PT89285B - Metodo para a producao recombinante de formas zimogenicas de proteina c humana - Google Patents

Metodo para a producao recombinante de formas zimogenicas de proteina c humana Download PDF

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Description

MEMÓRIA DESCRITIVA
Resumo
O presente invento diz respeito a um método para a produção recombinante de formas zimogénicas de proteína C humana. Estas formas zimogénicas diferem da proteína C zimogénica nativa pela sua sensibilidade aumentada í
.1
ELI LILLY AND COMPANY
MÉTODO PARA A PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE FORMAS ZIMOGÉNICAS DE PROTEÍNA C HUMANA
à activação pela trombina e trombina/trombomodu I ina . E também descrito o processo para a preparação de compostos de DNA, vectores e transformantes, úteis neste método.
método consiste em (A) se transformar uma célula eucariótica com um vector de DNA recombinante que compreende (i) uma sequência de DNA adequada que codifica uma sequência de resíduos de aminoácidos (ii) um promotor colocado de modo a poder dirigir a expressão da sequência de DNA e (B) se cultivar a célula hospedeira transfor mada no passo (A) sob condições que permitem a expressão da sequência de DNA.
presente invento relaciona-se com novos compostos de DNA e vectores de clonagem de DNA recombinante que codificam novas formas zimogénicas de proteína C humana. Estes zimogénios podem ser activados in vivo pela trombina sózinha a uma velocidade de importância clinica e são muito maus susceptiveis à activação por trombina/ /trombomodu1ina do que o zimogénio nativo da proteína C.Os vectores de expressão proporcionam um meio simples e eficaz para a expressão destes zimogénios de proteína C humana em células hospedeiras recombinantes. Os zimogénios nativos da proteína C requerem tratamento com níveis altos de trombina , ou trombina e trombomodu1ina ou outras enzimas caras para serem activados. 0 presente invento proporciona um método para a produção de formas zimogénicas de proteína C humana que servem como melhor substrato para a trombina e consequentemente podem ser activadas na presença de níveis baixos de trombina ou trombina/trombomodu1ina ou outras enzimas. Mais importante, as formas zimogénicas da proteína C humana do invento podem ser activadas pela trombina mesmo na presença de Ca^ fisiológico, o qual é inibidor da activação do zimogénio nativo da proteína C pela trombina. As novas formas zimogénicas da proteína C humana diferem das conhecidas no que respeita â sequência de resíduos de aminoácidos do peptideo de activação, o qual é removido das formas zimogénicas para produzir proteína C humana activada. Estas novas formas zimogénicas da proteína C oferecem vantagens especiais no tratamento de desordens sanguíneas envolvendo coagulação.
A proteína C, uma proteína do plasma dependente da vitamina K, é da maior importância fisiológica no controle da hemostasia e desempenha um papel importante na regulação da coagulação do sangue. A proteína C é sintetizada como uma molécula inactiva, aqui designada proteína C nascente. A proteína C nascente sofre processamento complexo, dando origem a uma série de diferentes moléculas inactivas conforme à frente é descrito mais deta1hadamente.As
formas inactivas secretadas da proteína C são referidas como proteína C zimogénica. A activação da proteína C ocorre no sangue através de uma reacção que envolve um complexo trom bomodulina-trombina. A proteína C activada, juntamente com o seu cofactor proteína S, é um anticoagu1 ante de grande importância fisiológica. A proteína C activada pode evitar a trombose intravascular e controlar a extensão de coágulos existentes. 0 mecanismo de activação da forma activada de proteína C e o mecanismo de activação do zimogénio inactivo para dar protease activa tem sido clarificado nos últimos anos (para revisão, ver J.E. Gardiner e J.H. Griffiη,Progress in Hematology, Vol XIII, pp. 265-278, ed. Elmer B. Brown, Grune e Stratton, Inc., 1983).
A activação da proteína C envolve trombioa, a protease serina final na cascada de coagulação e uma g 1 icoproteina associada à membrana de células endoteliais desiganda trombomodu1ina. A trombomodu1ina forma um complexo estequiométrico cerrado com trombina. A trombomodulina quando complexada com trombina, altera totalmente as propriedades funcionais da trombina. A trombina normalmente coagula o fibrinogénio, activa as plaquetas e converte os factores de coagulação V e VIII ras suas formas activadas, Va e VlIIa. Finalmente, a trombina activa a proteína C,mas apenas muito lentamente e ineficazmente e a activação é ainda inibida por Ca^+ fisiológico. Ao contrário, a trombina complexada com trombomodu1ina não coagula fibrinogénio , activa plaquetas ou converte os factores de coagulação V e VIII nas suas contrapartes Va e VlIIa, mas torna-se um activador muito eficaz do zimogénio da proteína C na presença de Ca2+ fisiológico. A constantecb velocidade de activação do zimogénio da proteína C pela trombomodulina-trombina é cerca de 1000 vezes superior do que a constante de velocidade da trombina sózinha.
-5Para compreender como a proteína C activada regula de modo negativo a coagulação do sangue proporciona-se a seguir uma descrição breve do sistema enzimático de coagulação. A melhor maneira de ver o sistema de coagulação é como uma reacção em cadeia envolvendo a activação sequenciada de zimogénios em proteases serina activas. Esta reacção em cadeia priduz eventua1 mente a enzima trombina, que através de proteólise limitada converte o fibrinogénio do plasma em fibrina gel insolúvel. Dois acontecimentos chave na cascada de regulação são a conversão do factor de coagulação X em Xa pelo factor de coagulação IXa e a conversão da protrombina em trombina pelo factor de coagulação Xa. Ambas as reacções ocorrem na superfície das células, principalmente na superfície das plaquetas e ambas as reacções requerem cofactires. Os cofactores pr i nc i pa i s , factores V e VIII, no sistema circulam como precursores relativamente inactivos, mas quando as primeiras poucas moléculas de trombina se formam, a trombina activa os cofactores através de proteólise limitada. Os cofactores activados Va e VHIa, aceleram a conversão da protrombina em trombina e também a conversão do factor X em factor Xa em aproximadamente cinco ordens de grandeza. A proteína C activada actua preferencia], mente sobre os factores de coagulação Va e VlIIa, as formas activadas dos factores de coagulação V e VIII, para proteoliticamente os degradar, hidrolizar e irreversivelmente destruir. Os factores de coagulação V e VIII, pelo contrário, são substratos fracos i n v i vo da proteína C activada. ·
Um cofactor importante da proteína C activada é a proteína S, uma outra proteina do plasma dependente da vitamina K. A proteina S aumenta substancialmente a hidrólise dos factores Va e VlIIa, 25 vezes, mediada pela proteina C activada.
A proteína C é reconhecida como um agente terapêutico importante (ver, por exemplo, Publicações de Patentes Europeias Nos. 0215548 e 0191606). A proteína C activada é um novo agente antitrombótico com um índice terapêutico mais vasto do que os anticoagu1 antes vulgares, como sejam a heparína e os anticoagu1 antes orais do tipo hidroxicoumarina. Nem a proteína C zimogénica nem a proteína C activada são eficazes até se gerar trombina, porque a trombina é necessária para converter os factores de coagulação V e VIII em Va e VlIIa respectivamente; as formas activadas destes dois cofactores são o substrato preferido da proteína C activada. A trombina é também necessária para activar a proteína C zimogénica, porque com o complexo trombo modu1ina-trombina, a proteína C zimogénica não é convertida na sua contraparte activa.
A proteína C activada é um anticoagu 1 an_ te importante porque a proteína C activada funciona através da inactivação dos cofactores Va e VlIIa. Devido à trombina ser necessária para converter os factores V e VIII nas suas contrapartes activadas Va e VlIIa, a proteína C actua apenas como anticoagu1 ante após produção de trombina. Os anticoagulantes convencionais, ao contrário da proteína C activada, mantêm um estado constante de anticoaguI ante durante a circulação a partir do momento em que são dados ao paciente, aumentando assim substancialmente o risco de complicações do tipo hemorregia relativamente à proteína C ou à proteína C activada. A proteína C activada é portanto um anticoagu1 ante necessário de grande utilidade clinica para usar como alternativa à heparína e às hidroxicoumarinas.
Nalguras doenças, como seja deficiência em proteína C hereditária , o zimogénio da proteína C é de grande importância terapêutica. Na deficiência em proteína
C homozigôtica congénita, os indivíduos afectados morrem durante a infância de purpura fulminans, uma forma muitas vezes letal de coagulação intravascular disseminada. Na dedifiência em proteína C heterozigôtica , os indivíduos afecta dos sofrem de ataques tromboembó1icos frequentes e graves. Está clinicamente bem estabelecido, que os concentrados de proteína plasmática destinados a tratar hemofilia B ou deficiência no factor IX, que contem proteína C como uma impureza, são eficazes na prevenção e tratamento de coagulação intravascular na deficiência em proteína C heterozigôtica. Também se observou níveis de proteína C anormalmente baixos em estados trombóticos tais como coagulação intravascular disseminada e em estados de doenças com predisposição para trombose, como seja trauma major cirúrgica major e cancro .
Para facilitar uma compreensão da activação da proteína C e o invento, descreve-se abaixo a sequencia codificadora e a correspondente sequência de resíduos de aminoácidos da proteína C humana nascente. Esta sequência de resíduos de aminoácidos e suas partes importantes, também caracteriza a proteína C humana nativa para fins do presente invento.
10 5'-ATG TGG CAG CTC ACA AGC h2n-met trp gln LEU thr SER 5 20 CTC LEU CTG LEU 30 40 ACC TGG GGA ATT ILE
CTG LEU TTC PHE 10 GTG GCC
VAL ALA THR TRP GLY 15
50 60 70 80 90
TCC GGC ACA CCA GCT CCT CTT GAC TCA GTG TTC TCC AGC AGC GAG CGT
SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG
20 25 30
100 110 120 130 140
GCC CAC CAG GTG CTG CGG ATC CGC AAA CGT GCC AAC TCC TTC CTG GAG
ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU
35 40 45
150 160 170 180 190
GAG CTC CGT CAC AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC ATA GAG GAG ATC TGT
GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS
50 55 60
200 210 220 230 240
GAC TTC GAG GAG GCC AAG GAA ATT TTC CAA AAT CTG GAT GAC ACA CTG
ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU
65 70 75 80
250 260 270 280
GCC TTC TGG TCC AAG CAC GTC GAC GGT GAC CAG TGC TTG GTC TTG CCC
ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO
85 90 95
290 300 310 320 330
TTG GAG CAC CCG TGC GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG TGC ATC
LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE
100 105 110
340 350 360 370 380
GAC GGC ATC GGC AGC TTC AGC TGC GAC TGC CGC AGC GGC TGG GAG GGC
ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY
115 120 125
390 400 410 420 430
CGC TTC ARG PHE 130 TGC CAG CGC ARG GAG GLU GTG VAL 135 AGC TTC CTC AAT TGC TCG CTG GAC AAC
CYS GLN SER PHE LEU ASN CYS 140 SER LEU ASP ASN
440 450 460 470 480
GGC GGC TGC ACG CAT TAC TGC CTA GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC TGT
GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS
145 150 155 160
490 500 510 520
AGC TGT GCG CCT GGC TAC AAG CTG GGG GAC GAC CTC CTG CAG TGT CAC
SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS
165 170 175
530 540 550 560 570
CCC GCA GTG AAG PRO ALA VAL LYS TTC CCT TGT GGG CYS GLY AGG CCC TGG AAG CGG ATG GAG AAG
PHE PRO ARG 185 PRO TRP LYS ARG MET 190 GLU LYS
180
580 590 600 610 620
AAG CGC AGT CAC CTG AAA CGA GAC ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA
LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL
195 200 205
630 640 650 660 670
GAT CCG CGG CTC ATT GAT GGG AAG ATG ACC AGG CGG GGA GAC AGC CCC
ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO
210 215 220
680 690 700 710 720
TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA
TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA
225 230 235 240
730 740 750 760
GTG CTC ATC CAC CCC TCC TGG GTG CTG ACA GCG GCC CAC TGC ATG GAT
VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP
245 250 255
-ΙΟ-
770 GAG TCC GLU SER AAG LYS 780 AAG CTC LYS LEU 260 CTT LEU GTC VAL 790 AGG ARG CTT LEU 265 GGA GLY 800 GAG TAT GLU TYR GAC ASP 810 CTG CGG LEU ARG 270 CGC ARG
820 830 840 850 860
TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC
TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS
275 280 285
870 880 890 900 910
ccc AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC
PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS
290 295 300
920 930 940 950 960
CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC TGC CTC
LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU
305 310 315 320
970 980 990 1000
CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC AAT CAG GCC GGC CAG GAG
PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU
325 330 335
1010 1020 1030 1040 1050
ACC CTC GTG ACG GGC TGG GGC TAC CAC AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC
THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA
340 345 350
1060 1070 1080 1090 1100
AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC AAC TTC ATC AAG ATT CCC GTG GTC
LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL
355 360 365
1110 1120 1130 1140 1150
CCG CAC AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG TCT GAG AAC
PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN
370 375 380
1160 1170 1180 1190 1200
ATG CTG TGT GCG GGC ATC CTC GGG GAC CGG CAG GAT GCC TGC GAG GGC
MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
385 390 395 400
-li-
GAC ASP AGT SER GGG GLY 1210 GGG CCC GLY PRO 405 ATG MET 1220 GTC GCC VAL ALA TCC SER 1230 TTC CAC PHE HIS 410 GGC GLY ACC THR 1240 TGG TTC TRP PHE 415 CTG LEU
1250 1260 1270 1280 1290
GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC CTT CAC AAC TAC
VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR
420 425 430
1300 1310 1320 1330 1340
GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAC CTC GAC TGG ATC CAT GGG CAC
GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS
435 440 445
1350 1360 1370 1380
ATC AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT TAG- •3'
ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- •COOH
450 455 460
em que A é desoxiadeni1 o, G é desoxiguanilo, C é desoxicitidilo, T é timidilo, ALA é Alaiina, ARG é Arginina, ASN é Asparagina, ASP é Acido Aspártico, -COOH é o extremo carboxilo, CYS é Cisteina, GLN é Glutamina, GLU é Acido Glutâmico, GLY é Glicina, HgN é o extremo amino, ILE é Isoleucina, LEU é Leucina, LYS é Lisina, MET é Metionina, PHE é Feni 1 a 1 anina, PRO é Prolina, SER é Serina, THR é Treonina, TRP é Triptofano, TYR é Tirosina e VAL é Valina.
A sequência de DNA descrita atrás derivou de clones de cDNA preparados a partir de mRNA de fígado humano que codifica a proteína C humana. Os familiarizados com a matéria reconhecem que a natureza degenerada
do código genético permite construir muitas sequências de DNA diferentes que codificam a mesma seqiBicia de resíduos de aminoácidos. A sequência de cDNA para a proteína C humana nascente descrita atrás é assim apenas uma de muitas possíveis sequências codificadoras de proteína C humana nascente. Ao construir-se os clones de cDNA, uma sequência poli G 5' , uma sequência poli C 3' e sequências de reconhecimento da enzima de restrição Pst I 3' e 5' foram construídas nos extremos do cDNA codificador da proteína C. Dois destes clones de cDNA foram manipulados para construir uma molécula de DNA compreendendo a sequência codificadora da proteína C humana nascente e também porções do DNA codificador do mRNA não traduzido nos extremos 5' e 3' da região codificadora. Esta molécula de DNA foi inserida no sitio Pst I do plasmídeo pBR322 para construir o plasmideo pHC7. 0 plasmideo pHC7 compreende assim a sequência codificadora acima e, novamente descrevendo apenas uma cadeia da molécula, contem também estas sequências adicionais:
5'-C TGC AGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG CTG TCA TGG CGG CAG GAC
GGC GAA CTT GCA GTA TCT CCA CGA CCC GCC CCT ACA GGT GCC
o AGT GCC TCC AGA-3'
'-CGA CCC TCC CTG CAG GGC TGG GCT TTT GCA TGG CAA TGG ATG GGA
CAT TAA AGG GAC ATG TAA CAA GCA CAC CCC CCC CCC CCC CCC CCC
CCC CCC CCT GCA G-3'
-13nos extremos 5' e 3' respectivamente, da cadeia codificadora da sequência codificadora da proteína C humana nativa. Devido à natureza complementar do emparelhamento de bases do DNA, a sequência de uma cadeia de uma molécula de DNA de cadeia dupla é suficiente para determinar a sequência da cadeia oposta. 0 plasmídeo pHC7 pode ser convencionalmente isolado a partir de £. coli K12 RRl/pHC7, uma estirpe depositada e que faz parte da colecção permanente de culturas stock do Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois. Uma cultura de E_. co 1 i K12 RRl/pHC7 pode ser obtida no NRRL com o número de acesso
NRRL B-15926. Na Figura 2 está apresentado um mapa de sítios de restrição e de funções do plasmídeo pHC7 dos desenhos juntos.
A proteína C nascente também pode ser descrita esquemáticamente como se mostra abaixo.
,1 42,43 197|198 199,200 211,212 461 |pre-pro | LC| KR | AP |AHC <---------HC------------>
pre-pro- resíduos de aminoácidos 1-42 da proteína C humana nascente que codificam o peptideo sinal e o propeptideo da proteína C humana, importante para dirigir a secreção e γ-carboxi1 ação da proteína C.
LC - residuo de aminoácidos 43-197 da proteína C nascente, uma vez modificada após a tradução, constitui a cadeia leve (£C) do zimogénio de duas cadeias (formado a partir do zimogénio de uma só cadeia
por remoção do dipeptideo KR, conforme discutido abaixo) e formas activadas da proteína C.
KR resíduos de aminoácidos 198-199 da proteína C humana nascente; pensa-se que estes resíduos sejam removidos (com base na homologia com a proteína C bovina) provávelmente por um processo de dois passos compreendendo uma primeira clivagem (quer entre os resíduos 197-198 quer entre 199-200) seguido da acção de carboxipeptidases ou aminopeptida se para formar proteína C de duas cadeias.
AP - resíduos de aminoácidos 200-211 da proteína C nascente constituem o peptideo de activação que é removido das formas zimogénicas da proteína C para se obter proteína C activada.
AHC - resíduos de aminoácidos 212-461 da proteína C nascente, uma vez modificados após a tradução, constituem a cadeia pesada activada (AHC) da proteína C activa.
HC - a cadeia pesada da forma de duas cadeias do zimogénio da proteína C, uma vez modificada após tradução é composta pelos resíduos de aminoácidos 200-461, o AP e AHC.
zimogénio da proteína C humana é um precursor de protease serina sintetizado no fígado e presente no sangue. Para expressão de actividade biológica completa, a proteína C requere modificações após tradução para as quais é necessária a vitamina K. 0 zimogénio da proteína C de duas cadeias ligadas por pontes dissulfureto
-15surge do zimogénio de cadeia sirples por proteólise limitada. Pensa-se que esta proteólise limitada inclui clivagem e remoção dos resíduos de aminoácidos 198 e 199. A activação do zimogénio de duas cadeias na protease serina activa envolve a clivagem proteolitica de uma ligação peptidica ARG-LEU (resíduos 211 e 212). Esta última clivagem liberta um dodecapeptideo (resíduos 200-211), o peptideo de activação, que constitui o extremo amino da cadeia maior (pesada) da molécula de zimogénio de duas cadeias. A proteína C é bastante glicosilada; a enzima madura contem^23% de açúcares. A proteína C também contém uma série de aminoácidos invulgares, incluindo ácido Γ-carboxig1utâmico e ácido β-hidroxiaspártico (eritro-L-p-hidroxi-aspartato). 0 ácido Γ-carboxiglutâmico (gla) é produzido por carboxilação de K-glutamilo a partir de resíduos de ácido glutâmicocom a ajuda de uma carboxilase microssómica hepática que requere a vitamina K como cofactor.
