SU1739854A3 - Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей зимоген С человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотех нологии и может быть использовано дл  получени  зимогенных форм чело веческого белка С. Способ конструиро - вани  рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей зимоген С человека, зак лючаетс  в выделении фрагмента ДНК, кодирующего т желую цепь белка С человека с последующим осуществлением сайт специфического мутагенеза исубклониро- ванием фрагмента ДНК с мутацией в соответствующую плазмиду. При этом получают плазмиды, кодирующие поли пептид, включающий легкую цепь белка С человека, сигнальньй пептид и про пептид J1 карбоксшшрованного секре -1 тируемого белка, дипептид лизин арг- гинин, аргиниж-лизин или аргинин - аргинин и фрагмент ДНК, содержащий мутацию о 2 табл ,

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  получени  зимогенных форм человечес- кого белка С.

Белок С - витамин К - зависимый плазменный белок играет важную роль при регулировании свертывани  крови. Концентраци  белка С  вл етс  низкой при тромботических состо ни х, таких как диссемилирующий внутрисосудистый тромбоз, и при заболевани х, располагающих к тромбозу, таких как больша 

10 20

5 -АТС TGG CAG СТС АСА AGC СТС СТО H2N-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU

5

травма, крупное хирургическое вмешательство и рак.

Дл  облегчени  понимани  изобретени  и активации белка С ниже представлена кодирующа  последовательность и соответствующа  аминокислотна  последовательность человеческого белка С Эта аминокислотна  последовательность и ее соответствующие части характеризуют также нативный человеческий белок С дл  целей предлагаемого способа

3040

CTG TTC GTG GCC ACC TGG GGA АТТ LEU РНЕ VAL ALA THR TRP GLY ILE 1015

V|

CA О 09 СЯ

N

CO

50 60 70 8090

ТСС GGC АСА CCA GCT CCT CTT GAC TCA GTG TTCTCC AGC AGC GAG CGT

SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHESER SER SER GLU ARG

20 25 30

-1739854

100110 120 130 140

GCC CAC CAG GTGCTG CGGАТС CGC AAA CGT GCC AAC ТСС ТТС CTG GAG

ALA HIS GLN VALLEU ARGILE ARG LYS ARC ALA ASN SER PHE LEU GLU 35 40 45

150 - 160 170 180190

GAG CTC CGT CAC AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC ATA GAG GAG АТС TGT GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS 505560

200 210220 230 240

GAC TTC GAG GAGGCC AAG GAA ATT TTC CAA AAT GTG GAT GAC АСА CTG

ASP PHE GLU GLUALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU 65707580

250 260 270 280

GCC TTC TGG TCC AAG CACGTC GAC GGT GAC CAG TGC TTG GTC TTG CCC

ALA PHE TRP SER LYS HISVAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

8590 95

29Q 300 310 320 330 TTG GAG CAC CCG TGC.GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG TGC АТС LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE 100105110

340 350 360 370 380

GAC GGC АТС GGC AGC TTC AGC TGC GAC TGC CGC AGCGGCTGG GAG GGC

ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SERGLYTRP GLU GLY

115120125

390400410420 430

CGC TTC TGC CAG CGCGAGGTG AGCTTC CTC AAT TGC TCG CTG GAC AAC

ARG PHE CYS GLN ARGGLUVAL SERPHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN

130135140

440 450 460 470 480

GGC GGC TGC ACG CAT TAC TGCСТА GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC TGT

GLY GLY CYS THR HIS TYR CYSLEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS 145- 150155160

490 500 510 520

AGC TGT GCG CCT GGC TAC AAG CTG GGG GAC GAC CTC CTG CAG TGT CAC SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS

165 170175

530 . 540 550 560 570

CCC GCA GTG AAG TTCCCT TGT GGG AGG CCC TGG AAG CGG ATG GAG AAG

PRO ALA VAL LYS PHEPRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS 180185190

580590 600 610 620

AAG CGC ACTCAC CTG AAA CGA GAC АСА GAA. GAC CAA- GAAGAC CAA GTA

LYS ARG SERHIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLUASP GLN VAL

195200 205

630640 650 660670

GAT CCG CGG CTC ATT GAT GGG AAG ATG ACC AGG CGG GGA GAC AGC CCC ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO 210215220

51739854

680 690 700 710 720 TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA 225230235240

730 740 750760

GTG CTC АТС CAC CCC TCC TGG GTG CTG АСА GCG GCC CAC TGC ATG GAT VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THE ALA ALA HIS CYS MET ASP

245250255

770 780 790 800 810

GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTTGGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC

GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEUGLY GLU TYR ASP LEU ARC ARC , 260 265 270

820830 840 850 860

TGG GAG AAG TGGGAG CTG GACCTG GACАТС AAG GAG GTC TTC GTC CAC

TRP GLU LYS TRPGLU LEU ASPLEU ASPILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

275280285

870 880 890 900 910 CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC АТС GCA CTG CTG CAC PRO ASN TYR SER LYS SEK THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS 290295300

920 930 940 950 960 CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC АТС TGC CTC LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU 305310315320

970 980 990 1000

CCG GAC AGC GGC CTTGCA GAC CGC GAGCTC, AATCAG GCC GGC CAG GAG

PRO ASP SER GLY LEUALA GLU ARG GLULEU ASNGLN ALA GLY GLN CLU

325330335

1010 10201030 1040 1050

ACC CTC GTG ACG GGC TCGGGC TAC CACAGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC

THR LEU VAL THR GLY TRPGLY TYR HISSER SER ARG CLU LYS GLU ALA.

340345 350

1060 1070 1080 1090 ПОО AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC AAC TTC АТС AAG ATT CCC GTG GTC LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL 355360365

1110 1120 1130 1140 1150 CCG CAC AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG TCT GAG AAC PRO HIS ASN GLU CYS SER GbU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN 370375380

116011701180 1190 1200

ATG CTG TGT GCG GGCАТС CTC GGGGAC CGG CAG GAT CCC TGC GAC GGC

MET LEU CYS ALA GLYILE LEU GLYASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

385 390395 400

121012201230 1240

GAC AGT GGG GGG CCCATG GTC GCCTCC TTC CAC GGC ACC TGG TTC CTC ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU

405410. 415

1250 1260 1270 1280 1290 GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC CTT CAC AAC TAC VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR 420425430

1300 1310 1320 1330 1340 GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAC CTC CAC TGG АТС CAT GGG CAC GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS 435440445

1350 1360 1370 1380 АТС AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT TAG-3 CLE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH 450455460

ДНК-последовательность получена из к-ДНК-клонов, созданных из человеческой печеночной м-РНК, кодирующей человеческий белок С Два из этих к-ДНК-клонов используют дл  конструировани  ДНК-молекулы, включающей в себ  как последовательность, кодирующую белок С, так и части ДНК, кодирующие нетранслированную м-РНК на концах и 3 -кодирующего участка. Эту молекулу ДНК ввод т в Pscl-сайт плаз- миды pBR322 дл  конструировани  плаз- миды рНС7. Плазмида рНС7 включает описанную выше кодирующую последовательность , а также следующие дополнительные последовательности:

TGG AGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG СТА ТСА TGG CGG CAG GGC GAA СТТ GCA СТА ТСТ CCA CGA CCC GCC ССТ АСА GGT GCC ACT GCC ТСС AGA-31

ге-pro - последовательность аминокислотных остатков 1-42, кодирующа  сигнальный пептид и пропептид белка С человека , важный дл  направленной секреции и fr-карбо- ксилировани  белка С:

LC - последовательность аминокислотных остатков 43-197 белка С составл ет легкую цепь (LC) как двуцепочечного зимогена (образованного из одноцепочечного зимогена отщеплением KR- дипептида), так и активированных форм белка С}

KR - последовательность аминокислотных остатков 198 - 199 белка С человека; считаетс , что эти остатки отщепл ютс  возможно в две стадии, включающие в себ  сначала расщепление (по остаткам 197 - 198 или 199 - 200), а затем действие кар- боксипептидазы или амино-i пептидазы с образованием двуцепочечного белка С;

АР - последовательность аминокислотных остатков 200 - 211 белка С, включающа  в себ  пептид активации, отщепл емый от зимогенных

и

5 -CGA CCC ТСС CTG-CAG GGC TGG GCT TTT GCA TGG CAA TGG CAA TGG ATG GGA CAT TAA AGG GAC ATG TAA CAA GCA CAC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC GCA G-3

r r

соответственно на концах 5 - и 5 - нити, кодирующей последовательности дл  выделившегос  человеческого белка С В силу комплементарной природы пар оснований ДНК, последовательность одной нити двунитевой молекулы ДНК остаточна дл  определени  последовательности второй нити. Плазмиду рНС7 выдел ют из E.coli K12 RR 7/рНС7, депонированного под номером NRRL В-15926,

Белок С можно представить схема- тически следующим образом:

5

0

5

форм С с образованием активированного белка С; АНС - последовательность аминокислотных остатков 212 - 461 белка С, однократно пост-трансл ционно модифицированного , составл ет активированную т желую цепь (АНС) активного белка С; НС - т жела  цепь двуцепочечной формы зимогена С, однократно пост-трансл ционно модифицированного , состоит из аминокислотных остатков 0 200 - 461, АР и АНС„

Зимоген С  вл етс  предшественни - ком сариновой протеаэы, синтезируемым в печени и присутствующим в крови. . Дл  про влени  полной биологической 5 активности белок С требует посттрансл ционных модификаций, дл  которых необходим витамин К. Двуцепо- чечный, св занный дисульфидным мостиком , зимоген С образуетс  из од- 0 ноцепочечного зимогена протеолизом Считаетс , что этот ограниченный протеолиз включает в себ  отщепление и удаление аминокислотных остатков 198 и 199. Активаци  двуцепочечного 5 зимогена включает в себ  протеоли- тическое расщепление пептидной св зи ARG-LEU (остатки 211 и 212). Это последнее расщепление освобождает декалептид (остатки 200 - 211), акти- вационный пептид, составл ющий амино- окончание большей (т желой) цепи дву цепочечной молекулы зимогена. Белок С содержит около 23% углеводов. Белок С содержит также большое количество необычных аминокислот, включа  J -кар- боксиглутаминовую кислоту и -окси- аспарагиновую кислоту,J1-к ар бок сиг лу- таминова  кислота (gla) образуетс  jf-глутамилкарбоксилированием из остатков глутаминовой кислоты с помощью микросомальной карбоксилазы.

