megadva.)

Claims (13)

  1. SZABADALMIIGÉNYPONTOK
    40 1. Eljárás humán egyláncű urokináz típusú plazminogén aktivátor vagy annak egy mutánsa előállítására, azzal jellemezve, hogy
    i) egy élesztő expressziós kontrollszekvenciát, ii) egy olyan DNS-darabOt, melyben az első DNS45 szekvencia szlgnálpeptidet kódol és a második DNSszekvencía az érett urokináz típusú plazminogén aktivátort vagy annak egy mutánsát kódolja, ahol az első DNS-szekvencia a második DNS-szekvencia 5’ vége előtt van azzal leolvasási fázisban, és a nevezett DNS50 darab az említett expressziós kontrollszekvencia transzkripciós szabályozása alatt áll, iii) valamint egy élesztőgén transzkripciós termínációsjelét tartalmazó DNS-szekvenciát tartalmazó hibrid vek55 torral transzformált élesztőtörzset megfelelő körülmények között tenyésztünk, és az említett urokináz típusú plazminogén áktívátort vagy annak mutánsait izoláljuk. (Elsőbbsége: 1987.04.15.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás humán egyláncű urokináz típusú, proteáz-rezisztens, plazminogén akti22
    HU 204 557 Β vátormutáns előállítására, azzal jellemezve, hogy a nevezett mutánst izoláljuk. (Elsőbbsége: 1987.04.15.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás humán egyláncú urokináz típusú, a glikozilezési helyen módosított, plazminogén aktivátormutáns előállítására, azzal jellemezve, 5 hogy a nevezett mutánst izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988. 04.14.)
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás az I általános képletű
    Ser Asn Glu Leu His Gin Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Thr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe
    Gly Gly Gin His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu
    Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met
    Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu Gin Gin
    Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gin Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp
    Cys Tyr Val Gin Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gin Glu Cys Met
    Val His Asp Cys Ala Asp Gly XI X2 Pro Ser Ser Pro Pro Glu
    Glu Leu Lys Phe Gin Cys Gly Gin Lys Thr Leu Arg Pro Y1 Y2
    Y3 Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gin Pro Trp
    Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr
    Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala
    Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val
    Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gin Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala
    Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg
    Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gin Pro Ser Arg Thr Ile Gin Thr
    Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gin Phe Gly Thr Ser
    Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Z1 Ser Z2 Asp Tyr Leu
    Tyr Pro Glu Gin Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gin Gin Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gin Trp Lys Thr Asp Ser Cys
    Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gin Gly Arg
    Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu
    Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro
    Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu, ahol Xi és X2 egymástól függetlenül jelent Lys-t egy bázikus aminosavtól eltérő aminosavat vagy egy kémiai kötést, Yi jelentése Arg, egy bázikus aminosavtól eltérő aminosav vagy kémiai kötés, Y2 jelentése Phe, egy savas aminosav vagy kémiai kötés, Y3 jelentése Lys, 40 egy báziskus aminosavtól eltérő aminosav vagy kémiai kötés, Zi jelentése élesztőspecifikusan glikozilezett Asn vagy más aminosav, jelentése pedig Thr, vagy bármely más, Ser-tői eltérő aminosavat jelent, plazminogén aktivátor előállítására, azzal jellemezve, hogy a nevezett 45 plazminogén aktivátort izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988.
    04.14.)
  5. 5. Eljárás a 4. igénypont szerinti I általános képletű, ahol Xi jelentése Lys, Gly vagy Ser, X2 jelentése Lys, Yj jelentése Arg, Y2 jelentése Phe, Asp vagy Glu, Y3 jelen- 50 tése Lys, Zi jelentése élesztőspecifikusan glikozilezett Asn vagy Gin és Z2 jelentése Thr, plazminogén aktivátor előállítására, azzal jellemezve, hogy a nevezett plazminogén aktivátort izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988.
    04.14.) 55
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás plazminogén aktivátor előállítására, mely a természetes emberi egyláncú urokináz típusú plazminogén aktivátor aminosavsorrendjével rendelkezik, és amelyben a 302-es Asn élesztőspecifikusan glikozilezve van, azzal jellemezve, hogy 60 a nevezett plazminogén aktivátort izoláljuk. (Elsőbbsége: 1987.04.15.)
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás scu-PA, (Gly 135)scu-PA, (Serl35)-scu-PA, (Aspl57)-scu-PA, (Serl35, Aspl57)-scu-PA és (Glyl35, Aspl57)-scu-PA, amelyben az Asn302 élesztőspecifikusan glikozilezve van, vagy a (Gln302)-scu-PA, (Glyl35, Aspl57,Gln302)-scuPA és (Serl35, Aspl57, Gln302)-scu-PA plazminogén aktivátor előállítására, azzal jellemezve, hogy a nevezett plazminogén aktivátorok valamelyikét izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988.04.14.)
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztőtörzsként egy Saccharomyces cerevisiae törzset használunk. (Elsőbbsége: 1987.04.15.)
  9. 9. Eljárás élesztő hibrid vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely élesztővektorba
    i) egy élesztő expressziós kontrollszekvenciát, ii) egy olyan DNS-darabot, melyben az első DNSszekvencia szignálpeptidet kódol és a második DNSszekvencia érett urokináz típusú plazminogén aktivátort vagy annak egy mutánsát kódolja, ahol az első DNSszekvencia a második DNS-szekvencia 5’ vége előtt van azzal leolvasási fázisban, és a DNS-darab az említett expressziós kontrollszekvencia transzkripciós szabályozása alatt áll, iii) valamint egy harmadik, egy élesztőgén transzkripciós terminációs jelét tartalmazó hordozó DNS-szekvenciát építünk be. (Elsőbbsége: 1987.04.15.)
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás élesztő hibrid vek- 5 tor előállítására, azzal jellemezve, hogy a hibrid-vektorba élesztő PHOS vagy G&PDZf-promotort építünk be. (Elsőbbsége: 1987.04.15.)
  11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás élesztő hibrid vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a hibrid vektorba az élesztő PHOS génből, az élesztő-invertáz génből
    HU 204 557 B vagy a humán urokinázgénból származó szignálszakaszt építünk be. (Elsőbbsége. 1987.04.15.)
  12. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás élesztő hibrid vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a hibrid vektorba az élesztő PHOS génből származó transzkripciós terminációs jelet építünk be. (Elsőbbsége; 1987.04.15.)
  13. 13. Eljárás transzformáit élesztőgazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy élesztőgazdasejtet a 9-12, igénypontok bánnelyike szerinti hibrid vektorral transz10 formálunk. (Elsőbbsége: 1987.04.15.)
HU881922A 1987-04-15 1988-04-14 Process for producing uroquinase-type plasminogen activators HU204557B (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB878709081A GB8709081D0 (en) 1987-04-15 1987-04-15 Production of proteins
GB878714059A GB8714059D0 (en) 1987-04-15 1987-06-16 Production of proteins
IE329987A IE81116B1 (en) 1986-12-05 1987-12-04 Hybrid plasminogen activators