A activação da proteína C humana também pode ser representada esquemáticamente e mostra-se abaixo. Os familiarizados com a matéria reconhecem que a ordem dos passos mostrados no esquema não reflecte necessáriamente a ordem dos passos da via metabólica in vivo.
-16pre-pro-LC-KR-AP-AHC proteína C nascente modificação pós tradução , i. e. f-carbox i - , | lação dos resíduos de ácido glutâmico | específicos,β-hidroxi1 ação de um resíduo | de ácido aspártico e glicosilaçãoI
I secreção,a remoção dos resíduos'
1-42,que podem envolver mais do que I uma clivagem proteolitica'
LC-KR-AP-AHC zimogénio de uma cadeia
I
I reroção dos resíduos 198-199,cerca' de 90% da proteína C zimogénica' encontrada no sangue humano é a * forma de duas cadeias (S-S=ligação j d i ssu1fureto )
LC
I
S-S zimogénio de
I duas cadeias
AHC-AP activação por ψ trombina-trombomodulina
LC
I
S-S proteína C activada
AHC
presente invento proporciona novos compostos, vectores, transformantes e métodos para a expressão recombinante de novos zimogénios da proteína C.
Para fins do presente invento, conforme aqui é descrito e reivindicado, os termos que se seguem são conforme definidos abaixo.
Ad2LP- o principal do adenovírus tipo 2. promotor tardio
ou peptideos aqui Resíduos de aminoácidos em proteínas descritos abreviados como se segue:
Abreviatura Abrev i at ura
de três letras Residuo de aminoácido de uma letra
PHE Fen i1 a Ian i na F
LEU Leuc i na L
ILE Isoleucina I
MET Meti on i na M
VAL Va1i na V
SER Ser i na S
PRO Proli na P
THR T reon i na T
ALA AIan i na A
TIR T i ros i na Y
HIS H i st i d i na H
GLN G1utam i na Q
ASN Aspa rag i na N
LYS L i s i na K
ASP Acido Aspártico D
GLU Acido Glutâmico E
CYS C i ste ina C
TRP Triptofano W
ARG Arg i ni na R
GLY G1i c i na G
-18ApR - o fenótipo resistente à ampicilina ou o gene que confere o mesmo.
BK - DNA do vírus BK.
CAT- o gene da acetiltransferase do c 1 oranfen i co1.
Enh ou potenciador - o potenciador do vírus BK.
ep ou SV40ep - um segmento de DNA compreendendo o promotor precoce do SV40 do gene do antigénio T, os sitios de ligação do antigénio T, o potenciador do SV40 e a origem de replicação do SV40.
Ίί- carboxi 1 ação- uma reacção que adiciona um grupo carboxilo aos ácidos glutâmicos no carbono proteina f-carboxi1ada - uma proteina em que alguns resíduos de ácidos glutâmicos sofreram y-carboxilação.
IVS - DNA codificador de um intrão, também designado sequência interviniente.
MMTpro - o promotor do gene da metalotioneína I de ratinho.
Proteina nascente - o polipeptideo produzido quando da tradução de um mRNA, antes de quaisquer modificações pós-tradução. No entanto as modificações pós-tradução tais como γ-carboxi1 ação de resíduos de ácido glutâmico e hidroxilação de resíduos de ácido aspártico pode ocorrer antes de uma proteina estar totalmente traduzida a partir de um mRNA.
NeoR - um gene que confere resistência à neomicina, o qual pode também ser usado para conferir resistência ao antibiótico G418.
pA - uma sequencia de DNA codificadora de um sinal de po1iadeni1 ação.
Promotor - uma sequencia de DNA que dirige a transcrição de DNA em RNA.
Actividade de proteína C - qualquer propriedade da proteína C humana responsável por actividades proteolitica, amidolitica, estereolitica e biologica (anticoagu1 ante ou profibrino 1itica). Os métodos para detectar proteínas com actividade anticoagu1 ante são bem conhecidos, i.e., ver Grinnell et al., 1987, Biotechnology 5:1189.
Vector de clonagem de DNA recombinante - qualquer agente, incluindo, mas não limitados: agentes de integração cromossómica, plasmideos de replicação autónoma e fagos, compreendendo uma molécula de DNA a que um ou mais segmentos de DNA adicionais podem ser ou foram adicionados.
Vector de expressão de DNA recombinar^ te - qualquer vector de clonagem de DNA recombinante no qual foi incorporado um promotor e colocado de modo a dirigr a expressão do produto de um gene.
Vector de DNA recombinante - qualquer vector de clonagem ou expressão de DNA recombinante.
Replicão - uma sequencia de DNA que controla e permite a replicação autónoma de um plasmideo ou outro vector.
Fragmento de restrição - qualquer sequência de DNA linear gerada pela acção de uma ou mais enzimas endonuc1eases de restrição.
Célula hospedeira sensível - uma célula hospedeira que não pode crescer na presença de um dado antibiótico ou outro composto tóxico sem um segmento de DNA que lhes confira resistência.
TcR - o fenótipo de resistência â tetraciclina ou o gene que confere o mesmo.
Transformação - a introdução de DNA numa célula hospedeira recipiente que altera o genótipo da célula rec i p iente.
Transformante - uma célula hospedeira recipiente que sofreu transformação.
Sequência de activação da traduçãoqualquer sequência de DNA, inclusive a codificadora de um sítio de ligação ao ribossoma e codão de iniciação da tradução, como seja 5'-ATG-3', que proporciona a tradução de um mRNA num peptideo ou piipeptideo.
Zimogénio - um precursor enzimáticamente inactivo de uma enzima proteo1itica. Zimogénio da proteína C, como aqui é usado, refere-se a formas inactivas secretadas da proteína C, quer de uma quer de duas cadeias.
A Figura 1 consiste em quatro partes que ilustram esquemáticamente o protocolo de construção do plasmideo pLPC, um material de partida usado na construção do plasmideo de partida pLAPC.
-21A Figura 1, Parte A, descreve a construção do plasmideo pBKneol a partir do vírus BK e do plasmideo pdBPV-MMtneo.
A figura 1, Parte B, descreve a construção do plasmideo pLPcat a partir do adenovírus 2 e do plasmideo pSV2cat.
A Figura 1, Parte C, descreve a construção do plasmideo pBLcat a partir do plasmideo pBKneol e do plasmideo pLPcat.
A Figura 1, Parte D, descreve a construção do plasmideo pLPC a partir do plasmideo pBLcat e do plasmideo pL133.
A Figura 2, ilustra esquematicamente a construção do plasmideo pL133, um material de partida usado na construção do plasmideo pLPC.
presente invento está relacionado com compostos de DNA que codificam a expressão de novas formas zimogénicas da proteína C humana. Vários métodos de produção do zimogénio da proteína C humana nativa e da proteína C humana nascente foram descritos (ver Publicação das Patentes Europeias 215548 e 191606). Estes métodos descritos proporcionam expressão das formas zimogénicas da proteína C humana que não diferem das formas zimogénicas presentes no sangue humano.
do por estes métodos deve como í<-trombina , tripsina zimogénio da proteína C produziser tratado com substâncias tais ou uma mistura de trombina e trombomodulina (quer in vi vo quer i n vitro) teina C activada. Em adição, uma forma teina C humana produzida por tecnologia que é idêntica às formas zimogénicas da encontrada naturalmente no sangue humano será apenas actipara se obter prozimogénica da prode DNA recombinante proteína C humana
vada no corpo pela via de activação natural envolvendo o complexo trombina-trombomodu1ina. 0 zimogénio da proteína C humana nativa pode ser activado pela trombina zózinha; no entanto, a activação requere a ausência de Ca^+ e niveis elevados de trombina e/ou zimogénio da proteína C que não é uma viva importante in vivo para a proteína C activada.
presente invento proporciona formas zimogénicas da proteína C humana que podem ser activadas in vivo pela trombina zózinha a uma velocidade clinicamente importante. Em adição, estas formas zimogénicas são muito mais susceptiveis à activação pela trombina/trombomodulina do que o zimogénio da proteína C humana nativa. 0 presente invento também proporciona compostos de DNA, vectores de expressão de DNA recombinante, linhas celulares transformadas e métodos para a expressão recombinante destas novas formas zimogénicas da proteína C humana. 0 método para a produção destas formas zimogénicas da proteína C humana compreende:
(A) transformação de uma célula hospedeira eucariótica com um vector de DNA recombinante, o referido vector compreender^ do:
(i) uma sequência de DNA que codifica uma sequência de resíduos de aminoácidos a referida sequencia de resíduos de aminoácidos compreendendo, a partir do extremo amino para o extremo carboxilo:
a) um peptideo sinal e pro-peptideo de uma proteína y-carboxilada secretada;
b) a cadeia leve da proteína C humana;
c) um dipeptideo seleccionado do grupo constituído por LYS-ARG, ARG-LYS, LYS-LYS e ARG-ARG;e
d) a sequência de resíduos de aminoácidos:
ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL
Ri r2 ARG LEU ILE r3 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO
TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA
VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP
GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG
TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS
PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS
LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU
PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU
THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA
LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL
PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN
MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU
VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR
GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS
ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- COOH
em que Rj é seleccionado do grupo constituído por PHE,GLY, TYR e TRP, R2 é seleccionado do grupo constituído por VAL e PRO, Rg é seleccionado do grupo constituído por ASP e ASN, ARG é Arginina, ASN é Asparagina, ASP é Acido aspártico, -COOH é o extremo carboxilo, CYS é Cisteina, GLN é Glutamina, GLU é Acido glutâmico, GLY é Glicina, HIS é Histidina, ILE é Isoleucina, LEU é Leucina, LYS é Lisina, MET é Metionina,
PHE é feni1 a 1anina, PRO é Prolina, SER é Serina, THR é Treonina, TRP é Triptofano, TYR é Tirosina e VAL é Valina; e (ii) um promotor colocado de modo a dirigir a expressão da referida sequência de DNA; e (B) cultura da referida célula hospedeira transformada no passo (A) em condições que permitam a expressão da referida sequência de DNA. Este método e compostos úteis no método são descritos mais deta1hadamente abaixo.
invento também proporciona compostos de DNA para usar no método de produção destas novas formas zimogénicas da proteína C humana. Estes novos compostos codificam todos um pre-propeptideo compreendendo um peptideo sinal para dirigir a secreção e um propeptideo de uma proteína £-carboxi1ada (através da acção de uma carboxilase dependente de vitamina K). Tais sequências propeptidicas são bem conhecidas na especialidade. Ver, por exemplo, Suttie et a 1., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei.84:634-637. De preferencia e para facilitar a construção, tanto a sequencia codificadora do peptideo sinal como a sequencia codificadora do propeptideo serão derivadas da sequência de resíduos de aminoácidos do pre-propeptideo de uma proteína y-carbox i 1 ada . Exemplos de tais proteínas >f-carbox i 1 adas incluem, mas não estão limitadas ao factor VII, factor IX, factor X, protrombina, proteína S, proteína Z e proteína C. Uma sequencia de DNA codificadora do pre-propeptideo da proteína C hurana é a preferida para usar nos vectores do invento.
Os compostos de DNA do invento compreendem ainda a sequência codificadora da cadeia leve da proteína C humana colocada imediatamente adjacente, e a jusante e na mesma grelha de leitura da sequencia codificadora do pre-propeptideo. A cadeia leve da proteína C humana
-25contem os resíduos de aminoácidos 43 a 197, inclusive, da proteína C nascente, conforme descrito na secção de fundamen_ tos atrás. As partes do extremo amino das proteínas plasmáticas dependentes de vitamina K, como seja a porção terminal amino da cadeia leve da proteína C, são responsáveis pela actividade de ligação do cálcio destas proteínas. Os domínios de ligação do cálcio destas proteínas p 1 asmáticas,tais como factor VII, factor IX, factor X, protrombina e proteína S, são intermutáveis (Ver Publicação da Patente Europeia No. 0215548A1, nas páginas 12 e 13) e equivalentes ao domínio de ligação do cálcio da cadeia leve da proteína C humana.
Os compostos de DNA do invento compreendem ainda a sequencia codificadora do dipeptidei LYS-ARG (KR) colocado imediatamente adjacente, e a jusante e na mesma grelha de leitura da sequencia codificadora da cadeia leve. Um dipeptideo dibásico como seja LYS-ARG é colocado na proteína nascente no lado do extremo carboxilo da cadeia leve. A orientação do dipeptideo LYS-ARG na proteína expressa é irrelevante para fins do presente invento. Os dipeptideos dibásicos tais como LYS-LYS ou ARG-ARG são equivalentes ao dipeptideo LYS-ARG para fins do presente invento. Para fins do presente invento, no entanto prefere-se o dipeptideo LYS-ARG, que é o dipeptideo da proteína C nativa humana.
Imediatamente a jusante dos codões do dipeptideo LYS-ARG está a sequencia codificadora do peptideo de activação. Nos compostos do invento, alterações na sequencia codificadora do peptideo de activação (e correspondente sequencia de aminoácidos) são as principais responsáveis pela propriedade do aumento de sensibilidade à trombina destes novos zimogénios.
-26Os fami1iarizados com a matéria reconhecerão que as formas zimogénicas do presente invento diferem básicamente das formas zimogénicas nativas da proteína C humana como descrito abaixo. Na proteína C humana nativa o peptideo de activação é:
200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 ASP-THR-GLU-ASP-GLN-GLU-ASP-GLN-VAL-ASP-PRO-ARG, no qual os números referem-se à posição dos resíduos de aminoácidos na proteína C humana nascente. 0 presente invento descreve que a alteração cb resíduo ASP na posição 209 para um resíduo PHE, GLY, TYR ou TRP resultará na corres^ pondente forma zimogénica tendo uma maior sensibilidade para a clivagem pela trombina, sózinha, além de uma maior sensib^ lidade à clivagem pelo complexo trombina-trombomodu1ina.
Outras substituições de aminoácidos, em conjunção com as substituições na posição 209, podem também aumentar a sensibilidade à trombina do zimogénio resultante. A frase zimogénio resultante é usada para indicar que apesar de serem descritas substituições com referencia às posições de aminoácidos na proteína C humana nascente, a proteína C humana nascente deve ser primeiro secretada (resultando na remoção dos resíduos de aminoácidos 1 a 42) para se obter uma forma zimogénica. A substituição do resíduo prolina (no peptideo de activação) na posição 210 na proteína C nascente, além de uma das quatro substituições na posição 209 descrita acima, por um resíduo de valina resulta assim num novo zimogénio do presente invento. A substituição do residuo de ácido aspártico (na cadeia pesada activacLa) na posição 214 na proteína C humana nascente, além de uma das quatro substituições na po-
-27sição 209 descritas acima em adição ou não à substituição na posição 210 descrita acima, por um residuo de asparagina também resulta num novo zimogénio do presente invento.
Assim, as novas formas zimogénicas preferidas da proteína C humana do presente invento resultam da secreção e processamento de moléculas da proteína C humana nascente com a sequencia de resíduos de aminoácidos descrita abaixo:
h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE
SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG
ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU
GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS
ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU
ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO
LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE
ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY
ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN
GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS
SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS
PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS
LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL
Rt r2 ARG LEU ILE r3 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO
TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA
VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP
GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG
TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS
PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS
LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU
PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU
THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA
LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL
PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN
MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU
VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR
GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS
ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- COOH
ie R 1 é PHE, GLY,TYR OU TRP ; R. > é PRO OU VAL ; e R3 é
ASP ou ASN.
reconhecerão que,
Os familiarizados com a matefia devido à degeneração do código genético,
-29uma variedade de compostos de DNA podem codificar o polipeptideo descrito atrás. Consequentemente as construções descritas abaixo e nos Exemplos juntos para os compostos de DNA vectores e transformantes preferidos do invento são meramente ilustrativos e não limitam o âmbito do invento.
As novas sequências codificadoras do invento podem ser fácilmente construídas partindo de uma sequencia codificadora da proteína C humana nascente da qual se retirou a região codificadora de AP por mutágenese especifica de sitio. Mostrada esquemáticamente esta sequência codificadora tem a estrutura:
| pre-pro | LC | KR
AHC
Conforme descrito nos exemplos juntos, esta sequencia codificadora foi inseridb num vector de expressão de DNA recombinante e o vector resultante foi designado plasmideo pLAPC. 0 plasmideo pLAPC serve como material de partida util na construção de vectores ilustrativos do invento que dirigem altos niveis de expressão recombinante das novas formas zimogénicas da proteína C humana do invento. 0 protocolo de construção para o plasmideo pLAPC a partir do plasmideo inicial pHC7 está descrito no Exemplo 1. 0 plasmideo pHC7 pode ser adquirido ao Northern Regional Research Center (NRRL), Peoria, IL 61604 em E. coli K12 RRI/pHC7 com o número de acesso NRRL B-15926.
plasmideo pLPC-167G é um vector de expressão ilustrativo do invento no qual o codão para o ácido aspártico na posição 209 na proteína C humana nascente
foi alterado para um codão de glicina. 0 protocolo de construção para o plasmideo pLPC-167G está descrito detalhadamente no Exemplo 3. Essencialmente a construção envolve mutagénese especifica de sítio da sequencia codificadora da proteína C. Uma porção da sequencia codificadora da proteína C compreendendo o DNA codificador do peptideo de activação foi isolada a partir do plasmideo pHC7, inserido no fago M13mpl8 e depois alterada por mutagénese especifica de sitio. A sequencia codificadora mutagenizada foi então clonada num vector de clonagem eucariótico para se conseguir um plasmideo, designado pLPC-167G, idêntico ao plasmideo pLAPC, excepto no que respeita à inserção de uma sequencia codificadora de peptideo de activação em que o codão da glicina substitui o codão do ácido aspártico na posição 209.
plasmideo pLPC-167F é um vector de expressão ilustrativo do invento em que o codão do ácido aspártico na posição 209 da proteína C humana nascente foi alterado para um codão da feni 1 a 1 anina. 0 protocolo de construção do plasmideo pLPC-167F está descrito detalhadamente no Exemplo 4. Exceptuando o oligonucleotideo mutagenizante diferente usado na construção, o protocolo de construção do plasmideo pLPC-167F foi substancialmente o mesmo do protocolo de construção do plasmideo pLPC-167G.
Os métodos da mutagénese específica de sitio descrita nos Exemplos juntos são ilustrativos e podem ser usados para gerar outros compostos e vectores do invento. Conforme estabelecido atrás, estes outros compostos do invento incluem as proteínas nascentes produzidas quando da tradução do mRNA gerado a partir das sequências de DNA codificador do invento. Os compostos do invento também incluem as formas zimogénicas geradas quando da secreção das proteínas nascentes do invento. Em adição,no caso dos compostos do invento em que o residuo de ácido
-31aspártico na posição 214 foi alterado para um resíduo asparagína, o derivado de proteína C activada produzido quando da activação da forma zimigénica é também um composto do invento. Assim, os compostos do invento incluem sequências codificadoras de DNA, vectores de expressão que dirigem a expressão daquelas sequências, proteínas nascentes produzidas quando da tradução do mRNA gerado a partir daquelas sequências codificadoras, zimogénios produzidos quando da secreção daqueles proteinas nascentes e derivados activados de alguns dos zimogénios.
Nas sequências codificadoras preferidas do invento (e portanto as proteinas nascentes preferidas, zimogénios e moléculas activadas), a sequencia codifica_ dora codifica uma sequencia de resíduos de aminoácidos idêntica à da proteína C humana nascente exceptuando as substituições nas posições 209, 210 e 214. Estas substituições estão descritas abaixo na Tabela I.
Tabel a I
Resíduos de aminoácidos codificados nas posições 209,210 e 214 nas Sequências codificadoras prefe ridas do invento.
Composto
209
PHE
PHE
PHE
PHE
GLY
GLY
GLY
GLY
TYR
TYR
TYR
TYR
TRP
TRP
TRP
TRP
210
PRO
PRO
VAL
VAL
PRO
PRO
VAL
VAL
PRO
PRO
VAL
VAL
PRO
PRO
VAL VAL
214
ASP ASN ASP ASN ASP ASN ASP ASN ASP ASN ASP ASN ASP ASN ASP ASN
Os compostos de DNA do invento podem também ser sintetizados quimicamente ou por combinação de fragmentos de restrição ou por uma combinação de técnicas conhecidas na especialidade. As máquinas de síntese de
DNA estão também disponíveis e podem ser usadas para cons-33-
truír os compostos do invento.
Os vectores ilustrativos do invento, plasmideos pLPC-167G e pLPC-167F, compreendem o potenciador BK colocado, para estimular a transcrição pelo promotor tardio principal do adenovirus da sequencia codificadora do invento. Os familiarizados com a matéria reconhecem que um grande número de promotores, potenciadores e vectores de expressão eucarióticos são conhecidos dentro da especialidade e podem ser usados no método do presente invento. Os família, rizados com a matéria também reconhecerão que um vector de expressão eucariótico pode funcionar sem um elemento potenciador. 0 aspecto chave do presente invento não reside no potenciador particular, caso exista, ou promotor, usado para dirigir a expressão do zimogénio da proteina C mas antes resj. de na nova sequencia codificadora e correspondentes proteínas produzidas a partir daquela sequencia.
No entanto, a escolha dos elementos do vector, tais como os promotores, potencíadores e marcas seleccioná veis, pode ter grande impacto nos niveis finais de proteina produzida por uma célula hospedeira eucariótica. A Publicação Europeia No. 0245949 divulga uma S6rie de vectores de expressão para a proteina C zimogénica nativa que utiliza o potenciador BK para estimular um promotor eucariótico colocado de modo a dirigir a expressão da proteina C humana nascente. Estes vectores dirigem especialmente níveis elevados de expressão quando usados para transformar células eucarióticas que também expressam um produto de um gene precoce imediato de um virus de DNA grande, como seja o produto do gene EIA dos adenovirus. Como é evidente a partir dos vectores ilustrativos pLPC-167G e pLPC-167F aqui descritos, o método de expressão do potenciador BK- produto do gene EIA é especialmente preferido para usar com os vectores do presente invento.
-340 presente invento não está limitado ao uso numa célula hospedeira eucariótica particular. Uma variedade de células hospedeiras eucarióticas estão disponíveis nos depositários tais como American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD 20852 e são adequadas para serem usadas com os vectores do invento. A escolha de uma célula hospedeira particular depende até certo ponto do vector de expressão particular usado para dirigir a expressão dos compostos de DNA codificadores da proteína C do invento. Devido à proteína C humana nascente e derivados da proteína C humana nascente do invento sofreram substancial modificação pós-tradução, algumas células hospedeiras são mais preferidas para usar com os vectores do invento. Grinnell et a 1 . , 1 987, Bio/Techno1ogy 5:1189 descreve que células de rim embrionário humano transformadas com adenovírus são especialmente preferidas para usar na produção recombinante de proteínas /-carboxi1adas tais como proteína C humana. Um exemplo de uma linha celular de rim embrionário hurano transformada por adenovírus é a linha celular 293, disponível na ATCC com o número de acesso ATCC CRL 1573. A linha celular 293 é também preferida para usar com os vectores do presente invento.
NO entanto, as vantagens da produção de uma proteína /-carboxi1ada, como seja o zimogénio da proteína C humana, numa linha celular transformada com adenovírus não estão limitadas às células de rim embrionário humano transformado com adenovírus. De facto, as células transformadas com adenovírus em geral são hospedeiros excepcionais para a produção de proteína C humana y-carboxi1ada. Uma linha celular deste tipo especialmente preferida é a linha celular AV1 2-664 (daqui em diante AV12’1), disponível na ATCC com o número de acesso ATCC CRL 9595. A linha celular AV12 foi construída através da injecção de um hamster Sírio na parte posterior do pescoço com adenovírus 12 humano
-35e isolamento das células do tumor resultante. 0 Exemplo 5, abaixo, descreve a transformação das linhas celulares 293 e AV12 com vectores ilustrativos pLPC-167G e pLPC-167F.
Os vectores do invento podem ser transformados e expressos numa variedade de células hospedeiras eucarióticas, especialmente de mamíferos. Os vectores do invento que não possuem marca selectiva com a qual se possa isolar e identificar transformantes eucaríóticos estáveis são úteis não só para fins de ensaio transitório mas também para fins de cotransformação, um processo divulgado na Patente U.S.No. 4 399 216. Os vectores do invento podem também compreender sequências que permitam a replicação em
E.coIi, uma vez que é geralmente mais eficaz preparar DNA de plasmideo em E.co1i do que noutros organismos hoispedeiros
A expressão das sequências codificadoras da proteína C humana contidas nos vectores do invento ocorre naquelas células hospedeiras em que o promotor particular está associado a funções de genes estruturais. Exemplos de células hospedeiras adequadas ao uso no invento estão descritos na Tabela II, juntamente com os comentários adequados.
Célula hospedeira ___________Origem_____________ Fonte ________Comentários
E · * Φ O —< X P
05 O •^4
1 CL Φ
Φ O x
> nz * Φ
Φ o —* CL
p P Φ •—4 00
o 05 3 Φ co o
oo cr X X x
Φ 3 CZ
X <—-1 O 00 Φ
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American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Marymand 20852-1776
-37Conforme indicado pela Tabela II, muitas células hospedeiras de mamífero possuem araquinaria celular necessária para o reconhecimento e processamento correcto do peptideo sinal das proteínas nascentes do invento e proporcionam as modificações pós-tradução, tais como gl icosj_ lação, y-carboxi 1 ação e β-hidroxilação como são observadas na proteína C humana presente no plasma sanguíneo. Existe uma grande variedade de vectores, discutidos abaixo, para a transformação de tais células hospedeiras aucarióticas, mas os vectores específicos exemplificados abaixo não pretendem de algum modo limitar o âmbito do presente invento.
Os vectores do tipo pSV2 compreendem segrentos do genoma de SV40 que constituem uma unidade de transcrição eucariótica definida -- promotor (ep), sequência interviniente (IVS) e sitio de poliadenilação (pA). Na ausência do antigénio T do SV40, os vectores tipo plasmídeo pSV2 transformam células hospedeiras de mamíferos e de outros eucariótas através da integração no DNA cromossónico da célula hospedeira. Construiu-se uma variedade de vectores do tipo plasmídeo pSV2 (ver Eukaryotic Virai Vectors, editado por Gluzman, publicado por Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1982), tais como pSV2-gpt, pSV2-neo, pSV2-dhfr, pSV2.hyg e pSV2-£-globina, nos quais o promotor do SV40 dirige a transcrição de um gene inserido. Estes vectores são adequados ao uso com as sequencías codificadoras do invento e estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC) em Rocville, Maryland ou no Northurn Regional Research Laboratory (NRRL) em Peoria, 111i no i s .
-380 plasmideo pSV2-dhfr (ATCC 37146) compreende um gene da di-hidrofolato reductase (dhfr) de mur ganho sob o controle do promotor precoce do SV40. Nas condições adequadas sabe-se que o gene dhfr é amplificado ou codificado no cromossoma hospedeiro. Esta amplificação, descrita num artigo de revisão por Schimke , 1984, Ce 11 37:705-713, pode envolver sequências de DNA práticamente contíguas com o gene dhfr, como seja uma sequencia codificadora da proteína C humana nascente do invento e portanto pode ser usada para auientar a produção dos zimogénios da proteína C do invento.
Os plasmideos que foram construj_ dos para a expressão da proteína C nasecente e dos zimogénios da proteína C do invento em células hospedeiras de mamífero ou de outros eucariotas podem utilizar uma larga variedade de promotores. 0 presente invento não está de modo algum limitado ao uso dos promotores eucarióticos particulares aqui exemplificados. Promotores tais como o promotor tardio de SV40 ou os promotores eucarióticos divulgados em Bucher et al., 1986, iluc. Acids Res. 14(24):1009 ou promotores de genes eucarióticos, tais como por exemplo, o gene da ovalbumina de galinha induzivel por estrogénios, os genes do interferão, o gene da tirosina-aminotransferase induzivel por g 1 ucocorticoides, o gene da tilidina cinase e os principais genes precoces .tardios, dos adenovírus, podem ser fácilmente isolados e modificados para usar em vectores de expressão de DNA recombinante destinados a produzir zimogénio da proteína C humana em células hospedeiras eucarióticas. Os promotores eucarióticos podem também ser usados em tandem para dirigir a expressão de uma sequencia codificadora do invento. Ainda, conhece-se um grande numero de retrovirus que infectam uma larga gama de células hospedeiras eucarióticas. As repetições terminais longas no DNA de retrovirus codificam por vezes a actividade de promotor e podem assim
ser usadas para dirigir a expressão das sequências codificadoras do invento.
plasmideo pRSVcat (ATCC 37152) compreende porções da repetição terminal longa do vírus do Sarcoma de Rous (RSV), um virus que se sabe infectar células de galinha e outras células hospedeiras, As sequências das repetições terminais longas do RSV podem ser isoladas num fragmento de restrição Nde I-H i nd 111 0,76 kb do plasmideo pRSVcat. 0 promotor na repetição terminal longa do RSV (Gorman et a 1 . , 1982, P.N.A.S. 79:6777 é adequado para utilização em vectores do invento. 0 plasmideo pMSVi (NRRL B- 1 5929) compreende as repetições terminais longas do virus do Sarcoma Murino (MSV), um virus que se sabe infectar células de ratinho e outras células hospedeiras. Estas sequências repetidas são adequadas ao uso como promotor nos vectores do invento. 0 promotor da meta 1otioneína (MMT) de ratinho também foi bem caracterizado para uso em células hospedeiras eucarióticas e é adequado para ser usado nos vectores do invento. 0 promotor MMT está presente no plasmideo pdBPV-MMTneo de 15 kb (ATCC 37224), o qual pode servir como material de partida para a construção de outros plasmideos do presente invento.
São possíveis muitas modificações e variações das presentes sequencías de DNA ilustrativas e plasmideos. Por exemplo a degeneração do código genético permite a substituição de nucleotideos nas regiões codificadoras do polipeptideo, assim como no sinal de paragem da tradução, sem alterações da sequencia do polipeptideo codificado. Tais sequencías substituíveis podem ser deduzidas a partir da sequencia conhecida de aminoácidos de DNA da proteína C humana e podem ser construídas seguindo processos convencionais de sintese ou de mutage'nese dirigida especifica de sitio. Os métodos de síntese podem ser efectuadbs substancialmente de acordo com os processos de Ita kura et al.,
-401977, Science 198:1056 e Crea et a 1. , 1978, Proc . Nat. Sc i.
USA 75:5765. Deste modo o presente invento não está de modo algum limitado às sequências de DNA e plasmideos especificamente exemplificados.
Após transformação de um vector do invento numa célula hospedeira eucariótica, pode-se seleccionar transforamntes com base num fenótipo seleccionável. Este fenótipo seleccionável pode ser conferido por uma marca seleccionável presente no vector de expressão ou presente num outro vector cotransformado com o vector de expressão na célula hospedeira. Uma vez se 1 eccionados os transformantes é desejável identificar quais os transformantes que expressam os níveis mais altos da proteína pretendida codificada no vector de expressão. Tal identificação é especíalmente importante após um processo de cotransformação, o qual dá origem a uma série de transfonrantes que contém apenas o plasmideo contendo a marca seleccionável e portanto não contêm o vector de expressão. No exemplo 6, abaixo, descreve -se um protocolo não só para identificação de células que expressam e secretam uma proteína pretendida mas também para quantificação, relativa às outras células examinadas usando o método, da quantidade de proteína secretada. 0 protocolo também permite o isolamento de células viáveis que secretem os niveis mais altos de uma proteína pretendida.
A proteína C activada tem propriedades antitrombóticas substanciais na prevenção da extensão de trombos intravenosos, na prevenção da formação de trombos arteriais e na prevenção da morte e paragem de orgãos devido a sepsis por Gram negativos, endotoxemia e, coagulação intravascular disseminada. Nas experiencias com animais, a infusão de proteína C zimogénica nativa não teve efeito no tratamento de septicémia provocada por Gram negativos com choque e coagulação intravascular disseminada (DIC).Estes
-41resu1tados negativos indicaram que nesta forma de trombose microvascu1 ar disseminada envolvendo geração massiva de trombina estava presente insuficiente trombomodu1ina para complexar com a trombina e activar o zimogénio dado por infusão.
A prindipal desvantagem da proteína C activada, tal como com qualquer protease serina activada, é a sua curta semí-vida (T'/2) comparado com o precursor zimogénio. A T'/2 em cães foi estabelecida como sendo de 11 minutos e a T'/2 em macacos como sendo de 22 a 26 minutos. Em comparação, a T'/2 do zimogénio da proteína C nativa no homem está calculada como sendo 6 horas. A razão para as semi-vidas biológicas curtas das proteases serina activadas, indluindo proteína C activada, comparado com os seus zimogénios, é complexa e envolve mecanismos celulares e humorais. As proteases serina activadas também formam complexos com os inibidores das proteases serina normalmente presentes no plasma. A proteína C activada (APC) complexa-se com um inibidor de APC recentemente descrito assim como com alfa-2-macrog1obu 1 ina. Os zimogénios inactivos, incluindo os zimogénios de proteína C do invento, não reagem com os inibidores de proteases serina.
A vantagem dos zimogénios da proteína C deste invento é que eles são melhor activados pela trombina do que o zimogénio da proteína C nativa, porque a trombina, já não tem uma necessidade absoluta de se complexar com a trombomodu 1 ina para activar estes zimogénios na presença de CA^+. Segue-se que estes zimogénios da proteína C, quando administrados, podem ser activados em locais de geração de trombina intravascular, i.e., em qualquer sitio onde se esteja a desenvolver um trombo intravascular. Assim, estes zimogénios de proteína C recombinante podem ser usados como pró-drogas e serão activados apenas nos locais de gera-
-42ção de trombina. Uma vez que estes zimogénios sensíveis à trombina podem ser administrados na forma de zimogénio ,e1es não se complexarão com inibidores da proteína C e terão ura semi-vida biológica igual à do zimogénio da proteína C nativa.
Os zimogénios da proteína C recombinante do invento são úteis na prevenção e tratamento de uma grande variedade de doenças que envolvam coagulação intravascular, incluindo trombose de veias profundas, embolia pulmonar, trombose arterial periférica, embolia com origem no coração ou em artérias periféricas, enfarte do miocárdio agudo, choques trombóticos e coagulação intravascular disseminada. Estes derivados da proteína C podem também ser usados eficazmente no tratamento de números significativos de pacientes com deficiência em proteina C heterozigóticas apresentando trombose frequente de veias profundas e no caso dos pacientes com deficiência em proteina C homozigótica com purpura fulminans.
Os resultados experimentais, e clínicos sugerem que os anticoagu1 antes convencionais, particularmente Warfarin são uteis no tratamento de cancros invasicos e actuam de modo a evitar ou reduzir as lesões metás ticas distantes destas doenças. Em adição, está bem estabelecido que os estímulos inflamatórios, tais como endotoxinas, factor de necrose tumoral e interleuquina 1, eliminam a trombomodu 1 ina da superfície das células endoteliais pensando-se que isto desencadeie trombose microvascular e macrovascular. Os zimogénios da proteina C recombinante do invento representam ura alternativa atractiva aos anticoagu1 antes convencionais nestas situações clinicas.
-43As dozes dos zimogénios de proteína C recombinante do invento, devido à sua T’/2 melhorada, podem ser substancialmente reduzidas em situações clinicas, quando comparado com a proteína C activada. Na deficiência em proteína C homozigótica, a dose de um zimogénio de proteína C do invento variará entre cerca de 5 mg e 100 mg por tratamento e na deficiência em proteína C heterozigótica, a dose variará entre cerca de 2,5 mg e 50 mg por tratamento.
Ura indicação terapêutica atractiva para a proteína C activada é na prevenção de trombose de \eias profundas e embolia pulmonar correntemente tratadas com doses baixas de heparina. Nos pacientes de alto risco, particularmente pacientes sujeitos a cirurgia, a dose de proteína C recominante activada para a prevenção da trombose de veias profundas é na gama de 1-10 mg/dia. A dose de zimogé^ nio da proteína C do invento variará entre cerca de 0,25 e 5 mg por dia. Uma vantagem adicional destes zimogénios é que podem ser dados com um bolus em vez de infusões intravenosas constantes. A proteína C activada deve ser dada por infusão intravenosa continua devido â T'/2 curta daquela proteína. Na trombose de veias profundas e/ou embolia pulmonar estabelecidas e objectivamente documentadas, a dose de proteína C activada varia entre 1 e 10 mg como dose inicial seguido de infusão continua em quantidades que variam entre 3 e 30 mg por dia. Os zimogénios da proteína C do invento, por outro lado, podem ser dados por injecção de bolus repetidos em doses que não excedam cerca de 12 mg por 24 horas.
Esquemas de dosagem semelhantes são aplicáveis no tratamento de trombos arteriais periféricos. Existe uma probabilidade baixa de complicações hemorrágicas devidas a infusões de zimogénios da proteína C do invento. Assim, estes zimogénios podem substituir a heparina intra e pós-cirurgicamente em conjunção com trombectomias
-44ou embo1ectomias, processos cirúrgicos que são por vezes necessários para salvar membros isquémicos da amputação quando do estabelecimento de uma obstrução alterial aguda. Devido à sua T'/2 longa, comparada com a proteina C activada, e a sua relativa facilidade de administração, estes zimogénios são mais adequados do que a proteina C activada para o tratamento de embolias arteriais originadas no coração. A administração a longo prazo destes zimogénios em doses comparáveis às usadas no tratamento de embolia pulmonar-trombose de veias profundas estabelecidas tem substancial utilidade na prevenção de embolia cardiogénica.