Аминокислотные остатки в описываемых белках и пептидах имеют сокращени , приведенные в табл,

Т а б л и ц а

200 201 202 203 204 205 296 207 208 209 210 211 ASP-THR-GLU-ASP-GEN-GLU-ASP-GLN-VAL-ASP-PRO-ARG,

к

1

10

15

20

73985410

Описано несколько способов получени  нативного зимогена человеческого белка С. Зимогенна  форма человеческого белка С, полученна  техно- , логиеи рекомбинантной ДНК, идентична зимогенным формам человеческого белка С, естественно присутствующим в человеческой крови, и активируетс  в теле лишь естественным путем, включающим тромбин-тромбомодулиновьй комплекс - В данном изобретении предлагаютс  зимогенные формы человеческого белка С, которые могут активироватьс  in vivo одним тромбином с клинически значительной скоростью. Кроме того, эти зимогенные формы легче подвергаютс  активации тромбин/бромбомоду- лином, чем нативный зимоген человеческого белка С

В изобретении предлагаютс  также рекомбинантные ДНК, которые кодируют пре-препептид, содержащий сигнальный пептид дл  направлени  секреции и

25 пропептид из У-карбоксилировэнного белка о

Рекомбинантные ДНК по. данному изобретению включает в себ  также последовательность, кодирующую легкую цепь человеческого белка С, расположенную в трансл ционной структуре считывани  сразу за последовательностью , кодирующей пре-пропептид. Легка  цепь человеческого белка С содержит аминокислотные последовательности 43-197 белка С, Аминокон- цевые части витамин К-зависимых плазменных белков, такие как аминоконце- ва  часть легкой цепи белка С, ответственны за св зывающую кальций активность этих белков„

Рекомбинантные ДНК по данному изобретению включают в себ  также последовательность, кодирующую дипеп- тид LGS-ARG (KR), расположенный в

45 трансл ционной структуре считывани  сразу за последовательностью, кодирующей легкую цепь. Дипептид LYS-ARG расположен на карбокси-концевом участке легкой цепи,

50 Зимогенные формы по данному изобретению отличаютс  от.нативных зимо- генных форм человеческого белка С, В нативном человеческом белке С . имеетс  следующий ахтивационный пеп55 тид:

30

35

40

где числа соответствуют положению водит к отщеплению аминокислотных аминокислотных остатков в белке С. В остатков 1 -42) с образованием зи- данном изобретении описываетс  замена могенной формы. Замена пролшювого остатка ASP в положении 209 на один остатка в положении 210 в выделившемс  человеческом белке С на валин,

из следующих остатков: РНЕ, GLY, TYR или TRP, что приводит к соответствующей зимогенной форме, имеющей большую чувствительность к расщеплению одним тромбином, кроме повышенной чувствительности к расщеплению тром- бин-тромбомодулиновым комплексом

Другие замены аминокислот нар ду с заменами в положении 209 могут

кроме одной из четырех описанных выше замен в положении 209, приводит к новому зимогену. Замена остатка IQ аспарагиновой кислоты в положении 214 белка С, нар ду с одной из описанных выше замен в положении 209 и с заменой, описанной дл  положени  210, или без такой замены, на остатакже повышать чувствительность ре- j 5 ток аспарагина также приводит к полузультирующего зимогена к действию тромбина Выражение результирующий зимоген означает, что хот  замены описаны с указанием положени  амичению нового зимогена„

Таким образом, предпочтительные новые зимогенные формы человеческого белка С образуютс  в результате секнокислотных остатков в выделившемс  20 Реции и обработки молекул выделившечеловеческом белке G, однако выделившийс  человеческий белок С должен быть сначала секретирован (что приHfcN-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU РНЕ VAL ALA THR TRP GLY ILE

. SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARC

ALA HIS GLN VAL LEU ARC ILE ARC LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU

GLU,LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

. ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU

ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE

ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GT.Y ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN

GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL R R2 ARG LEU ILE R3 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

кроме одной из четырех описанных выше замен в положении 209, приводит к новому зимогену. Замена остатка аспарагиновой кислоты в положении 214 белка С, нар ду с одной из описанных выше замен в положении 209 и с заменой, описанной дл  положени  210, или без такой замены, на остачению нового зимогена„

Таким образом, предпочтительные новые зимогенные формы человеческого белка С образуютс  в результате секгос  человеческог-о белка С со следующей аминокислотной последовательностью:

1

13 ASN TYR SER.

ALA GLN PRO ASP SER GLY LEU VAL THR ARC ASN ARC HIS ASN GLU LEU CYS ALA SER GLY GLY GLY LEU VAL VAL TYR THR ARC ASP LYS

.LYS SER ALA THR LEU ALA GLY TRP THR PHE CYS SER GLY-ILE PRO MET SER TRP LYS VAL GLU ALA

плазмиды pL APC

Аминокислотные последовательности, кодируемые в положени х 209, 210 и 214 в предпочтительных кодирующих последовательност х, представлены в табло2«

Таблица2

39854 THR ASP

SER GLN ARC GLU TYR HIS LEU ASN VAL MET GLY ASP ALA SER GLU GLY ARC TYR GLN LYS

14 ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU SER .SER ARC GLU LYS GLU ALA PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL SER ASN MET VAL SER GLU ASN ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS SER TRP ALA PRO-COO

Плазмида pLPC-167G  вл етс  иллюстративным вектором экспрессии, в котором кодон аспарагиновой кислоты в положении 209 белка С заменен на ко- дон дл  глицина. Конструирование плазмиды pLPC-167G описано в примере 3. Существенно, что конструирование включает в себ  сайт-специфичный мутагенез последовательности, кодирующей белок С. Часть последовательности , кодирующей белок С, вставл ют в в фаг М13тр18 и измен ют сайт-специфичным мутагенезом. Подвергнутую мутагенезу кодирующую последовательность клонируют затем в эукариотном клонирующем векторе дл  получени  плазмиды pLPC-167G, идентичной плаз

15

миде pLAPC, за исключением того, что , имеетс  вставка последовательности, | кодирующей активационный пептид, в . котором кодон дл  глицина заменен на кодон дл  аспарагиновой кислоты в положении 209.

В случае соединений по предлагаемому способу, где остаток аспарагиновой кислоты в положении 214 заменен на остаток аспарагина, производное белка С, получаемое при активации зимогенной формы, также  вл етс  соединением по данному изобретению

ДНК по данному изобретению могут быть также синтезированы химически или соединением рестрикционных фрагментов , либо сочетанием способов, известных в данной области

Иллюстративные векторы по данному изобретению, плазмиды pLPC-167G и pLPC-1-67G содержат ВК-усилитель, стимулирующий транскрипцию аденовирусным основным поздним промотором Большое -число эукариотных промоторов, усилителей и векторов экспрессии известно в данной области и может быть использовано в предлагаемом способе. Эука- риотньй вектор экспрессии может также функционировать без усиливающего . элемента. Суть данного изобретени  не св зана с конкретным усилителем или промотором, используемым дл  стимул ции экспрессии зимогена белка С, а скорее определ етс  новой кодирующей последовательностью и соответствующими белками, получаемыми из такой последовательности,,

Однако выбор векторных элементов таких как промоторы, усилители и селективные маркеры, может оказать сильное вли ние на максимальные концентрации белка, вырабатываемого клеткой-хоз иномс

Выбор клеток-хоз ев зависит от конкретного вектора экспрессии, используемого дл  экспрессии ДНК-соединений , кодирующих белков С. Поскольку белок С и производные белка С согласно предлагаемому способу подвергаютс  значительной пост-трансл ционной модификации, то некоторые клетки-хоз ева более предпочтительны дл  использовани  с векторами по данному изобретению. Известно, что

15

20

25

Jf-карбоксилированных белков, таких I как человеческий белок С. Одна та- ка  трансформировани  аденовирусом , лини  клеток человеческой эмбриональной почки представл ет собой ли нию клеток 293, доступную в АТСС по номером АТСС CRL 1573.