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT46360A HUT46360A (en) 1988-10-28
HU204557B true HU204557B (en) 1992-01-28

Family

ID=27263391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU881922A HU204557B (en) 1987-04-15 1988-04-14 Process for producing uroquinase-type plasminogen activators

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5175105A (hu)
EP (1) EP0288435B1 (hu)
JP (1) JP2894696B2 (hu)
AT (1) ATE102994T1 (hu)
AU (1) AU604305B2 (hu)
CA (1) CA1341306C (hu)
DD (1) DD274053A5 (hu)
DE (1) DE3888386T2 (hu)
DK (1) DK203588A (hu)
ES (1) ES2061719T3 (hu)
FI (1) FI98219C (hu)
HU (1) HU204557B (hu)
IL (1) IL86058A (hu)
MX (1) MX168507B (hu)
MY (1) MY103358A (hu)
NO (1) NO179046C (hu)
NZ (1) NZ224243A (hu)
PT (1) PT87230B (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2634495B1 (fr) * 1988-07-01 1990-10-26 Chambon Pierre Procede de preparation d'une proteine par des levures utilisant un systeme inductible, vecteurs et souches transformees correspondantes
DE69034013T2 (de) * 1989-03-06 2003-07-31 Univ Texas Serpin-resistenter T-PA; Mutanten; Gene
US5866413A (en) * 1989-03-06 1999-02-02 Board Of Regents Of The University Of Texas System Pai-1 mutants
EP0387380A1 (en) * 1989-03-17 1990-09-19 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Mutants of urinary plasminogen activator, their production and use
US5268273A (en) * 1990-12-14 1993-12-07 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same
GB2256197B (en) * 1991-05-31 1995-11-22 Ciba Geigy Ag Yeast as host for expression of heterologous glycosyl transferase enzymes
SE9201544L (sv) * 1991-05-31 1992-12-01 Ciba Geigy Ag Saett att framstaella glykosyltransferaser
JPH0823995A (ja) * 1994-07-14 1996-01-30 Green Cross Corp:The 宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の製造方法
US20030113271A1 (en) * 1997-01-29 2003-06-19 University Technology Corporation Formulations for pulmonary delivery
US6207442B1 (en) * 1997-10-16 2001-03-27 Zymogenetics, Inc. Plasmid construction by homologous recombination