De modo semelhante, os zimogénios de proteina C do invento podem ser usados no tratamento de embolias originadas em trombos nas artérias periféricas,mais principalmente nas artérias carótidas, as quais não são tratadas ou evitadas satisfatóriamente com os regimes normalmente usados, os quais incluem drogas capazes de suprimir a função das plaquetas, anticoagu 1 antes orais ou suas combinações. No caso de embolia cardiogénica estes zimogénios podem ser administrados a longo termo tal como descrito para a embolia cardiogénica e têm grande potencial na prevenção de embolias originadas em trombos nas artérias carótidas que resultam em choques embólicos.
Os zimogénios da proteina C do invento são também úteis nos ataques trombóticos. Actualmente os ataques não são geralmente tratados com anticoagu1 antes convencionais. 0 tratamento de ataques com heparina ou anticoagulantes orais, se bem que ocasionalmente benéficos, são acompanhados de um elevado risco de hemorregia na área do cérebro com enfarte, agravando assim o déficite neurológico que acompanha o ataque. Devido ao seu baixo potencial para causar complicações hemorrágicas e à sua selectividade, os zimogénios do invento podem ser dados a vitimas de ataques
e podem ser benéficos na prevenção da extensão local de trombos arteriais causadores de oclusão, reduzindo assim o déficite neurológico resultante do ataque. A quantidade de zimogénio eficaz no trataiento de ataques será mais baixa, quando comparado com a proteína C activada, mas a dose varia rá com cada paciente dependendo da natureza e gravidade do ataque.
Os zimogénios do invento serão também úteis no tratamento de enfarte do miocárdio agudo, devido às suas propriedades pro-fibrinolíticas, uma vez activados. Estes zimogénios podem ser dadaos com activador do p1 asminogénio de tecido durante as fases agudas do enfarte do miocárdio. Após dissolução do trombo coronário causador da oclusão, os zimogénios podem ser dados durante mais dias para evitar novo enfarte agudo do miocárdio. Se a proteína C activada fôr administrada nesta situação é administrada ao paciente uma dose inicial de 1-10 mg na altura do inicio do tratamento com activador do p1asminogénio seguido de infusão continua de proteína C activada variando entre 3 e 30 mg por dia. Ao contrário, os zimogénios do invento podem ser administrados através de uma injecção de bolus 3 a 4 vezes por dia em doses que não excedem cerca de 12 mg/dia.
A proteína C activada é útil no tratamento de coagulação intravascu1 ar disseminada. Em extensos ensaios clínicos têm sido dados heparina e anticoagulantes orais a pacientes com coagulação intravascu1 ar disseminada (DIC) mas os resultados têm sido desapontadores. Na coagulação intravascular disseminada a proteína C activada, assim como os zimogénios do presente invento, têm uma vantagem distinta sobre os anticoagulantes convencionais. Conforme mencionado atrás, foi esatbelecido em experiências com animais que o zimogénio da proteína C é ineficaz na pre-
-46venção da morte e danificação de orgãos causados por septícémia com Gram negativos e coagulação intravascular disseminada. Ao contrário, os zimogénios da proteína C do invento, sendo altamente susceptiveis à activação pela trombina, serão eficazes no tratamento de coagulação intravascu1 ar disseminada. As quantidades necessárias de proteína C activada para tratar DIC são de aproxímadamente 100 mg/dia; as doses das formas zimogénicas do invento para o tratamento de DIC não excedem cerca de 30 mg/dia, administradas por injecções de bolus repetidas.
As doses de anticoagu1 antes convencionais, particularmente Warfarin, são úteis no tratamento de tumores malignos invasivos. Muitas células tumorais produzem substâncias que induzem a activação do sistema de coagulação resultando em depósitos locais de fibrina. Estes depósitos de fibrina funcionam como ninhos em que as células cancerosas se podem dividir para formar lesões metásticas. No entanto, não é possível administrar Warfarin ou outras anticoagulantes convencionais em combinação com formas mais intensas e eficazes de quimioterapia, porque tal terapia produz sempre uma queda rápida na contagem de plaquetas e trombocitopenia combinada com terapia com Warfarin coloca o doente perante um risco alto e inaceitável relativamente a complicações hemorrágicas. Os derivados de proteína C do invento, tal como a proteína C activada, sendo mais selectivos do que os anticoagulantes convencionais e tendo um índice terapêutico superior do que a heparina ou anticoagulantes orais, podem ser administrados com relativa segurança a pacientes trombocitopénicos, tornando assim possível o tratamento de doentes com cancros invasivos usando quimioterapia eficaz e intensiva em combinações com um zimogénio da proteína C do invento. 0 tratamento seguirá um regime de dosagem comparável ao usado na embolia pulmonar-trombose de veias profundas.
-47Os zimogéníos, e contrapartes actívadas, do presente invento podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, nas quais um zimogénio da proteína C humana ou proteína C activada do invento é combinado com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Veículos adequados e suas formulações, inclusive de outras proteínas humanas, e.g., albumina do soro humana, estão descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutica 1 Sciences 16ê ed. 1980,Mack Publishing Co., editado por Osol et a 1., que aqui é incluído por refereçcia. Tais composições conterão uma quantidade eficaz de um zimogénio da proteína C ou contraparte activada, juntamente com uma quantidade adequada de veiculo para preparar composições farmaceuticamente aceitáveis adequadas à administração eficaz do hospedeiro. A composição de proteína C pode ser administrada parentéricamente ou por outros métodos que asseguram a sua libertação na corrente sanguínea numa forma eficaz.
Deverá também notar-se que os zimogéníos do presente invento podem ser usados para preparar proteína C activada in vitro. Apenas dos métodos recombinantes para a produção de proteína C activada directamente em células eucarióticas serem bem conhecidos, estes métodos requerem que a proteína C activada permaneça no meio de cultura durante tempos prolongados. Em adição, a proteína C activada deve ser purificada a partir do meio de cultura, um processo que envolve vários passos e é dispendioso.DEvido à proteína C activada ser relativamente instável, estes métodos de expressão directa podem dar pequenas quantidades de proteína C activada. Pelo contrário, os zimogéníos do invento podem ser activados pela trombina sózinha, mesmo
Λ na presença de Ca^+ e oferecem portanto vantagens significativas sobre os métodos conhecidos para produção de proteína C activada.
-48Os exemplos que se seguem ilustram os métodos e descrevem os protocolos de construção dos compostos, vectores e transformantes representativos do invento sem limitar o mesmo.
Exemplo 1
Construção do plasmideo pLAPC
Este Exemplo proporciona um protocolo detalhado para a construção do plasmideo pLAPC. Resumidamente, o Exemplo IA descreve o isolamento de um fragmento de DNA codificador de uma porção da molécula de proteína C, incluindo o peptideo de activação, a partir do plasmideo pHC7. 0 Exemplo 1B descreve a clonagem deste fragmento de DNA no fago M13mpl8 e a remoção do DNA codificador do peptideo de activação a partir do fago recombinante resultante por mutagénese especifica de sitio. 0 Exemplo IC descreve os passos finais na construção do plasmideo pLAPC, mais especificamente, o isolamento do fragmento mutagenizado e a sua ligação com dois fragmentos derivados do plasmideo pLPC para dar o plasmideo pLAPC. 0 protocolo de construção do plasmideo pLPC está descrito no Exemplo 2.
-49Α. Isolamento de um fragmento de DNA contendo a sequência codificadora do peptideo de activação da proteína C humana plasmideo pHC7 contem a sequência codificadora completa da proteína C humana nascente. Um litro de caldo L (10 g de peptona, 10 g de NaCl e 5 g de extracto de levedura) contendo 15 pg/ml de tetracíclina foi inoculado com uma cultura de E. co1i K12 RRl/pHC7 (NRRL B-15926) e incubado num agitador a 37°C até a densidade óptica (O.D.) a 590 nm ser~ 1 unidade de absorvência, altura em que se adicionou 150 mg de cloranfenicol à cultura. A incubação continuou durante cerca de 16 horas; a adição de cloranfenicol inibe a síntese proteica e portanto inibe a divisão celular mas permite a continuação de replicação do plasm ideo.
A cultura foi centrifugada num rotor Sorvall GSA (Dupont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) a 6000 rpm durante 5 minutos a 4°C. 0 sobrenadante resultante foi rejeitado e o sedimento de células lavado em 40 ml de tampão TES (lOmM Tris-HCl, pH 7,5; lOmM NaCl; e lmM EDTA) e depois centrifugado novamente. 0 sobrenadante foi novamente rejeitado e o sedimento de células congelado num banho de neve carbónica -etanol e depois descongelado. 0 sedimento de células descongelado foi ressuspenso em 10 ml de uma solução de 25% sucrose/50mM EDTA. Cerca de um ml de uma solução de lisozima a 5 mg/ml; 3 ml de 0,25M EDTA, pH=8.0; e 100 μΐ de RNAse A a 10 mg/ml foram adicionados â solução que foi então incubada em gelo durante 15 minutos. Três ml da solução de lise (preparada pela mistura de 3 ml de Triton-X100 a 10%; 75 ml de 0,25M EDTA, pH = 8.0; 15 ml de 1M Tris-HCl, pH=8.0; e 7 ml de água) foram adicionados às células tratadas com Iisozima, misturados e a solução resultante incubada em gelo durante mais 15 minutos. As células lisadas foram
congeladas num banho de neve carbónica-etanol e depois descongeladas.
Os detritos celulares foram removidos da solução por centrifugação a 25 000 rpm durante 40 minutos num rotor SW27 (Beckman, 7360N.Linco1n Ave., Lincolnwood, IL60646 ) . Cerca de 30,44 g de CsCl e ^1 ml de uma solução de brometo de etídio a 5 mg/ml foram adicionados à solução, o volume da mesma foi então ajustado a 40ml. A solução foi decantada para um tubo de ultracentrífuga Vti50 (Beckman). 0 tubo foi selado e depois centrifugado num rotor Vti50 a 42 000 rpm durante 15 horas. A banda de plasmideo resultante visualizada com luz ultravioleta, foi isolada e depois colocada num tubo e rotor ti75 (Beckman) e centrifugada a 55000 rpm durante 16 horas. Quaisquer ajustamentos de volumes necessários foram feitos usando TES contendo 0,7 61 g / m 1 de CsCl. A banda do plasmideo foi novamente isolada, o brometo de etídio extraído com isopropanol saturado com sal e finalmente diluída a 1:3 com tampão TES. Adicionou-se então dois volumes de etanol à solução e a mistura resultante foi incubada durante a noite a -20°C. 0 DNA de plasmideo foi sedimentado por centrifugação da solução num rotor SS34 (Dupont Co.) durante 15 minutos a 10 000 rpm.
Cerca de^l mg de DNA do plasmideo pHC7 obtido por este processo foi suspenso em 1 ml de tampão TE (lOmM Tris-HCl, pH=7,6 e 0,lmM EDTA) e guardado a -20°C. Na Figura 2 dos desenhos juntos está apresentado um maoa de sitios de restrição e funções do plasmideo pHC7.
Cerca de 7 /jg (7 ul) de DNA do
TM plasmideo pHC7 foram adicionados a 25 μΐ de tampão Core
BRL, é 500mM Tris-HCl, pH = 8,0; 500mM NaCl; e lOOmM MgCl2) ,
198 μ 1 de Η£θ e 12 pl da enzima de restrição Sst I ( ^60 uni-51-
cbdes, Bethesda Research Laboratories (BRL), Ga i thersburg , MD20877; todas as enzimas referidas nestes Exemplos podem ser adquiridas, a menos que outra forma indicada, à BRL ou New England Biolabs (NEB), Beverly, MA 01915-9990, e são usadas essencialmente de acordo com as instruções do fabricante) e 8 ^1 (80 unidades) da enzima de restrição 5a1I. A mistura de reacção foi incubada a 37°C durante quatro horas; depois, o DNA do plasmideo pHC7 digerido com Sst-Sa1I foi extraído primeiro com fenol e depois com clorofórmio, colhido por precipitação com etanol e centrufugação e finalmente suspenso em 15 μΐ de tampão Te/10 (10 mM Tris, pH=7,6 e 0,1 mM EDTA).
A mistura de reacção foi então sujeita a electroforese num gel de ^0,6% de agarose de baixa temperatura de fusão (FMC Corporation, Ma r i ne Colloids Division, Rockland, Maine 04841) durante 2-3 horas a^/130V e ~65 mA em tampão Tris-Acetato. 0 gel foi corado numa solução diluída de brometo de etídio e a banda de DNA constituindo o fragmento de restrição SstI-Sa1I com ^0,7Kb, que foi visualizado com luz UV de longo comprimento de onda foi cortada do gel num segmento pequeno. 0 volume do segmento foi determinado pelo peso e densidade do segmento e adicionou-se quatro volumes de TE contendo 0,25M NaCl ao tubo contendo o segmento. 0 segmento foi então fundido por incubação a 72°C. Cerca de 0,5 pg do fragmento de restrição Sst I-Sa 11 de-^0,7Kb do plasmideo pHC7 foi obtido num volume de aproximadamente 400 μ 1. Posterior purificação do DNA foi obtida passando a solução de DNA através de uma coluna NACS-prepac^ (BRL) de acordo com as recomendações do fabricante; o fragmento purificado foi ressuspenso em 15 pl de água desionizada.
-52Β. Construção de fagos recombinantes e remoção do DNA codificador do peptideo de activação por mutagénese especifica de sitio
Cerca de 1 pg de DNA RF do fago M13mpI8(obtido da New England Biolabs) foi digerido com as enzimas de restrição SstI e Sal I substancialmente de acordo com o processo descrito no Exemplo IA. A reacção foi parada por extarcção da mistura de reacção com fenol e depois com cloroformio; em seguida o DNA foi precipitado, colhido por centrifugação e ressuspenso em cerca de 15 μΐ de tampão TE. Os dois fragmentos resultantes da digestão foram separados num gel de -^0,6% de agarose de baixa temperatura de fusão e o fragmento maior for cortado do gel e purificado como descrito no Exemplo IA.
Cerca de 0,1 pg (em 7 pl de h^O) do fragmento de restrição SstI-Sa1I de^0,7Kb do plasmideo pHC7 foi adicionado a 5 pl de DNA RF do M13mpI8 digerido com Sst I-Sa11 juntamente com 2 ul de tampão ligase 10X (0,5M Tris-HCl, pH=7,8); 60mM MgCl^; e 0,2M ditiotreítol (DTT), 2 /jI de BSA a 1 mg/ml, 1 pl de 25mM ATP, 1 pl ( ^400 unidades) de DNA ligase de T4 (NEB) e 2 pl de F^O. A reacção de ligação foi incubada a 25°C durante a noite;o DNA ligado constituía o DNA do fago M13mpl8-HE1 pretendido na forma de cadeia dupla.
Aproximadamente 300 pl de uma cultura de E. coIi K12 JM101 crescida durante a noite (New England Biolabs) foram usados para inocular 30 ml de caldo TY 2x (caldo TY é 10 g/1 de triptona, 10 g/1 de NaCl e 5 g/1 de extracto de levedura).e a cultura resultante foi incubada a 37°C com arejamento até a O.D.gQQ ser de-^0,5.
A cultura foi arrefecida durante 10 minutos num banho de
água com gelo, colhida por centrifugação e ressuspensa em ml de lOmM NaCl frio. As células foram novamente colhidas por centrifugação e depois ressuspensas em 15 ml de 30 mM CaCl2 frio. Colocaram-se as células em gelo durante 20 minutos e colheram-se por centrifugação. Ressuspenderam-se as células em 1,5 ml de 30mM CaCl2 frio; retirou-se 200 pl de células, adicionou-se a 9 pl do DNA ligado preparado atrás e incubou-se em gelo durante cerca de 30 minutos. A mistura de células-DNA foi então incubada a 42°C durante 2 minutos e depois adicionada a 3 ml de agar de topo (caldo TY com 0,5% de agar mantido fundido a 45°C)que também continha 50 pl de 2% X-Gal (X-Gal é 5-Bromo-4-cloro-3-indo1i1-p-D-ga1actopiranosido ) , 50 pl de lOOmM IPTG (IPTG é isopropi1-β-D-tioga1actopiranosido) e 100 pl de coIi K12 JM101 em fase de crescimento logaritimico. A mistura células-agar de topo foi então colocada em placas de agar TY e as placas foram incubadas a 37°C durante a noite.
Na manhã seguinte, quatro placas transparentes foram individualmente usadas para inocular 2 ml de caldo TY 2X e as culturas resultantes foram incubadas a 37°C com arejamento durante 6 horas. Em seguida, as culturas foram centrifugadas e 500 pl do sobrenadante resultante (os sedimentos de células foram usados para preparar DNA fágico para analise por enzimas de restrição) foi adicionado a 500 pl de culturas (0.D.^^θ=0,5) de E.coli K12 JM101 e 50 ml de caldo TY 2X. Estas culturas foram incubadas durante a noite a 37°C. 0 DNA fágico RF foi isolado a partir dos sedimentos celulares usando uma versão reduzida do processo descrito no Exemplo IA, excepto não se ter usado antibiótico no meio demltura e os passos de ultracentrifugação foram substituídos por extracções com fenol e clorofórmio. Os transformantes contendo DNA fágico M13mpl8-HE1 foram identificados por análise com enzimas de restrição do seu DNA fágico.
-54As culturas crescidas durante a noite e cerca de 1 ml de ura solução composta por 20% de po1ieti1enog 1 ico1 (PEG) 6000 e 2.5mM NaCl foi adicionado por 5 ml de sobrenadante, o qual foi então incubado à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura foi centrifugada durante 10 minutos a 10 000 rpm e o sedimento resultante, que continha DNA fágico de cadeia simples M13mpl8-HE1, foi ressuspenso em 500 pl de tampão TES(20mM Tris-HCl, pH=7,5; 0,lM EDTA; e lOmM NaCl). A solução de DNA foi extraída primeiro com cloroformio, depois duas vezes com fenol saturado com TE e depois de novo com cloroformio. 0 DNA de cadeia simples foi então precipitado usando NaOAc e etanol, centrifugado e após lavagem do sedimento com etanol a 70% e secagem, o sedimento resultante foi dissolvido em 80 pl de H20. Esta preparação fágica foi usada no passo seguinte, a mutagénese especifica de sitio, para remover o DNA codificador do peptideo de activação.
fragmento de DNA de cadeia simples usado na mutagénese para remover o DNA codificador do peptideo de activação foi sintetizado num sintetizador de DNA automático e está descrito abaixo:
51-GCGCAGTCACCTGAAACGACTCATTGATGGGAAGATGA-31
Cerca de 30 picomoles (1 pl) do fragmento de DNA de cadeia simples descrito atrás (o oligonucleotideo mutagénico) e 1,5 pl (7,5 picomoles do iniciador universal de M13 (comercializado pela Boehringer-Mannheim Biochemicals (BMB), 7941 (castleway Drive, P.0. Box 50816, India napo1is, IN 46250) foram individualmente tratados com 5 unidades de polinucleotideo-cínase de T4 (Pharmacia, P-L Biochemicals, Inc.,800 Centennial Avenue, Piscataway, NY 08854) em lOpl de tampão cinase IX (100 mM Tris-HCl, pH=8,3;
-55100 mM DDT, e 100 mM MgCl2) contendo 1 pl de 1 mM ATP durante 30 minutos a 37°C, seguido de uma incubação a 65° durante 10 minutos e subsequente congelação. Os DNAs tratados com cinase foram usados no processo de mutagénese descrito abaixo.
No primeiro passo do processo de mutagénese, o o 1 igonuc1eotideo mutagénico e o iniciador universal de M13 foram emparelhados com o DNA fágico de cadeia simples. A reacção de empare1hamento foi efectuada pela adição de 300 nanogramas (0,5 pl) de DNA fágico de cadeia simples M13mpl8-HE1 a 1 picomole (0,2 pl) do iniciador universal, 1 picomole (0,3 pl) do o 1 igonuc1eotideo mutagénico, 2 pl de tampão de empare1hamento 10X (100 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 1 mPi EDTA; e 500 mM NaCl) e 16 pl de H20, incubação da mistura a 80°C durante 2 minutos e depois a 50°C durante 5 minutos e finalmente arrefecimento da mistura até à temperatura ambiente.
Uma vez emparelhados os oligonucleotideos, o DNA fágico foi tornado de cadeia dupla através da extensão dos iniciadores com DNA polimerase. A reacção de extensão foi efectuada pela adição de 3 pl de tampão de extensão 10X (500 mM Tris-HCl, pH=8; 1 mM EDTA; e 120 mM MgCl2) ; 3 pl de tampão ligase 10X; 1,5 pl de 0,2 mM DTT; 3 pl de mistura de dNTPs (cada dNTP 0,5 M; 17 pl de 25 mM ATP; 0,5 pl da enzima Klenow (5 U/pl , BMB); 1 pl de DNA-ligase de T4 (400 U, NEB); e 19,8 pl de H20 â mistura de DNA emparelhado. A reacção de extensão foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos, depois a 37°C durante 4 horas e depois durante a noite a 4°C.
A reacção foi parada por uma extracção com fenol-cloroformio e precipitação do DNA com etanol e acetato de sódio (NaOAc). 0 DNA foi colhido por
centrifugaçãoe ressuspenso em 40 ul de tampão Sl. (0,3 M NaCl; 0,03 M NaOAc, pH=4,5; e 0,3 mM ZnCl^). 0 tratamento com Sl descrito abaixo foi considerado como benéfico nos processos de mutagénese especifica de sitio. No entanto, os presentes inventores não encontraram qualquer vantagem significativa no tratamento com Sl e nos protocolos de construção descritos nos Exemplos que aqui se seguem o tratamento com Sl foi totalmente omitido.
A solução de DNA foi dividida iguaj_ mente por dois tubos e a um dos tubos adicionou-se 100 unidades (BMB) de nuclease Sl. A reacção com Sl foi incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos e parada por extracção da mistura de reacção uma vez com fenol saturado com TE-c1orofórmio (50:50). 0 DNA foi precipitado da mistura de reacção e da amostra não tratada com Sl usando NaOAc e etanol.
Os sedimentos de DNA foram ressuspensos em 60 pl de H^O e usados para transformar J[. col i K12 JM101 de acordo com o processo usado durante a construção do fago M13mpl8-HE1, excepto não se ter adicionado IPTG ou X-Gal às placas. Os mutantes foram despistados usando uma pequena porção do oligonucleotideo mutagénico, 5'-TGAAA CGACTCATTGA-31 (marcado radioactivamente) como sonda nas hibridações em placa e em dot-blot. Várias placas que surgiram como positivas nas hibridações foram repicadas e inoculadas individualmente em 2 ml de uma cultura de E.co1i K12 JM101 na fase de crsecimento logarítmico. Estas culturas foram incubadas a 37°C com arejamento durante cerca de 6 horas, quando foram então usadas para preparar DNA de cadeia simples como descrito atrás para o fago M13mpl8-HE1.
DNA de cadeia simples foi sequenciado usando o método de sequenciação didesoxi (J.H. Smith,1980,
-57Methods in Enzymology 65: 560-580 ). Vários fagos foram identificados com a mutação pretendida. Um fago em que a sequencia codificadora do peptideo de activação foi eliminada foi designado fago M13mpl8-HE2. A mutação no fago M13mpl8-HE2 provoca um decréscimo de 36 pb relativamente à sequencia codificadora natural, uma diferença que pode ser usada para facilitar a identificação de DNA que contenha a região mutagenizada. A forma RF do fago M13mpl8-HE2 foi preparada para ser usada em subsequentes construções.
C. Construção final do plasmideo pLAPC a partir do fago M13mpl8-HE2 e do plasmideo pLPC.
fragmento de restrição SstI-Sa 1 I mutagenizado (^0,7 kb) da forma RF do fago M13mpl8-HE2 foi cortado do fago e isolado substancialmente de acordo com o processo do Exemplo IA. No entanto, MOO pl da solução contendo Μ), 1 /jg do fragmento de Μ), 7 kb pretendido numa diluição de 1:2 de agarose de baixo ponto de fusão não passaram através de qualquer coluna de purificação sendo usados directamente na ligação para produzir o plasmideo pLAPC descrito aba ixo.
Três fragmentos de DNA foram ligados uns aos outros para formar o plasmideo pLAPC: o fragmento de restrição SstI-Sa11 de-^0,7 kb do fago M13mpl8-HE2, descrito acima, e dois fragmentos de DNA do plasmideo pLPC. 0 protocolo de construção para o plasmideo pLPC está descrito no Exemplo 2. Na Figura 1 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e de funções do plasmideo pLPC. Devido ao posicionamento de Sa11, Sst I e EcoRI no plasmideo pLPC, os fragmentos de restrição pretendidos EcoRI-Sa11 e EcoRI-SstI tiveram de ser preparados em duas digestões separadas.
-58Para preparar o fragmento EcoRI -SstI , cerca de 40 pg do plasmideo pLPC em 25 pl de H^O foram adicionados a 10 pl de BSA a 1 mg/ml, 10 μ 1 de tampão TM
Core 10X (BRL), 5 p1 da enzima de restrição EcoRI (50 U, BRL), 5pl da enzima de restrição SstI ( 25 U, BRL), e 45 pl de e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante 1,5 horas. 0 DNA do plasmideo pLPC digerido com SstI-EcoR I foi colhido por precipitação com etanol e centrí fugação. 0 DNA digerido com SstI-EcoRI foi ressuspenso em H20 e depois aplicado num gel de^O.ô» de agarose de baixo ponto de fusão para separar os fragmentos de DNA por electro forese.
Para preparar o fragmento
EcoR I -Sa 1 I, cerca de 15 pg do plasmideo pLPC em 9 pl de H^O foram primeiro tratados com a enzima de restrição ApaI para eliminar contaminação com fragmentos de restrição de tamanho semelhante. Cerca de 10 pl de tampão Apa I 10X (60 mM NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 7,4; 60 mM MgCl2; e 60 mM DTT), 10 p1 de BSA a 1 mg/ml, 69 pl de H^O e 2 p1 da enzima de restrição ApaI (50 U, NEB) foram adicionados à solução de DNA de plasmideo pLPC e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante uma hora. Em seguida, 15 pl de 2 M NaCl, 69 pl de H^O, 8 pl da enzima de restrição
Sa1I (NEB) e 8 pl da enzima de restrição EcoRI (NEB) foram adicionados à solução de DNA do plasmideo pLPC digerido com
ApaI e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante 1 hora. 0 DNA do plasmideo pLPC digerido com ApaI-Sa11 -EcoRI foi extraído primeiro com fenol e depois com cloroformio, depois colhido por precipitação com etanol e centrifugação e finalmente ressuspenso em 25 pl de H^O.O DNA foi então aplicado num gel de v0,6% de agarose de baixo ponto de fusão e os fragmentos de DNA separados por e1ectroforese.
Os fragmentos de restrição
EcoRI-Sal I 3,76 kb e EcoRI-SstI ^2,0 kb foram retirados do λ
-59gel e os fragmentos de gel fundidos após adição de iguais volumes de 10 mM Tris-HCl, pH=7,6, como descrito no Exemplo IA. Cerca de 2 pg do fragmento de restrição EcoRI-Sa1I de .<v3,76 kb do plasmideo pLPC foram assim obtidos em ^200 p 1 de 10 mM Tris-HCl, pH=7,6, que também continha a agarose fundida. Cerca de 2 pg do fragmento de restrição EcoRI-Sa 1 I de ^2,0 kb do plasmideo pLPC foram obtidos separadamente em^200 p\ de 10 mM Tris-HCl, pH=7,6, contendo agarose.
Cerca de 12,5 pl de cada uma das soluções dos dois fragmentos de restrição purificados (o fragmento de restrição EcoRI-Sa11 -v3,76 kb do plasmideo pLPC e o fragmento de restrição EcoRI-SstI de 2,0 kb do plasmideo pLPC) foram adicionados a 20 pl do fragmento de restrição SstI-Sa 11 de ^0,7 kb do fago M13mpl8-HE2 , 10 pl de BSA a 1 mg/ml, 10 pl de lOmM ATP, 10 pl de tampão ligase 10X, 2 pl ( ~800 U, NEB) de DNA-ligase de T4 e 23 pl de H2O e a reaçção de ligação resultante foi incubada a 15°C durante a noite. 0 DNA ligado constituiu o plasmideo pLAPC pretendido. 0 plasmideo pLAPC difere do plasmideo pLPC (Figura 1) apenas na delecção do DNA codificador do peptideo de activação.
Para testar a estrutura do plasmideo e obter grandes quantidades do plasmideo pLAPC para transformação de células eucaríóticas e outras construções, o DNA ligado contendo o plasmideo pLAPC foi usado para transformar co1i K12 RV308, disponível no NRRL com o número de acesso NRRL B-15624.
ml de cultura de £. co1i K12
RV308 em caldo L foi cultivado até uma densidade óptica (0.D) a 590 nm de ^0,6. A cultura foi arrefecida em gelo durante dez minutos e as células foram colhidas por centrifugação. 0 sedimento de células foi ressuspenso em 25 ml de
mM N“C 1 frio. As células foram novamente sedimentadas por centrifugação e o sedimento foi resuspenso em 25 ml de 30 mM CaCl2 frio e incubado em gelo durante 30 minutos. As células foram novamente colhidas por centrifugação e ressuspensas em 2,5 ml de 30 mM CaCl2 frio.
Duzentos yul desta suspensão de células foram misturados com o DNA ligado contendo o plasmídeo pLAPC e incubados em gelo durante 60 minutos. A mistura foi então incubada a 42°C durante 2 minutos, seguido de uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente. Cerca de 10 ml do caldo TY 2X foram adicionados à mistura de células-DNA e em seguida as células foram incubadas num incubador com agitação num balão de 125 ml a 37°C durante duas horas.
Semearam-se amostras da mistura de células em placas de agar TY (caldo TY com 15 g/1 de agar) contendo 100 pg/ml de ampicilina e as placas foram incubadas então a 37°C durante a noite. Os transformantes _E. coli K12 RV308/pLAPC foram verificados por análise com enzimas de restrição do seu DNA de plasmídeo. 0 DNA de plasmídeo foi obtido a partir dos transformantes coli K12
RV308/pLAPC substancialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo IA, excepto ter-se usado como agente selectivo 50 ug/ml de ampicilina e não tetracic1ina.
Exemplo 2
A construção do plasmídeo pLPC plasmídeo pLPC foi usado como um vector intermédio na construção do plasmídeo pLAPC (ver Exemplo IC). 0 plasmídeo pLPC compreende um segmento de
DNA que codifica o potenciador do vírus BK e o promotor tardio do adenovirus 2 colocados de modo a dirigirem a expressão da proteína C humana. 0 protocolo de construção para o plasmideo pLAPC resulta essencíalmente na substituição da sequência codificadora da proteína C humana no plasmideo pLPC com uma outra sequencia codificadora da proteína C da qual foi removido o DNA codificador do peptideo de activação.
As sequências de controle da expressão potenciador BK/promotor tardio dos adenovirus nos plasmideos pLPC e pLAPC são altamente estimuladas em actividade pela presença de um produto do gene precoce imediato de um vírus de DNA grande, i.e. o produto do gene EIA dos adenov i rus.
protocolo de construção para o plasmideo pLPC está estabelecido abaixo. Todo o protocolo de construção para o plasmideo pLPC está ilustrado esquemáticamente na Figura 1 dos desenhos juntos.
Resumidamente, o Exemplo 2A descreve o isolamento do DNA do virus BK, a partir do qual pode ser obtido o potenciador BK. 0 Exemplo 2B estabelece o protocolo de construção para o plasmideo pBKneol, em plasmideo resultante da inserção do potenciador BK no plasmideo pdBPV-MMtneo. 0 Exemplo 2C ensina o protocolo da construção do plasmideo pLPcat, um plasmideo resultante da inserção do promotor tardio do adenovirus 2 no plasmideo pSV2cat. 0 Exemplo 2D ensina o protocolo de construção do plasmideo pBLcat, um plasmideo que contem o potenciador BK colocado para estimular a actividade do promotor tardio do adenovirus. 0 Exemplo 2E descreve o protocolo de construção do plasmideo pL133, um vector de expressão da proteina C, começando com o plasmideo pHc7 como material de partida e prosseguindo com a construção do plasmideo intermediário
pSV2-HPC8 e depois a construção final do plasmideo pL133. Finalmente, o Exemplo 2F ensina o protocolo de construção do plasmideo pLPC, o qual compreende a sequencia de controle da expressão potenciador BK/promotor tardio dos adenovirus do plasmideo pBLcat inserida no plasmideo pL133 para dirigir a expressão da proteína C humana.
A.Preparação de DNA do vírus BK vírus BK é obtido da American Type Culture Collection com o número de acesso ATCC VR-837. 0 virus é entregue na forma liofilizada e ressuspenso em sais equilibrados de Hank (Gibeo, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072)para dar um titulo de cerca de 10$ unidades formadoras de placas (pfu/ml). 0 hospedeiro preferido para a preparação de DNA de virus BK são células primárias de rim embrionário humano (pHEK), as quais podem ser obtidas de Flow Laboratories, Inc., 7655 Old Springhouse Road.McLean, VA 22101, com o número de catálogo 0-100 ou de M.A. Bioproducts com o número de catálogo 70-151.
Para preparar o vírus usaram-se cinco frascos de polistireno de 75 mm contendo mono camadas confluentes de aproximadamente 106 células PHEK. Cerca de 1 ml de vírus BK com um titulo de 10 pfu/ml foi adicionado a cada um dos frascos, que foram então incubados a 37°C durante uma hora e depois adicionados meio de cultura fresco (Dulbecco's Modified Eagle Médium, Gibeo, Grand Island, NY 14072, suplementado com 10% de soro fetal bovino) e as células infectadas foram incubadas a 37°C durante 10-14 dias ou até se observar efeito citopatogénico total do virus. Este efeito citopatogénico varia de linha celular para linha celular e de virus para virus mas geralmente consiste no arredondamento, aglomeração e descolamento das células.
vírus é libertado das células por três ciclos de congelação-descongelação e os dbtritos celulares são removidos por centrifugação a 5000 x g. 0 virus presente num litro de sobrenadante é precipitado e colhido pela adição de 100 g de PEG-6000, incubação da solução durante 24 horas a 4°C e centrifugação a 5000 x g durante 20 minutos. 0 sedimento é dissolvido em tampão SSC 0,IX (IX SSC = 0,15 M NaCl e 0,015 M NaCitrato, pH=7) a 1/100 do volume original. A suspensão de viris é colocada sobre 15 ml de solução de KBr saturado num tubo, o qual é centrifugado a 75 000 x g durante 3 horas. Após centrifugação são evidentes duas bandas na solução de KBr. A banda inferior, que contem o virião compJLeto, é colhida e removido o sal numa coluna de Sephadex^ G-50 (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0 63178) usando TE (10 mM Tris-HCl, pH=7,8 e 1 mM EDTA) como tampão de eluição.
Adicionou-se dodeci1su1fato de sódio (SDS) à solução de viriões purificados obtidos da coluna para uma concentração de 1%; a protease pronase (Sigma) é adicionada para uma concentração de 100 pg/ml e a solução é incubada a 37°C durante 2 horas. Adiciona-se então cloreto de césio â solução para uma densidade de 1,56 g/ml, e adicionou-se brometo de etídio à solução para uma concentração final de 100 pg/ml. A solução é centrifugada num rotor Sorvall 865 (DuPont Co., Newton, CT 06470) ou num rotor semelhante vertical a 26 0000 x g durante 24 horas. Após centrifugação a banda de DNA virai é isolada e extraída cinco vezes com álcool isoamílico saturado com 100 mM Tris-HCl, pH=7,8. A solução de DNA do vírus BK é então dializada contra tampão TE até a razão de absorvâncias 260 nm/280 nm do DNA ser entre 1,75 e 1,90. 0 DNA é precipitado ajustando a concentração de NaCl a 0,15 M, adicionando dois volumes de etanol, incubando a solução a -70°C durante pelo menos 2 horas e centrifugando a solução a
000 x g durante 10 minutos. 0 sedimento resultante de DNA de virus BK é suspenso em tampão TE numa concentração de 1 mg/ml. Na Figura 1 dos desenhos juntos está apresentado um mapa dos sitios de restrição e funções do virus BK.
B. Construção do Plasmideo pBKneol
As células E^. co 1 i K12 HBlOl/MMtneo são adquiridas na forma liofilizada à American Type Culture Collection com o número de acesso ATCC 37224. As células liofilizadas são semeadas em placas de L-agar contendo 100 pg/ml de ampicilina e incubadas a 37°C para se obter colónias isoladas.
Um litro de caldo L (10 g de triptona , 10 g de NaCl e 5 g de extracto de levedura por litro) contendo 50 pg/ml de ampicilina foi inoculado com uma colónia de E. coli K12 HB101/pdBPV-MMTneo e incubado num agitador a 37°C até a Ο.ϋ.^^θ ser unidade de absorvância , a 1tura em que se adicionou 150 mg de cloranfenicol â cultura. A incubação continuou durante cerca de 16 horas; a adição de c 1 oranfenico1 inibe a síntese proteica e portanto inibe a div isão celular mas permite que a replicação do plasmideo continue. 0 DNA do plasmideo pdBPV-MMTneo foi então preparado a partir da cultura substancialmente de acordo com o processo descrito no Exemplo IA.
Aproximadamente^ mg de DNA do plasmideo pdBPV-MMTneo obtido por este processo foi suspenso em 1 ml de tampão TE e guardado a -20°C. 0 processo de isolamento do plasmideo descrito no Exemplo IA é geralmente usado quando se pretende grandes quantidades de DNA de plasmideo muito puro. 0 processo pode ser modificado para se obter rapidamente uma quantidade menor de DNA menos
-65puro. Como é necessário quando se faz o despiste de transformantes quanto à presença de um dado plasmideo, usando apenas 5 ml de células em cultura, lisando as células em tampão de lise proporc iona Ineite reduzido e substituindo os passos de centrifugação por extracções com fenol e clorofórrn i o .
Cerca de 5 ug (5 ul) de DNA do plasmideo pdBPV-MMTneo preparado como descrito atrás e cinco pg (5 pl) de DNA do virus BK preparado como descrito atrás foram digeridos separadamente a 37°C durante 2 horas numa solução contendo 2 pl de tampão BamHI 10X (1,5 M NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 7,9; 60 mM MgCl^,; e I mg/ml de BSA) , 1 pl ( λ/10 unidades) da enzima de restrição BamHI e 7 pl de H^O. A reacção foi parada por extracção com um volume igual de fenol seguido de duas extracções com clorofórmio. Cada um dos DNAs digeridos com BamHI foram precipitados, colhidos por centrifugação e ressuspensos em 5 pl de Η^,Ο.
Cerca de 1 pl de tampão de ligase 10X foi adicionado a uma mistura do plasmideo pdBPV-MMTneo digerido com BamHI (1 pl) e do DNA do virus BK digerido com BamHI (1 pl). Após adição de 1 pl ( ^5 unidades) de DNA-ligase de T4 e 6 pl de Η~0 à mistura de DNA, a reacção resultante foi incubada a 16°C durante a noite. 0 DNA ligado constituiu os plasmideos pretendidos pBKneoI e pBKneo2, que diferem apenas relativamente à orientação do DNA do virus BK.
Na Figura 1 dos desenhos juntos está apresentado um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmideo pBKneol.
As células E.co1i K12 HB10I são adquiridas na forma liofilizada à Northern Regional Research Laboratory com o núiero de acesso NRRLB-15626. 50 ml de uma cultura de Ei. col ί K12 HB101 em caldo L foi cultivada até uma densidade óptica a 625 nm(0.D.g3g) de aproximadamente 0,4 unidades de absorvância. A cultura foi arrefecida em gelo durante dez minutos e as células foram colhidas por centrifugação. 0 sedimento de células foi ressuspenso em 25 ml de 100 mM MgCl2 frio e incubado em gelo durante 25 minutos. As células foram novamente sedimentadas por centrifugação e o sedimento ressuspenso em 2,5 ml de 100 mM CaCl2 frio e incubado durante 30 minutos em gelo. Após incubação as células são competentes relativamente à internalização de DNA transformante.
Duzentos ul desta suspensão de células foram misturados com o DNA ligado preparado atrás e incubados em gelo durante 30 minutos. No final deste período as células foram colocadas num banho-maria a 42°C durante 2 minutos e depois voltaram ao gelo durante mais dez minutos. As células foram colhidas por centrifugação e ressuspensas em 1 ml de caldo L e incubadas a 37°C durante 1 hora. As células transformadas foram semeadas em placas de agar L contendo 100 pg/ml de ampicilina. Os transformantes E.coIi K12 HB101/pBKneo1 e coli K12/pBKneo2 foram identificados pelo seu fenótipo de resistência à ampicilina e por analise com enzimas de restrição do seu DNA de plasmideo. Na Figura 1, Parte A, dos desenhos juntos está apresentado um mapa de restrição e de funções do plasmideo pBKneol.
<5S>rA
C. Construção do plasmideo pLPcat, um plasmideo intermediário usado na construção do plasmideo pBLcat
DNA do virião do adenovirus 2 (Ad2) é uma molécula linear de cadeia dupla com cerca de 35,94kb de taranho. 0 promotor tardio do Ad2 pode ser isolado num fragmento de restrição AccI-Pvu 11 de ^0,32 Kb do genoma de Ad2; este fragmento de restrição de ^0,32 kb corresponde á sequencia entre as posições de nucleotideos 5755 e 6071 do genoma do Ad2. Para isolar o fragmento de restrição pretendido AccI-Pvu 11 ^0,32 kb, o DNA de Ad2 é primeiro digerido com a enzima de restrição Ba 11 e isolado o fragmento de restrição Ba11 de -^2,4 kb que compreende toda a sequen cia do fragmento de restrição AccI-PvuII de ^0,32 kb. Em seguida, o fragmento de restrição Ba II de~2,4 kb é digerido com Acc I e Pvu 11 para se obter o fragmento pretendido.
í
Cerca de 50 pg do DNA de Ad2 (adquirido á BRL) são dissolvidos em 80 pl de H20 e 10 pl do tampão Bali 10X (100 mM Tris-HCl, pH=7,6; 120 mM MgCl2; 100 mM DTT; e 1 mg/ml de BSA). Cerca delO pl (-v 20 unidades) da enzima de restrição Bali são adicionados à solução de DNA do Ad2 e a reacção resultante é incubada a 37°C durante 4 horas.
DNA digerido com Ba 11 é aplicado num gel de agarose e sujeito a e1ectroforese até os fragmentos de restrição estarem bem separados. A visualização do DNA migrado é conseguida por coloração do gel com uma solução diluída (0,5 pg/ml) de brometo de etidio e exposição do gel a luz ultravioleta (UV) de grande comprimento de onda. Um método para isolar DNA de agarose é como se segue. Faz-se um pequeno corte no gel em frente ao fragmento pretendido e coloca-se em cada corte um pequeno pedaço de membrana NA-45
-68DEAE (Schleicher and Schwell, Keene, NH03431 ). Submetendo a posterior e1ectroforese, o DNA liga-se não cova 1entemente à membrana de DEAE. Após o fragrento pretendido estar ligado à membrana de DEAE a membrana é removida e lavada com tampão de baixo teor salino (100 mM KC 1; 0,1 mM EDTA; e mM Tris-HCl, pH=8). Em seguida a membrana é colocada num pequeno tubo e imersa em tampão de alto teor salino (1M NaCl; 0,1 mM EDTA; e 20 mM Tris-HCl, pH=8) e depois incubada a 65°C durante uma hora para remover o DNA do papel DEAE. Após a incubação a 65°C o tampão de incubação é colhido e a membrana lavada com tampão de alto teor salino. A solução de lavagem com alto teor salino é junta ao tampão de incubação de alto teor salino.
volume da solução de DNA de alto teor salino é ajustado de modo a que a concentração de NaCl seja de 0,25M e em seguida adiciona-se à solução tres volumes de etanol absoluto frio. A solução resultante é misturada e colocada a -70°C durante 10-20 minutos.A solução é então centrifugada a 15 000 rpm durante 15 minutos. Após uma outra precipitação para remover o sal residual, o sedimento de DNA é lavado com etanol, seco, ressuspenso em 20 μΐ de tampão TE e constitui cerca de 3 pg do fragmento de restrição do Ad2. 0 fragmento purificado obtido é dissolvido em 10 yul de tampão TE:
Cerca de 6 pl de H20 e 2 pl de tampão Acc I 10X (60 mM NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH=7,5;
mM MgCl2; 60 mM DTT; e 1 mg (ml de BSA) são adicionados à solução do fragmento de restrição Ba 1I v2,4 kb do Ad2. Após a adição de aproximadamente 2 ^ul (~10 unidades) da enzima de restrição Acc I à solução de DNA, a reacção é incubada a 37°C durante 2 horas. Após a digestão com Acc I, o
DNA é colhido por precipitação com etanol e resuspenso em
μΐ de Η^Ο e 2 pl de tampão Pvu 1 1 10X ( 600 mM NaCl;
mM Tris-HCl, pH=7,5; 60 mM MgCl2; 60 mM DTT; e 1 mg/ml de BSA). Após a adição de cerca de 2 μ 1 (aproximadamente 10 unidades) da enzima de restrição Pvu11 à solução de DNA, a reacção é incubada a 37°C durante 2 horas.
fragmento de restrição Ba 11 de -2,4 kb digerido com Acc Ι-Pvu 11 do Ad2 é aplicado num gel de ^6% de po 1 i acr i 1 am i da e sujeito a ei ectrof orese até o fragmento de restrição AccI-Pvu11 que compreende o promotor tardio do Ad2, ser separado dos outros produtos de digestão. 0 gel é corado com brometo de etidio e observado usando luz UV e o segmento de gel contendo o fragmento de restrição AccI-Pvu11 ^0, 32 kb é cortado do gel, esmagado e incubado durante a noite à temperatura ambiente em 250 μ 1 de tampão de extracção (500 mM NH^OAc; 10 mM MgOAc; 1 mM EDTA; e 0,1% de SDS). Na manhã seguinte a mistura é centrifugada e o sedimento rejeitado. 0 DNA no sobrenadante é precipitado com etanol; cerca de 2 pg de tRNA são adicionados para assegurar precipitação completa do fragmento pretendido. Cerca de 0,2 pg do fragmento de restrição AccΙ-Pvu 11 ^0,32kb são obtidos e suspensos em 7 pil de H^O.
Para converter o fragmento de restrição Acc I- Pvu 11 num fragrento de restrição AccI-PvuI 1,1 igaram-se adapatadores Bc1I ao fragmento de restrição Acc I -Pvu 11 dev0,32 kb. Devido aos adaptadores Bc1 I terem extremos· cegos eles ligam-se apenas ao extremo PvuII do fragmento de restrição. Os adaptadores BcII (New England Biolabs)que possuem a sequência:
5'-CTGATCAG-3' 1 -UÍÍÂ4t(!-5 1 ,
-70foram fosforilados e preparados para ligação pelo processo que se segue: Quatro pl de adaptadores ( ^2 /ug) foram dissolvidos en 20,15 ai 1 de H^O e 5 pl de tampão cinase 10X (500 mM Tris-HCl, pH=7,6 e 100 mH mgCl2), incubados a 90°C durante dois minutos e depois arrefecidos até à temperatura ambiente. Cinco pl de γ-32Ρ-ΑΤΡ ( >v20 pCi), 2,5 pl de 1 M DTT e 5 pl de po1inuc1eotideo-cina se ( λΊΟ unidades) foram adicionados à mistura a qual foi então incubada a 37°C durante 30 minutos. Em seguida, 3,35 pl de 0,01 Μ ATP e 5 /ul de cinase foram adicionados e a reacção continuou durante mais 30 minutos a 37°C. 0 ATP radioactivo ajuda na determinação da ligação dos adaptadores ao DNA alvo.
Cerca de 0,25 pg (em 0,5 pl) de adaptadores Bc1 I fosforilados foi adicionado à solução do fragmento de restrição Acc I - Pvu 11 deA/0,32 kb e depois 1 pl H1000 unidades) de DNA-ligase de T4 e 1 pl de tampão ligase 10X foram adicionados à solução de DNA e a reacção resultante foi incubada a 16°C durante a noite. Os adaptadores Bc11 puderam ligar-se apenas ao extremo Pvu 11 do fragmento de restrição Acc Ι-Pvu 11 . Mais tarde a sequenciação de DNA revelou que quatro adaptadores Bc111 se ligaram ao extremo Pvu 11 do fragmento de restrição Acc I -Pvu 11. Estes adaptadores BcIL extra podem ser removidos por digestão com Bcll e religação; no entanto, os adaptadores Bclí extra não foram removidos uma vez que os adaptadores não interferem com o funcionamento correcto dos vectores que possuem adaptadores extra.
As células £. coli Kl2 HB101 (pSVcat são adquiridos na forma liofilizada à ATCC com o número de acesso ATCC 37155 e o DNA do plasmídeo pSV2cat foi isolado a partir das células essencialmente de acordo com o processo do Exemplo IA, exceptuando ter-se usado ampícilina a 50 pg/ml em lugar de tetracic1ina. Na Figura 1, ι
γ
Parte Β, está apresentado um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmideo pSV2cat, dos desenhos juntos. Obtem-se cerca de 1 mg de DNA do plasmideo pSVâat que se dissolve em ml de tampão TE. Cerca de 3 pg (3 μ 1) de DNA do plasmideo pSV2cat foram adicionados a 2 pl de tampão AccI 10X e 16 pl de H20 e em seguida, adicionou-se 3 pi 1 (cerca de 9 unidades) da enzima de restrição AccI à solução de DNA do pSV2cat e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante 2 horas. 0
DNA do plasmideo pSV2cat digerido com AccI foi então digerido com a enzima de restrição StuI pela adição de 3 ul de tampão StuI 10X (1,OM NaCl; 100 mM Tris-HCl, pH = 8,0; 100 mM MgCl2; 60 mM DTT; e 1 mg/ml de BSA), 5 /1 de H20 e cerca de 2 pl (aproximadamente 10 unidades da enzima de restrição Stu I. A reacção resultante foi incubada a 37°C durante 2 horas. Parou-se a reacção através de extracção da mistura de reacção uma vez com fenol, depois duas vezes com cloroformio. Cerca de 0,5 pg do fragmento pretendido foi obtido e dissolvido em 20 pl de tampão TE.
AccI-PvuII de ^0,32 kb
Ad2 e após a adição de 3
Cerca de 4 pl de DNA do plasmideo pSV2cat digerido com AccI-StuI foram misturados com cerca de 7 p 1 do fragmento de restrição (com adaptadores Bc1 I ligados) pl de tampão ligase 10X, 15 pl unidades) de DNA-ligase de T4, cubada a 16°C durante a noite.
plasmideo pLPcat pretendido, um plasmideo que compreende o promotor tardio de crição e portanto -acet i 1 transferase.
um mapa dos sitios de testrição e pLPcat.
do de H20 e 2 pl (cerca de 100 a reacção de ligação foi in0 DNA ligado constituiu o
Ad2 colocado de modo a dirigir a transa expressão do
Na Figura 1 , gene de c1oranfenico1Parte B, está apresentado funções do plasmideo
DNA ligado foi usado para transformar células /. co1i K12 HB101 substancialmente de
acordo com o processo do Exemplo 2B. As células transformadas foram semeadas em placas de agar L contendo 50 pg/ml de ampicilina) a análise com enzimas de restrição do DNA do plasmideo foi usada para identificar os transformantes E. coli K12 HB101/pLPcat. 0 DNA do plasmideo pLPcat foi isolado a partir dos transformantes para ser usado em subsequentes construções substancialmente de acordo com o processo de isolamento de plasmideos descrito no Exemplo IA, excepto ter-se usado ampicilina como agente selectivo em vez de tetrac i c1i na .
D. Construção do plasmideo pBLcat
Cerca de 88 ug de DNA do plasmideo pBKneol em 50 μ 1 de tampão TE foram adicionados a 7,5 pl de tampão AccI IOX, 30 pl de H^O e 15 pl (cerca de 75 unidades) da enzima de restrição Acc I e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante 2 horas. 0 DNA do plasmideo pBKneol digerido com AccI foi aplicado num gel de agarose e o frag mento de 1,4 kb que contem o potenciador Bk foi separado dos outros produtos de digestão. 0 fragmento de restrição
AccI 1,4kb foi então isolado a partir do gel e purificado.
Cerca de 5 pg do fragmento foram tampão P vu 11 10X, 45 pl de h^O e da enzima de restrição Pvu 11 e a incubada a 37°C durante 2 horas.
resuspensos em 5 pl de pl(cerca de 25 unidades) reação resultante foi
DNA digerido com PvuII foi então isolado, purificado e preparado para ligação. Cerca de 2 ^ug do fragmento Acc I -Pvu 11 -^1,28 kb pretendido foram obtidos e dissolvidos em 5 pl de tampão TE.
Aproximadamente 1 pg de DNA do plasmideo pLPcat foi dissolvido em 5 ^ul de tampão Acc I 10X e 40 pl de F/O. Cerca de 5 yu 1 (^25 unidades) da enzima de restrição AccI foram adicionados à solução de DNA do plasmi-
-73deo pLPcat e a reacção resultante foi incubada a 37°C. 0
DNA do plasmideo pLPcat digerido com AccI foi precipitado com etanol e resuspenso em 5 yul de tampão StuI 10X, 40 p 1 de H^O e 5 p1 d(cerca de 25 unidades) da enzima de restrição Stu I e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante 2 horas. 0 DNA do plasmideo pLPcat digerido com AccI-StuI foi precipitado com etanol várias vezes para purificar o fragmento de re-strição Acc Ι-Stu I ^4,81 kb que compreende a origem de replicação de ΙΞ. co 1 i e o promotor tardio do Ad2 separando-o do outro produto de digestão, um fragmento de restrição com cerca de 16 pb de tamanho. Obteve-se cerca de 1 ^ug do fragmento de restrição de~4,81kb pretendido e dissolveu-se em 20 pl de tampão TE:
Os 5 yUl do fragmento de restrição Acc Ι-Stu I ^4,81kb do plasmideo pLPcat foram adicionados a 5 pl do fragmento de restrição AccI-Pvu11 Ί,28kb do plasmídeo pBKneoI. Após a adição de 3 pl de tampão ligase 10X, 15 p1 de H^O e 2 p1 (cerca de 10 unidades) de DNA-ligase de T4 à mistura de DNA, a reacção de ligação resultante foi incubada a 16°C durante a noite. 0 DNA ligado constituiu o plasmideo pBLcat pretendido. Na Figura 1, Parte C, ctsdesenhos juntos está apresentado num mapa dos sítios de restrição e funções do plasmideo pBLcat.
DNA ligado foi usado para transformar células E. co1i K12 HB101 substancialmente de acordo com o processo descrito no Exemplo 2B. Os transformantes E,. co 1 i K12 HB101 /pBLcat foram identificados por análise com enzimas de restrição do seu DNA de plasmideo 0 DNA do plasmideo pBLcat foi preparado para ser usado em subsequentes construções substancialmente de acordo com o processo do Exemplo IA, exceptuando ter-se usado ampicilina como agente selectivo em vez de tetracic1ina.
Ε. Construção do plasmideo pLI33 plasmideo pL133 é um vector de expressão da proteina C humana. Conforme descrito abaixo, o plasmideo pL133 pode ser construído usando como vectores de partida os plasmideos pSV2gpt e pHC7 (a preparação do plasmideo pHC7 está descrito abaixo no Exemplo IA), para construir o plasmideo vector intermediário pSV2-HPC8, o qual é então combinado com o plasmideo pSV2-β-g1obina para dar o plasmideo pL133. 0 protocolo de construção do plasmideo pL133 está descrito deta 1 hadamente abaixo, e esquematicamente ilustrado na Figura 2 dos desenhos juntos.
Cinquenta pl ( ^50 pg) de DNA do plasmideo pHC7 foram misturados com 5 pl ( ~50 unidades) da enzima de restrição BanI , 10 pl do tampão de reacção Bani 10X (1,5 M NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH=7,9; 60 mM MgClp; e 1 mg/ml de BSA) e 35 pl de 1^0 e incubado até a digestão estar completa. 0 DNA do plasmideo pHC7 digerido com Bani foi então sujeito a e1ectroforese num gel de 3,5% de poliacrilamida (29:1, acrilamida; bis-acri1amida) até o fragmento de restrição Bani ^1,25 kb estar separado dos outros produtos de digestão.
A região do gel contendo o fragmento de restrição Bani -vl,25 kb foi cortada do gel, colocada num tubo de ensaio e dividida em pequenos fragmentos. Um ml de tampão de extracção (500 mM NH^OAc, 10 mM MgOAc, 1 mM EDTA, 1% SDS e 10 mg/ml de tRNA) foi adicionado ao tubo contendo os fragmentos e o tubo foi colocado a 37°C durante a noite. A remoção de detritos fez-se por centrifugação e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Os detritos foram lavados uma vez com 200 p! de tampão de extracção; o sobrenadante da lavagem foi combinado com o primeiro sobrena-
-75dante da extracção que decorreu durante a noite. Após passagem do sobrenadante através de uma almofada de fibra de vidro, adicionou-se dois volumes de etanol e misturou-se com o sobrenadante. A solução resultante foi colocada num banho de neve carbónica-etanol durante 10 minutos e depois o DNA foi sedimentado por centrifugação.
Aproximadamente 8 μς do fragmento de restrição Bani ^1,25 kb foram obtidos por este processo. 0 fragmento purificado foi suspenso em 10 /j 1 de tampão TE e guardado a -20°C. 0 fragmento de rsetrição Bani teve de ser modificado pela adição de um adaptador para construir o plasmideo pSV2-HPC8. Os fragmentos de DNA usados na construção do adaptador foram sintetizados usando um Sintetizador de DNA Systec 1450A (Systec Inc., 3816 Chandler Drive, Minneapolis, MN) ouum Sintetizador de DNA ABS 380A(applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA94404).
Conhecem-se muitos equipamentos para a síntese de DNA e podem ser usados para fazer os fragmentos. Em adição, os fragmentos podem ser convencíonalmente preparados substancialmente de acordo com os processos de Itakura et al., 1 977, Science, 198:1056 e Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 75:5765.
Quinhentos picomoles de cada uma das cadeias simples do adaptador foram fosforiladas em 20 /jl de tampão de reacção, que continha 15 unidades ( Μ), 5 pl)de pol inucleotideo-cinase de T4, 2 /j 1 de tampão ligase 10X, 10 μ 1 de ATP 500 /jM e 7,5 μ 1 de HgO. A reacção de fosforilação foi incubada a 37°C durante 30 minutos e a reacção foi parada pela incubação a 100°C durante 10 minutos. Para assegurar uma fosforilação completa, a reacção foi arrefecida em gelo, e adicionou-se â mistura de reacção 2 /j! de 0,2 M
ditiotreitol , 2,5 p1 de 5 mM ATP e 15 unidades de polinucleo tideo-cinase de T4 e a mistura de reacção foi incubada mais 30 minutos a 37°C. A reacção foi parada por outra incubação a 100°C durante 10 minutos e depois arrefecida em gelo.
Apesar de fosforiladas separadamente as duas cadeias simples do DNA adaptador foram misturadas após a reacção de fosfori1 ação. Para emparelhar as cadeias, a mistura de reacção fosforilada foi incubada a 100°C durante 10 minutos num banho-maria contendo^>150 ml de água. Após esta incubação desligou-se o banho-maria e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente, num processo que demora cerca de 3 horas. 0 banho-maria ainda contendo o tubo com DNA fosforilado foi então incubado a 4°C durante a noite. Este processo emparelhou as cadeias simples.0 adaptador construído tem a seguinte estrutura:
1 -AGCTTTGATCAG-3'
II II Η H
3'-AACTAGTCCACG-51 adaptador foi guardado a -20°C até ser usado.
Os ^8 ug do fragmento Bani de ^1,25 kb foram adicionados e misturados com os ^50 μ 1 de adaptador ( ^500 picomoles), 1 μ 1 de DNA-ligase de T4 ( unidades), 10 ρ 1 de tampão ligase 10X e 29 /j 1 de HgO e a reacção de ligação resultante foi incubada a 4*C durante a noite. A reacção de ligação foi parada através de uma incubação de 10 minutos a 65°C. 0 DNA foi sedimentado pela adição de NaOac para uma concentração final de 0,3M, adição de 2 volumes de etanol, arrefecimento num banho de neve car-77-
bónica-etanol e depois centrifugação da solução.
sedimento de DNA foi dissolvido em 10 pl de tampão de reacção ApaI 10X (60 mM NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH=7,4; 60 mM MgCl2; e 60 mM 2-mercaptoetano 1 ) , 5 pl ( *>5 0 unidades) da enzima de restrição ApaI e 85 pl de H20 e a reacção foi colocada a 37°C durante duas horas. A reacção foi então parada e o DNA sedimentado como atrás. 0 sedimento de DNA foi dissolvido em 10 pl de tampão de reacção H i nd 111 10X,5 pl (*>50 unidades) da enzima de restrição H i nd 111 e 85 pl de H20 e a reacção foi colocada a 37°C durante duas horas. Após a digestão com H i nd 111, a mistura de reacção foi aplicada num gel de 3,5% de po1iacri1amida e o fragmento de restrição pretendido H i nd 111 - Apa I de*>l,23kb foi isolado a partir do gel e purificado. Obtiveram-se aproximadamente 5 pg do fragmento pretendido, suspenderam-se em 10 pl de tampão TE e guardaram-se a -20°C.
Cinquenta pl (-v50 pg) de DNA do plasmideo pHC7 foram misturados com 5 pl ( *>50 unidades) da enzima de restrição PstI , 10 pl de tampão de reacção PstI 10X (1,0M NaCl; 100 mM Tris-HCl, pH= 7,5; 100 mM MgCI2; e 1 mg/ml de BSA) e 35 pl de H20 e incubado a 37°C durante duas horas. 0 DNA do plasmideo pHC7 digerido com PstI foi então sujeito a electroforese num gel de 3,5% de poliacrilamida e o fragmento pretendido de *>0,88 kb foi purificado substancialmente de acordo com o processo descrito atrás. Obtiveram-se aproximadamente 5 pg do fragmento pretendido que se suspenderam em 10 pl de tampão TE e guardou-se a -20°C.
5^ug do fragmento PstI de*>0,88kb foram adicionados e misturados com ^50 pl do adaptador que se segue, o qual foi construído num sintetizador automático de DNA:
51 -GTGATCAA-3'
I II I II II
3'-ACGTCACTAGTTCTAG-5'
Cerca de 1 pl de DNA ligase de T4 ( λ/ΙΟ unidades), 10 pl de tampão ligase 10X e 29 μ 1 de H20 foram adicionados à mistura de DNA e a reacção de ligação resultante foi incubada a 4°C durante a noite.
A reacção de ligação foi parada por uma incubação de 10 minutos a 65°C. Após precipitação do DNA ligado, o sedimento de DNA foi dissolvido em 10 μ 1 de tampão de reacção Apa I 10X, 5 pl (^50 unidades) da enzima de restrição Apal e 85 pl de F^O e a reacção foi colocada a 37°C durante duas horas. A reacção foi então parada e o DNA sedimentado outra vez. 0 sedimento de DNA foi dissolvido em 10 ul de tampão de reacção Bg111 10X ( 1 M NaCl; 100 mM Tris-HCl, pH= 7.4; 100 mM MgCl^; 100 mM 2-mercaptoetano1; e 1 mg/ml de BSA), 5 pl (^50 unidades) da enzima de restrição Bg111 e 85 pl de H20 e a reacção foi colocada a 37°C durante duas horas. Após a digestão com Bg1II a mistura de reacção foi aplicada num gel de 3,5% de poliacrilamida e o fragmento de restrição pretend ido Z^pa I - B g 111 de -^0,19 kb foi isolado essencialmente de acordo com o processo descrito atrás. Aproximadamente 1 pg do fragmento pretendido foi obtido, suspenso em 10 pl de tarpão TE e guardado a -20°C.
Aproximadamente 10 pg de DNA do plasmideo pSV2gjot (ATCC 37145) foram dissolvidos em 10 pl de tampão de reacção Hi nd 111 10X, 5 pl (-v50 unidades) da enzima de restrição Hind111 e 85 pl de H20 e a reacção foi colo cada a 37°C durante 2 horas. A mistura de reacção foi então ajustada a 0,25M de NaOAc e após a adição de dois volumes de
-79etanol e incubação em banho de neve carbónica-etanol, o DNA foi sedimentado por centrifugação. 0 sedimento de DNA foi dissolvido em 10 μ 1 de tampão Bg 111 10X, 5 ^1 (^50 unidades) da enzima de restrição Bg1 11 e 85 μ 1 de H^O e a reacção foi colocada a 37°C durante duas horas. Após a digestão com Bg 1 11, a mistura de reacção foi aplicada num gel de 1% de agarose, e os fragmentos foram separados, por electroforese. 0 gel foi corado com brometo de etidio e observado sob luz ultravioleta e a banda contendo o fragmento pretendido Hindi I I-Bgl II ^5,1 kb foi cortado do gel e colocado em tubo de diálise e a electroforese continuou até o DNA sair da agarose. 0 tampão contendo o DNA do tubo de diálise foi extraído com fenol e CHCl^ e depois o DNA foi precipitado.
sedimento foi ressuspenso em 10 pl de tampão TE e constituiu ^5 yug do fragmento de restrição pretendido H i nd 111 -Bg 111 ^5,1 kb do plasmideo pSV2gpt.
Dois p 1 do fragmento de restrição
Η í nd 111 -ApaI ^1,23 kb. 3 μ 1 do fragmento de restrição
Apa I -Bg 1 11 vO , 19 kb e 2/jI do fragmento Hi nd 111 -Bg 111 5 , 1 kb foram misturados e depois incubados com 10 μ 1 de tampão ligase 10X, 1 p1 de DNA-ligase de T4 (^500 unidades) e 85 μ 1 de H20 a 16°C durante a noite. 0 DNA ligado constituiu o plasmideo pretendido pSV2-HPC8; na Figura 2 dos desenhos juntos está apresentado um mapa dos sítios de restrição e funções do plasmideo.
Células E. coli K12 RR1 (NRRLB-15210) foram tornadas competentes para transformação substancialmente de acordo com o processo descrito para E.co I i KL2 HB101 no Exemplo 2B. 0 DNA ligado preparado acima foi usado para transformar as células e amostras da mistura de transformação foram colocadas em placas de agar L contendo
100 yjg//jl de ampicilina. As placas foram então incubadas a
37°C. Os transformantes de E.coli KI2 RR 1/pSV2-HPC8 foram
-80verificados por análise com enzimas de restrição do seu DNA de plasmideo. 0 DNA do plasmideo pSV2-HPC8 foi preparado a partir dos transformantes substancialmente de acordo com o processo do Exemplo IA, excepto ter-se usado ampicilinas, e não tetracic1ina, como agente selectivo durante a cultura dascélulas.
Cinquenta μς do plasmideo pSV2-HPC8 foram dissolvidos em 10 μ 1 de tampão de reacção H i nd 111 10X, 5 /j1 ( v50 unidades) da enzima de restrição Hi nd 111 e 85 £1 de H^O e a reacção foi incubada a 37°C, durante duas horas. Após digestão com H i nd 111, o DNA foi precipitado e o sedimento de DNA foi dissolvido em 10 /i 1 de tampão de reacção Sa1I 10X (1,5 M NaCl; 60 mM Tris-HCI, pH = = 7,9; 60 mM MgCl2; 60 mM 2-mercaptoetano 1 ; e 1 mg/ml de BSA), 5 μ 1 (^50 unidades) da enzima de restrição Sa 11 e 85 /il de H20. A mistura de reacção Sa 11 resultante foi incubada durante 2 horas a 37°C. 0 plasmideo pSV2-HPC8 digerido com H i nd111 -Sa1 I foi aplicado num gel de 3,5% de poliacrilamida e sujeito a e1ectroforese até o fragmento de restrição Hi nd 111 -Sa 11 de -^0,29 kb estar separado dos outros produtos de reacção. 0 fragmento pretendido foi isolado do gel; obtiveram-se cerca de 2 /ig do fragmento que se suspenderam em 10 μ 1 de tampão TE.
Cinquenta /jg do plasmideo pSV2-HPC8 foram dissolvidos em 10 /11 de tampão de reacção Bg 1 11 10X, 5 /il ( 50 unidades) da enzima de restrição Bg 111 e 85 μ\ de H20 e a reacção foi incubada a 37°C durante duas horas. Após a digestão com Bg111 o DNA foi precipitado e o sedimento de DNA dissolvido em 10 μ 1 de tampão de reacção Sa I I 10X, 5 /il (v50 unidades) da enzima de restrição Sa 11 e 85 μ 1 de H20. A mistura de reacção Sal I resultante foi incubada durante 2 horas a 37°C. 0 plasmideo pSV2-HPC8 digerido com Sa1I-Bg1II foi aplicado num gel de 3,5% de poliacri-81-
lamida e sujeito a e 1 ectroforese até o fragmento de restrição pretendido Sa 11-Bg 111 ^>1 , 15kb ter-se separado dos outros produtos de reacção. 0 fragmento de restrição Sa1I-Bg1II ^1,15 kb foi isolado do gel; cerca de 8 pg do fragmento foram obtidos e suspensos em 10 μ 1 de tampão TE:
Aproximadamente 10 pg de DNA do plasmideo pSV2-p-g1obina (NRRL B-15928) foram dissolvidos em 10 pl de tampão de reacção Η i n d 111 10X, 5 pl ( -v50 unidades) da enzima de restrição Hind111 e 85 μ 1 de H^O e a reacção foi colocada a 37°C durante 2 horas. A mistura de reacção foi ajustada a 0,25M de NaOAc e após a adição de dois volumes de etanol e incubação em neve carbónica-etanol, o DNA foi sedimentado por centrifugação. 0 plasmideo pSV2-p-globina digerido com H i nd 111 foi dissolvido em 10 pl de tampão Bg 1 11 10X, 5 pl (/x>50 unidades) da enzima de restrição Bg 111 e 85 pl de H20 e a reacção foi colocada a 37°C durante duas horas. Após digestão com Bg1 11 a mistura de reacção foi aplicada num gel de 1% de agarose e os fragmentos foram separados por e1ectroforese. 0 fragmento de restrição pretendido Hindi I I-Bgl 11 4,2 kb foi isolado a partir do gel; obtiveram-se cerca de 5 pg do fragmento pretendido e suspenderam-se em 10 pl de tampão TE.
Dois pl do fragmento H i nd 111 -Sa1I ^0,29 kb do plasmideo pSV2-HPC8, e pl do fragmento Sal I-Bgl 11 de -vl , 1 ζ kb e 2 pl do fragmento HIndII I-Bg 111 de ^4,2 kb do plasmideo pSV2-p-g1 obina foram misturados e ligados com DNA-ligase de T4. 0 DNA ligado constituiu o plasmideo pretendido pL133; na Figura 2 dos desenhos juntos está apresentado em mapa de restrição e de funções do plasmideo pL133. 0 DNA ligado foi usado para transformar
E. co1ί K12 RR1 e os transformantes pretendidos E. co1i KL2 RRl/pL133 foram identificados pelo seu fenótipo de resistência à ampicilina e por análise do seu DNA de plasmideo com enzimas de restrição.
F. Construção do plasmideo pLPC a partir dos plasmideos pL133 e pBLcat
Cerca de 20 pg de DNA do plasmideo pBLcat for.am dissolvidos em 10 pl de tampão Hindi 11 10X e 80 pl de H20. Cerca de 10 pl (MOO unidades) da enziíia de restrição Hind111 foram adicionados à solução de DNA do plasmideo pBLcat e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante 2 horas. 0 DNA do plasmideo pBLcat digerido com Hi nd 111 foi aplicado num gel de agarose e sujeito a electroforese até o fragmento de restrição Hi nd 111 de -^0,87 kb que compreende o potenciador BK e o promotor tardio do Ad2 ter-se separado dos outros produtos de digestão; em seguida, isolou-se o fragmento de^0,87 kb, purificou-se e preparou-se para ligação. Obtiveram-se cerca de 2 pg do fragmento pretendido que se dissolveu em 5 pl de tampão TE.
Cerca de 1,5 pg de DNA do plasmideo pL133 foram dissolvidos em 2 pl de tampão Hind111 10X e 16 pl de H20. Cerca de 1 pl ( M0 unidades) da enzima de restrição H i nd 111 foi adicionado à solução dé DNA e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante 2 horas. 0 DNA foi então diluído para 100 pl com tampão TE e tratado comA/0,06 unidades de fosfatase alcalina de intestino de vitela e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante 30 minutos. A solução foi ajustada para conter SET IX (5 mM Tris-HCl, pH=7,8; 5 mM EDTA; e 150 mM NaCl), 0,3 M NaOAc e 0,5% de SDS e depois incubada a 65°C durante 45 minutos. 0 DNA do plasmideo pL133 digerido com Hind 111 foi então extraído duas vezes com fenol e uma vez com cloroformio, precipitado com etanol e ressuspenso em 10 pl de tampão TE.
Cerca de 5 pl de fragmento de restrição Hind 111 -vO ,87 kb do plasmideo pBLcat foram adicío-83-
nados a 1,5 /jg (10 μ 1 ) do plasmideo pL133 digerido com Hi nd 111 e depois adicionou-se â solução de DNA 2 μ 1 de tampão ligase 10X, 1 /j 1 (r-10 unidades) de DNA ligase de T4 e 2 yU 1 de H^O e a reacção resultante foi incubada a 16°C durante a noite. 0 DNA ligado constituiu o plasmideo pLPC pretendido.
DNA ligado foi usado para transformar E. co1i K12 HB101 substancialmente de acordo com o processo do Exemplo 2B. As células transformadas foram semeadas em placas de agar contendo ampicilina e o DNA de plasmideo dos transformantes resistentes à ampicilina foi examinado por analise de restrição para identificar os transformantes £. co1i K12 HBlOl/pLPC. 0 fragmento de restrição Hindi 11 -Ό ,87 kb que codifica o potenciador BK e o promotor tardio do Ad2 pode inserir-sesno plasmideo pL133 digeridos com H i nd 111 numa de duas orientações possíveis, apenas uma delas dá o plasmideo pLPC. Na Figura 1, Parte D, dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sitios de restrição e funções do plasmideo pLPC.
Exemplo 3
A construção do plasmideo pLPC-167G plasmideo pLPC-167G foi construído substancialmente de acordo com a mutagénese especifica de sitio e outros protocolos de construção usados na construção do plasmideo pLAPC, conforme descrito no Exemplo 1. Os tampões e condições de emparelhamento usados na construção do plasmideo pLPC- 167G foram como descrito por Zoller e Smith, 1984, DNA3:479-489.
-84Na construção do plasmideo pLPC-167G, o fago M13mpl8-HE1 (ver Exemplo IB) foi sujeito a mutagénese especifica de sitio usando o oligonucleotideo mutagénico descrito abaixo:
5'-GACCAAGAAGACCAAGTAGGCCCGCGGCTCATTGATG-3'.
fago mutagenizado resultante da mutagéne especifica de sitio foi designado M13mpl8-HE4.
A construção final do plasmideo PLPC-167G decorreu de modo analogo à construção do plasmideo pLAPC descrito no Exemplo IC. No entanto, o plasmideo pLAPC foi construído usando dois fragmentos de rsetrição derivados do plasmideo pLPC. Na construção do plasmideo pLPC-167G, estes mesmos dois fragmentos foram por outro lado obtidos a partir do plasmideo pLAPC. A razão para o uso do plasmideo pLAPC como fonte dos fragemntos em vez do plasmideo pLPC, foi para facilitar a analise de restrição na identificação dos transformantes do plasmideo pLPC-167G. Devido aos plasmideos pLPC e pLPC-167G terem tamanhos muito semelhantes seria difícil distinguir parentais (plasmideo pLPC) do plasmideo pLPC-167G. Estes parentais poderão estar presentes apesar da purificação dos fragmentos usados na ligação devido a uma série de factores. No entanto, devido ao plasmideo pLAPC ser mais pequeno do que o plasmideo pLPC-167G, através da obtenção dos dois fragmentos a partir do plasmideo pLAPC, pode-se fácilmente distinguir os parentais (plasmideo pLAPC) do plasmideo pretendido pLPC-167G. Assim, para construir o plasmideo pLPC-167G, o fragmento de restrição SstI-Sa1I ^0,7 kb do fago M13mpl8-HE4 foi ligado ao fragmento de restrição EcoR I -Sa11 ^3,76 kb do plasmideo pLAPC e ao fragmento de restrição EcoRI-SstI^2,Okb do plasmideo pLAPC.