Однако преимущества при получени JQ У-карбоксилированного белка, такого как зимоген человеческого белка С в линии клеток, трансформированных ад новирусом, не ограничиваютс  чело- веческими почечными эмбриональными клетками, трансформированными адено вирусом Фактически, как правило, трансформированные аденовирусом кле ки  вл ютс  отличными хоз евами дл  получени  Jf-карбоксилированного человеческого белка С Одной из особенно предпочтительных клеточных линий этого типа  вл етс  AV 12-664 (далее обозначаетс  как AV 12) клеточна  лини , доступна  в АТСС под номером АТСС CRL 9595 Клеточна  ли ни  AV 12. получена инъекцией человеческого аденовируса 12 в шею сирийского хом ка и выделением клеток результирующей опухолио

Экспресси  кодирующих последовательностей человеческого белка С, содержащихс  в векторах по данному изобретению, происходит в тех клетках-хоз евах , в которых промотор св зан со структурными генными функци ми

Векторы pSV 2-типа включают в себ  сегменты генома SV 40, содержащего определенный эукариотный промотор единицу (ер), последовательность вве 40 дени  (IVS) и полиаденомный (рА)

сайт. При отсутствии Т-антигена SV 4 плазмидные векторы pSV 2-типа трансформируют клетки-хоз ева млекопитающих и другие эукариотные клетки интегрированием в хромосомную ДНК клеток-хоз ев «

Вырожденность генетического кода позвол ет заменить нуклеотиды в участках, кодирующих полипептид, а также в трансл ционном стоп-сигнале без изменени  последовательности, кодирующей полипептидо Такие последовательности могут быть выведены из известной аминокислотной или ДНК-пос

30

35

45

50

трансформированные аденовирусом чело- 55 ледовательности человеческого белка

С и могут быть сконструированы по обычным синтетическим или сайт-специ фичным мутагенным методикам.

веческие эмбриональные почечные клетки предпочтительны дл  использовани  при рекомбинантном получении

, |

15

20

25

73985416

Jf-карбоксилированных белков, таких I как человеческий белок С. Одна та- ка  трансформировани  аденовирусом , лини  клеток человеческой эмбриональной почки представл ет собой линию клеток 293, доступную в АТСС под номером АТСС CRL 1573.

Однако преимущества при получении JQ У-карбоксилированного белка, такого как зимоген человеческого белка С в линии клеток, трансформированных аденовирусом , не ограничиваютс  чело- , веческими почечными эмбриональными клетками, трансформированными аденовирусом Фактически, как правило, трансформированные аденовирусом клетки  вл ютс  отличными хоз евами дл  получени  Jf-карбоксилированного человеческого белка С Одной из особенно предпочтительных клеточных линий этого типа  вл етс  AV 12-664 (далее обозначаетс  как AV 12) клеточна  лини , доступна  в АТСС под номером АТСС CRL 9595 Клеточна  лини  AV 12. получена инъекцией человеческого аденовируса 12 в шею сирийского хом ка и выделением клеток результирующей опухолио

Экспресси  кодирующих последовательностей человеческого белка С, содержащихс  в векторах по данному изобретению, происходит в тех клетках-хоз евах , в которых промотор св зан со структурными генными функци ми

Векторы pSV 2-типа включают в себ  сегменты генома SV 40, содержащего определенный эукариотный промотор- единицу (ер), последовательность вве- 40 дени  (IVS) и полиаденомный (рА)

сайт. При отсутствии Т-антигена SV 40 плазмидные векторы pSV 2-типа трансформируют клетки-хоз ева млекопитающих и другие эукариотные клетки интегрированием в хромосомную ДНК клеток-хоз ев «

Вырожденность генетического кода позвол ет заменить нуклеотиды в участках, кодирующих полипептид, а также в трансл ционном стоп-сигнале без изменени  последовательности, кодирующей полипептидо Такие последовательности могут быть выведены из известной аминокислотной или ДНК-пос-

30

35

45

50

ледовательности человеческого белка

С и могут быть сконструированы по обычным синтетическим или сайт-специфичным мутагенным методикам.

17

Основным недостатком активированного белка С, как и любых активированных сериновых протеаз,  вл етс  его короткое врем  полураспада (Т1/2) по сравнению с зимогенным предшественником . Причиной более короткого биологического полураспада активированных сериновых протеаз, включа  активированный белок С,  вл ютс  сложные процессы, вовлекающие клеточные и гуморальные механизмы. Активированные сериновые протеазы образуют также комплексы с ингибиторами сериновых протеаз, в норме присутствующими в плазме. Активированный белок С (АРС) комплексуетс  с АРС-ингибитором, а также с альфа-2-макроглобулином,, Неактивные зимогены, включа  зимогены белка С по данному изобретению, не реагируют с ингибиторами сериновых протеаз.

Преимущество предлагаемых зимо- генов С заключаетс  в том, что они лучше активируютс  тромбином, чем зимоген нативного белка, поскольку дл  активации зимогенов в присутстви Са отсутствует абсолютное требование комплексовани  тромбина с тром- бомодулиномо Это означает, что эти зимогены С после введени  могут активироватьс  в местах внутрисосудис- того образовани  тромбина, в любых зонах развити  внутрисосудистых тромбов. Таким образом эти рекомби- нантные зимогены белка С могут быть использованы как превентивные лекарства и будут при этом активироватьс  только в местах образовани  тромбов. Так как эти чувствительные к тромбину зимогены могут вводитьс  в зимогенной форме, то они не будут образовывать комплексы с ингибиторами белка С и будут обладать биологическим временем полураспада, равным таковому времени дл  зимогена нативного белка С.

Рекомбинантные зимогены белка С . по данному изобретению пригодны дл  предупреждени  и лечени  широкого спектра заболеваний, включа  внутри- сосудистое свертывание, в том числе глубокий тромбоз вен, легочный эм болизм, периферийный артериальный тромбоз, эмболиэм, возникший в сердце и периферийных артери х, острый инфаркт миокарда, тромботические удары и диссеминирующий внутрисосу- дистый тромбоз.

и 73985418

По сравнению с активированным белком С дозы зимогенов белка С по данному изобретению из-за их уве- 5 (личенного Т1/2 могут быть значительно снижены при клиническом применении . При гомозиготном дефиците белка С доза зимогена белка С по данному изобретению находитс  в интервале Ю приблизительно 5 - 100 мг на одно лечение, а при гетерозиготном дефиците белка С - в интервале около 2,5 - 50 мг на лечение

Хорошим терапевтическим показа- 15 нием дл  активированного белка С  вл етс  предотвращение глубокого тромбоза вен и легочного эмболизма,

Зимогены белка С по данному изобретению могут быть использованы при 20 лечении эмболии, происход щих от тромбов в периферийных артери х, преимущественно в каротидных артери х .

Зимогены по данному изобретению 25 пригодны также дл  лечени  острых инфарктов миокарда. В острой фазе инфаркта миокарда эти зимогены можно вводить вместе с активатором тканевого плазминогена.

30

35

40

45

50

55

1

Пример 1,, Контсруированиеплаз- миды pLAPC.

А. Выделение ДНК-фрагмента, кодирующего пептид белка С.

Плазмида РНС7 содержит полную кодирующую последовательность белка С, 1 л L-бульона (10 г пептона, 10 г NaCl, 5 г дрожжевого экстракта), содержащего 15 мкг/мл тетрациклина, засевают культурой Escherichia coli К12 RR1/pHC7, инкубируют со встр хиванием при 37°С до достижени  оптической плотности (О. U.) при 590 нм приблизительно 1 и прибавл ют 150 мг хлорамфеникола Инкубирование продолжают 16 ч; добавление хлорамфеникола ингибирует синтез белка и дальнейшее деление клеток, но позвол ет плазми- дам по-прежнему реплицироватьс .

Культуру центрифугируют, суперна- тант отбрасывают, клеточную массу промывают 40 мл TES-буфера (10 мМ трис-НС1,рН 7,5; 10 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА) и затем снова осаждают центрифугированием , Супернатант отбрасывают , клеточную массу замораживают в бане сухой лед - этанол и оттаивают. Отта вшую клеточную массу ресуспендируют в 10 мл раствора

25% сахарозы 50 мМ ЭДТА, прибавл ют 1 мл 5 мг/мг раствора лизоцима; 3 мл 0,25 М ЭДТА, рН 3,0 и 100 мкл 10 мг/ /мл РНК-азы А и провод т инкубирование во льду в течение 15 мин 3 мл лизи- рующего раствора (3 мл 10% тритон-Х 100; 75 мл 0,25 М ЭДТА, рН 8,0; 15 мл 1 М трис-HCl и 7 мл воды) прибавл ют к обработанным лизоцимом клеткам, перемешивают и инкубируют на льду в течение 15 мин„ Клетки замораживают в бане сухой лед - этанол, оттаивают, центрифугируют в градиенте хлористого цези . Выдел ют плазмидную полосу, наблюдаемую в УФ-свете Плазмид-ДНК экстрагируют„

1 мг ДНК плазмиды рНС7 суспендируют в 1 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HClt рН 7,6 и 0,1 мМЭДТА) и хран т при - 20°С.

7 мкг ДНК плазмиды рНС7 гидроли- зуют ферментом Sst 1, а затем реет- риктазой Sal 1„ Sst I - Sal I фрагмент экстрагируют сначала фенолом, затем хлороформом, собирают осаждением этанолом, центрифугируют и суспендируют в 15 мкл ТЕ/10-буфера (10 мМ трис-основани , рН 7,6 и 0,1 мМ ЭДТА).

Смесь подвергают электрофорезу в О,6% агарозном геле с низкой температурой гелеобразовани  2 - 3 ч приблизительно при 130 В и 65 мА в трис-ацетатном буфере Гель окрашивают в растворе этидий бромида и полосу ДНК, составл ющую около 0,7 ТоП.Оо, вьцэезают из гел  в виде маленького сегмента. Сегмент расплавл ют инкубированием при 72°С.ХВ объеме около 400 мкл получают приблизительно 0,5 мкг рестрикционного фрагмента Ssc I - Sal I плазмиды рНС7 длиной около 0,7 т.ПоО. Дополнительную очистку ДНК провод т пропусканием раствора ДНК через колонку NaCS-pre рас (BRL) в соответствии с инструкцией . Очищенный фрагмент ресуспенди- руют в 15 мкл деионизированной водыс

В. Конструирование рекомбинантно- го фага и удаление ДНК, кодирующей активационный пептид, сайт-специфичным мутагенезом

Около 1 мкг репликативной формы (RF) ДНК фага М13 m P18 обрабатывают рестриктазами Sst I и Sal 1„ Два фрагмента, получившиес  в результате расщеплени , раздел ют в 0,6% геле из агазорьа с низкой температурой гё5

5

леобразовани , больший фрагмент вырезают из гел  и очищают.

О,1 мкг Sst I - Sal I фрагмента

плазмиды рНС7-длиной около 0,7 т.п«о0 лигируют с 5 мкл Sst I - Sal I - обработанной М13 m p18 RZ ДНК в 2 мкл ЮХ-лигазного буфера, (0,5 М трис-HCl, рН 7,8; 60,8 мМ rfgCl ; 0,3 М дитиот

реитол /DTT/), 2 мкл 1 мг/мл BSA ,

1мкл 25 мМ АТР, 1 мкл (около 400 ед.) Т4-ДНК-лигаэы (NEB) и 2 мкл воды.

Около 300 мкл культивированной в течение ночи культуры E.coli K12 Ml01 используют дл  засевани  30 мл 2Х-ТУ-бульона (TY-бульон - это 10 г/л триптона, 10 г/л NaCl и 5 г/л дрожжевого экстракта) и результирующую культуру инкубируют при 37 С и аэрировании до достижени  OoD,00 около 0,5, Культуру 10 мин охлаждают на лед ной бане, собирают центрифугированием и снова суспендируют в 15 мл холодного 10 мМ NaCl. Клетки снова собирают центрифугированием и суспендируют в 15 мл холодного 30 мМ CaCl-j 200 мкл клеток отдел ют, добавл ют к 9 мкл полученной выше ли- гированной ДНК и инкубируют на льду 0 приблизительно 30 мин. Затем ДНК-клеточную смесь инкубируют при 42°С

2мин и прибавл ют к 3 мл топ-агара (TY-бульон с 0,5% агара, поддерживаемого в виде расплава при 45°С), содержащего также 50 мкл 2% X-Gal (X-Gal это 5-бром-5-хлор-3-индолил-/3- D-галактопиранозид), 50 мкл 100 мМ ,IPTG (IPTG - это изопропил- г-В-тио- галактопиранозид) и 100 мкл E.coli К12 Ш101 в логарифмической фазе роста . Затем смесь топ-агар/клетки помещают на TY-агаровые пластинки и инкубируют пластинки ночь при 37 С.

На следующее утро четыре  вные 5 колонии раздельно используют дл  засева 2 мл 2Х TY-бульона и результирующие культуры инкубируют при 37°С и аэрировании 6 ч„ Затем культуры центрифугируют и 500 мкл результирую- 0 щего супернатанта (клеточную массу используют дл  получени  фаговой ДНК дл  анализа с помощью рестриктаз) прибавл ют к 500 мкл культуры (O.D.55Q - 0,5) E.coli K12 Ц1101 и . 50 мл 2Х TY-бульона. Эти культуры инкубируют ночь при 37°С, KF ДНК фага выдел ют из клеточной массы по упрощенной методике по примеру 1А без антибиотика в культуральной среде и

5

0

21

стадии ультрацентрифугировани  замен ют экстракци ми фенолом и хлороформом . Трансформанты содержащие ДНК фага М13 m p18-HEI, идентифицируют рестрикционным ферментным анализом их фаговой ДНК.

После ночи культуры центрифугируют и к 5 мл супернатанта прибавл ют около 1 мл раствора, содержащего 20 % полиэтиленгликол  (PEG) 6000 и 2,5 мМ NaCl, и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Смесь центрифугируют , результирующий осадок, содержащий однонитевую ДНК фага М13 m р18-ПЕ1, снова суспендируют в 500 мкл TES-буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 0,1 МЭДТА; 10 мМ Nad) Раствор ДНК

57-GGGCAGTCACCTGAAACCACTGATTGATGGGAACATGA-3V

30 пмоль этого фрагмента индивидуально обрабатывают 5 ед Т4-полинуклео- тидкиназы в 10 мкл IX-киназного буфера (100 мМ трис-HCl, рН 8,3, 10 мМ DDT; 100 мМ MgClg.), содержащего 1 мкл 1 мМ АТР, 30 мин при 37°С и затем инкубируют 10 мин при 65°С и замораживают . Обработанные киназой ДНК используют дл  описываемого ниже мутагенеза .

На первой стадии мутагенеза мутагенный олигонуклеотид и универсальный праймер М13 ренатурируют в однонитевую фаговую ДНК Ренатурирование .провод т , прибавл   300 нг (0,5 мкл) од- нонитевого фага M13mp18-HEI к 1 пмоль (1,2 мкл) универсального праймера, 1 пмоль (0,3 мкл) мутагенного олиго- нуклеотида, 2 мкл 1ОХ-ренатурационно- го буфера (100 мМ трис-HCl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА и 500 мМ NaCl) и 16 мкл воды , инкубируют смесь при 80° С 2 мин и затем 5 мин при 50° Сf затем дают смеси остыть до комнатной температуры .

После ренатурации олигонуклеоти- дов фаговую ДНК делают двунитевой, расшир   праймеры ДНК-полимеразой, Эту реакцию провод т, прибавл   3 мкл 1ОХ расшир ющего буфера (500 мМ трис-HCl, рН 8; 1 мМ ЭДТА и 120 мМ MgCl ) 3 мкл 10 Х-лигазного буфера; 1,5 мкл 0,2 мМ DTT; 3 мкл dNTP-снеси (0,5 мМ каждой dNTP); 1,2 мкл 25 мМ АТР; 0,5 мкл фермента Кленова (5 ед/ /мкл, ВМВ); 1 мкл Т4-ДНК-лигазы (400 едо, NEB) и 19,8 мкл воды к смет си ренатурированной ДНК, Расширение

985422

экстрагируют сначала хлороформом, згН тем дважды ТЕ-насыщенным фенолом и затем снова хлороформом, Однонитевую ДНК осаждают с помощью NaOAc и этанола , центрифугируют, промывают 70%- ным этанолом.

Осадок высушивают и раствор ют в 80 мкл водыо Этот образец фага ис- 10 пользуют на следующей стадии сайт- специфичного мутагенеза дл  удалени  ДНК, кодирующей активационньй пептид.

Фмагмент однонитевой ДНК, исполь- зуемый дл  мутагенеза при удалении ДНК, кодирующей активационньй пептид , получают на автоматическом ДНК-синтезаторе в следующем виде:

провод т инкубированием при комнатной температуре в течение 30 мин, затем 4 ч при 37°С и в течение ночи при 4С.

Реакцию останавливают экстракцией фенол-хлороформом и ДНК осаждают этанолом с ацетатом натри  (NaOAc)„ ДНК собирают центрифугированием, суспен- дируют в 40 мкл Si-буфера (0,3 М NaCl:; 0,03 M NaOAc, рН 4,5 и 0,3 мМ ZnCl2) и прибавл ют к раствору ДНК, Установлено, что Si-обработка не обладает существенными, преимуществами и в методиках конструировани , описываемых в последующих примерах, Si-обработка полностью исключена.

Раствор ДНК раздел ют в две пробирки на две равные части и в одну из пробирок прибавл ют 100 ед. (ВМВ) SI-нуклеазы, Si-реакцию провод т инкубированием 5 мин при комнатной температуре и останавливают экстрагированием реакционной смеси ТЕ-на- сыщенной смесью фенол-хлороформ (50:50).

Осадок ДНК суспендируют в 60 мкл воды и трансформируют в E.coli K12 IM101 о.Мутантов отбирают с помощью радиоактивно меченного мутагенного олигонуклеотида, AAACGACTCA- TTGA-3 и точечных гибридизаций, . Несколько положительно гибридизиро ванных п тен отбирают и высевают в 2 мл культуры E,coli K12 IM101, наход щейс  в логарифмической стадии роста. Культуры инкубируют при 37 С и аэрировании около 6 ч и затем используют дл  получени  однонитевой ДНК.

Однонитевую ДНК секвентируют. Несколько фагов идентифицируют цепе- вой мутацией. Фаг, в котором удалена последовательность, кодирующа  ак- тивационный пептид, это целевой фаг М13 mpia-HE2. Мутаци  в фаге М13 гар18-НЕ2 вызывает уменьшение размера на 36 пар оснований по сравнению с природной кодирующей последовательностью и эту разницу можно использовать дл  идентификации ДНК, содержащей мутировавший участок. RF-форму фага М13 тр18-НЕ2.получают последующим конструированием.

С. Конструирование штазмиды pLAPC из фага М13 тр18-НЕ2 и плазмиды pLPC

Sst I - Sal I фрагмент (около 0,7 т„п„о,) KF-формы фага М13 тр18-НЕ отрезают от фага и выдел ют по методике примера 1А„

Три ДНК-фрагмента св зывают вместе с получением плазмиды pLAPC: Sst I - Sal I фрагмент фага М13 mp18-HE2 (около 0,7 т.п.о.) и 2 ДНК-фрагмента плазмиды pLPCo Поскольку в плазмице pLPC наход тс  сайты рестриктаз Sal Sst I и Eco RI, то целевые рестрик- ционные фрагменты Eco RI - Sal I и Eco RI - Sst I нужно получать двум  отдельными расщеплени ми.

Sst I - Eco RI расщепленную ДНК суспендируют в воде и помещают в 0,6% гель из агарозы с низкой темпе- ратурой гелеобразовани  дл  отделе- ни  ДНК-фрагментов.

Дл  получени  EcoR I - Sal I- фрагмента около 15 мкг плазмиды pLPC сначала обрабатывают рестрикционным ферментом Ара дл  удалени  загр знений близкими по размерам:, рестрик- ционными фрагментами. Затем рестрик- тазы Sal I, EcoR I добавл ют к раствору Apal-расщепленной ДНК плазмиды pLPC и результирующую смесь инкубируют .. I-EcoR I расщепленную ДНК плазмиды pLPC сначала экстрагируют фенолом, затем хлороформом,

-

собирают осаждением этанолом и цент рифугированием. Суспендируют в воде,( помещают в 0,6% агароз ый гель и раздел ют электрофорезом.

Рестрикционные фрагменты EcoR I - Sal I (около 3,76 т.п.о.) и EcoR I - Sst 1„(около 2,0 т.п.о.) вырезают из гел  и выдел ют./

-

. JQ jg

20 2 25 ,

35

40

45

( /

50

55

Каждый из двух очищенных рестрик- ционных фрагментов прибавл ют к Sst I - Sal 1-рестрикционного фрагмента (около 0,7 т.п.о) фага М13 тр18-НЕ2 и лигируют, получа  в результате целевую плазмиду pLAPC. Ппазмида pLAPC отличаетс  от плазмиды pLPC отсутствием ДНК, кодирующей активационный пептид.

Плазмиду pLAPC трансформируют в E.coli K12 RV308 и выращивают.

Трансформанты Ее соli K12 RV308/ /pLAPC подтверждают рестрикционным ферментным анализом. Плазмидную ДНК получают из трансформантов E.coli К12 RV308/PLAPC практически так же, как в примере 1А, за исключением того, что в качестве селективного агента используют 50 мкг/мл ампициллина , а не тетрациклина.

П р и м е р 2. Конструирование плазмиды pLPC.

Плазмиду pLPC используют как промежуточный вектор при конструировании плазмиды pLAPCo Плазмида pLPC содержит сегмент ДНК, кодирующий ВК-вирус- ный усилитель и поздний промотор аденовируса 2, ведущие экспрессию человеческого белка С. Конструирование плазмиды pLAPC в основном приводит к замене последовательности, кодирующей человеческий белок С в плазмиде pLPC, на другую последовательность кодирующую белок С, на которой удалена ДНК, кодирующа  активационный пептид .

В примере 2В описано конструирование плазмиды рВК пео1, получаемой вставкой ВК-усилител  в плазмиду pdBPV-MMT neo. В примере 2С описано конструирование плазмиды pLPcat, получаемой вставкой позднего промотора аденовируса 2 в плазмиду pSV2cat. ч примере 2F описано конструирование плазмиды pBLcat, содержащей ВК-уси- литель дл  повышени  активности позднего аденовирусного промотора. В примере 2Е описано конструирование плазмиды рЫЗЗ, вектора экспрессии белка С, начина  с исходной плазмиды рНС7 через конструирование промежуточной плазмиды pSV2-HPC8 и результирующее конструирование промежуточной плазмиды pLPC,.содержащей контролирующую экспрессию последовательность ВК-усилитель (аденовирусный поздний промотор плазмиды pBLcat, вставленную в плазмиду рЫЗЗ дл  управлени  экспрессией человеческого белка С),

A.Получение ВК-вирусной ДНК. ВК-вирус получают из Коллекции

Культур Американского Типа, номер АТСС VR-837. Организмом-хоз ином дл  получени  ВК-вирусной ДНК  вл етс  культура клеток человеческой эмбриональной почки (РНЕК).

Вирус выдел ют из клеток трем  циклами замораживани -оттаивани  и клеточные остатки удал ют центрифугированием Вирус осаждают, собирают добавлением- ПЭГ - 6000, инкубируют 24 ч при 4°С и центрифугируют о Осадок раствор ют в 0,1 X SSC-буфере (1Х SSC 0,15 М NaCl и 0,015 М цитрат натри , рН 7) при 1/100 первоначального объема. Вирусную суспензию центрифугируют, при этом наблюдают две полосы. Нижнюю полосу, содержащую полный вирион, собирают и обессоливают на колонке с сефадексом С-50

Додецилсульфат натри  прибавл ют к раствору очищенных вирионов, полученных после колонки, до конечной концентрации 1%; прибавл ют протеазу в концентрации 100 мкг/мл и раствор инкубируют 2 ч при 37 С. Затем к раствору прибавл ют хлорид цези  до плотности 1,56 г/мл и этидий бромид до концентрации 100 мкг/мл° Раствор центрифугируют. После центрифугировани  полосу вирусной ДНК выдел ют и 5 раз экстрагируют изоамиловым спиртом, насыщенным 100 мМ трис-НС1, рН 7,8о Затем раствор ВК-вирусной ДН диализуют против ТЕ-буфера до достижени  отношени  поглощени  ДНК при 260 нм/280 нм, равного 1,75 - 1,90 ДНК осаждают, довод  концентрацию NaCl до 0,15 М, добавл ют 2 объема этанола, инкубируют раствор не менее 2 ч при -70 С и центрифугируют 10 ми при 12000 g. Результирующий осадок ВК-вирусной ДНК суспендируют в ТЕ- буфере в концентрации 1 мг/мл.

B.Конструирование плазмиды рВК neol.

Клетки E.coli K12 HB101/pdBPV - 11МТ пео получают в лиофилизованной форме из Коллекции Культур Американского Типа под номером АТСС 37224„ Лиофюшзованные клетки помещают на L-агаровые пластинки, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37°С с получением изол тов единичной колонии.

0

5

0

5

1 л L-бульона, содержащего 50 мкг/ /мл ампициллина, засевают колонией E.coli K12 HBlOI/pdBPV-NMT neo и инкубируют при 37 С до достижени  OoD.5g0 равной приблизительно 1 г„ К культуре прибавл ют 150 мг хлорам- фениколао Инкубирование продолжают приблизительно 16 ч; добавка хлорам- феникола ингибирует синтез белка и дальнейшее деление клеток, но позвол ет продолжатьс  репликации плаз- мид. Из культуры получают плазмидную ДНК pdBPV-MMT neo по методике, описанной в примере 1А.

ДНК плазмиды pdBPV-MMT neo расщепл ют рестриктазойс ВатН1„ ВатН1 - ВатН1 фрагмент ДНК осаждают, собирают центрифугированием и суспендируют о

ВатШ - ВатНЧ фрагмент плаэмиды pdBPV - ММТ пео (1 мкл) и ВагаН1 - ВатН1 фрагмент ВК-вирусной ДНК лиги- руют Т4-ДНК лигазой.Лигированную ДНК трансформируют в клетки E.coli К12 НВ101.

Трансформированные клетки помещают на L-агаровые пластинки, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Трансформанты Eocoli K12 НВ101/рВКпео1 и E.coli К12/рВК пео2 идентифицируют рестрик- ционным ферментным анализом

С оКонструирование плазмиды pLPcat, промежуточной плазмиды дл  конструировани  плазмиды pBLcat.

Вирионна  ДНК аденовируса 2 (Ad2)  вл етс  двунитевой линейной молекулой длиной около 35,94 т«,п0о Поздний промотор Ad2 можно выделить в рест- рикционном фрагменте AccI - Pwu II,, (около 0,32 Ton.oJ генома Ad2; этот рестрикционный фрагмент соответствует последовательности между нуклеотида- ми Ь755 и 6071 генома Ad2, дл  его выделени  ДНК Ad2 сначала рас- 5 щепл ют рестриктазой Bal I ri вьщел ют Bal I - рестрикционный фрагмент длиной около 2,4 .Оо, содержащий всю последовательность AccI - Pvu II рестрикционного фрагмента длиной око- 0 ло 0,32т.п.о. Затем рестрикционный фрагмент Bal I длиной .около 2,4 ТоП„о. расщепл ют AccI Pvu II с получением целевого фрагмента

ДНК Ad2 (полученной от BRL) обрабатывают рестриктазой Bal I, подвергают электрофорезу до разделени  , рестрикцийиных фрагментов,

Bal I - рестрикционный фрагмент Ad2 длиной около 2,4 т.п.о, расщеп0

5

0

5

л ют вначале рестриктазой Accl, затем рестриктазой Pvu II, нанос т на 6%-ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до отделени  Accl - Pvu II - рестрикционного фрагмента длиной около 0,32 т„п.о, содержащего пйздний промотор Ad2.