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4245051A (en) * 1978-03-30 1981-01-13 Rockefeller University Human serum plasminogen activator
US4558010A (en) * 1980-04-03 1985-12-10 Abbott Laboratories Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator and method of making plasminogen activator protein therefrom
US4370417A (en) * 1980-04-03 1983-01-25 Abbott Laboratories Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator
NL8003402A (nl) * 1980-06-11 1982-01-04 Leuven Res & Dev Vzw Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking.
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
FI88932C (fi) * 1982-04-15 1993-07-26 Genentech Inc Framstaellning av funktionellt maenskligt urokinasprotein
AR241654A1 (es) * 1982-05-05 1992-10-30 Genentech Inc Procedimiento para producir activador de plasminogeno de tejido humano.
NZ207926A (en) * 1983-04-25 1988-04-29 Genentech Inc Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast
US5010003A (en) * 1983-04-25 1991-04-23 Genentech, Inc. Use of yeast homologous signals to secrete heterologous proteins
EP0154272B1 (en) * 1984-02-27 1992-01-08 Green Cross Corporation Production of human urokinase
JPS60256385A (ja) * 1984-05-18 1985-12-18 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 酵母においてヘテロローガスポリペプチドを効率よく発現するための方法、ベクターおよび形質転換体
JPS60248181A (ja) * 1984-05-23 1985-12-07 Shiseido Co Ltd 酵母発現ベクタ−
EP0174835A1 (en) * 1984-09-11 1986-03-19 The Upjohn Company Human tissue plasminogen activator and recombinant DNA compounds
WO1986004351A1 (en) * 1985-01-25 1986-07-31 Sagami Chemical Research Center Stabilized human prourokinase
US5219569A (en) * 1985-04-22 1993-06-15 Genentech, Inc. Protease resistant urokinase
FR2581652B1 (fr) * 1985-04-22 1989-12-22 Genentech Inc Nouveaux mutants de l'activateur tissulaire du plasminogene humain
FI100106B (fi) * 1986-12-05 1997-09-30 Novartis Ag Menetelmä plasminogeenin yksisäikeisen yhdistelmäaktivaattorin valmist amiseksi
DE19736137C1 (de) * 1997-08-20 1998-10-01 Daimler Benz Ag Verfahren zum Starten eines Verbrennungsmotors

Also Published As

Publication number Publication date
NO179046B (no) 1996-04-15
FI98219C (fi) 1997-05-12
FI881713A0 (fi) 1988-04-13
MX168507B (es) 1993-05-27
EP0288435B1 (en) 1994-03-16
DE3888386T2 (de) 1994-07-14
NO179046C (no) 1996-07-24
JPS63296689A (ja) 1988-12-02
EP0288435A1 (en) 1988-10-26
CA1341306C (en) 2001-10-23
FI98219B (fi) 1997-01-31
IL86058A0 (en) 1988-09-30
FI881713A (fi) 1988-10-16
NZ224243A (en) 1991-02-26
DK203588D0 (da) 1988-04-14
DD274053A5 (de) 1989-12-06
DE3888386D1 (de) 1994-04-21
PT87230B (pt) 1992-08-31
ATE102994T1 (de) 1994-04-15
ES2061719T3 (es) 1994-12-16
JP2894696B2 (ja) 1999-05-24
DK203588A (da) 1988-10-16
IL86058A (en) 1993-07-08
NO881615D0 (no) 1988-04-14
AU1462688A (en) 1988-10-20
AU604305B2 (en) 1990-12-13
MY103358A (en) 1993-06-30
NO881615L (no) 1988-10-17
US5175105A (en) 1992-12-29
HUT46360A (en) 1988-10-28
PT87230A (pt) 1988-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0225286B1 (en) Modified fibrinolytic agents
KR930002889B1 (ko) 효모에 의한 조직 플라스미노겐 활성화제의 제조방법
RU2069694C1 (ru) Способ получения прореннина, способ получения штамма дрожжей - продуцента прореннина, способ получения рекомбинантной плазмидной днк рхх-33, способ получения рекомбинантной плазмидной днк рхх-22, способ получения рекомбинантной плазмидной нк рхх-11
JP2610783B2 (ja) ポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およびそれを含有するベクター
EP0213593B1 (en) Repressible yeast promoters
HU204097B (en) Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species
EP0225633A2 (en) Production of thrombin inhibitors
JP2645237B2 (ja) ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータをコードする遺伝子
HU204557B (en) Process for producing uroquinase-type plasminogen activators
KR970001564B1 (ko) 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체
IE881129L (en) Process for the production of proteins
US5580559A (en) Hybrid plasminogen activator
EP0489201A1 (en) Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant DNA and transformed microorganisms

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: NOVARTIS AG, CH

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee