HU202586B - Process for producing proteaze-resistant uroquinaze and pharmaceutical composition containing them - Google Patents

Description

Az urokináz (E. C. 3. 4. 21. 31.) egy szerin proteáz, amely a plazminogént plazminná aktiválja. A protein számos szövetben szintetizálódik, beleértve a belhámot (endotherium) és a vesét, és nyomnyi mennyiségben a vizeletben ürül. A tisztított urokináz két aktív formában létezik, egy nagy molekulatömegű formában (HŰK, körülbelül 50 kilodalton) és egy kis molekulatömegű formában (LUK, körülbelül 30 KD). Mindkét humán forma teljes aminosav szekvenciája meghatározásra került (Gunzler, W. A. és mtsai: The primary structure of high molecular mass urokinase from humán urine: The complete amino acid sequence of the A chain. „HoppeSeyler’s Z. Physiol. Chem. Bd.” 363:1155-1165 1982; Stcffens, G. J. és mtsai: The complete amino acid sequence of low molecular mass urokinase from humán urine. „Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. Bd.” 363: 1043-1058 1982; 92 182 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentés). A LUK-ról kimutatták, hogy a HUK-ból származik egy a lizin 135 utáni kötésproteolitikus bontásával, ez felszabadítja a HŰK első 135 aminosavat (Gunzler, W. A. és mtsai: The primary structure of high molecular mass urokinase from humán urine: The complexe amino acid sequence of the A chain. „Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. Bd.” 363: 1155-1165 1982). Szakmai körökben elterjedt vélemény szerint a HUK-ot vagy LUK-otproteolitikusan aktív formában kell hozni egy egyes szálú, prourokináznak is nevezett prekurzor lizin 158 és izoleucin 159 közötti proteolitikus hidrolízisével ahhoz, hogy a kettős szálú aktivált formához jussunk (amely vagy a HUK-nak vagy a LUK-nak felel meg továbbra is). Az ebből a hidrolitikus kezelésből származó proteolitikusan aktív urokináz speciesek két olyan aminosavláncot tartalmaznak, amelyeket egyetlen dtszulfid kötés kapcsol össze egymással. Az aktivációs kapcsolással keletkező két lánc közül az egyiket A-val vagy A_rgyel jelöljük (attól függően, hogy HUK-ról vagy LUK-ról van szó), míg a másik lánc a B lánc, amely a molekula proteáz tartományát tartalmazza.

Az urokináz hatékony trombolitikus reagensnek bizonyult Mivel azonban a természetben csak nyomnyi mennyiségben termelődik, az enzim előállításának költségei igen magasak ahhoz, hogy hatékony alkalmazására lehessen gondolni. Az urokinázt rekombináns DNS technikával is szintetizálták és ismert urokinázt kódoló DNS, valamint az alkalmas vektorok és gazdamikroorganizmusok (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés; Heyneker H. et al.: Functional Expression oí the humán urokinase gene in Escherichia coli in „Genetics of Industrial Micrcorganisms, 1982, Proceedings of the IVth International Symposium” K. IKeda et. al. Eds., 214-221 1983).

Mint már említettük, feltételezték, hogy a plazminogén aktivátorok proteolitikusan inaktív zimogének formájában léteznek, amelyeket proteolízissel „aktiválni” kell mielőtt az enzim a plazminogénre hatna, hogy beindítsa a fibrinolitikus kaszkádot (Wun, T. C. et al. A Proenzyme Form of Humán Urokinase, „Jorunal of Biological Chemistry” 257: 7262-7268 1982; Nielsen, L. S. et al. Purification of Zymogen to Plasminogen Activator from Humán Glioblastoma cclls by Affinity Chromatography with Monoclonal Antibody. „Biochemistry” 21:6410-6415 1982). Míg megfigyelték, hogy az urokináz egyes láncú proenzim erős aktivitást mutat a zimografikus és fibrinolitikus folyamatokban (Wun. T. C. et al. A Proenzyme Form of Humán Urokinase.

Journal of Biological Chemistry” 257: 7262-7268 1982; 4 381 346 sz. USA-beli szabadalmi leírás), az a tény, hogy a proenzim csak kis aktivitást mutat alacsony molekulatömegű szintetikus polipeptideken, arra a következtetésre vezetett, hogy a proenzim készítményekben található szennyező aktív (kettős láncú) urokináz nyomok vagy a fibrin lemez vizsgálatokban használt plazminogénben található plazmin nyomok a felelősek a prourokináz fibrinolitikus aktivitásáért (Wun, T. C. et al. A Proenzyme Form of Humán Urokinase. „Journal of Biological Chemistry” 257; 7262-7268 1982). Ebből viszont arra a következtetésre lehet jutni, hogy az egyes szálú urokinázt kettős láncú formában kell hozni annak érdekében, hogy képes legyen a plazminogén hasítására, és a fibrinolízis in vivő elindítására.

Az urokináz szerepe a vérrögök feloldásában in vivő meglehetősen bonyolult. A prourokinázról feltételezik, hogy a plazmán belül egy inhibitortal lép kölcsönhatásba. Úgy gondolják, hogy a fibrin távolítja el ezt az inhibitort, miután a prourokináz felszabadul a plazminogén hatás céljára [Zamarron et al. Competitive inhibition by Humán Plasma of the Activation of Plasminogen by Pro-Urokinase in „Thrombosis and Haemostasis” 54 (1): abs. 604, pp 102, July 14, 1985]. Nem teljesen világos, hogy vajon önmagában az inhibitor eltávolítása elegendő-e a plazminogén hidrolízis kiváltásához, vagy az inhibitor eltávolítása egyszerűen kedvez a szokásos kettős láncú formájú urokináz kialakításának. Nem ismert, hogy az urokináznak mely része kötődik az inhibitorhoz, és ugyancsak ismeretlen a kötés mechanizmusa. Egy további bonyolult hipotézis az urokináznak egy fibrin-megkötő képességet tulajdonít a HŰK species-hcz, különösen a 49 és 132 helyek közötti tartományhoz (Heyneker, H. et al. Functional Expression of the humán urokinase gene in Escherichia coli in „Genetics of Industrial Microorganisms, 1982, Proceedings of the IVth International Symposium” K. Ikeda et al Eds., pp 214-221 1983). E hipotézis viszonya az inhibitor posztulátumhoz, és ezek egymáshoz viszonyított értéke egyelőre ismeretlen.

A kettős láncú urokináz vérrögök kezelésére való felhasználásának egyik komoly akadálya, hogy a kettős láncú formát nyilvánvalóan nem köti meg a prourokináz feltételezett inhibitora. Ha a kettős láncú urokinázt perifériásán adagoljuk, ennek következtében az képes lesz a plazminogén aktiválására a keringési rendszer bármely pontján, ami nem kívánatos mellékhatásokhoz vezet. A kettős láncú urokináz, amely az egyes láncú urokináz plazmin hidrolízisével keletkezik a vérrög helyén, ugyanezekkel a negatív mellékhatásokkal jut be a keringési rendszerbe, különösen a szisztemikus fibrinogenolízis cs az a2 anti-plazmin kiürülése említendő. Ezek a mellékhatások akadályozzák a megfelelő trombogenezist in vivő. Szükség van tehát egy javított formájú egyes láncú urokinázra, amely (a) képes akár a fibrin akár a feltételezett inhibitor megkötésére, azaz amely végül lényegében ugyanúgy funkcionál, mint a natív prourokináz a vérrög keletkezésének helyén mutatott plazminogén aktiváció szempontjából, (b) amely ellenáll a proteolitikus emésztésnek, különösen a kettős láncú formában történő átalakításnak, és (c) amely minimális vagy semmi antigén hatást nem mutat a kezelt betegekben.