Дл  превращени  Accl - Pvu II рестрикционного фрагмента в Accl - Bel I - рестрикционный фрагмент Bel I - линкеры св зывают с рестрик ционным фрагментом Accl - Pvu II длиной около 0,32 ТсП.о„ Поскольку , Bel I-линкеры имеют тупые концы, то они присоедин ютс  только к Pvu II- окончани м рестрикционных фрагментов Линкеры Bel I имеют следующую последовательность :

5 -CTGATCAG-3

3 -GACTAGTC-5 о

0,25 мкг обработанных киназой Bel I-линкеров прибавл ют к раствору Accl - Bvu II-рестрикционного фрагмента длиной около 0,32 т„п„о,, затем добавл ют 1000 ед„ Т4-ДНК-лигазы и 1 мкл 10Х лигазного буфера и результирующую смесь инкубируют ночь при 16°С. Линкеры Bel I могут св зыватьс  только с Pvu II-концом рестриционного фрагмента AccI-Pwu II. Последующее ДНК-секвентирование показывают , что 4 Bel I-линкера присоединены к Pvu II-концу рестрикционного фрагмента AccI-Pvu Но Эти дополнительные Bel I-линкеры можно удалить Bel I-отщеплением и повторным св зыванием; однако дополнительные Bel I- линкеры не удал ют, поскольку они не мешают правильному функционированию векторов, содержащих эти линкеры

Клетки Eocoli R12 НВ101/pSV2cat получают в лиофилизованной форме от АТСС под номером АТСС 37155, и плаз- мидную ДНК pSV2cat выдел ют. ДНК плазмиды pSV2cat лигируют вначале рестриктазой Асе I, а затем рестриктазой Stu I.

Accl - Stu I фрагмент ДНК плазмиды pSVcat смешивают с Accl - Pv« II фрагментом Ad2 имеющим присоединенные Bel I-линкеры, лигируют и трансфор мнруют в Eocoli K12 НВ101. Св занна  ДНК  вл етс  целевой плаэмидой pLPcat, содержащей поздний промотор Ad2, расположенный так, чтобы управл ть транскрипцией и экспрессией хлорамфениколацетилтрансферазного гена .

D. Конструирование плазмиды pBLcat.

ДНК плазмиды рВК пуо расщепл ют ферментом Accl и с помощью агарозного гел  выдел ют фрагмент длиной около 1,4 ТоПоО., содержащий ВК-усилитель„ 5 мкг фрагмента расщепл ют рестриктазой Pvu II Фрагмент Pvu II ДНК Q выдел ют, очищают и подготавливают к св зыванию.

ДНК плазмиды pLPcat гидролизуют вначале рестриктазой Accl, а затем рестриктазой Stuff, ДНК плазмиды pLPcat несколько раз осаждают этанолом дл  очистки Accl - Stu I-рест- рикционного фрагмента длиной около 4,81 ТсПоО., содержащего E.coli - источник репликации и поздний промо- 0 тор Ad2.

Accl - Stu I - фрагмент плазмиды pLPcat лигируют с Accl т Pvu II- фрагментом (1,28 т.п.о.) плазмиды рВК neol. Св занна  ДНК составл ет 5 целевую плазмиду pBLcat,

Св занную ДНК используют дл  трансформировани  клеток Е„соЦ К12 НВ101. Трансформанты E.coli K12 НВ101/ /pBLcat идентифицируют рестрикционным анализом

Е. Конструирование плазмиды рЫЗЗ„ Плазмида рЫЗЗ представл ет собой вектор экспрессии человеческого белка С.

5,0 мкг дНК плазмиды рНС/ смеши- 5 вают с 50 ед0 рестриктазы Ban I, 10 мкл 10Х Ban I - реакционного буфера (1,5 М NaCl; 60 мМ трис-НС1, рН 7,9; 60 мМ МсС12 и 1 мг/мл BSA), 35 мкл воды и инкубируют, Расщеплен- 0 ную ДНК плазмиды рНС7 подвергают

электрофорезу в 3,5% полнакриламидном геле.

Из гел  вырезают участок, содер- жащий Ban I - рестрикционный фрагмент длиной около 1,25 т.п,0о, поме0

щают в испытательную пробирку и измельчают . 1 мл экстракционного фера (500 мМ ШНОАс, 10 мМ MgOAc,

1 мМ ЭДТА, 1% SDS и 10 мг/мл т-РНК) добавл ют к частицам и пробирку выдерживают ночь при 37°С„ Остатки удал ют центрифугированием и супер- натант перенос т в новую пробирку. Супернатант пропускают через стекловату , прибавл ют 2 объема этанола и смешивают. Результирующий раствор помещают на 10 мин в сухой лед - эта29

пол и ДНК осаждают центрифугированием .

Очищенный фрагмент суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера и хран т при -20°С. Рестрикционный фрагмент Ban 1 модифицируют добавлением линкера дл  конструировани  плаэмиды pSV2-HPC8

Необходимый линкер имеет следующую структуру:

5 -AGCTTTGATCAG- З1

3 -AACTAGTCCACG-5

8 мкг Ban I-фрагмента длиной около 1,25 т.п.о. добавл ют и смешивают с 500 пмоль линкера и лигируют0

ДНК выдел ют и раствор ют в Ара реакционного буфера и гидролизуют рестриктазой Apal. ДНК осаждают Осадок ДНК раствор ют и гидролизуют рестриктазой Hind III. Hind III - - Apal - рестрикционный фрагмент выдел ют с помощью электрофореза в геле , 5 мкг целевого фрагмента суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера и хран т при -20°С.

ДНК плазмиды рНС7 гидролизуют рестриктазой Psc I буфера (1,0 М NaCl; 100 м М трис-HCl, рН 7,5; 1.00 мМ MgCl2 и 1 мг/мл BSA) и 35 мкл воды и инкубируют 2 ч при 37°С, подвергают электрофорезу в 3,5%-ном по- лиакриламидном геле, целевой фрагмен длиной около 0,88 тиПоО„, очищают, суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера и хран т при -20°С

5 мкг Pst I-фрагмента длиной около 0,88 т.п.Оо смешивают с 50 мкл следующего линкера, который конструируют на автоматическом ДНК-синтезаторе :

5 -GTGATCAA-3

S -ACGTCACTAGTTCTAG-S ,

Смесь лигируют с помощью Т4-ДНК- лигазы.

ДНК осаждают, раствор ют и гидролизуют вначале рестриктазой Apal, а затем рестриктазой Bgl II, нанос т на 3,5%-ный полиакриламидный гель и целевой рестрикционный фрагмент Apal Bgl Ц длиной около 0,19 ТоПоО выдел ют .

ДНК плазмиды pSV2gpt (ATCC 37145) гидролизуют вначале рестриктазой Hind III, а затем рестриктазой Bgl 11 После расщеплени  Bgl II реакционную смесь нанос т на 1%-ный агарозный гель и фрагменты раздел ют электрофо резом. Гель окрашивают этидий бромидом , полосу, соответствующую целевом

w

to

15

20

25

739854. 30

фрагменту Hind III - Bgl II длиной около 5,1 т.п.Оо, вырезают из гел  и помещают в диализную пробирку и электрофорез продолжают до выхода ДНК из агарозы. Буфер, содержащий ДНК из диализной пробирки, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают ДНК,Осадок суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера и получают приблизительно 5 мкг целевого рестрикцион- ного фрагмента Hind III - Bgl II плазмиды pSV2gpt длиной около 5,1

Т.П.Оо

Hind III - Ара I фрагмент длиной 1,23 т.п,о., Ара I - Bgl II фрагмент длиной 0,19 ТоП.о. и Hind III - Bgl II фрагмент смешивают и лигируют„ Полученна  ДНК  вл етс  целевой плазмидой PSV2-HPC8.

Клетки E.coli K12 RRI (NRKL В-15210) трансформируют лигазной смесью и помещают на L- агаровые пластинки , содержащие 100 мкг/мл ампициллина . Затем пластинки инкубируют при 37°С. Наличие трансформантов E0coli К12 RRI/pSV 2-HPC8 подтверждают рест- рикционным ферментным анализом,

50 мкг плазмиды pSV 2-HPC8 гидролизуют вначале рестриктазой Hind III, а затем рестриктазой Sal I0 Смесь нанос т на 3,5%-ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до отделени  целевого рестрикционного фрагмента Hind III - Sal I длиной около 0,29 ТоПоОо

ДНК плазмиды pSV 2-HPC8 гидролизуют вначале рестриктазой Bgl II, а затем рестриктазой Sal 1„ Смесь нанос т на 3,5% полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до отделени  целевого рестрикционного фрагмента Sal I - Bgl II длиной около 1,15 ТоП.о,

ДНК плазмиды р5Ґ2-Ј-глобин (NRRL В15928) гидролизуют рестриктазами Hind III и Bgl 11„ После расщеплени  реакционную смесь нанос т на 1%-ный агарозный гель и фрагменты раздел ют 50 электрофорезом. Из гел  выдел ют це30

35

40

4S

левой рестрикционный фрагмент Hind III - Bgl II.

Hind III - Sal I фрагмент плазмиды pSV 2-HPC8, длиной около 0,29 т.п0о,, Sal I - Bgl II фрагмент плаз- 55 миды pSV 2-HPC8 длиной около 1,15 т.п00о и 2 мкл Hind III - Bgl II фрагмента плаэмиды pSV 2-й-глобин лигируют Т4-ДНК -лигазой. Св занна 

ДНК  вл етс  целевой плазмидой рЫЗЗ Св занную ДНК используют дл  трансформировани  Е„со11 К12 RRI и целевые трансформанты E.coli K12 RRI/ /рЫЗЗ идентифицируют по их ампициллин-устойчивому фенотипу и с помощью рестрикционного анализа0

F. Конструирование плазмиды pLPC из плазмид рЫЗЗ и pBLcat.

ДНК плазмиды pBLcat гидролизуют рестриктазой Hind III, отдел ют в агарозном геле фрагмент длиной около 0,87 ТоП.о,, содержащий ВК-усшштель и поздний промотор Ad2.

ДНК плазмиды рЫЗЗ гидролизуют рестриктазой Hind III, смесь инкубируют 2 ч при 37аС, Затем ДНК разбавл ют до 100 мкл, обрабатывают 0,06 ед тел чьей кишечной щелочной фос- фатазы, дважды -экстрагируют фенолом и один раз хлороформом, осаждают этанолом и снова суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера о

Hind III фрагмент (длиной около 0,87 .о.) плазмиды PBLcat прибавл ют к. Hind III- обработанной плазмиды рЫЗЗ и лигируют. Св занна  ДНК составл ет целевую плазмиду

5 -GACCAAGAAGACCAAGTAGGCCCGCGGCTCATTGATG-3

Мутагевизированный фаг, полученный сайт-специфичным мутагенезом, назван М13 тр18-НЕ4„

Конструирование плазмиды pLPC - 167 G провод т аналогично конструированию плазмиды pLAPC, описанному в примере 1Cо Однако плазмиду pLAPC конструируют с использованием двух рестрикционных фрагментов из плазмиды pLPC. При конструировании плазмиды pLPC - 167G эти же фрагменты получают из плазмиды pLAPC Причиной использовани  плазмиды pLAPC в качестве ,источника фрагментов вместо плазмиды pLPC  вл етс  облегчение рестрикционного анализа при идентификации трансформантных плазмид pLPC - 167G. Так как плазмиды pLPC и pLPC - 167 G очень близки по размерам , то трудно различить плазмиду pLPC от плазмиды pLPC - 167С„

Однако.поскольку плазмида pLAPC меньше, чем плазмида pLPC - 167G, то, получа  два фрагмента из плазмиды pLAPC, можно легко отличить родител  (плазмиду pLAPC) от целевой плазмиды pLPC 167G. Таким образом,

Св занную ДНК используют дл  трансформировани  EoCdli K12 НВ101, Трансформированные клетки помещают на L-агаровые пластинки, содержащие ампициллин, и ДНК устойчивых к ампициллину трансформантов провер ют рестрикционным анализом Рестрикцион- ный фрагмент Hind III длиной около 0,87 т„ПоО„, кодирующий ВК-усили- тель и поздний промотор Ad2, может встроитьс  в Hind III - расщепленную плазмиду pL133 в одной из двух ориентации , лишь одна из которых дает плазмиду pLPCo

Приме рЗ„ Конструирование плазмиды pLPC-167 Go

Плазмиду pLPC-167 G конструируют в соответствии с сайт-специфичным мутагенезом и другими методиками, использованными при конструировании плазмиды pLAPC, как это описано в примере 1.

5

При конструировании плазмиды pLPC - 167G фаг М13 mp18-IIE1 (см. пример 1В) подвергают сайт-специфичному мутагенезу с помощью следующего мутагевизирующего олигонуклеотида:

при конструировании плазмиды pLPC - 167G рестрикционный фрагмент Sst I Sal I длиной около 0,7 т,п,о„ фага М13 тр18-НЕ4 св зывают с рестрикционным фрагментом EcoR I - Sal I длиной около 3,76 т.. плазмиды pLAPC и рестрикционным фрагментом EcoR I Sst I длиной около 2,0 плазмиды pLAPC. Св занна  ДНК составл ет целевую плазмиду pLPC - 167G9 трансформирующую Eocoli K12 RV308 Результирующие трансформанты E.coli K12

RV308/pLPC - 167G используют дл  получени  больших количеств. ДНК плазмиды pLPC - 167G«

П р и м е р 4. Конструирование плазмиды pLPC - 167F

Плазмиду pLPC - 167F конструируют практически так же, как описано в примере 1 дл  конструировани  плазмиды pLAPC с использованием сайт-специфичного мутагенеза и других стадий,

№ конструировании плазмиды pLPC - 167F фаг М13 тр18-НЕ1 подвергают сайт-специфичному мутагенезу с исп пользованием следующего мутагенизи- рующего олигонуклеотида:

33 173985434

5 -GACCAAGAACAACCAAGTATTCCGCGGCCTCATTGATC-3 J

Мутагенезированный фаг, получившийс  в результате сайт-специфичного мутагенеза , назван М13 тр18-НЕ5.

Финальное конструирование плазми- ды pLPC - 167F провод т аналогично конструированию плазмиды pLAPC, описанному в примере 1C. Однако плазми- ду pLAPC конструируют с использованием двух рестрикционных фрагментов из плазмиды pLPC0 В отличие от этого при конструировании плазмиды pLAPC - 167F эти же два фрагмента получают из плазмиды pLAPC Причиной использовани  плазмиды pLAPC в качестве источника фрагментов вместо плазмиды

pLPC  вл етс  облегчение рестрик- - ционного анализа при идентифицировании трансформантов плазмиды pLPC - 167F. Поскольку плазмида pLAPC меньше , чем плазмида pLPC - 167F, то, получа  два фрагмента из плазмиды pLAPC, можно легко отличить родительскую плазмиду (pLAPC) от целевой плазмиды pLPC - 167F

Таким образом, при конструировании pLPC - 167F рестрикционный фрагмент Sst I - Sal I длиной около 0,7 т.п.о. фага М13 тр18-НЕ5 св зывают с рестрикционным фрагментом EcoR I - Sal I плазмиды pLAPC длиной около 3,76 . и с рестрикционным фрагментом EcoR I - Sst I длиной около 3,76 т.п.о., и с рестрикционным фрагментом EcoR I - Sst I длиной около 2,0 топ.о. плазмиды pLAPC, Св занна  ДНК составл ет целевую плазмиду pLPC - 167F, которую трансформируют в Eocoli K12 RV308

П р и м е р 5 о Конструирование трансформированных аденовирусом человеческих эмбриональных почечных клеток линии 293 и трансформированных аденовирусом трансформантов клеток сирийского хом ка линии AV12 с ис-. пользованием плазмид pLPC - 167G и pLPC - 167F.

Человеческие эмбриональные почечные клетки линии 293 получены от Коллекции Культур Американского Типа под номером АТСС CRL 1573,, Трансформированные аденовирусом клетки сирийского хом ка линии AV12 также могут быть получены из Коллекции Культур Американского Типа, где они хран тс  под № АТСС CRL 9595.

Клетки 293 выращивают в минималь- 5 ной среде Игла с 10%-ной термоинак- тивированной лощадиной сывороткой при 37 С (среду мен ют дважды в неделю)„ Среда состоит из D MEM с 10% тел г чьей сыворотки, 50 мкг/мл ентамицина 0 и 10 мкг/мл Agua МЕРНУТСШ фитандио- на витамина К.„ Клетки субкультиви- руют удалением среды, промывают раствором Хенка, прибавл ют 0,25%-ный трипсин (содержащий 0,2 г/л ЭДТА) 5 на 1-2 мин, промывают свежей средой, отсасывают и распредел ют в новые сосуды с отношением субкультивировани  1:5 или 1:10.

За 1 день перед трансформированием 0 клетки высевают в количестве 0,7x10 клеток на 100 мм чашку Петри, Стерильную , осажденную этанолом плазмиду ДНК раствор ют в ТЕ-буфере и используют дл  получени  раствора 2Х ДНК-СаС1а, 5 содержащего 25 мкг/мл трансформирующей плазмидной ДНК (при трансформаци  плазмидами PLPC - 167F или pLPC - 167G обычно используют две плазмиды, плазмиду pLPC - 167F или 0 pLPC - 167G и плазмиду, содержащую селективный маркер) и 250 мМ СаС12° Получают 2XHBSS, содержащий 280 мМ NaCl, 50 мМ HepeS и 1,5 мМ фосфат натри  с рН, доведенным до 7,05 - 5 7,15. Раствор 2Х ДНК - СаС1г по капл м прибавл ют к равному объему стерильного 2Х HBSS и продувают пузырьками в ходе прибавлени  ДНК, Позвол ют формироватьс  ДНК-кальцийфосфат- 0 ному осадку без перемешивани  30 - 45 мин при комнатной температуре.

