DK175304B1 - Præparat der omfatter enkelt-kæde-urokinase, nukleinsyre der koder for enkelt-kæde-urokinase, replicerbar vektor der omfatter en sådan nukleinsyre, rekombinant værtscelle der er transformeret med en sådan vektor, fremgangsmåde til fremstilling..... - Google Patents

Description

i DK 175304 B1

Urokinase (E.C. 3.4.21.31) er en serinprotease, som aktiverer plasminogen til plasmin. Proteinet syntetiseres i en række forskellige væv, herunder endothelium og nyrer, og udskilles i spormængder i urin. Renset urokinase eksisterer i to aktive former, en form med høj molekylvægt (HUK, omkring 50 K) og en form med lav 5 molekylvægt (LUK, omkring 30 K). Hele aminosyresekvensen af begge humane former er blevet bestemt (1,2,3). LUK er blevet påvist at dannes ud fra HUK ved et proteolytisk klip efter lysin 135; dette klip frigør de første 135 aminosyrer fra HUK

(1). Konventionel visdom har holdt pi, at HUK og LUK mi omdannes til proteolytisk aktive former ved proteolytisk hydrolyse af en enkelt-kæde-precursor, også 10 betegnet prourokinase, mellem lysin 158 og isoleucin 159 til frembringelse af en to-kæde-aktiveret form (som vedbliver at svare til enten HUK eller LUK). De proteolytisk aktive urokinasearter, som opstår ved dette hydrolytiske klip, indeholder to aminosyrekæder holdt sammen af en enkelt disulfidbinding. De to kæder dannet ved aktiveringsklippet betegnes A- eller Aj-kæden (fra henholdsvis HUK eller LUK) 15 og B-kæden indeholdende molekylets proteasedomæne.

Urokinase er blevet påvist at være et effekt thrombolytisk middel. Da det imidlertid naturligt kun produceres i spormængder, er prisen for enzymet høj for en effektiv dosering. Urokinase er blevet produceret i rekombinant cellekultur, og DNA, som 20 koder for urokinase, er kendt sammen med egnede vektorer og værts mi kroorganismer (3,8).

Som anført ovenfor har det været antaget, at plasminogenaktivatorer eksisterer som proteolytisk inaktive zymogener, der må "aktiveres" ved proteolyse, før enzy-25 met kan virke på plasminogen til påbegyndelse af den fibrinolytiske kaskade (4,5).

Selv om det er blevet iagttaget, at urokinase-enkelt-kæde-proenzymet udviser høje niveauer af aktivitet på zymografiske og fibrinolytiske procedurer (4,6) har den kendsgerning, at proenzymet også kun udviser lav amidolytisk aktivitet på syntetiske polypeptidsubstrater med lav molekylvægt, ført til den konklusion, at 30 spor af kontaminerende aktiv (to-kæde) urokinase i proenzympræparaterne eller spor af plasmin i det plasminogen, der nu anvendes ved fibrinpladeprøvningerne, var ansvarlige for den fibrinolytiske aktivitet af prourokinase (4). Dette ville på sin side tvinge til den konklusion, at enkelt-kæde-urokinase må omdannes til to-kæ-deformen for at spalte plasminogen og starte fibrinolyse in vivo.

35

I DK 175304 B1 I

I 2 I

I Urokinases rolle ved koagellyse in vivo er kompliceret. Prourokinase antages nu at I

I samvirke med en inhibitor i plasma. Fibrin postuleres at frigøre denne inhibitor, I

I hvorpå prourokinase frigøres til virkning på plasminogen (7). Det er uklart, om I

I fjernelse af inhibitoren alene er tilstrækkeligt til at starte plasminogenhydrolyse, I

I 5 eller om frigørelse fra inhibitoren simpelthen letter konventionel urokinaseaktive- I

I ring til to-kæde-formen. Det til inhibitoren bundne urokinasedomæne er ukendt r I

I ligesom bindingsmekanismen. En yderligere komplicerende hypotese tilskriver en I

I fibrinbindende evne hos urokinase til HUK-arten, især til et område kaldt en I

I "kringle" - lokaliseret inden for tilnærmelsesvis resterne 49-132 (8). Denne hypo- I

I 10 teses forhold til inhibitorpostulatet og deres sammenligningsfortrin forbliver uløst. I

I En hovedhindring for anvendelsen af to-kæde-urokinase til behandling af blodko- I

I agier er, at to-kæde-formen øjensynligt ikke bindes af den formodede inhibitor for I

I prourokinase. Hvis to-kæde-urokinase indgives perifert, er den derfor i stand til at I

I 15 aktivere plasminogen ved ethvert punkt inden for kredsløbssystemet, hvilket fører I

I til uønskede bivirkninger. To-kæde-urokinase frembragt ved plasminhydrolyse af I

I enkelt-kæde-urokinase ved koagelstedet træder i cirkulation med de samme ska- I

I delige bivirkninger, især systemisk fibrigenolyse og udtynding af a2-antiplasmin. I

I Disse bivirkninger forhindrer rigtig thrombogenese in vivo. Der er behov for en for- I

I 20 bedret form af enkelt-kæde-urokinase, som (a) er i stand til at binde enten fibrin I

I eller den postulerede inhibitor, dvs. som i sidste ende fungerer i det væsentlige på I

I samme måde som nativ prourokinase med hensyn til plasminogenaktivering ved I

I koagelsteder; som (b) er resistent over for proteolytisk nedbrydning, især over for I

I omdannelse til to-kæde-formen; og som (c) udviser minimal eller ingen antigeni- I

I 25 citet hos patienter, hvortil den indgives. I

Dette opnås ifølge opfindelsen ved tilvejebringelse af et præparat, der omfatter - I

I proteaseresistent enkelt-kæde-urokinase. Proteaseresistent enkelt-kæde-urokinase I

I frembringes ved at kombinere urokinase med et middel, som danner kompleks ' I

I 30 med urokinase, eller ved kovalent at modificere enkelt-kæde-urokinase ved I

I proteolysesteder, således at urokinasen ikke længere er modtagelig for I

I proteasehydrolyse ved disse lokaliteter. Målstederne inkluderer Argi56 til Lysi58 og, I

I fortrinsvis, stedet ved resterne Lys^s til Lysi36- Kovalente modifikationer I

I gennemføres ved omsætning af nativ urokinase med derivatiserende reagenser I

I 35 eller ved rekombinant syntese af mutanter med stedspecifikke udskiftninger, I

3 DK 175304 B1 indsætninger eller deletioner af aminosyrerester ved målstedet eller -stederne. Kompleksdannende midler, såsom antistoffer, bindes til urokinase ved målstederne eller ved flankerende steder, således at adgangen til stederne for proteaser vanskeliggøres eller forhindres. Alle disse urokinasederivater udformes til at 5 reducere eller eliminere proteasers tilbøjelighed til at spalte ved målstederne. Omdannelsen af enkelt-kæde-urokinase til to-kæde-urokinase med plasmin, bakterielle proteaser, trypsin og andre proteaser vanskeliggøres af sådanne stedspecifikke mutationer, hvilket reducerer uønskede bivirkninger in vivo uden også at skade muligheden for at mutant-urokinase-arterne kan fungere fuldt ud på 10 en anden måde end nativ enkelt-kæde-urokinase. Det er specielt unødvendigt at enkelt-kæde-urokinase omdannes til to-kæde-urokinase in vivo for at aktivere plasminogen. De ifølge opfindelsen tilvejebragte mutanter er i det væsentlige ikke-immunogene hos mennesker, de forbliver i sidste ende fibrinspecifikke, og de er i stand til at aktivere plasminogen uden at frigøre to-kæde-urokinase i vaskulaturen.

15 EP-A-0 210 279, som er kendt teknik i kraft af Art 54(3) EPC, beskriver prourokinase som polypeptider, der har en aminosyresekvens, som er identisk med naturlig human prourokinase, men med en sur aminosyrerest i position 157 og eventuelt methionin N-terminalt.

20 I tegningen:

Fig. 1 viser aminosyre- og nukleotidsekvensen for human urokinase. Amino-syresekvensen er vist på den øverste linje, og nukleotidsekvensen nedenunder.

25 Utranslaterede 5'- og 3'-områder er også vist.

Enkelt-kæde-urokinase defineres af at omfatte proteinet med human urokinases aminosyresekvens som afbildet i fig. 1A og IB i dens art med høj molekylvægt (ca.

54.000 dalton, NH2-Ser, Gln2 Glu3-terminus) eller dens art med lav molekylvægt 30 (ca. 33.000 dalton, NH2-Lysi36 Proi37 Seri38-terminus) og aminosyresekvens- variationer og -derivater deraf, herunder naturlige alleler, hvori molekylet består af en enkelt aminosyrekæde, som forbliver uspaltet ved proteolysestedet omfattende resterne Argi56 - Lys158 (i det følgende betegnet "kædeomdannelsesstedet"). Proteaseresistent enkelt-kæde-urokinase er et urokinasederivat med en enkelt 35 aminosyrekæde, som er mindre modtagelig for proteolytisk hydrolyse end den

I DK 175304 B1 I

I I

I tilsvarende uderivatiserede native form af urokinase. Især er protease seresistent I

I urokinase resistent over for omdannelse til to-kæde-urokinase ved proteolyse ved I

I kædeomdannelsesstedet. Typisk bestemmes dette ved inkubation af det I

I urokinasederivat, som antages at være proteaseresistent, med humant plasmin og I

I 5 sammenligning af aktiviteten af den behandlede kandidat på et kromogent I

I substrat, såsom S-2444, i sammenligning med nativ enkelt-kæde- r I

I urokinasebehandlet og prøvet på samme måde. Hvis graden af plasminomdannelse I

I af kandidat-urokinasederivatet til to-kæde-arten (som bedømt ved en forøgelse i I

I S-2444 hydrolytisk aktivitet) er mindre end ca. 50%, almindeligvis mindre end I

I 10 10% af omdannelsesgraden af den sammenlignelige native urokinase til to-kæde- I

I arten, så siges kandidaten af være proteolyseresistent. Denne procedure er I

I beskrevet yderligere i eksemplerne. I

I Proteolyseresistent enkelt-kæde-urokinase inkluderer også enkelt-kæde-urokinase- I

I 15 derivater, som er i det væsentlige ude af stand til at spaltes proteolytisk ved Lys13S I

I Lysi36-stedet (i det følgende betegnet nLUK"-stedet). Disse derivater defineres som I

I dem, hvori omdannelsen af HUK til LUK foregår i en mindre grad med I

I proteolyseresistent urokinase end med nativ enkelt-kæde-urokinase. Hvis graden I

I af trypsinomdannelse af kandidat-urokinasederivatet til LUK-formen (bedømt ved I

I 20 gelelektroforese, gelfiltrering, immunoprøvning eller lignende) er mindre end ca. I

I 50%, almindeligvis mindre end ca. 10% af omdannelsesgraden af den sammenlig- I

I nelige urokinaseart til LUK, så siges kandidaten af være proteolyseresistent. I

I Proteolyseresistent defineres også eventuelt i forhold til andre proteaser, som kan I

I 25 forventes i enkelt-kæde-urokinasens miljø. Mikroorganismer, der anvendes som I

I værter for rekombinant syntese af enkelt-kæde-urokinase, indeholder proteaser, I

I såsom endo- og exopeptidsaser, såvel som esteraser eller amidaser med proteoly- - I

I tisk aktivitet. Nogle af disse tilfældigt mødte proteaser vil spalte enkelt-kæde-uro- I

I kinase og er særligt vanskelige at have med at gøre under rensning, når den re- ' I

I 30 kombinante urokinase er opløselig og kan udsættes for forhøjede koncentrationer I

I af disse proteaser. Tidligere har svaret på dette problem inkluderet anvendelsen af I

I proteolyseinhibitorer, fx 1 M guanidin-HCI, i rensningsopløsningsmidlerne (3). Des- I

I uden blev et enzym, identificeret som en enkelt-kæde-urokinase, isoleret fra na- I

I turlige kilder ved hurtigseparationsprocedurer (6) beregnet til at forhindre omdan- I

I 35 nelse af to-kæde-arten. I

5 DK 175304 B1

Den proteaseresistente enkelt-kæde-urokinase fremstilles ved metoder, som i sig selv er kendte af fagfolk. Kædeomdannelsesstedet, og fortrinsvis også LUK-stedet, modificeres enten kovalent, således at det er mindre modtageligt for proteolytisk 5 spaltning, eller kombineres med et middel, som inhiberer proteasens adgang til stedet.

Midler, som inhiberer proteasens adgang, inkluderer monoklonale antistoffer eller fragmenter deraf, fx fab-fragmenter, rettet mod de pågældende steder eller nabo-10 epitoper i en sådan position, at det bundne antistof sterisk hindrer proteasers adgang til stedet. I denne udførelsesform kan urokinasen være et nativt såvel som et mutant molekyle, men deter ikke-kovalent forbundet med et andet molekyle, der tilfører proteaseresistent. Egnede antistoffer eller andre bindingsproteiner identificeres let ved immunisering af et dyr, fx mus, mod enkelt-kæde-urokinase i 15 "Freund’s complet adjuvant", udvinding af miltceller fra det immuniserede dyr, sammensmeltning af cellerne til frembringelse af hybridomer og sigtning af fusi-onskultursupernatanterne for a nti proteolytisk aktivitet. En egnet sigtningsprøvning gennemføres ved først at inkubere kandidat-antistoffet med enkelt-kæde-urokinase og derpå med plasmin, trypsin eller enhver anden protease af interesse. Derefter 20 tilsættes en proteaseinhibitor for at standse reaktionen, og fragmenterne separeres ved gelelektroforese. En sammenligning med og uden reduktion på en elektrofore-segel vil påvise, om antistoffet har beskyttet enkelt-kæde-urokinasen eller ej, dvs. at tilstedeværelsen af et bånd, som vandrer med enkelt-kæde-urokinase på den reducerende gel, vil belyse den grad af beskyttelse, som gives enkelt-kæde-uroki-25 nasen.

En anden udførelsesform omfatter den kovalente modifikation af enkelt-kæde-urokinase ved kædeomdannelsesstedet og fortrinsvis også LUK-stedet for at gøre dem mindre modtagelige for proteolytisk spaltning. Kovalent modifikation gennemføres 30 almindeligvis på én af to måder. I den ene udførelsesform udsættes enkelt-kæde-urokinase for en derivatiserende forbindelse og omsættes, indtil mindst én rest i en væsentlig population af kædeomdannelses- eller LUK-steder er substitueret med eller sterisk hindret af kovalent binding af urokinasen til en organisk del. Betingelserne for reaktionen bestemmes ved et simpelt matrixforsøg, hvorved bevarelse af 35 urokinasens plasminogenaktiverende aktivitet sammenlignes med forøgelser i pro-

I DK 175304 B1 I

I 6 I

I teolytisk resistens. Egnede midler er monofunktionelle forbindelser, som anvendes I

I under sådanne betingelser, at de er maksimalt selektive for sidekæderne i arginin- I

I og, fortrinsvis, lysinresterne, herunder 1,2-cyclohexandion, eddikesyreanhydrid og I

I phenylglyoxal. Uønsket derivatisering i det urokinaseaktive center og kringlestruk- I

I 5 turen minimeres ved gennemførelse af reaktionen i et støkiometrisk overskud af I

I hhv. plasminogen (eller et andet substrat eller en substratanalog) og fibrin eller I

I benzamidin. Da midlet er monofunktionelt, vil proteinerne ikke blive tværbundet. I

I Imidlertid er den foretrukne fremgangsmåde til fremstilling af den proteaseresi- I

I 10 stent enkelt-kæde-urokinase ifølge opfindelsen at indføre en aminosyresekvens- I

I variation i kædeomdannelses- eller LUK-stederne ved rekombinante metoder. En I

I DNA-sekvens, som koder for enkelt-kæde-urokinase, er kendt ligesom fremgangs- I

I måder til dens udtrykkelse i rekombinante værtsceller (3,8). Der kendes som så- I

I dan metoder, som kan anvendes til i denne DNA at indføre mutationer, der udtryk- I

I 15 kes som proteolyseresistente aminosyresekvensvarianter. For eksempel udskæres I

I DNA-segmenter, som koder for kædeomdannelses- og LUK-stederne (såvel som I

I flankerende områder, om nødvendigt) fra den urokinasekodende DNA ved sekven- I

I tiel nedbrydning med restriktionsendonukleaser, der virker på lokaliteter flankeren- I

I de den DNA, som koder for proteolysestederne (bestemt ved DNA-sekvensanaly- I

I 20 se), den rigtigt spaltede DNA (bestemt ved gelfiltrering) udvindes, der syntetiseres I

I et oligonukleotid, som koder for den ønskede aminosyresekvens og flankerende I

I områder, oligonukleotidet nedbrydes med de restriktionsenzymer, som også blev I

I anvendt til at udskære det uønskede fragment, således at der skabes cohæsive I

I termini, og den syntetiske DNA ligeres ind i resten af enkelt-kæde-urokinase- I

I 25 strukturgenet. DNA, som koder for LUK-stedet, udskæres fx ved delvis nedbryd- I

I ning af pUK54trp207-l(3) med MstI og Ball, udvinding af vektorfragmentet og re- I

I konstituering af vektoren ved ligering af dette fragment til et syntetisk oligonukle- I

I otid med den ønskede sekvens. I denne udførelsesform skabes DNA, som koder for I

I [Lysi35-^A] human urokinase, ved indsætning mellem MstI- og Ball-termini af et I

I 30 oligonukleotid med sekvensen I

I pGCAGATGGAMGCCCT^CTCTrcCTCCAGAAGAATIAAAATTrCAGTGTGG I

I CGTCTACCnTG^GGAGGAGAGGAGGTCTTCTIAATTrrAAAGTCACACCp. I

I 530 582 I

I 35 I

7 DK 175304 B1 (Numrene under sekvensen korrelerer med fig. 1).

På lignende måde udskæres fx den DNA, som koder for kædeomdannelsesstedet, 5 ved delvis nedbrydning af urokinase-DNA'en med Ball og EcoRl på samme måde og ligering af et oligonukleotid, som bærer den basesekvens, som koder for de ønskede aminosyrerester, ind i det åbnede gen. Til belysning er et repræsentativt oligonukleotid, som skal anvendes til fremstilling af [Argi56-»His; LySis8-»Aj human urokinase: 10 -HisPhelle- pCCAAAAGACTCTCAGGCCCCAClTTMTATTGGGGGAG GGTTITCTGAGACTCCGGGGTGAAATAATAACCCCCTCTIAAp.

. 583 627 15 Andre variantsekvenser fremstilles ved syntetisering og indsætning af passende oligonukleotider på analog måde.

Imidlertid er det sædvanligvis mere hensigtsmæssigt at mutere urokinase-DNA'en under anvendelse af M13-fag-mutagenese-metoden (9). Denne metode, som er 20 velkendt i sig selv, forklares nærmere i det følgende.

De heri beskrevne aminosyresekvensmutanter er karakteriseret ved deletionen eller udskiftningen af de basiske rester (arginin og/eller lysin), som findes i protease-stederne, eller indsætningen af rester, som gør de basiske rester i det væsentlige 25 ude af stand til at deltage i proteolytisk spaltning. Der anvendes kombinationer af indsætninger, deletioner eller udskiftninger. Foretrukne mutationer er anført i tabellen nedenfor. Denne tabel skal ikke betragtes som fuldstændig med hensyn til nyttige mutationer.

Urokinase-rester Mutation

3Q

1. Lys135 ti eller Lys135-*His, Ser eller Tyr 2. I-ys136 Δ; eller Lys 13&-*Pro ΛΐίεΛ |ΉίεΛ 3' ^156^157^158 Δ; eJJer Ar9156Phe157LyS158** ^r' ,e157^?fr' 35 Glu Glu, or or tGly J156 Iciy J158

I DK 175304 B1 I

I 8 I

I (His,j I

I Ser,

I 5 4* Phei57Lys158 Δ; eller ^„Lys^Phe^jTyr, I

IGlu, I

or I

Gly ^158 I

I 5. Δ; eller Lys^g-»Hisf Ser, lyr eller Gly I

I 6- Lys158Ilel59 **Lys158 ProIle159 ! I

I 10 I

I Hvis Lysi35 er uforstyrret eller muteret til arginin, bør Lysi36 muteres til prolin eller I

I deleteres. Desuden bør der, hvis Lysise er uforstyrret eller muteret til arginin, ind- I

I sættes prolin mellem Lysi58 og Ile159, eller indføres prolin i stedet for ΙΙε159. De I

I 15 mest foretrukne udførelsesformer er deletionsmutanterne, især af Lys ns, Argne og I

I Lysns, tæt fulgt af udskiftninger af disse tre rester med histidinyl, da sådanne I

I mutationer sandsynligvis vil være mindst tilbøjelige til at frembringe autoantistoffer I

I hos patienter. Den foretrukne udførelsesform er en deletion af LySns eller Lys136 |

I kombineret med en deletion af PheisyLysjsa. Denne mutant har den fordel, at når I

I 20 der sker proteolytisk omdannelse til to-kæde-formen, selv om der kun sker be- I

I grænset proteolyse efter Arg156, har det resulterende molekyle de samme C- og N- I

I termini begge urokinasekæder som 2-kæde-urokinase (normal proteolyse af I

I prourokinase in vivo frigør PheLys-dipeptidet). Endvidere forbliver molekylet med I

I den foretrukne mutant i HUK-formen. I

I 25 I

I Nukleinsyren, som koder for den proteaseresistente variant, indsættes i en udtryk- I

I kelsesvektor. Vektoren anvendes til at transformere en værtscelle, transformanten I

dyrkes, indtil urokinasevarianten er akkumuleret i kulturen, og varianten udvindes I

I derpå fra kulturen. De fremgangsmåder til fremstilling af rekombinant urokinase, I

I 30 som er beskrevet i den publicerede litteratur (3), som udtrykkeligt anses for inkor- I

I poreret i denne beskrivelse ved henvisning, er alle tilfredsstillende til fremstilling af I

I varianterne. Et eksempel på en sådan fremgangsmåde er beskrevet i eksemplerne I

I nedenfor. Imidlertid vil det forstås, at andre vektorer og værtsceller kan anvendes I

I tilfredsstillende til fremstilling af de her beskrevne varianter. I

I 35 I

9 DK 175304 B1

Urokinasevarianten, som produceres direkte i rekombinante bakterier, (dvs. uden anvendelsen af en sekretorisk leder) deponeres som intracellulære, i vand uopløselige aggregater, som kaldes lysbrydende legemer. Disse udvindes ved separering af de lysbrydende legemer fra cellerester, såsom cellevægfragmenter og lignende.

5 Dette gennemføres hensigtsmæssigt ved centrifugering, fx sucrosegradientsepara-tion. Derefter solubiliseres de lysbrydende legemer i et proteindenatureringsmiddel, såsom 6M quanidinhydrochlorid, proteinet genfoldes, midlet fjernes, fx ved dialyse, og urokinasevarianten renses yderligere ved klassisk teknik, såsom ionbytterhar-piks- eller gelsøjler. Da imidlertid urokinasevarianten er proteaseresistent, er det 10 ikke nødvendigt at anvende benzamidin-"SepharoseM til at adskille enkelt-kæde-fra to-kæde-urokinase, og det er heller ikke nødvendigt at anvende enten en pro-teaseinhibitor (1M quanidinhydrochlorid) eller hurtig-separationsprocedurer under rensningstrinnene.

15 Hvad enten den proteaseresistente urokinase er en urokinasevariant syntetiseret i rekombinante bakterier, gær eller højere eukaryotiske cellekulturer eller fremstillet ved kovalent eller adsorptiv modifikation af nativ urokinase, sammensættes den derpå til et præparat til terapeutisk indgivning til patienter med blodkoagler. Den urokinasekoncentration, den indgivningsvej og de farmaceutiske excipienter, som 20 tidligere er anvendt for nativ urokinase, er lige så tilfredsstillende for den proteaseresistente urokinase ifølge opfindelsen. Typisk sammensættes fra omkring 10.000 til omkring 75.000 int.enh./ml proteaseresistent urokinase i 5% dextrose eller andet isotonisk intravenøst medium, om ønsket sammen med bærere, excipienter og stabilisatorer. Den proteaseresistente urokinase infuseres intravenøst med 25 en tilstrækkelig hastighed til at opnå perfusion af den okkluderede arterie eller vene som almindeligvis visualiseret ved konventionel teknik, sædvanligvis med mere end ca. 4000 int.enh./kg/h. Almindeligvis vil infusionshastigheden og koncentrationen af urokinase imidlertid variere betydeligt baseret på aktiviteten af det valgte urokinasederivat, patientens almentilstand, fx omfanget af koaglet og pa-30 tientens hæmostatiske status, og indgivningsvejen, fx ved hjælp af coronarkateter eller perifer indgivning. Bestemmelse af passende urokinasekoncentrationer og indgivningshastigheder vil ligge inden for den almindelige fagmands kunnen. Det bør bemærkes, at det relative fravær af bivirkninger, som opnås med de omhandlede urokinasearter, letter anvendelsen af større doser og indgivningshastigheder, 35 end det hidtil har været muligt med to-kæde-urokinase.

____ ___________

I DK 175304 B1 I

I 10 I

I EKSEMPEL 1 I

I Konstruktion af Lvs1^f;->A-mutant I

I 5 I

I Plasmid pUK54trp207*TX blev anvendt som udgangsplasmidet. Dette plasmid in- I

I deholder DNA, som koder for det komplette HUK-gen under styring af IL co!i trp- I

I promotoren. Dette plasmid er identisk med pUK54trp207-l (3), undtagen af det I

I kun indeholder et EcoRI-center, nær ved 3’-enden af trp-promotoren, og de 641 bp I

I 10 mellem Aval- og PvuII-centrene i pBR322-vektor-komponenten er blevet fjernet I

I (den såkaldte "XAP”-deletion) (14). I

I Plasmid pUK54trp207-l*TX fremstilles ved en kendt procedure (3), undtagen at I

I det udgangsplasmid, som anvendtes ved den procedure var pHGH207-l*XAP i ste- I

I 15 det for pHG207-l. pHGH207-l*XAP blev produceret ved delvis EcoRI-nedbrydning I

I af pHGH207-l for at åbne plasmidet, hvorpå de cohæsive termini blev fyldt ud un- I

I der anvendelse af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I, plasmidet blev recir- I

I kulariseret under anvendelse af T4-ligase og derefter anvendt til at transformere E. I

I colj. Der blev selekteret et plasmid, pHGH207-l*, hvori kun EcoRI-centret ved 3'- I

I 20 enden af trp-promotoren overlevede, som bestemt ved restriktionsenzymanalyse. I

I For at frembringe XAP-deletionen blev pHGH207-l* nedbrudt med Aval og PvuII, I

I det store vektorfragment udvundet, de cohæsive termini fyldt ud under anvendelse I

I af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I, plasmidet stumpende-ligeret under I

I 25 anvendelse af T4-ligase, og coJi transformeret med ligeringsblandingen. I

I pHGH207-l*XAP blev udvundet og anvendt ved den kendte fremgangsmåde for at I

I nå til pl)K54trp207*TX. I

I pUK54trp207-l*TX blev nedbrudt med PstI og Bell, og fragmentet, som spændte I

I 30 over baserne 439-732 blev udvundet. Dobbeltstrenget M13mpl0 (ækvivalent fag I

I M13mpl8 er kommercielt tilgængelig fra Bethesda Research Laboratories) blev I

I nedbrudt med PstI og BamHI og sammensmeltet med Pstl-BcII urokinase-DNA- I

I fragmentet til dannelse af M13mplOUKl. E. cQli JMlOl-celler (ATCC nr. 33876) I

I blev transformeret med den dobbeltstrengede replikative form (RF) af I

I 35 M13mplOUKl. Den enkeltstrengede og RF M13mpl0UKl blev isoleret fra inficerede I

11 DK 175304 B1 E. coli JMlOl-celler på kendt måde. Bemærk at Bell og BamHI danner cohæsive termini, således at M13mpl0-fagen var i stand til at recirkularisere med urokina-seindsætningen. Den enkeltstrengede form blev anvendt til stedspecifik mutagene-se af urokinase ved Lysi36-stedet.

5

Et syntetisk oligonukleotid blev fremstillet ved fast-fase-phosphortriester-metoden (16) til anvendelse som en mutagenese startkæde. Den følgende startkæde blev anvendt til deleteringen af Lys^: 10 5’pGCAGA7GGAAAACCC T CCTCTCCT.

530 556

Dette er den portion af urokinasekodestrengen, som flankerer Lysi36, undtagen at 15 AAG-kodonen for Lysi36 var deleteret.

Den herefter beskrevne procedure blev anvendt til at frembringe en urokinaseklon indeholdende den muterede sekvens af de syntetiske startkæder. Denne procedure er i sig selv alment kendt (9).

20 50 ng af det syntetiske oligonukleotid blev phosphoryleret i 30 minutter ved 37°C i 10 μΙ afen blanding af 50 mM "Tris’’-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCI2, 10 mM dithio-threitol, 1 mM ATP indeholdende 8 enh. T4-polynukleotidkinase. Til anvendelse som sonde blev 400 ng af det syntetiske oligonukleotid phosphoryleret som oven-25 for, undtagen at ATP blev erstattet med 60 mCi [y^Pj-ATP (3000 Ci/mmol), hvilket resulterede i omkring (50-60) x 106 tæll./min. pr. 400 ng 24mer. Til heteroduplex-dannelse blev 100 ng enkeltstrenget M13mplOUKl opvarmet til 95°C (10 min.) og . langsomt afkølet til stuetemperatur i løbet af 30 min. i 40 μΙ af en blanding indeholdende 10 mM "Tris"-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCI2, 1 mM dithiothreitol, 10 ng af 30 den phosphylerede startkæde og 500 ng EcoRI-nedbrudt M13mplOUKl stort fragment. Startkædeforlængelse blev startet ved tilsætning af 10 μΙ puffer indeholdende 50 mM ”Tris"-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCI2 og 1 mM dithiothreitol, 2 mM ATP, 0,25 mM hver af dGTP, dTTP, dCTP og dATP, 5 enh. E. cgji DNA-polymerase I stort fragment og 400 enh. T4-DNA-ligase. Efter 1 time ved 12°C blev reaktionsblan-35 dingen anvendt til at transformere E. coli JMlOl-celler.

I DK 175304 B1 I

I 12 I

I Transformationen blev gennemført ved blanding af 10 μΙ af ligeringsblandingen I

I med 200 μΙ kompetente JMlOl-celler efterfulgt af inkubation i 30 min. på is og I

I 5 min. ved 37°C. Derefter blev 3,5 ml 2YT topagar ved 55°C blandet med 300 μΙ I

I 5 mættede JMlOl-celler, 10 μΙ IPTG (200 mM) og 50 μΙ Xgal og efter tilsætning af de I

I transformerede celler udpladet på 9 cm petriskåle indeholdende LB uden antibioti- I

I ka. I

I To farveløse plakker (B2 og GI2) blev opsamlet og overført til en mikrotiterskål in- I

I 10 deholdende 100 μΙ 2YT-medium. De podede mikrotitervæsker blev stemplet på LB- I

I agarplader med diameter 15 cm overlejret med en plæne af 600 μΙ JMlOl-celler i 8 I

I ml 2YT-topagar og inkuberet natten over ved 37°C. De dannede plakker blev I

I overført til en nitrocelluloseskål ved fysisk kontakt i 1 minut. Nitrocelluloseskålen I

I blev behandlet med 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI i 3 min. og vasket to gange med 3 Μ I

I 15 NaCI-0,5 M ,Tris"-HCI/ pH 7,5 i 15 min. og derpå med 2 X SSC i 15 min. Praehybri- I

I diseringsblandingen indeholder 10 mM "Tris”, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCI, IX I

I Denhardt, 0,5% NP40, 100 μΜ ATP, 1 mM natriumpyrophosphat, 1 mM natrium- I

I phosphat og 50 ug/ml E, coli tRNA. IX Denhardt’s indeholder pr. liter 200 mg Fi- I

I coli, 200 mg polyvinylpyrrolidon, 200 mg okseserumalbumin (BSA; fraktion V). I

I 20 Pladen blev bagt ved 80°C i vakuum i 90 min. og derpå inkuberet i 3 timer med 6 I

I ml præhybridiseringsvæske i en petriskål efterfulgt af tilsætningen af 5 x ΙΟ6 I

I tæll./min. mærket startkæde og hybridiseret natten over. Selektiv vaskning af I

I skålen blev gennemført med 0,4 X SSC ved 49°C, og efter lufttørring blev skålen I

I eksponeret på røntgenfilm. De positivt hybridiserendé kloner blev yderligere analy- I

I 25 seret ved dideoxysekvensbestemmelse. B2-klonen blev bekræftet at indeholde den I

I rette sekvens indeholdende Lysne-deletionen. I

I Udtrykkelseplasmidet blev rekonstitueret ved ligering af Xbal-Bcl og Xbal-PstI- I

I fragmenter fra pUK54trp207-l*TX med Sau3A-PstI-indsættelsesfragmentet fra I

I 30 plak B2 og transformation af ligeringsblandingen ind i E. coli. Der blev selekteret en I

I transformant, som indeholdt et plasmid bærende mutantgenet (pUK54B2). Frag- I

I menterne blev opnået ved konventionel restriktionsenzymnedbrydning og udvin- I

I ding af det ønskede fragment. Selv om Bell- og BamHI-centrene begge ødelægges I

I herved, bør det bemærkes, at M13-urokinaseindsætningen blev udskåret ved det I

13 DK 175304 B1 I samme punkt som Bell- og BamHI-ligeringen af Sau3A, som genkender centreret 4 I baser fra ethvert af Bell-, BamHI- eller BclI-BamHI-ligeringscentrene.

I PUK54B2 blev anvendt til at transformere £, £oli. For tiden er den foretrukne I 5 stamme af E. £g]j W3110fhuA\ Denne stamme er ikke nødvendig for fremstillingen I af de her omhandlede urokinasemutanter, men den er mere hensigtsmæssig, fordi I den er mere resistent over for kontaminerende fag og således mere praktisk til I syntese i kommerciel målestok.

I 10 E, ςοΠ W3110 fhuA' er en TI-fag-resistent bakterie karakteriseret ved en deletion I eller invertion af DNA-sekvenser forbundet med fhuA-genet.

I Kort fortalt transduceres EL £θϋ W3110 (ATCC 27325) med λ-bakteriofag I indeholdende det overflyttelige element TnlO, som overfører tetracyclinresistens.

I - 15 Stammer af TnlO-transduceret W3110 selekteres for resistens over for fag- I infektion. Fag-resistente stammer hældes sammen og inficeres med bakteriofag I PI. Det resulterende lysat anvendes til at transducere EL coli AT982 (17). Stamme

I AT982 indeholder en DAP-mutation lokaliseret tæt ved fhuA-genet. I

I overensstemmelse hermed indicerer transduktion af stamme AT982 med Pl-lysatet I 20 og selektion af transduktanter, som er tetracyclinresistente, og som genskaber I DAP-funktionen, at transposon TnlO er lokaliseret i fhuA-genet. Stammer, som er I tetracyclinresistente og viser genskabt DAP-funktion, er kilden til DNA for I bakteriofag-Pl-transduktion af JL coil W3110. Der selekteres transducerede I W3110-stammer, som udtrykker tetracyclinresistens og fagresistens over for fag- I 25 infektion og reversion til tetracyclinfølsomhed (18). Reversionen til I tetracyclinfølsomhed koblet med bevarelsen af resistens over for TI-fag-infektion I indicerer, at DNA-sekvensen forbundet med fhuA-genet enten er blevet fjernet eller irreversibelt inverteret. Således konstruerede stammer betegnes E. coli W3110 fhuA'.

30

Fagen indeholdende det overflyttelige element TnlO, som blev anvendt til at indsætte TnlO i W3110, blev konstrueret som følger. Udgangsmaterialet var λ cl857b 2210am29. Denne fag er kendt af fagfolk (19) og blev konstrueret ud fra tre velkendte mutanter af λ-fag ved standardprocedurer. Et lysat af denne λ-fag blev 35 fremstillet på amber-suppressoren E. coli C600 (ATCC nr. 23724), som ved proce-

I DK 175304 B1 I

I 14 I

I durer kendt af fagfolk var blevet manipuleret til også at bære TnlO-transposonet I

I (19). Dette lysat blev anvendt til at inficere E. coji C600 (λ C1857), som indeholder I

I en amber-suppressor og en λ-profag bærende cl857-genotypen. Lysater af tetra- I

I cydinresistente kolonier blev fremstillet ved varmeinduktion ved dyrkning af de te- I

I 5 tracyclinresistente kolonier først i væske ved 32°C og derefter ved 42°C i 90 mi- I

I nutter. Lysatet blev derpå udpladet på JL soli C600 og replika-udpladet. Plakkerne, I

I der vist sig på E. coli C600, blev replika-udpladet ved 32°C på E. cpli C600 og E. I

I £fili W3102 sup+ (λ imm434), som indeholder den heteroimmune profag λ imm434 I

I (20). Plakker, der viste sig på den heteroimmune stamme, blev udpladet på tetra- I

I 10 cyclinplader. Plakker, der viser sig på disse plader, er i stand til at transducere te- I

I tracyclinresistens og anvendes ved den ovenfor beskrevne metode til frembringelse I

I af ELCfiii W3110 fhuA*. I

I Rekombinant nativ og [Iysi36-»A] human urokinase blev opnået ud fra 1 liters kul- I

I 15 turer af W3110 eller W3110 fhuA'-celler transformeret med det passende plasmid. I

I Udtrykkelse blev induceret yderligere ved tilsætning af indolacrylsyre. I

I EKSEMPEL 2 I

I 20 Konstruktion af fLysi3R-»Al; Pheiq7Lvsi^-»Al human urokinase I

I I det væsentlige den samme procedure blev fulgt ved frembringelsen af udtrykkel- I

I sesplasmider bærende andre eller yderligere mutanter. Det er hensigtsmæssigt i I

I nogle tilfælde at anvende M13-fagen, som allerede bærer én eller flere mutanter, I

I 25 ved fremstillingen af DNA muteret ved yderligere steder. Den følgende procedure I

I blev anvendt til at fremstille [PhejsyLysise-^A; Lysi36-A] human urokinase. I

I M13mplOUKl blev anvendt som skabelon for en startkæde med den følgende se- I

I kvens: I

I 30 5 * pCTGAGGCCCCGCATTATTGGGGA. I

I 593 621 I

I Under anvendelse af den ovenfor beskrevne metode blev plakken 2F3 identificeret. I

I 35 Fag fra plak 2F3 blev bestemt at bære et urokinase-DNA-fragment indeholdende I

15 DK 175304 B1

Pheis7Lysi58-»A-mutationen. Udtrykkelsesplasmidet for denne mutation, som også indeholder Lys136-deletionsmutationen (eks. 1), blev rekonstitueret ved ligering af vektorfragmentet fra en Ball-Bdl-nedbrydning af pUK54B2 med BalI-Sau3A-ind-sætningsfragmentet af fag 2F3 og transformering og dyrkning af Eceli W3110 el-5 ler W3110 fhuA'. Transformerede celler blev dyrket på minimalt medium natten over til en adsorbans ved 550 nm på 1,2. Yderligere medium blev tilsat. Endol-acrylsyre, en forbindelse, som yderligere inducerer udtrykkelse af de tryptophan-operon-kontrollerede gener, tilsattes til en koncentration på 10 pg/ml. Cellerne blev inkuberet i 2 timer og indhøstet.

10

Selv om pUK54tpr207-l*TX var det plasmid, som faktisk blev anvendt ved fremstillingen af de her beskrevne proteaseresistente urokinasesekvensvarianter, vil det indses af fagfolk, at andre udtrykkelsesvektorer er egnede til anvendelse i forbindelse med denne opfindelse. Alt, hvad der er nødvendigt, er klonet DNA, som ko-15 der for urokinase. Denne DNA opnås ved syntese eller ved fremskaffelse af mRNA fra egnede celler, fx Detroit 562-celler (ATCC nr. CCL 138), og fremstilling af cDNA ud fra denne (3). Denne DNA identificeres ved i det mindste væsentlig DNA- og aminosyre-sekvenshomologi med den native urokinase-sekvens vist i fig. 1. Egnede restriktionsenzymcentre identificeres fra DNA-sekvensen og anvendes sammen 20 med adaptorer eller linkere efter behov til opnåelse af DNA, som er egnet til indsætning i den valgte udtrykkelsesvektor. Anvendelsen af andre plasmidkonstrukti-oner og værts-vektor-systemer vil være inden for fagets kunnen.

EKSEMPEL 3 - 25

Rensning af fLvSi^^-»A: Phei^LvSisn-^Al human urokinase 1 g cellepasta, indhøstet fra halvdelen af 10 liters gæring gennemført som beskrevet i eksempel 2, blev homogeniseret ved 4°C i 10 liter 0,005 M "Tris", pH 7,2, 30 indeholdende 0,02 M EDTA, 0,5 g/liter lysozym (Sigma) og 0,01 g/liter hver af ri-bonuklease (Sigma). Opløsningen blev sendt tre gange igennem en Menton Gaulin-mølle ved 31 MPa og centrifugeret i 30 minutter ved 4700 x g ved 5°C. Den resulterende pille, som indeholder urokinase som kontrolleret ved SDS-PAGE og Western-afdupning, blev resuspenderet ved homogenisering i 500 ml 0,05 M ’Tris"

I DK 175304 B1 I

I 16 I

I og 0,02 M EDTA, pH 7,2. Denne suspension blev lejret over 1,3 liter 50% glycerol I

I og centrifugeret igen i 30 minutter ved 4700 x g. I

I Urokinasen, som igen fandtes i pillen, blev opløst under omrøring i 6-8 timer i I

I 5 300 ml 6,0 M guanidinhydrochlorid ved 4°C. Uopløseligt materiale blev fjernet ved I

I centrifugering i 30 minutter ved 4700 x g. Supernatanten blev fortyndet til 6,0 liter I

I med henblik på genfoldning. Den endelige koncentration af salte i pH 9,0 genfold- I

I ningspufferen var: 0,05 M "Tris", 1,0 M guanidinhydrochlorid, 0,2 M arginin, 0,005 I

I M EDTA, 0,005% "Tween 80”, 1,25 mM reduceret glutathion og 0,25 mM oxideret I

I 10 glutathion. Volumenet på 6,0 liter var udregnet til at give en Α2βο<1· Opløsningen I

I fik lov at stå i 24 timer ved 4°C til opnåelse af maksimale udbyttere af aktivitet I

I som målt ved fibrinpladeprøvningen. Genfoldningsreagenser blev fjernet ved dialy- I

I se ved 4°C over for to udskiftninger på hver 60 liter 0,05 M natriumphosphat, pH I

I 6,8 indeholdende 0,005% "Tween 80". Dialysen blev fuldført natten over. Alle ef- I

I 15 terfølgende rensningstrin blev udført ved 4°C. I

I Den dialyserede opløsning blev charge-ekstraheret med 400 ml DEAE-cellulose I

I "DE-52" (Whatman) ækvilibreret i dialysepufferen. Opslæmningen blev filtreret un- I

I der anvendelse af en Biichner-tragt. Supernatanten indeholdende uadsorberet uro- I

I 20 kinase blev sat umiddelbart på en 100 ml (5 x 5 cm) hydroxylapatitkolonne (Bio- I

I Rad), som i forvejen var ækvilibreret med dialysepufferen. Kolonnen blev vasket I

I med 0,125 M natriumphosphat, pH 6,8 indeholdende 0,005% ’Tween 80”. Urokina- I

I se blev elueret med 0,4 M natriumphosphat, pH 6,8 indeholdende 0,005% ’Tween I

I 80”. I

I 25 I

I Elueringspuljen fra hydroxylapatitkolonnen blev koncentreret til omkring 30 ml un- I

I der anvendelse af et "YM10 Amicon”-filter og blev sat på en 2,5 x 130 cm I

I "Sephacryl® S-200"-størrelsesadskillende kolonne ækvilibreret med 0,05 M natri- I

I umphosphat, pH 6,8 indeholdende 1,0 M guanidinhydrochlorid og 0,005% "Tween I

I 30 80". Maksimet indeholdende urokinase blev hældt sammen og dialyseret over for I

I 100 volumener 0,05 M natriumphosphat, pH 7,3, indeholdende 0,15 M natrium- I

I chlorid og 0,005% "Tween 80". I

EKSEMPEL 4 17 DK 175304 B1

Aktivitet af fLvsA^-»A·. Phe^LvSi^-^Al human urokinase 5 Urokinase og dens mutanter blev prøvet pi fibrinplader (11). Fibrinpladerne bestod af 1,25% agarose, 4,1 mg/ml humant fibrinogen, 0,3 enheder/ml thrombin og 0,5 Mg/ml soyabønne-trypsininhibitor. Urokinase og dens mutanter blev også prøvet som anført med direkte kromogent substrat, S-2444 (Helena Laboratories, Beaumont, Texas) (12). Alle prøvninger blev sammenlignet med urokinasestandar-10 den (Calbiochem) med hensyn til absolutte aktiviteter.

De relative aktiviteter af rekombinant [Lysi36-»A; Pheis7LySi58-»A] human urokinase, rekombinant nativ HUK (3) og nativ HUK sammenlignet ved fibrinpladeprøv-ning. Resultaterne var henholdsvis 96250, 126200 og 121200 Ploug-enheder 15 (PU)/mg. Dette viser, at de tre aminosyredeletioner ikke væsentligt modificerede mutant-urokinasens plasminogenaktiverende evne. 300 PU af mutanten indeholdt kun 0,76 PU ved S-2444-kromogen aktivitet. Dette var kun ca. 0,25% af nativ urokinases S-2444-aktivitet. Det blev konkluderet, at mutanten udviste enten nogen resterende S-2444-aktivitet eller at der var sket begrænset omdannelse til to-20 kæde-formen.

Der gennemførtes en sammenligning af aktiviteten af plasmin på [LysJ36-»A; Phe157Lysi58->A] human urokinase og rekombinant enkelt-kæde nativ urokinase.

Når 0,0625 enheder plasmin sattes til 300 PU (fibrinplade) mutant, og der blev in-25 kuberet i 1 time ved 37°C, blev der produceret enzym med en S-2444-aktivitet på 10,36 PU, medens en meget mindre mængde plasmin (0,005 enheder) inkuberet i et kortere tidsrum (15 min.) ved 37°C med 50 PU rekombinant enkelt-kæde nativ urokinase gav enzym med en meget større S-2444-aktivitet (ca. 45 PU). En sammenligning af de specifikke S-2444-aktiviteter af to-kæde- og plasminiinkuberet 30 rekombinant nativ urokinase og rekombinant mutant urokinase er vist nedenfor.

35

I DK 175304 B1 I

I 18 I

I Enzym____S-2444 aktivitet (PUxlO~* /mg) I

I rekombinant enkelt-kæde-HUK 89,0 I

I to-kæde rekombinant-HUK 102,2 I

I to-kæde nativ HUK 92,7 I

I 5 rekombinant enkelt-kæde mu- I

I tant HUK 3f3 I

I Således er mutanten langt mindre modtagelig for plasmidaktivering end det native I

I 10 molekyle. I

19 DK 175304 B1

BIBLIOGRAFI

1. Gunzler, W.A. et aL The primary structure of high molecular mass urokinase from human urine: The complete amino acid sequence of the A chain. "Hoppe- 5 Seyler's Z. Physiol. Chem. Bd." 3£2: 1155-1165 (1982).

2. Steffens, G J. et al. The complete amino acid sequence of low molecular mass urokinase from human urine. "Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. Bd." 363: 1043-1058 (1982).

10 3. ΕΡ-offentliggørelsesskrift nr. 92182.

4. Wun, T-C et al. A Proenzyme Form of Human Urokinase. "Journal of Biological Chemistry" 25Z: 7262-7268 (1982).

15 5. Nielsen, L.S. et al. Purification of Zymogen to Plasminogen Activator from Human Glioblastoma cells by Afficity Chromatography with Monoclonal Antibody. "Biochemistry" 21: 6410-6415 (1982).

20 6. US-patentskrift nr. 4 381 346.

7. Zamarron et al., Competitive Inhibition by Human Plasma of the Activation of Plasminogen by Pro-Urokinase in "Thrombosis and Haemostasis” 54(1): abs. 604, s. 102 (14. juli 1985).

25 8. Heyneker, H. et al., Functional Expression of the human urokinase gene i Escherichia coli in "Genetics of Industrial Microorganisms, 1982, Proceedings of the IVth International Symposium" K. Ikeda aj., red., s. 214-221 (1983).

30 9. Adelman, J. et al., In Vitro Deletional Mutagenesis for Bacterial Production of the 20,000-Dalton Form of Human Pituitary Growth Hormone. "DNA" 2(3): 183-193 (1983). 1

Winter, G. et al., Redesigning Enzyme Structure by Site-directed Mutagenesis: 35 Tyrosyl tRNA Synthetase and ATP Binding. "Nature" 290: 756-758 (1982).

I DK 175304 61 I

I 20 I

I 11. Ploug, J. et al., Urokinase: An activator of plasminogen from human urine. I. I

I Isolation and porperties. "Biochim. Biophys. Acta" 24: 278-282 (1957). I

I 5 12. Hayashi, S. et al., Assay of urokinase activity in plasma with a chromogenic I

I substrate. "Thrombosis Research" 22: 573-578 (1981). I

I 13. Gray et al. "Bio/Technology" 2: 161-165 (februar 1984). I

I 10 14. Sutdiff, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 43: 77 I

I (1979). I

I 15. Goeddel, D. et al.. "Nature" 287: 411 (1980). I

I 15 16. Crea et al., "Proc. Nat. Acad Sci. USA" 75: 5765 (1978). I

I 17. Bukhari et al., "J. Bacteriology" 105:844 (1971). I

I 18. Naloy et al., nJ. Bacteriology” 145:1110 (1981). I

I 20 I

I 19. Kleckner et al., nJ. Mol. Biol.” 116: 125 (1977). I

I 20. Kleckner et al., "Genetics" 90: 427 (1978). " I

I 25 I

Claims (32)

1. Præparat, der omfatter enkelt-kæde-urokinase, hvilken urokinase er resistent over for proteolytisk omdannelse til to-kæde-urokinase og har fibrinolytisk 5 aktivitet, hvilken urokinase ikke er en nativ enkelt-kæde-urokinase og ikke er en f urokinase, der har en aminosyresekvens, som er identisk med den naturlige . humane prourokinase i fig. 1, men hvilken urokinase haren sur aminosyrerest i position 157 og eventuelt methionin N-terminalt.

2. Præparat ifølge krav 1, hvor urokinasen er en aminosyresekvensvariant.

3. Præparat ifølge krav 2, hvor urokinasen er human, og variationen inkluderer en mutant aminosyresekvens i området resterne Argl5é til LySise-

4. Præparat ifølge krav 3, hvor urokinasen er [Phei57 Lys,58-»A] urokinase.

5. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 2 og 4, hvor variationen yderligere inkluderer en mutant aminosyresekvens i området resterne Lysi35til Lysi36.

6. Præparat, der omfatter urokinase, hvilken urokinase har fibrinolytisk aktivitet og er en aminosyresekvensvariant af human urokinase, hvor varianten har en mutant aminosyresekvens i området resterne Lysi35 til Lysj36, således at varianten er resistent over for proteolytisk kløvning ved Lys135 Lysi36*stedet; hvilken urokinase ikke er en urokinase, der har en aminosyresekvens, som er identisk 25 med den naturlige humane prourokinase i fig. 1, men hvilken urokinase har en ikke-basisk aminosyrerest i position 135 og eventuelt methionin N-terminalt.

7. Præparatet ifølge krav 6, hvor urokinasen er Lysi36-»A urokinase.

8. Præparatet ifølge et hvilket som helst af kravene 2-6, hvor urokinasen er en deletionsmutant af urokinase.

9. Præparat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor urokinasen er resistent over for bakterielle proteaser. 35

10. Præparat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor urokinasen er resistent over for plasmin.

11. Præparat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den protease-40 resistente enkelt-kæde-urokinase ved inkubation med humant plasmin omdannes I DK 175304 B1 I I 22 I I til to-kæde-urokinase i en grad på mindre end 10% af omdannelsesgraden af I I nativ enkelt-kæde-urokinase. I

12. Præparat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den protease- I I 5 resistente urokinase er mindre modtagelige for proteolytisk omdannelse til to- I I kæde-urokinase end nativ enkelt-kæde-urokinase. ’ I

13. Præparat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor urokinasen er I I valgt blandt [Lysi36-^A] human urokinase, Pheis7 LySi58-»A] human urokinase, I I 10 [Pheis? Lysise Lysnet] human urokinase, [Argiss] human urokinase, [His158] I I human urokinase, [Glyise] human urokinase, [Seri58] human urokinase, [Tyr158] I I human urokinase, [Arg156-»His; Lysi58->Ser] human urokinase, [Argi56 Lysi58->A] I I human urokinase, [ArgjS6 Phei57 Lysi58-»A] human urokinase, [Lysi58Ilei59->l-ySi58 I I Pro Ilej59] human urokinase, [Phei57 LySis8-»A; Argi56->His} human urokinase og I I 15 [Argi56 Phei57-^A; Lysjss-^Gly] human urokinase. I

14. Præparat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, der omfatter en I I terapeutisk effektiv koncentration af den protease-resistente urokinase i I I tilsætning med en farmakologisk acceptabel excipient. I I 20 i

15. Præparat ifølge krav 14, hvor koncentrationen er fra omkring 10.000 til I I omkring 75.000 int. enh. urokinase/ml. I

16. Nukleinsyre, der koder for enkelt-kæde-urokinase, hvilken urokinase er I I 25 resistent over for proteolytisk omdannelse til to-kæde-urokinase, hvilken I I urokinase har fibrinolytisk aktivitet og hvilken urokinase er en aminosyre- I I sekvensvariant af urokinase forskellig fra en urokinase, der har en I I aminosyresekvens, som er identisk med den naturlige humane prourokinase ϊ fig. I I 1, men hvilken urokinase har en sur aminosyrerest i position 157 og eventuelt I I 30 methionin N-terminalt. I

17. Nukleinsyre ifølge krav 16, hvor urokinasen er human, og variationen I I inkluderer en mutant aminosyresekvens i området resterne Argi56 til LySi58. I I 35

18. Nukleinsyre ifølge krav 16 eller 17, hvor variationen yderligere inkluderer en I I mutant aminosyresekvens i området resterne Lys^s til LySi36. I

19. Nukleinsyre, der koder for en urokinase, hvilken urokinase har fibrinolytisk I aktivitet og er en aminosyresekvensvariant af human urokinase, hvor varianten I I 40 har en mutant aminosyresekvens i området resterne Lysi3s til Lysi36, således at I DK 175304 B1 varianten er resistent over for proteolytisk kløvning ved Lysi35 Lysj36-stedet; hvilken urokinase ikke er en urokinase, der har en aminosyresekvens, som er identisk med den naturlige humane prourokinase i fig. 1, men hvilken urokinasé har en ikke-basisk aminosyrerest i position 135 og eventuelt methionin N-5 terminalt.

20. Nukleinsyre ifølge et hvilket som helst af kravene 16-19, hvor varianten er en deletionsmutant af urokinase-genet.

21. Nukleinsyre ifølge krav 20, hvor mutanten er [LyS]36-»A) human urokinase.

22- Replicerbar vektor, der omfatter en nukleinsyre ifølge et hvilket som helst af kravene 16-21.

23. Rekombinant værtscelle, der er transformeret med en vektor ifølge krav 22.

24. Fremgangsmåde til fremstilling af en variant af urokinase, hvilken fremgangmåde omfatter 20 (a) at der tilvejebringes nukleinsyre, der koder for en fibrinolytisk aktiv aminosyresekvensvariant af enkelt-kæde-urokinase, hvilken variant er resistent over for proteolytisk omdannelse til to-kæde-urokinase, og hvilken urokinase ikke er en urokinase, der har en aminosyresekvens, som er identisk med den naturlige humane prourokinase i fig. 1, men hvilken 25 urokinase har en sur aminosyrerest i position 157 og eventuelt methionin N-terminalt, (b) at en værtscelle transformeres med nukleinsyren fra trin (a), 30 (c) at den transformerede værtscelle dyrkes, indtil urokinasevarianten er akkumuleret i kulturen, og (d) at urokinasevarianten udvindes fra kulturen.

25. Fremgangsmåde til fremstilling af en variant af urokinase, hvilken fremgangmåde omfatter (a) at der tilvejebringes en nukleinsyre, der koder for en urokinase, som har fibrinolytisk aktivitet og som er en aminosyresekvensvariant af human 40 urokinase, hvilken variant har en mutant aminosyresekvens i området I DK 175304 B1 I I 24 I I resterne LysJ3S til LySi36, siledes at varianten er resistent over for I I proteolytisk kløvning ved LySi35 Lyststedet; hvilken urokinase ikke er en I I urokinase, der har en aminosyresekvens, som er identisk med den I I naturlige humane prourokinase i fig. 1, men hvilken urokinase har en ikke- I I 5 basisk aminosyrerest i position 135 og eventuelt methionin N-terminalt, I I (b) at en værtscelle transformeres med nukleinsyren fra trin (a), I I (c) at den transformerede værtscelle dyrkes, indtil urokinasevarianten er akku- I I 10 muleret i kulturen, og I I (d) at urokinasevarianten udvindes fra kulturen. I

26. Fremgangsmåde ifølge krav 24 eller 25, hvor værtscellen er en prokaryotisk I I 15 celle. I

27. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 24-26, hvor urokinasen I I udvindes fra kulturen ved en procedure omfattende I I 20 (a) indhøstning af lysbrydende legemer indeholdende enkelt-kæde-urokinasen, i I (b) solubilisering af urokinasen i de lysbrydende legemer, I I (c) adsorption af uønskede proteiner på en kationbytterharpiks, I I 25 I I (d) adsorption af den solubiliserede urokinase pi hydroxylapatit, og I I (e) eluering af urokinasen fra hydroxylapatiten. I I 30

28. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 24-27, hvor urokinasen I I udvindes ved en procedure, som ikke inkluderer anvendelse af en exogent tilsat I I proteolyseinhibitor eller benzamidin-sepharose. I

29. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13 til anvendelse i I I 35 behandling af en vaskuløs embolus. I

30. Præparat ifølge krav 29, hvor urokinasen er [Lys,35 Phei57 Lysi58-»A] til I I indgivelse ved intravenøs infusion med en dosis på ca. 4000 int.enh./kg/h. I DK 175304 B1

31. Præparat ifølge krav 30, hvor urokinasen er [Lys136 ->δ] til indgivelse ved intravenøs infusion med en dosis på ca. 4000 int.enh./kg/h.

32. Protease-resistent modificeret human urokinase, der har en muteret 5 aminosyresekvens ved (a) resterne Argi56 Phe,57 Lysi58, (b) resterne Lysi35 LySi36, eller (c) resterne Arg156 Pheisy Lysise og resterne Lysi35 Lys,36; hvilken urokinase ikke er: (i) en urokinase, der har en aminosyresekvens, som er identisk med den naturlige humane prourokinase i fig. 1, men hvilken urokinase har en sur aminosyrerest i position 157 og eventuelt methionin N-terminalt; eller (ii) en 10 urokinase, der har en aminosyresekvens, som er identisk med den naturlige humane prourokinase i fig. 1, men hvilken urokinase har en ikke-basisk aminosyrerest i position 135 og eventuelt methionin N-terminålt.