Mindezeket és egyéb a területen jártas szakember

HU 202 586 Β számára fontos feltételeket is kielégít egy olyan készítmény, amely proteáz-rezisztens egyes láncú urokinázt tartalmaz. A proteáz-rezisztens egyes láncú urokinázt úgy állítjuk elő, hogy az urokinázt egy olyan szenei kezeljük, amely komplexet alkot az urokinázzal, vagy az egyes láncú urokinázt kovalensen módosítjuk a proteolízis helyein úgy, hogy az urokináz ezeken a helyeken a továbbiakban nem lesz proteolitikusan hidrolizálható. Ezek a helyek felölelik Arg_is« és a LySi» közötti, és előnyösen a Lys^j és a Lys₁₃₆ közötti helyeket. A kovalens módosításokat úgy hajtjuk végre, hogy a natív urokinázt derivatizáló reagensekkel reagáltatjuk, de alkalmazhatjuk olyan mutánsok rekombináns szintézisét is, amelyek a target helyeken helyspecifikus aminosav szubsztitúciókat, inszerciókat vagy deléciőkat tartalmaznak. A komplexképző szerek, így az ellenanyagok a target helyeken vagy azok mellett úgy kapcsolódnak az urokinázhoz, hogy megakadályozzák vagy gátolják a proteáz hozzáférését ezekhez a helyekhez. Az urokináz készítmények úgy készülnek, hogy csökkentsék vagy teljesen kiküszöböljék a proteázok képességét a target helyeken történő hasításra. Ezek a helyspecifikus mutációk megakadályozzák az egyes szálú urokináz kettős szálú urakinázzá alakulását plazminok, bakteriális proteázok, tripszin vagy más proteázok hatására, ezáltal in vivő csökkentik a nem kívánatos mellékreakciók fellépését, anélkül, hogy csökkentenék a mutáns urokináz speciesek képességét arra, hogy egyébként teljes mértékben ugyanúgy viselkedjék, mint a natív egyes szálú urokináz. Kiemeljük, hogy nincs szükség az egyes szálú urokináz in vivő kettős szálú urokinázzá történő átalakítására ahhoz, hogy a plazminogént aktiváljuk. A találmány szerinti mutánsok emberben lényegében nem immunogének, fibrin-specifikusak maradnak és képesek arra, hogy plazminogént anélkül aktiválják, hogy kettős szálú urikonázt juttatnának a szervezetbe.

Az 1. ábrán a humán urikonáz aminosav és nukleotid szekvenciáját mutatjuk be. A felső vonal az aminosav szekvenciát, az alatta lévő vonal a nukleotid szekvenciát mutatja. Ugyancsak feltüntettük a nem transziáit 5’ és 3’tartományokat is.

Az egyes láncú urikonázt olyan proteinként definiáljuk, amelynek aminosav szekvenciája megegyezik az lAés IB ábrán bemutatott a humán urikonáz aminosav szekvenciájával nagy molekulatömegő (kb. 54 000 dalion, NHj-Ser, Gln₂ Gluj-terminus) vagy kis molekulatömegű (kb. 33 000 dalton, NHrLySne-PromSer^-terminus) speciesében, de a definíció kiterjed azokra az aminosav szekvencia variációkra és származékokra is, beleértve a természetes alléleket, ahol a molekula olyan egyetlen aminosav láncból áll, amely nem hasad az Arg_15í-Lys₁₅₈ proteolitikus hasítási helyeken (a továbbiakban „lánckonvetziós helyek”). A proteáz-rezisztens egyes láncú urikonáz olyan urikonáz származék, amely egy aminosav láncból áll, amely kevésbé hajlamos proetolitikus hidrolízisre, mint a megfelelő át nem alakított, természetes formájú urikonáz. Különösen, a proteáz-rezisztens urikonáz nem alakul át kettős láncú urikonázzá a konverziós helyen lejátszódó proteolízis hatására. Ezt tipikusan úgy határozzuk meg, hogy a proteáz-rezisztensnek vélt urikonáz származékot humán plazminnal inkubáljuk, és az így kezelt származék aktivitását egy kromogén szubsztráton, így például S2444-en vizsgáljuk a natív egyes láncú, de egyébként azonos módon kezelt és vizsgált urikonáz aktivitásával összehasonlítva. Ha a kiszemelt urikonáz száramzék átalakulása plazmin hatására kettős láncú speciessé (amit a S-2444 hidrolitikus aktivitásának megnövekedése jelez) kevesebb mint 50%-a, rendszerint kevesebb mint 10%-a az összehasonlítóként használt natív urikonáz kettős láncú speciessé alakulásának, akkor a kiszemelt származékot proteolízis-rezisztensnek tekintjük. Az eljárást részletesebben a példákban szemléltetjük.

A proteolízis-rezisztens egyes szálú urikonázok körébe tartoznak az olyan egyes szálú urikonáz-származékok is, amelyek lényegében képtelenek a proteolitikus hasadásra a 156-158 és 135-136 helyeken (a továbbiakban „LUK” helyen). Ezek olyan származékok, amelyekben a HUK-nak LUK-ká alakulása proteolízisrezisztens urikonázzal kisebb sebességgel megy végbe, mint természetes egyes szálú urikonázzal. Ha a szóban forgó urikonáz származék a tripszin hatására átalakul LUK formába (gélelektroforézissel, gélszűréssel, immunvizsgálattal vagy hasonlókkal meghatározva) kevesebb mint kb. 50%-a, rendszerint kevesebb mint kb. 10%-a az összehasonlítható urikonáz species LUK-ká alakulási sebességének, a szóban forgó urikonáz származékot proteolízis-rezisztensnek nevezzük.

A proteolízis rezisztencia definiálható más olyan protázokkal is, melyek jelenléte várható az egyes szálú urikonáz környezetében. Az egyes szálú urikonáz rekombináns szintézisében gazdaszervezetként alkalmazott mikroorganizmusok olyan proteázokat tartalmaznak, így például endo- és exopeptidázokat és bizonyos észterázokat vagy amidázokat, amelyek proteolitikus aktivitással rendelkeznek. E proteázok némelyik hasítja az egyes szálú urikonázt, és különösen nehezen kezelhető a tisztítás során, amikor a rekombináns urikonáz oldható, és e proteázok megnövekedett koncentrációjának lehet kitéve. Korábban ezt a problémát úgy próbáltak megoldani, hogy proteolízis inhibitorokat, például egy mólos guanidin HCl-t alkalmaztak a tisztításhoz használt oldószerekben (92182 sz. európai szabadalmi bejelentés). Ezen felül egy egyes szálú urikonázként azonosított enzimet izoláltak a kétszálas alakba való átalakulás megelőzésére alkalmas, gyors elválasztási módszerekkel (4381 346 sz. USA-beli szabadalmi leírás).

A proteáz-rezisztens egyes szálú urikonáz előállítása az irodalomból jól ismert módszerekkel történik. A lánc konverziós helyet, különösen a LUK helyet vagy kovalensen módosítják úgy, hogy kevésbé legyen hajlamos proteolitikus hasadásra, vagy egy olyan reagenssel kombinálják, amely gátolja a proteázoknak az adott helyekre jutását.

A proteázok hozzáférését akadályozó reagensek közé tartoznak például a monoklonális antitestek vagy azok fragmentumai, például a fab fragmentumok, amelyek a kérdéses helyekhez vagy szomszédos epitópokhoz kapcsolódnak úgy, hogy az adott helyekhez kötődő ellenanyag sztérikusan gátolja a proteázok hozzáférését a helyhez. Ebben az esetben az urikonáz lehet akár natív, akár mutáns, de mindenképpen nem kovalensen kötődik egy olyan másik molekulához, amely biztosítja a proteáz-rezisztenciát. Az alkalmas ellenanyagok vagy más kötődő proteinek könnyen azonosíthatók úgy, hogy egy állatot, például egeret Freund-féle teljes adjuvánsban oldott egyes szálú urikonázzal szemben immu3

HU 202 586 Β nizálunk, az immunizált állatnak elkülönítjük a lép sejtjeit, a sejteket fuzionálva hibridomákat hozunk létre, és megvizsgáljuk a fúziós tenyészet felülúszójának antiprotcolitikus aktivitását A szkrinelést végezhetjük például úgy, hogy a szóban forgó ellenanyagot egyes szálú 5 urikonázzal inkubáljuk, majd az inkubálástplazminnal, tripszinnel vagy bármely más szóbajöhető proteázzal folytatjuk. Ezután proteáz inhibitort adunk hozzá, hogy megállítsuk a reakciót, és a fragmentumokat gél elektroforézissel elkülönítjük. Összehasonlítva az elektrofo- 10 rézis gélen végzett redukcióval illetve anélkül kapott eredményeket megállapíthatjuk, hogy az ellenanyag megvédte-e az egyes szálú urikonázt, azaz egy az egyes szálú urikonázból álló sáv jelenléte a redukáló gélen szemléltetni fogja az egyes szálú urikonáznál tapasztalt 15 védettség mértékét

Egy másik megoldás szerint az egyes szálú urikonázt a konverziós helyen, előnyösen a LUK helyen kovalensen módosítják úgy, hogy csökkentsék a hajlamot a proteolitikus hasadásra. A kovalens módosítás általá- 20 bán kétféle módon történhet Az egyik megoldás szerint az egyes szálú urikonázt egy származékképzésre alkalmas vegyűlettel reagáltatjuk mindaddig, míg egy jelentős populációból legalább egynél a lánckonverziós vagy LUK helyén lévő urikonáz és egy szerves moleku- 25 la kovalensen kapcsolódik, vagy a szerves molekula úgy kapcsolódik az urikonázhoz, hogy a LUK vagy konverziós helyet szférikusán gátolja. A reakciókörülmények egyszerű mátrix kísérletben határozhatók meg, amelyben az urikonáz plazminogén aktivitásának meg- 30 őrzését vizsgáljuk a proteolitikus rezisztenciával összehasonlítva. Alkalmas reagnesek olyan monofunkcionális vegyületek, amelyek az alkalmazott körülmények között maximálisan szelektívek az arginin oldalláncra, és előnyösen a lizin maradékokra, beleértve az 1,2-cik- 35 lohexán-diont, az ecetsav-anhidridet és a fenil-glioxált.

A nem kívánatos származékok keletkezése az urikonáz aktív helyein és a „kringle” szerkezet kialakulása minimalizálható, ha a reagáltatást sztöchimetrikus feleslegben lévő plazminogénnel (vagy egyéb szubsztráttal 40 vagy szubsztrált analóggal) és fibrinnel vagy benzamidinnel végezzük. Miután a reagens monofunkciós, térhálósodásától nem kell tartani.

A találmány szerinti, proteáz-rezisztens egyes szálú urikonáz előállításának előnyös módja azonban az, hogy rekombináns módszerekkel változást hozunk létre az aminosav szekvenciában a lánc konverziós és kívánt esetben LUK helyeken. Az egyes szálú urikonázt kódoló DNS szekvencia ismert, és imsertek azok a módszerek is, amelyekkel rekombináns gazdasejtekben expresszióval létrehozható (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés; Heyneker H. et al. Functional Expression of the humán urokinase gene in Escherichia coli in „Genetics of Industrial Microorganisms, 1982, Proceedingsof the IVth International Symposium” K. Ikeda et al Eds. 214-221 1983). Önmagukban ismertek azok a módszerek is, amelyekkel olyan mutációk hozhatók létre ebben a DNS-ben, amelyek proteolízis-rezisztens aminosavszekvencia változatokként fejeződnek ki. Például, restrikciós endonukleázokkal végzett fokozatos emésztéssel a lánc konverziós és LUK helyeket (szükség esetén pedig ezekkel szomszédos tartományokat) kimetszük az urokinázt kódoló DNS-böl (a metszést a proteolízis helyeket kódoló DNS mellett végezve, melyet DNS szekvencia analízissel határozunk meg). Egy megfelelően kimetszett DNS-t elkülönítünk (gél szűréssel meghatározva), egy a kívánt aminosav szekvenciát és szomszédos régiókat tartalmazó oligonukleotidot szintetizálunk, ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel emésztjük, amelyeket a nem kívánt fragmentum kimetszésére is használtunk, és ezáltal kohéziós végeket hozunk létre, és a szintetikus DNS-t az egyes szálú urokináz struktur gén maradékához ligáljuk. A LUK helyet kódoló DNS-t például a pUK54trp207-l Mstl-el és Ball-el végzett részleges emésztéssel metsszük ki, kinyerjük a vektor fragmentumot és újból felépítjük a vektort úgy, hogy ezt a fragmentumot egy a kívánt szekvenciával rendelkező szintetikus oligonukleotiddal ligáljuk. Ennél a megvalósítási módnál humán urokinázt kódoló DNS-t (Lys₁₃₅—>Δ) úgy hozunk létre, hogy az MdtI és Ball terminálisoknál egy a következő szekvenciával rendelkező oligonukleotidot építünk be:

p GCAGATGGAAAGCCCTCCTCTCCTCCAGAAGAATTAAAATTTCAGTGTGG CGTCTACCTTTCGGGAGGAGAGGAGGTCTTCTTAATTTTAAAGTCACACCP 530 582 (A szekvencia alatt megadott számok megfelelnek az 1. ábrán feltüntetett számoknak.)

Hasonlóan, a lánc konverziós helyeket kódoló DNSt például úgy metsszük ki, hogy az urokináz DNS-t Ball 50 és EcoRI enzimekkel részlegesen emésztjük, az előbb megadott módon, majd a felnyitott génbe olyan oligonukleotidot ligálunk, amely a kívánt aminosav maradékokat kódoló alap szekvenciával rendelkezik. Illusztrációképpen feltüntetjük egy olyan oligonukleotid szekvenciáját, amely a humán urokináz (Arg₁₅₆-»AHis; Lys,₅₈—>Δ) létrehozásában alkalmazható:

-HisPhellep CCAAAAGACTCTGAGGCCCCACTTTATTATTGGGGGAG

GGTTTTCTGAGACTCCGGGGTGAAATAATAACCCCCTCTTAAp

583 627

Más variáns szekvenciákat úgy hozhatunk létre, hogy analóg módon megfelelő oligonukleotidokat szín- 60 tetizálunk és építünk be.

Általában azonban egyszerűbb az urokináz DNS mutációval történő módosítása, az M13 fág mutagenezis módszer felhasználásával [Adelman, J. et al. In Vitro Deletional Mutagenesis fór Bacterial Production of the 20 000-Dalton Form of Humán Pituitary Growth Hormoné. „DNA” 2(3): 183-193 1983]. Ez a módszer önmagában ismert.

Az aminosav szekvencia mutánsokat az jellemzi, hogy a proteáz helyeken található maradékokat deléció-4Ί

HU 202 586 Β val eltávolítjuk vagy helyettesítjük (arginin és/vagy lizin), vagy olyan maradékokat inszertáltunk, amelyek a bázis maradékokat lényegében képtelenné teszik a proteolitikus hasadásban való {észvételre. Az előnyös muUrokináz maradékok tációkat az alábbi táblázatban adjuk meg. A táblázat adatait azonban csak szemléltednek szánjuk, semmiképpen nem a felhasználható mutációk kimerítő felsorolásának.

Mutációs történés (v = vagy)

1. LysIJS	Δ; v. LySi35->His, Ser v. iyr
2. Lysue	Δ; v. Lys136-»Pro
	His		His
3. Argu6Pheij7LySi5g	Δ; v. Arg156Phe157Lys,sí(-> Ser	Phei57	Ser
	Tyr		Tyr
	Glu		Glu
	v.		V.
	Gly	156	Gly
	His,
4. Phe1S7Lyslsg	Δ; v. Phe157LySi58-> Phe. ,57 Ser,
	Tyr,
	Gly, y
	Gly	158
5. LySjs*	Δ; v. Lysug->His, Ser, Tyr v. Gly
6. LySmjglleuj	-»Lysi5gProIlei59

Ha Lys_13S változatlan vagy aigininné mutált a Lysue-t prolinná kell mutálni vagy delécióval el kell távolítani. Ha viszont a Lysug változatlan vagy arginné 30 mutált, prolint kell inszertálni a Lys_isg és az Ilei₅₉ helyek közé vagy az ne_1J9-et prolinnal kell helyettesíteni.

A legelőnyösebb változatok a deléciós mutánsok, különösen a Lysus, Argi» és Lys_l5g melyeket szorosan követ a felsorolt három maradék hisztádil szubsztitúciója, 35 mert az ilyen mutánsok ellen legalábbis nagy valószínűséggel ellenanyagok termelődnek a betegek szervezetében. Legelőnyösebb a Lys₁₃₅ vagy Lys₁₃₆ és a Phe,j7Lys₁₃g egyidejű eltávolítása. Az így kapott mutáns előnye, hogy bár az Arg₁₃₆ után korlátozott proteolízis 40 fellép, amikor végbemegy a kettős szálú formához vezető proteolitikus átalakulás, a kapott molekula mindkét urokináz láncban ugyanazokkal a C és N terminusokkal rendelkezik, mint a kettős szálú urokináz (a prourokináz normál proteolízise in vivő felszabadítja a Phe 45 Lys dipeptidet). Ezen felül, ennél az előnyös mutánsnál a molekula HŰK formában marad.

A proteáz-rezisztens variánst kódoló nukleinsavat beépítjük egy expressziós vektorba, a vektorra] gazdasejtet transzformálunk, a transzformánst addig te- 50 nyésztjük, amíg a kívánt urokináz variáns felgyűlik a tenyészetben, miután a variánst elkülönítjük a tenyészetből. A rekombináns urokináz előállítása az irodalomból ismert módszerekkel történik (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés). Ezek mindegyike alkalmas 55 a kívánt variánsok létrehozására. A példákban ismertetett eljárás csak szemléltetésül szolgál, természetesen egyéb vektorok és gazdasejtek is kielégítő eredménnyel alkalmazhatók a kívánt variánsok előállítása során.

Állati szövettenyészet sejtjeinek gazdasejtként való 60 alkalmazását urokináz előállítására a 92 182 sz. EP szabadalmi bejelentés részletesen leírja. Ennek alapján a módosított fehérje kifejezése állati sejtekben ezzel teljesen analóg módon végrehajtható.

A rekombináns baktériumokban közvetlenül termelt 65 urokináz variáns (tehát amelynek a termelése szekréciós irányító nélkül folyik), intracelluláris, vízben oldhatatlan aggregátumok formájában rakódik le, amelyeket refrakciós anyagoknak („refractile bodies”) hívunk. A refrakciós anyagokat elkülönítjük a sejtmasszától, például a sejtfal törmeléktől és egyéb, hasonló anyagoktól. Ezt előnyösen centrifugálással, például szacharóz gradiens szeparálással végezzük. Ezután a refrakciós anyagokat egy protein denaturáló reagensben szolublizáljuk, amely lehet például 6 mólos guanidin-hidroklorid, a reagenst például dialízissel eltávolítjuk, és az urokináz variánst klasszikus technikákkal, például ioncserélő gyantán vagy géloszlopon tisztítjuk. Miután azonban az urokináz variáns proteáz-rezisztens, nincs szükség benzamidin-szefaróz felhasználására az egyes szálú és a kettős szálú urokináz elkülönítésére, és ugyancsak felesleges proteáz inhibitor (1 mól guanidin hidroklorid) vagy a tisztítási lépést követően gyors elkülönítési eljárások alkalmazása.

A proteáz-rezisztens urokinázt, akár rekombináns baktériumokban, élesztőkben vagy magasabbrendű eukariota sejtkultúrákban szintetizáltuk, akár a natív urokináz kovalens vagy adszorptív módosításával készült, olyan gyógyszerkészítmények formájában szereljük ki, amelyek alkalmasak a vérrögök feloldására a kezelt betegeknél. A korábban a natív urokinázzal kapcsolatban alkalmazott urokináz koncentrációk, adagolási módok és vivőanyagok egyaránt kielégítőek a találmány szerinti proteáz-rezisztens urokinázok esetében. Általában 10 000-75 000 NE/ml rezisztens urokinázt 5% glükóz vagy más izotoniás intravénás vivőanyaggal formulálunk, egyéb vivőanyagokkal, töltőanyagokkal és kívánt esetben stabilizátorokkal együtt A proteáz-rezisztens urokinázt intravénásán olyan sebességgel adagoljuk, amely elegendő az eldugult artéria vagy véna perfúziójához, szokásos technikákkal végzett megfigyelés szerint Az adagolási sebesség rendszerint nagyobb mint körülbelül 4000 Ne/kg/óra. Általában azon5

HU 202 586 Β bán az infúzió sebessége és az urokináz koncentrációja jelentősen változni fog, a választott urokináz származék aktivitásától, a beteg általános állapotától, például a vérrög kiterjedésétől és a beteg hemosztatikus állapotától, és az adagolás módjától (például koronáriás katéter vagy perifériás adagolás) függően. Az alkalmas urokináz koncentrációk és adagolási sebesség meghatározása a mindenkori gyakorló orvos feladata.

Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti urokináz speciesek esetében tapasztalt gyakorlatilag melléktünetmentesség nagyobb dózisok és adagolási sebességek alkalmazását teszi lehetővé, mint a korábban, a kettős szálú urokinázzal kapcsolatban megszokott értékek.

1. példa

A Lys₁₃₅ deléciós mutáns konstrukciója

Kiindulási plazmidként pUK54trp207*TX plazmidot használunk. Ez a plazmid a teljes HŰK gént kódoló DNS-t tartalmazza, E. coli trp promoter kontrollja alatt. Ez a plazmid azonos a pUK54trp207-l plazmiddal (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés), azzal az eltéréssel, hogy csak egy EcoRI helyet tartalmaz, a trp promoter 3’ végéhez közel és nem tartalmazza a pBR322 vektor-komponens Aval és PvuII helyei közötti 641 bp hosszúságú szakaszát, mert ezt delécióval eltávolították (úgynevezett „XAP” deléció) (Sutcliff, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 43: 77 1979).

ApUK54trp207-l*TX plazmid ismert eljárással készül, (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés), azzal az eltéréssel, hogy kiindulási plazmidként pHGH207-l helyett pHGH207-l*XAP-t használunk. A pHGH207l*XAPa pHGH207-l részleges emésztésével - a plazmid felnyitására -, a kohéziós végeknek a DNS polimeráz I Klenow fragmentumával végzett feltöltésével, a plazmid T4 ligázzal történő decirkularizálásával készült, majd a kapott plazmiddal E. colit transzformáltunk. Szelekcióval egy olyan plazmidot, a pHGH207l*-et választottunk ki, amelyben restrikciós enzim analízissel meghatározva csak a trp promoter 3’ végén lévő EcoRI hely maradt meg.

Az XAP deléció végrehajtása céljából a pHGH207l*-et Aval-gycl és PvuII-vel emésztjük, a nagy vektorfragmentumot kinyerjük, a kohézis végeket Klenow fragmentummal feltöltjük, a plazmid tompa végét T4 ligázzal ligáljuk, és a ligálási eleggyel E. colit transzformálunk. A pHGH207-l*XAP-t kinyerjük és ismert módon pUK54trp207*TX-et állítunk elő belőle.

A pUK54trp207-l*TX-et Pstl-el és BclI-gyel emésztjük és a körülbelül a 439-732 bázisokat felölelő fragmentumot kinyerjük. A kettős szálú M13mpl0-et (ekvivalens M13mpl8 fág a kereskedelemben a Bethesda Research Laboratories-től szerezhető be) Pstl-gyel és BamHI-gyel emésztünk, és a Pstl-Bcll urokináz DNS fragmentumhoz ligáljuk, ily módon M13mpl0UKl-et hozva létre. Az E. coli JM101 sejteket (ATCC 3387 6) az M13mpOUKl kettős szálú replikatív formájával (RF) transzformáljuk. Az egyes szálú és RF M13mpl0UKl-et a fertőzött E. coli JM101 sejtekből ismert módon izoláljuk. A Bell és BamHI kohéziós végeket alkot, így az M13mpl0 fág alkalmas az urokináz inszertummal történő recirkularizálásra. Az egyes szálú formált urokináz hely specifikus mutagenezisére használjuk, a Lys₁₃₆ helyen.

A szintetikus oligonukleotidot a szilárd fázisú fosz6 fotriészter módszerrel (Crea et al. „Proc. Nat Acad. Sci. USA” 75: 5765 1978) készítjük mutagenezis primerként történő felhasználásra. A Lys₁₃₆ deléciójához a következő prímért használjuk:

5’pGCAGATGGAAAACCCTCCTCTCCT 530 556

Ez az urokináznak az a része, amely a Lys₁₃₆-tan szomszédos szálat kódolja, azzal az eltéréssel, hogy a Lys_13ínak megfelelő AAG kodont eltávoh'tottuk.

A következőkben leírt eljárást használtuk egy a szintetikus primerek mutált szekvenciáját tartalmazó urokináz klón kialakítására. Ez az eljárás önmagában ismert [Adelman, J. et al. In Vitro Deletional Mutagenesis fór Bacterial Production of the 20 000-Dalton Form of Humán Pituitary Growth Hormoné „DNA” 2(3): 183193 1983].

ng szintetikus oligonukleotidot 30 percen át 37 ’C-on foszforilezünk, 10 μΐ olyan elegyben, amely 50 mmól Tris-HCl-t (pH 7,5), 10 mmól/1 MgCl₂-ot, 10 mmól/1 ditiotreitolt, 1 mmól/1 ATP-t, valamint 8 E T4 polinukleotid kinázt tartalmaz. A hidrolizációs próbaként történő felhasználásra 400 ng szintetikus oligonukleotidot a fenti módon foszforilezünk, azzal az eltéréssel, hogy az ATP helyett 60 mCi (³²p)-ATP-t (3000 Ci/mmól) használunk, amely körülbelül 50-60 x 10® cpm/400 ng 24mer-t eredményez. A heteropudle létrehozásához 100 ng egyes szálú M13mpOUKl-et 10 perc alatt 95 ’C-ra melegítünk, majd 30 perc alatt lassan szobahőmérsékletre hűtjük, 40 μΐ olyan elegyben, amely 10 mmól/1 Tris-HCl-t (pH 7,5), 10 mmól/1 MgCl₂-t, 1 mmól/1 ditiotreitolt és 10 ng foszforilezett prímért tartalmaz, 500 ng EcoRI-emésztett M13mpl0UKl nagy fragmentum mellett. A primer extenziót 10 μΐ olyan puffer hozzáadásával indítjuk, amely 50 mmól/1 Tris-HCl-t (ph 7,5), 10 mmól MgCl₂-t és 1 mmól ditiotreitolt, valamint 2 mmól/1 ATP-t tartalmaz, egyenként 0,25 mmól dGTP, dTTP, dCTP és dATP, 5 E E. coli DNS polimeráz I nagy fragmentum és 400 E T4 DNS ligáz mellett. Egy órás 12 ’C-on végzett kezelés után a reakcióelegyet E. coli JM101 sejtek transzformálására használjuk.

A transzformálást úgy végezzük, hogy 10 μΐ ligációs elegyet elkeverünk 200 μΐ kompetens JM101 sejttel, majd 30 percen át jégen és 5 percen át 37 ’C-on inkubálást végzünk. Ezután 55 ’C-on 3,5 ml 2YT fedő agart elkeverünk 300 μΐ telített JM101 sejttel, 10 μΐ IPTG-vel (200 mmól) és 50 μΐ Xgal-lal, majd a transzformált sejtek hozzáadása után az elegyet 9 cm átmérőjű, gyógyszer nélküli LB-t tartalmazó Petri-csészékbe helyezzük.