DNA ligado constituiu o plasmideo pretendido pLPC-167G, ο qual foi usado para transformar E. co1i K12 RV308. Os
transformantes resultantes E. col i K12 RV308/pLPC- 1 67G foram usados para se obter uma preparação em larga escala de DNA do plasmideo pLPC-167G para usar nas transformações de células eucarióticas.
Exemplo 4
A construção do plasmideo pLPC-167F plasmideo pLPC-167F foi construído essencialmente de acordo com o protocolo de mutagénese dirigida especifica de sitio e outros protocolos de construção usados na construção do plasmideo pLAPC, conforme descrito no Exemplo 1. Os tampões e condições de empareihamento usados na construção do plasmideo pLPC-167F foram as descritas por Zoller e Smith, 1984, DNA 3:479-489.
Na construção do plasmideo pLPC-167F o fago M13mpl8-HE1 (ver Exemplo 1B) foi sujeito a mutagénese especifica de sitio usando o oligonucleotideo mutagénico descrito abaixo:
5'-GACCAAGAAGACCAAGTATTCCCGCGGCTCATTGATG-3' fago mutagenízado resultante da mutagénese especifica de sitio foi designado Ml3mp18-HE5.
A construção final do plasmideo pLPC-167F decorreu de modo analogo à construção do plasmideo pLAPC, descrito no Exemplo IC. No entanto, o plasmideo
-86pLAPC foi construído usando dois fragmentos de restrição derivados do plasmídeo pLPC. Na construção do plasmídeo pLAPC-167F, estes mesmos dois fragmentos foram obtidos a partir do plasmídeo pLAPC. A razão para o uso do plasmídeo pLAPC como fonte dos fragmentos em vez do plasmídeo pLPC, foi para facilitar a analise de restrição na identificação dos plasmideos transformantes pLPC-167F. Devido aos plasmídeos pLPC e pLPC-167F terem tamanhos muito semelhantes seria difícil distinguir parentais (plasmídeo pLPC) do plasmídeo pLPC-167F. No entanto, devido ao plasmídeo pLAPC ser mais pequeno do que o plasmídeo pLPC-167F, ao obter-se os dois fragmentos a partir do plasmídeo pLAPC, pode-se facilmente distinguir os parentais (plasmídeo pLAPC) do plasmídeo pretendido pLPC-167F. Assim, para construir o plasmídeo pLPC-167F, o fragmento de restrição SstI-Sa1 I ^0, 7kb do fago M13mpl8-HE5 foi ligado ao fragmento de restrição EcoRI-Sa1I ^3,76 kb do plasnideo pLAPC e ao fragmento de restrição EcoRI-SstI do plasmídeo pLAPC. 0 DNA ligado constituiu o plasmídeo pretendido pLPC-167F que foi usado para transformar E_. coli K12 RV308. Os transformantes resultantes E. coli K12 RV308/pLPC-167F foram usados para se obter uma preparação em larga escala de DNA do plasmídeo pLPC-167F para usar nas transformações de células eucarióticas.
Exemplo 5
Construção de TRansformantes da linha celular
293 de rim embrionário humano transformada com adenovirus e da linha celular Avl2 de hamster sírio transformada com adenovírus usando os plasmideos pLPC-167G e pLPC-167F
A linha celular 293 de rim embrionário humano pode ser adquirida à American Type Culture
-87Collection com o número de acesso ATCC CRL 1573. A linha celular AV12 de hamster sírio transformada com adenovírus pode também ser adquirida à American Type Culture Collection com o número de acesso ATCC CRL 9595. 0 processo de transformação descrito abaixo refere-se às células 293 como linha celular hospedeira; no entanto o processo é de um modo geral aplicável à maioria das linhas celulares eucarióticas, incluindo a linha celular Avl2 e à expressão dos vectores do invento.
As células 293 são adquiridas à
ATCC com o número de acesso CRL 1573 num frasco de 25 mm contendo uma monocamada confluente de cerca de 5,5χ10θ células em Eagle's Minimum Essencial Médium (Gibco) com 10% de soro de cavalo inactivado pelo calor. 0 frasco foi incubado a 37°C; o meio foi mudado duas vezes por semana. 0 meio é composto por DMEM (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 50 yug/ml de gentamicina e 10 pg/ml de AquaMEPHYTON (R) fitonadiona vitamina Kl (Merck Sharp and Dohme, Merck e Co., Inc., West Point, PA 19486). As células são subcultivadas por remoção de meio, lavagem com solução de sais equilibrados de Hank (Gibco), adição de 0,25% de tripsina (contendo 0,2 g/1 de EDTA) durante 1-2 minutos, lavagem com meio fresco, aspiração e distribuição por novos frascos numa proporção de subcultura de 1:5 ou de 1:10.
Um dia antes da transformação, as células foram semeadas a 0,7 x 10θ células por placa de 100 mm. 0 DNA de plasmideo precipitado com etanol dissolvido em tampão TE foi usado para preparar uma solução de DNA-CaClg 2X contendo 25 pg/ml de DNA de plasmideo transformante (para as transformações com os plasmideos pLPC-167F ou pLPC-167G, usaram-se geralmente dois plasmideos, plasmideo pLPC-167F ou pLPC-167G e um plasmideo que contem uma marca selectiva, conforme discutido abaixo) e 250 mM CaC^.Prepa-88-
rou-se HBSS 2X contendo 280 mM NaCl, 50 mM Hepes e 1,5 mM fosfato de sódio, com o pH ajustado a 7,05-7,15. A solução de DNA-CaCl2 2X é adicionado gota a gota a um volume igual de HBSS 2X estéril. Uma pipeta de plástico de 1 ml estéril tendo uma rolha de algodão é inserida no tubo de mistura que contem o HBSS 2X e faz-se borbulhar ar na solução enquanto se adiciona o DNA. 0 precipitado de fosfato de cálcio-DNA é formado sem agitação durante 3>45 mirutos à temperatura amb i ente.
precipitado é então misturado pipeta ndo suavemente com uma pipeta de plástico e adiciona-se directamente 1 ml (por placa) de precipitado a 10 ml do meio de crescimento que cobre as células recipientes. Após 4 horas de incubação a 37°C, o meio é substituído por meio fresco e as células deixadas a incubar durante mais 72 horas, antes de se exercer a pressão selectiva. Para os plasmideos que não possuem uma marca selectiva que funcione em células eucarióticas, como seja o plasmideo pLPC-167F ou pLPC-167G, o processo de transformação utiliza uma mistura de plasmideos: o vector de expressão do presente invento que não possui uma marca seleccionável ; e um vector de expressão que compreende uma marca seleccionável que funciona em células eucarióticas. Existe uma variedade de vectores para usar em tais sistemas de cotransformação e inclui os plasmideos pSV2-dhfr (ATCC 37146), pSV2-neo (ATCC 37149), pSV2-gpt (ATCC 37145) e pSV2-hyg (NRRL B-18039). 0 plasmideo pSV2-hyg confere resistência à higromicina B a células eucarióticas hospedeiras. Esta técnica de cotransformação permite a selecção de células que contem o plasmideo com a marca selectiva. Estas células são ainda examinadas para se identificar células que possuam ambos os plasmideos transformantes. Certamente, o presente invento também inclui vectores de expressão que contenham uma marca seleccionável para células eucarióticas e que portanto não requerem o uso da técnica de ootrBnsformação.
-89Para células transfectadas com plasmideos contendo o gene que confere resistência à hiçjromicina, adiciona-se higromicina B ao meio de crescimento para uma concentração final de cerca de 200 pg/ml. As células são então incubadas a 37°C durante 2-4 semanas com mudanças de meio com intervalos de 3 a 4 dias. As colónias resultantes resistentes à higromicina são transferidas para frascos de cultura individuais para caracterização. 0 plasmideo pSV2-neo confere resistência à neomicina (G418 é também usado em lugar da neomicina) e a selecção das colónias resistentes a G418 é efectuada substancialmente de acordo com o processo de selecção das células resistentes à higromicina, excepto adicionar-se G418 para uma concentração final de 400 pg/m 1 .
uso do gene da di-hidrofo 1ato-reductase (dhfr) ou a resistência ao metotrexato conferida pelo derivado do gene dhfr (dhfr-mtx) como marca selectiva para a introdução de um gene ou plasmideo numa linha celular deficiente em dhfr e o uso subsequente do metotrexato para amplificar o número de cópias do plasmideo está bem documentado na literatura. As células 293 são dhfr positivas, portanto os transformantes 293 que contêm plasmideos compreendendo o gene dhfr não são seleccionados apenas com base no fenótipo dhfr positivo, o qual é a capacidade para crescer em meio sem hipoxantina e sem timina. As linhas celulares que não possuem um gene dhfr funcional e são transformadas com plasmideos contendo dhfr podem ser seleccionadas com base no fenótipo dhfr+. Apesar do uso de dhfr como marca seleccio nável e amplificável em células produtoras de dhfr não ter sido bem estudado os dados da literatura sugerem que dhfr possa ser usado como uma marca seleccionável e na amplificação de genes em células produtoras de dhfr. 0 presente invento não está limitado pela marca seleccionável usada nos vectores de expressão. Ainda podem ser usadas marcas amplificáveis tais como genes da meta 1otioneina, genes da adenosi-
-90na-desaminase ou membros da família de multigenes de resistência, exemplificado pelo gene da g1icoproteina P.
A transformação das linhas celulares 293 e AV12 com uma mistura de plasmideo pLPC-167F ou pLPC-167G e um vector que confere resistência à higromicina e subsequente seleccção de células resistentes à higromicína deu vários transformantes. (Outros transformantes foram obtidos usando o plasmideo pSV2-neo como vector de cotransformação e selecção de células resistentes a G418). Estes transformantes são analisados, como descrito no Exemplo 6, para determinar quais as células resistentes à higromicina que contêm o plasmideo pLPC-167F ou pLPC-167G.
Exemplo 6
Selecção de transformantes com secreção alta
Os transformantes resistentes à higromicina obtidos no Exemplo 5 foram cultivados em placas 2 de cultura de tecidos de 100 mm a uma densidade de várias centenas de clones de células por placa de cultura de tecidcs. 0 meio foi decantado e as células lavadas duas vezes com 5 ml de solução salina equilibrada de Hank (Gibco).Preparou-se uma solução estéril de 0,45% de agar (agarose Tipo 4 da Sigma, catálogo A3643, Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Louis, MO 53178) misturando 1 ml de 1,8% de agar (47°C) com 3 ml de Dulbecco's Modified Eagle's (DME) Salts (Gibco) (37°C) e 2 ml desta solução de agar a 0,45% foi colocado sobre as células.
Ferveram-se filtros de nitrocelulose (Schleicher and Schmell Inc., Keene, NA 03431) e
-91depois autoclavaram-se 2 horas para remover o agente molhante, o qual é tóxico para as células. Os filtros são então colocados por cima da camada de agar e depois de removidos as bolhas de ar as placas são incubadas a 37°C durante a 3 horas. Os filtros, préviamente marcados para indicar a orientação original do filtro na placa de modo a facilitar mais tarde a identificação de colónias, são então removidos e colocados em PBS (50 mM Tris-HCl, pH=7,2 e 150 mM NaCl).
Para manter as células na placa viáveis durante a analise dos filtros, as células são cobertas com 8 ml de uma mistura contendo 2 ml de agar a 1,8% (47°C), 2 ml de sais DME (37°) e 4 ml de sais DME com 20% de soro fetal bovino (37°C). As células são então colocadas numa estufa a 37°C.
Todas as lavagens e reacções efectuadas nos filtros são realizadas com os filtros numa plataforma de agitação. Os filtros são primeiro bloqueados por incubação à temperatura ambiente em leite a 5% em PBS. Os filtros são então lavados (5 minutos/1 a vagem) quatro vezes em PBS. Um anticorpo policlonal de cabra biotinilado anti-proteina C humana a 10 pg/ml em 2,5% de albumina do soro bovina é adicionado ao filtro (em quantidades suficientes para cobrir o filtro) o qual é então incubado a 37°C durante 1 hora.
A purificação da proteína C para usar subsequentemente na preparação de anticorpo contra a proteína C, pode ser conseguida como descrito por
Kisiel, 1979, J. Clin. Invest. 64:761. 0 anticorpo policlonal pode ser preparado pelo processo descrito em
Structura1 Concepts in Immunology and Immunochemi stry de
E.A. Kabat, publicado em 1968 por Holt, Rhinehart e
Winston. 0 anticorpo monoclonal que é também adequado
-92para usar no ensaio pode ser preparado como descrito por Kohler e Milstein, 1975, Nature, 256:495 ou como descrito na Patente U.S. No. 4 696 895; EPO Pub. No. 205046; Laurell et a 1 . , 1985, FEBS 191(1); 75; Suzuki et a 1 . , 1985 , J. Biochem. 97:127-138; e EPO Pub. No. 138 222. A avidina D e a peroxidase de rábano silvestre (HRP) biotinilada usadas no ensaio são obtidas num Kit Vectastain (Vector Laboratories, Inc., 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010): A Biotina é também adquirida à Vector Laboratories, Inc.
Os filtros são lavados quatro vezes com PBS a 4°C. Em seguida, preparam-se a avidina D e a peroxidase de rábano silvestre biotinilada e adicionam-se de acordo com as instruções do fabricante no Kit VectasTM tain (Vector Laboratories). Os filtros são incubados com a avidina D conjugada com HRP durante 1 hora a 4°C (pode-se usar tempos de incubação mais longos quando são secretadas pequenas quantidades de proteina); em seguida os filtros são lavados quatro vezes com PBS a 4°C.
Para revelar a côr indicadora nos filtros, cerca de 30 mg de reagente revelador da côr de HRP (4-c1 oro-1-nafto 1, Sigma) dissolvido em metanol a 100% arrefecido em gelo, são adicionados a 50 ml de PBS e 30 pl de H202 a 30%. Esta mistura é adicionada aos filtros de nitrocelulose os quais são incubados à temperatura ambiente até aparecer a côr. As colónias que secretam mais zimogénio da proteina C humana do invento serão indicadas nos filtros não só pelo aparecimento mais rápido da côr mas também pelas mais escuras nos filtros.
DEpois dos filtros terem sido revelados, os filtros são novamente realinhados com as placas originais para determinar quais as colónias corres-93-
pondentes às manchas no filtro. As colónias que secretam maior quantidade de zimogénio da proteína C humana do invento são então seleccionadas e usadas para a produção de z imogén i o.
Os familiarizados com a matéria reconhecerão que o ensaio acima é meramente ilustrativo do método de identificação de linhas celulares de secreção alta. Uma variedade de processos de ensaio pode ser empregue com sucesso no método. Por exemplo, pode ser empregue uma reacção com dois anticorpos em que o anticorpo de cabra biotinilado anti-proteina C é substituído por um anticorpo de cabra anti-proteina C (IgG) e um anticorpo biotinilado anti IgG de cabra.

Claims (7)

  1. REIVINDICAÇOES l3. - Processo de preparação de um vector de DNA recombinante caracterizado por compreender a ligação conjunta de (I) um composto de DNA que compreende uma sequência que codifica uma proteína que inclui desde a extremidade amino até à extremidade carboxi:
    a) um péptido sinal e propéptido de uma proteína segregada <-carboxilada.
    b) a cadeia leve da proteína C humana
    c) o dipeptido 1isina-arginina , arginina-1isina, lisina-lisina ou arginina-arginina e
    d) a sequência de resíduos de aminoácidos:
    ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL Rx r2 ARG LEU ILE r3 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
    ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- •COOH
    na qual Rj é PHE, GLY, TYR ou TRP, R? é VAL ou PRO, R3 é ASP ou ASN, ARG é Arginina, ASN é Asparagina, ASP é ácido aspártico, -COOH GLN é G1utam i na , é Histidina, ILE MET é Metionina, é a extremidade carboxilo, CYS é Cisteina,
    GLU é ácido glutâmico, GLY é Glicina,HIS é Isoleucina, LEU é Leucina, LYS é Lisina,
    PHE é feni la lanina, PRO é Prolina, SER é
    Serina, THR é Treonina, TRP é Triptofano, TYR é Tirosina e
    Vai é Valina e (II) um composto de DNA que compreende um
    -96promotor de tal forma que este está posicionado de modo a dirigir a expressão da sequência codificadora após a ligação.
  2. 2-. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o polipeptido codificado pelo DNA ser:
    h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS
    SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL R: r2 ARG LEU ILE Ra GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP
    GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- COOH
    em que -H2N é a extremidade amino; Rj é PHE, GLY, TYR ou TRP; R^ é PRO ou VAL; R^ é ASP ou ASN.
  3. 3?. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por produzir o plasmídeo pLPC - 167F.
  4. 49. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por produzir o plasmídeo PLPC-167G.
  5. 59. - Método para a produção recombinante de formas zimogénicas de proteina C humana por secreção a partir de uma célula hospedeira eucariótica caracterizado por compreender (A) a transformação de uma célula hospedeira eucariótica com um vector de DNA recombinante que compreende:
    (i) uma sequência de DNA que codifica uma sequência de resíduos de aminoácidos que compreende desde a extremidade amino até à extremidade carboxilo;
    a) um péptido sinal e propéptido de uma proteina segregada f-carboxilada;
    b) a cadeia leve da proteina C humana
    c) o dipéptido LYS-ARG, ARG-LYS, LYS-LYS ou ARG-ARG e
    d) a sequência de resíduos de aminoácidos:
    ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL r2 ARG LEU ILE Ra GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY
    ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO- -COOH
    em que R} é PHE, GLY, TYR ou TRP, R? é VAL ou PRO, R3 é ASP ou ASN, ARG é Arginina, ASN é Asparagina, ASP é Acido aspártico, -COOH é a extremidade carboxilo, CYS é Cisteina, GLN é Glutamina, GLU é ácido glutâmico, GLY é Glicina, HIS é Histidina, ILE é Isoleucina, LEU é Leucina, LYS é Lisina, MET é Metionina, PHE é feni 1 a 1 anina , PRO é Prolina, SER é Serina, THR é Treonina, TRP é triptofano, TYR é Tircsina e Vai é Va1i na e (ii) um promotor colocado de modo a poder dirigir a expressão da sequência de DNA e (B) a cultura da célula hospedeira transformada no passo (A) sob condições que permitem a expressão da sequência de DNA.
  6. 6-. - Método de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por o vector de expressão do DNA recombinante ser o plasmideo pLPC-167F.
    Ί-. - Método de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por o vector de expressão do DNA recombinante ser o plasmideo pLPC-167G.
    . 8-. - Método de acordo com a reivindicação 5, 6 ou 7 caracterizado por a célula hospedeira
    -100 ser a célula hospedeira 293 ou AV12.
  7. 9-. - Método de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por a célula hospedeira cultivada no passo (B) ser a célula hospedeira 293/pLPC-167F, 293/pLPC-167G, AV12/pLPC-167F ou AV12/pLPC-167G.
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