Затем осадок осторожно перемешивают отсосом пластиковой пипеткой и 1 мл (на пластинку) осадка прибав- g л ют пр мо в 10 мл среды, роста, покрывающей реципиентные клетки Через 4 ч инкубировани  при 37° С среду замен ют свежей и клетки инкубируют еще 72 ч до проведени  селекции. Дл  0 плазмид, не содержащих селективного маркера, функционирующего в эукариот- ных клетках, таких как плазмида pLPC - 167F или pLPC - 167G, в методике трансформировани  используют е следующую смесь плазмид: вектор экспрессии по данному изобретению, не содержащий селективного маркера; вектор экспрессии, содержащий селективный маркер, работающий в эукариотных клетках. Дл  трансформации использовали плазмиды pSV2 - dhfr (АТСС 37146), pSV 2 - neo (ATCC 37149), PSV2 - Bpt (ATCC 37145) и pSV2 - hyg (NRRL В18039)„ Плазмида pSV2 - hyg придает устойчивость эу- кариотным клеткам-хоз евам к гидро- мицину В. Таким образом методика совместной трансформации позвол ет отбирать клетки, содержащие плазмиды с селективным маркером

Плазмида pSV2 - neo придает -, устойчивость к неомицину (G418)o

Трансформацией клеточных линий 293 и AV 12 смесью плазмиды pLPC - 167F или pLPC - 167G и вектора, придающего устойчивость к гидромицину, и последующей селекцией гидромицин - устойчивых клеток получают большое число трансформантов 0

П р и м е р 6 о Отбор трансформан™ (тов с высокой секрецией о

Устойчивые к гидромицьну трансформанты , полученные в примере 5, выращивают в 100 мм дисках дл  тканевых культур или плотности в несколько cot клеточных клонов на диск. Среду декантируют и клетки дважды промывают .

Нитроцеллюлозные фильтры помещают в слой агара после удалени  пузырьков воздуха пластинки инкубируют 1 - 3 ч при 37°С, затем помещают в PBS (50 мМ трис-HCl, РН 7,2 и 150 мМ NaCl).

Дл  поддержани  жизнеспособности клеток в ходе анализа фильтров клетки покрывают сверху смесью, содержащей 2 мл 1,8% агара (47°С), 2 мл DME-солей (37°С) и 4 кл DME-солей с 20% тел чьей сыворотки (37°С) и помещают в инкубатор при 37 С,

Все промывки и реакции провод т с фильтром, помещенным на качающуюс  платформу. Сначала фильтры блокируют инкубированием при комнатной темпе5 - GCG CAG ТСА CCTG AAACG ACTCATTGATGGGAAGATGA-3

Способ конструиров нантной плазмидной ДН зимоген -.С человека, з том, что осуществл ют . мента 0,7 кв плазмиды вание его с фрагменто фага MB mp18 с образо mp18HE1- проведение с ческого мутагенеза с олйгонуклеотида

с образованием фага М13 тр8НЕ2 или

5 -GACCAAGAAGACCAAGTAGGCCCGCGGCTGATTGATG-3 с образованием фага тр18НЕ4 или

51 GACCAAGAAGACCAAGTATTCCCGCGGCTGATTGATC-3T

EcoR I - Sst I фрагментом плаэмиды pLAPC и EcoR I - Sal I фрагментом

с образованием фага М13 mp18-HE5, ли- гирование фрагмента SstI - Sal I

размером 0,7 кв фага М13 mp18HE2 с

5

5

0

5

4°С

ратуре в 5%-ном молоке в PBS. Затем фильтры промывают 4 раза в PBS (5 мин на промывку). К фильтру прибавл ют 10 мкг/мл биотинилированных поликло- нальных овечьих антител против чело- веческого белка С в 2,5%-ном бычьем сывороточном альбумине и инкубируют 1 ч при 37°С.

Фильтры 4 раза промывают PBS при

Затем авидин D и биотинилировэнную пероксидазу из ложечницы приморской подготавливают и добавл ют так, как описано в инструкции поставщика Фильтры инкубируют с HRP-конъюгиро- ванным авидином D 1 ч при 4°С (если секретировано небольшое количество белка, то можно использовать более длительные инкубационные времена, т.е. ночь)о

Дл  про влени  цвета индикатора прибавл ют инкубируют при комнатной температуре до про влени  цвета. Колонии, секретирующие наибольшее количество зимогена С человека , отмечаютс  на фильтрах не только более ранним по влением цвета, но и более темными п тнами на фильтрах

После про влени  фильтров их сно- ва накладывают на первоначальные пластинки дл  соотнесени  колоний с п тнами на фильтре. Колонии, секре- тирующие наибольшее количество зимогена С человека, отбирают и используют дл  получени  зимогена«

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ конструировани  рекомби- нантной плазмидной ДНК, кодирующей зимоген -.С человека, заключающийс  в том, что осуществл ют выделение фраг- .мента 0,7 кв плазмиды рНС7, лигиро- вание его с фрагментом Sst I - Sal1 I фага MB mp18 с образованием М13 mp18HE1- проведение сайт-специфического мутагенеза с использованием олйгонуклеотида

   размером 2,0 кв той же плазмиды или

   37 173985438

   тех же фрагментов фага М13 трНЕ4 и -карбоксилированного секретируемого

   плазмиды pLAPC, или М13 трНЕЗ ибелка, легкую цепь белка С человека,

   плазмиды PLAPC или pLPC - 167F COOT-дипептид лизин-аргинин, аргинин-ливетственно с последующим отбором, - зин или аргинин-аргинин со следующей

   плазмид, кодирующих полипептид, вклкпаминокислотной и нуклеотидной послечающий сигнальньй пептид и пропептиддовательностью:

   i/vii A:;I ы:и Ш1 ;I.N CYS HIS

   PRO ALAVAL LYS PIIE PRO CYS CLY ARG PROTRPLYS ARG MET CLU LYS

   LYS ARGSER HIS LEU LYS ARC ASP THR CI.UASPGLN GLU ASP GLN VAL

   Ri R2ARG LEU ILC R3 GLY LYS MET THRARCARG GLY ASP SER PRO

   TRP GLNVAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYSLYSLEU ALA CYS GLY ALA

   VAL LEUILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THRALAALA HIS CYS MET ASP

   GLU SERLYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLYGLUTYR ASP LEU ARG ARG

   TRP GLULYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILELYSGLU VAL PHE VAL HIS

   PRO ASNTYR SER LYS SER THR THR ASP ASNASPILE ALA LEU LEU HIS

   LEU ALAGLN PRO ALA THR LEU SER GLN THRILEVAL PRO ILE CYS LEU

   PRO ASPSER GLY LEU ALA GLU. ARC GLU LEUASNGLN ALA GLY. GLN GLU

   THR LEUVAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SERSERARG GLU LYS GLU ALA

   LYS ARGASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHEILELYS ILE PRO VAL VAL

   PRO HISASN GLU CYS SER GLU VAL MET SERASNMET VAL SER GLU ASN

   ПЕТ LEUCYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARGGLNASP ALA CYS GLU GLY

   ASP SERGLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHEHISGLY THR TRP PHE LEU

   VAL GLYLEU VAL SER TRP GLY GLU GLY,CYSGLYLEU LEU HIS ASN TYR

   GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

   .

   ILE ARC ASP LYS CLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

   .

   5 -GAC АСА GAA GAC CAA GAA GAC СЛА СТА

   R4 R5 CGG CTC ATT R6 GGG AAG ATG ACC AGO CGG GGA GAC AGC CCC TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC ТСЛ AAG AAG АЛО СТО GCC TGC GGG CCA ,GTG CTC АТС СЛС CCC TCC TGG GTG CTG АСА GCG GCC СЛС TGC ATG GAT GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTT GGA GAG TAT GAC CTC CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC АТС AAG GAG GTC TTC GTC СЛС CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC ЛАТ САС АТС GCA CTC CTG СЛС CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC АТС TGC CTC CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC ЛЛТ CAG GCC GCC CAG GAC

   39 . 173985440

   АСС СТС GTG ACG GGC TGG GGC СЛС AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC AAG АСА ААС CGC АСС ТТС СТС СТС АЛС ТТС АТС AAG ATT CCC GTG GTC

   р

   CCG СЛС ЛАТ GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC ЛЛС ATG GTG TCT GAG ЛЛС ATG СТО ТОТ CCG GGC ЛТС CTC GGG GAG COG CAG GAT GCC TGC GAG GGC GAC ACT GGG GGG CCC ATG GTC GCC ТСС ТТС СЛС GGC ACC TGG ТТС СТО GTG GGC СТО GTG AGC TGG GOT GAG GGC TGT GGG CTC CTT CAC AAC TAt GGC GTT -TAG ACC AAA GTC AGC CGC TAC CTC GAC TGG АТС CAT GGG CAC АТС АСА GAC AAS GAA GCC CCC GAG AAO AGC TOO CCA CCT-l