Két színtelen plaque-ot (B2 és G12) választunk ki és átvisszük egy 100 μΐ 2YT táptalajt tartalmazó mikrotiter edénybe. Az inokulált mikrotiter folyadékokat 15 cm átmérőjű LB agar lemezekre helyeztük, amelyeket 600 μΐ JM101 sejt 8 ml 2YT fedő agárral készített elegyével rétegzünk felül, és az egészet egy éjszakán át 37 ’C-on inkubáljuk. A keletkezett plaque-okat 1 percig tartó fizikai kontaktussal átvisszük egy nitrocellulóz lemezre. A nitrocellulóz lemezt 0,5 mól/1 nátrium-hidroxidot és 1,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó oldattal kezeljük 3 percig, majd kétszer, 15 percig 3 mól/1 nátrium-klorid és 0,5 mól/1 Tris-HCl-t (pH 7,5) tartalmazó oldattal, majd újabb 15 percig 2X SSC-vel mossuk. A prehibridizációs elegy 10 mmól/1 Tris-t (ph 7,5) 5 mmól/1 EDTA-t, 0,9 mól nátrium-kloridot, IX Den-611

HU 202 586 Β hardt-ot 0,5% NP40-et, 100 μπιόΐ/ΐ ATP-t, 1 mmól/1 nátrium-pirofoszfátot, 1 mmól/1 nátrium-foszfátot és 50gg/mI E. coli tRNS-t tartalmaz. Az IX Denhardt elegy literenként 200 g Ficollt, 200 mg poli/vinil-pirrolidon/-t, 200 mg szarvasmarhaszérum albumint (BSA, V frakció) tartalmaz. A lemezt vákuumban, 90 percen át 80 ’C-on hőkezeljük. Ezután 3 órán át, Petri-csészében 6 ml prehibridizációs folyadékkal inkubáljuk, majd hozzáadunk 5 x 10* cpm jelzett prímért és a hibridizálást egy éjszakán át folytatjuk. A lemez szelektív mosását 0,4X SSc-vel 49 ’C-on hajtjuk végre, és szárítás után a lemezről röntgenfelvételt készítünk. A pozitiven hibridizáló kiónokat didezoxi-szekvenálással tovább analizáljuk. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a B2 klón tartalmazta a Lys₁₃₆ deléciót tartalmazó helyes szekvenciát.

Az expressziós plazmid újbóli felépítése úgy történik, hogy a pUK54trp207-l *TX-ből származó XbalBcII és Xbal-PstI fragmentumokat a B2 plaque-ból származó Sau3A-PstI-beiktató fragmentummal ligáljuk, és a ligálási elegyet E. coli-ba transzformáljuk. Kiválasztunk egy olyan transzformánst, amely egy a mutáns gént hordozó plazmidot (pUK54B2) tartalmaz. A fragmentumokat szokásos restrikciós enzim emésztéssel és a kívánt fragmentumok kinyerésével készítjük. Míg eközen mind a Bell, mind a BamHl helyek elvesznek, az M13 urokináz inszertum kivágása ugyanazon a helyen történik, mint a Bell és BamHl ligálása a Sau3A-val, amely felismeri a Bell, BamHl vagy BclIBamHI ligációs helyek bármelyikének központi négy bázisát.

Az E. coli transzformálásához pUK54B2-t használunk. Jelenleg a W3110fhuA-t tartjuk előnyös E. coli törzsnek. Ez a törzs nem lényegbevágó a találmány szerinti urokináz mutánsok előállítása szempontjából, de alkalmazása kényelmes, mert kellőképpen rezisztens a szennyező fágokkal szemben, és így a kereskedelmi mennyiségű termék szintézise szempontjából praktikusan használható.

Az E. coli W3110 fhuA - egy TI fág rezisztens baktérium, amelyet az jellemez, hogy az fhuA génnel kapcsolatos DNS szekvenciákban egy deléciót vagy inverziót tartalmaz. Röviden, az E. coli W3110-et (ATCC 27325) transzdukáljuk lambda-baktriofággal, amely a tetraciklin-rezisztenciát biztosító TnlO transzpozálható elemet tartalmazza. A TnlO-zel transzdukált W3110 törzseket a fág-infekcióval szemben mutatott rezisztenciájuk alapján szelektáljuk. A fág-rezisztens törzseket összegyűjtjük, és a Pl bakteriofággal fertőzzük. A kapott lizátumot használjuk az E. coli AT982 (Bukhari et al. ,J. Bacteriology” 705:844 1971) transzdukálására. Az AT982 törzs egy DAP mutációt tartalmaz, az fhuA génhez közeli helyen. Ennek megfelelően, az AT982 törzs átalakítására (transzdukciója) a Pl lizátummal és az olyan transzduktánsok szelekciója, amelyek tetraciklin-rezisztensek és amelyek a DAP funkciót regenerálják, arra utalnak, hogy a Tn 10 transzpozon a fhuA génen belül helyezkedik el. Azok a törzsek, amelyek tetraciklin-rezisztensek és regenerált DAP funkciót mutatnak a forrásai az E. coli W3110 Pl baktérium fággal végzett transzdukciójához szükséges DNS-nek. Szelekcióval kiválasztjuk a tetraciklin-rezisztenciát és fág rezisztenciát kifejező transzdukált W3110 törzseket. Ezeket a törzseket azután a fág infekcióval szembeni rezisztencia és a tetraciklin-érzékenynyé történő átalakulás alapján szelektáljuk (Naloy et al. J. Bacteriology” 145:1110 1981). A tetraciklin-érzékenység visszatérése a TI fág infekcióval szembeni rezisztencia megtartásával kombinálva azt mutatja, hogy az fhuA génnel kapcsolatos DNS szekvencia vagy hiányzik, vagy irreverzibilisen invertálódott. Az így konstruált törzseket E. coli W3110 fhuA~-nak nevezzük.

A TnlO kicserélhető elemet tartalmzó fágot, amelyet a TnlO-nak a W3ll0-be történő inszertálására használunk, a következőképpen állítjuk elő:

A kiindulási anyag a lambda cl857b 2210am29. Ez a fág az irodalomból ismert (Kleckner etal. ,J. Mól. Bioi.” 116:1241977), és a lambda fág három jól ismert mutánsából standard eljárásokkal készült. E lambda fág lizátumát az E. coli C600 (ATCC 23724) szupresszoron készítjük el, amelyet olyan, a területen jártas szakember számára ismert módszerekkel manipulálunk, amelyek biztosítják, hogy a TnlO transzpozont is hordozza (Kleckner et al. ,J. Mól. Bioi 776: 125 1977). Ezt a lizátumot használjuk egy amber szupresszort és egy cl857 genotípust hordozó E. coli C600 (ATCC 23724) fertőzésére. A tetraciklin rezisztens kolóniák lizátumait hőindukcióval készítjük, a tetraciklin-rezisztens telepeket először folyékony táptalajban 32 ’C-on, majd 42 ’Con 90 percig inkubálva. A lizátumot ezután E. coli C600-ra rétegezzük, majd replikát készítünk. Az E. coli C600-on megjelenő plaque-okat 32 ’C-on E. coli C600on és E. coli W3102 sup*-on (lambda imm434) replikáljuk, mely utóbbi lambda a imm434 heteroimmun profágot tartalmazza (Kleckner et al. „Genetics” 90: 427 1978). A heteroimmun törzsön megjelenő plaque-okat tetraciklin lemezekre helyezzük. Az ezeken a lemezeken megjelenő plaque-ok alkalmasak a tetraciklin rezisztencia transzdukálására, és a fenti eljárással ezeket használjuk az E. coli W3110 fhuA^- kialakítására.

A rekombináns natív és (Lysu# ->Δ) humán urokinázt 1 liter W/3110 vagy W31 lOFhuA^- sejttenyészetből kapjuk, amelyet az alkalmas plazmiddal transzformáltunk. Az expressziót indol-akrilsav hozzáadásával indukáljuk.

2. példa

A (Lys_13í—>Δ; Phe^LySisg->Δ) humán urokináz konstruálása

A más vagy további mutánsokat is tartalmazó expressziós plazmidok kialakítása során lényegében az 1. példában ismertetett eljárást követjük. Néhány eseben célszerű olyan M13 fágot használni, amely már egy vagy több mutánst tartalmaz a további helyeken mutált DNS előállítása során. A cím szerinti humán urokináz előállítása a következő eljárással történik. Templátként az M13mpl0UKl-et használjuk, a következő szekvenciájú primerrel kombinálva:

5’pCTGAGGCCCCGCATTATTGGGGGA 593 621

A fentiekben ismertetett eljárást használva azonosítjuk a 2F3 plaque-oL A 2F3 plaque-ból származó fág egy a Phe₁₅₇ Lys_lsg-»A mutációt tartalmazó urokináz DNS fragmentumot tartalmaz. Az ezt a mutációt és ezen felül a Lysi» deléciós mutációt (1. példa) tartalmazó expressziós plazmidot úgy hozzuk létre, hogy a pUK54B2 Ball-BclI emésztésével kapott vektor fragmentumot a 2F3 fág BalI-Sau3A inszerciós fragmentumával ligáljuk, és E. coli W3110-et vagy W3110FhuA -t transzfor7

-713

HU 202 586 Β málunk és tenyésztünk. A transzformált sejteket egy éjszakán át minimál táptalajon növesztjük, 550 nm-en 1,2 O.D. értékig. Ezután további táptalajt adunk hozzá. 10 gg/ml koncentráció eléréséig indol-akrilsavat adagolunk, amelynek szerepe a triptofán operonnal kontrollált gének expressziójának további indukciója. A sejteket két órán át inkubáljuk, majd összegyűjtjük.

Míg az itt leírt proteáz-rezisztens urokináz variánsok előállítása során a pUK54trp207-l*TX plazmidot használtuk, meg kívánjuk jegyezni, hogy szakember számára nyilvánvaló módon más expressziós vektorok is alkalmasak erre a célra. Amire szükség van, az kizárólag urokinázt kódoló klónozott DNS. Ezt a DNS-t vagy szintézissel készítjük, vagy alkalmas sejtekből, például Detroit 562 sejtekből (ATCC CCL 138) mRN S-t izolálunk, amelyből cDNS-t készítünk (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés). Erre a DNS-re az jellemző, hogy DNS és aminosav szekvenciájában legalábbis lényegében homológ az 1. ábrán bemutatott natív urokináz szekvenciával. A DNS szekvenciában alkalmas restrikciós enzim helyeket határozunk meg és használunk szükség esetén adaptorok és linkerck alkamazásával együtt, hogy olyan DNS-hez jussunk, amely beépíthető a választott expressziós vektorba. Más plazmid szerkezete és gazdaveklor rendszerek alkalmazása a szakember köteles tudásához tartozik.

3. példa

A (Lysi₃₅->Á; Phe^Lys^—>Δ) humán urokináz tisztítása

200 g sejtmasszát, melyet egy 10 literes fermentor féléből a 2. példa szerint gyűjtünk össze, 4 “C-on 10 liter 0,05 mólos Tris-ben (pH 7,2) homogenizálunk, amely 0,5 g/liter lizozimet (Sigma) és 0,01-0,01 g/litcr ribonukleázt (Sigma) és dezoxiribonukleázt (Sigma) tartalmaz. Az oldatot háromszor átengedjük egy Mentőn Gaulin malmon, 30.10⁶ Pa nyomáson, és 30 percen át 4700 g-vel 5 ’C-on centrifugájuk. A kapott pelletct, amely SDS-PAGE és „Western blotting” módszerrel meghatározva urokinázt tartalmaz, homogenizálással 500 ml 0,05 mólos Tris-ben és 0,02 mól/1 EDTA-ban (pH 7,2) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 1,3 liter 50%os glicerinre rétegezzük, majd ismét 30 percen át 4700 g-vel centrifugáljuk.

Az urokinázt, amely az üledékben van, 6-8 órás keveréssel, 4 ’C-on feloldjuk 300 ml 6,0 mólos guanidin-hidrokloridban. Az oldhatatlan anyagokat 30 perces, 4700 g-vel végzett centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót 6,0 literre hígítjuk. A 9,0-es pH-jú pufferben a sók végső koncentrációja a következő: 0,05 mól/1 Tris, 1,0 mól/1 guanidin-hidroklorid, 0,2 mól/1 arginin, 0,005 mól/1 EDTA, 0,005% Tween 80, 1,25 mmól/1 redukált glutation és 0,25 mmól/1 oxidált glutation. A 6,0 literes térfogatszámítások szerint OD_ao S 1 értéket ad. Az oldatot 24 órán át 4 ’C-on állni hagyjuk, hogy fibrin lemez vizsgálattal maximális aktivitáshozamokat kapjunk. A visszazáró reagenseket 4 ’C-on kétszer 60 liter, 0,05 mólos 0,005% Tween 80-at tartalmazó oldattal szemben dializálva távolítjuk el. A dialízis egy éjszaka alatt teljessé válik. Minden ezt követő tisztítási lépést 4 ’C-on végzünk.

A dializált oldatot szakaszosan, a dialízis pufferrel egyensúlyba hozott DE-52 cellulóz (Whatman) 400 mles adagjaival extraháljuk. Az iszapot Buchner tölcséren átszűrjük. A nem adszorbeált urokinázt tartalmazó fe8 lülúszót azonnal felvisszük egy 100 ml-es (5x5 cm) hidroxi-apatit (BioRad) oszlopra, amelyet előzőleg a dialízis pufferrel egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot 0,005% Tween 80-at tartalmazó, 0,125 mólos pH 6,8) nátrium-foszfát pufferrel mossuk. Az urokinázt 0,4 mólos (pH 6,7) 0,005% Tween 80-at tartalmazó nátrium-foszfáttal eluáljuk.

A hidroxi-apatit oszlopról kapott eluátumot YM10 Amicon szűrő alkalmazásával körülbelül 30 ml-re koncentráljuk, és felvisszük egy 0,05 mólos (pH 6,8), 1,0 mól guanidin-hidrokloridot és 0,005% Tween 80 puffért tartalmazó nátrium-foszfát pufferrel egyensúlyba hozott, 2,5 x 130 cm-es Sephacryl S-200 oszlopra. Az urokinázt tartalmazó frakciót összegyűjtjük és 100 térfogategység 0,005 mólos (pH 7,3), 0,15 mól/1 nátrium-kloridot és 0,005% Tween 80-at tartalmazó nátrium-foszfáttal szemben dializáljuk.

4. példa

A (Lys₁₃₆->A Phe₁₅₇Lys₁₅g->A) humán urokináz aktivitása

Az urokinázt és mutánsait fibrin lemezeken (Ploug J. et al. Urokinase: An activator of plasminogen from humán urine. I. Isolation and Porperties. „Biochim. Biophys. Acta” 24: 278-282 1957) vizsgáltuk. A fibrin lemezek 1,25% agarózból, 4,1 mg/ml humán fibrinogénből, 0,3 egység/ml trombinból és 0,5 gg/ml szójabab tripszin inhibitorból álltak. Az urokinázt és mutánsait közvetlenül, kromogén szubsztráton (S-2444, Heléna Laboratories, Beaumont, Texas) (Hayashi S. et al. Assay of urokinase activity in plasma with a chromogenic substrate. „Thrombosis Research” 22: 573-578 1981) is vizsgáltuk. Minden vizsgálat során, az abszolút aktivitások megállapításához urokináz standardot (Calbiochem) használtunk.

A (Lys₁₃₆—>Δ; Phc^LySus—>Δ) humán rekombináns urokináz, a rekombináns natív HŰK (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés) és natív HŰK relatív aktivitását fibrin lemezes vizsgálatokkal hasonlítottuk össze. Az eredmények a megadott sorrendben a következők voltak: 96 250, 126 200 és 121 200 Poug egység (PE/mg). Ez azt mutatja, hogy a három aminosav deléciója nem módosította lényegesen a mutáns urokináz plazminogén aktiváló kapacitását. A mutáns 300 PE-jc az S-2444 alapján csak 0,76 PE kromogén aktivitást tartalmazott Ez csak körülbelül 0,25%-a volt a natív urokináz S-2444 aktivitásának. Azt a következtetést vontuk le, hogy vagy a mutáns bizonyos maradék S2444 aktivitást mutatott vagy fellépett bizonyos korlátozott átalakulás a kétláncú formává.

Elvégeztük a (Lys₁₃₆—>APhe₁₅₇Lys258—>Δ) humán urokináz és a rekombináns egyes szálú natív urokináz plazminon történő összehasonlítását is. Amikor 0,0625 egység plazmint adtunk 300 PE (fibrin lemez) mutánshoz és az egészet egy órán át 37 ’C-on inkubáltuk, egy 10,36 PE S-2444 aktivitású enzim termelődött, míg sokkal kisebb mennyiségű (0,005 egység) plazmin és rövidebb (15 perc) 37 ’C-on végzett inkubálás 50 PE rekombináns egyes szálú natív urokinázzal egy sokkal nagyobb (-45 PE) S-2444 aktivitású enzimet eredményezett. A kettős szálú és plazminnal inkubált rekombináns natív és rekombináns mutáns urokinázok S-2444 specifikus aktivitását a következő táblázatban foglaljuk össze:

-815

HU 202 586 Β

Enzim S-2444 aktivitás (P x 10³/mg) rekombináns egyes szálú HŰK 89.0 szálú rekombináns HŰK 102.2 szálú natív HŰK 92.7 mutáns rekombináns egyes szálú HŰK 3.3

Látható, hogy a mutánst sokkal kevésbé aktiválja a plazmin, mint a natív molekulát

Megjegyzés: A fenti példákban leírt eljárási műveleteket - amennyiben a példában más megáivá nincs - az önmagukban ismert műveletek szokásos körülményei között folytattuk le. A részletekre vonatkozólag utalunk a szakmában használatos laboratóriumi kézikönyvekre pl.: Maniatis etc.: Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor 1982, valamint Currcnt Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel etc. Eds. Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciencc, 1987.

Egyes, a példákban részletesen nem ismertetett standard oldatok és reagensek összetétel:

LB közeg: tripton (Difco 0123) 10,0 g élesztőkivonat (Difco 0127) 5,0 g nátriumklorid 10,0 g liter desztillált vízben

YT közeg: Bacto-Tryptone (Difco 0123) 8,0 g élesztókivonat (Difco 0127) 5,0 g nátriumklorid 5,0 g liter desztillált vízben x SSC: 3 mólos nátrium-klorid-oldat (175 g/1)

0,3 mól/1 Na₃-citráL 2H₂ (88 g/1) mólos hidrogén-klorid-oldattal 7,0 pH-ra beállítva (2 x SSC oldatot a fenti törzsoldat 10-szeres hígításával állítunk elő)

NP40: a SIGMA Chemical Company, St Louis, Mo. USA által előállított „Nonidct P. 40” készítmény rövidített elnevezése.

Claims (7)

1. Eljárás az (I) képlet szerinti aminosav-szekvenciában a 156-158 és kívánt esetben a 135-136 helyeken megváltozott aminosav-szekvenciájú proteáz-rezisztens egyes szálú urokináz előállítására, azzal jellemezve, hogy

1. az (I) képletben a 156-158 és kívánt esetben a 135—

136 aminosav helyeket kódoló DNS szakaszokat a megváltozó aminosav szekvenciájának megfelelően megváltoztatjuk,

2. valamely baktériumsejt- vagy állati szövettenyészetet előnyösen E. coli sejtet az 1. lépés szerint megváltoztatott DNS szakaszt tartalmazó vektorral transzformálunk,

3. a transzformált gazdasejtet mindaddig tenyésztjük, amíg az urokináz-variáns felgyülemlik a tenyészetben és

4. az urokináz-variánst a tenyészetből kinyerjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás Lys₁₃₆-»A;

Phei^LySug-ÍÁ urokináz előállítására, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet a tárgyi kör szerinti aminosavváltozásoknak megfelelően megváltoztatott DNS szakasszal rendelkező vektorral transzformáljuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás Lys₁₃₆—>Δ urokináz előállítására, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet a tárgyi kör szerinti aminosav-változásokoak megfelelően megváltoztatott DNS szakasszal rendelkező vektorral transzformáljuk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás Lys₁₃₅-»Á Phe_1S7Lys₁₅₈->A urokináz előállítására, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet a tárgyi kör szerinti aminosavváltozásoknak megfelelően megváltoztatott DNS szakasszal rendelkező vektorral transzformáljuk.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS szakaszokat helyspecifikus mutagenezissel változtatjuk meg.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az uroldnázt úgy nyerjük ki a tenyészetből, hogy

a) az egyes szálú urokinázt tartalmazó refraktív testeket összegyűjtjük,

b) az urokinázt - a refraktív testekben szolublizáljuk,

c) a nem kívánatos proteineket kation-cserélő gyantán adszoibeáljuk,

d) a szolubilizált urokinázt hidroxi-apatiton adszorbcáljuk, és

e) az urokinázt eluáljuk a hidroxi-apatitról.

7. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy az 1-6. igénypontok bármelyike szerint előállított proteáz-rezisztens urokinázt gyógyszerészetileg elfogadható vivő- és segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.