DE3851613T2 - Co-Expression in eukaryontischen Zellen. - Google Patents

Co-Expression in eukaryontischen Zellen.

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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Herstellung von Proteinen und insbesondere die Herstellung von Proteinen in biologisch aktiver Form und in wirtschaftlich machbaren Mengen.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Rekombinante DNA-Technologie ist verwendet worden, um eine Vielzahl von Proteinen mit therapeutischem oder anderem wirtschaftlichem Wert herzustellen, einschließlich Enzymen, Wachstumsfaktoren und Peptidhormonen. Diese Proteine sind in Bakterien, Pilzzellen und seit kurzen kultivierten Säugetierzellen hergestellt worden. Weil einzellige Organismen viele menschliche Proteine nicht richtig verarbeiten können, ist es oft notwendig gewesen, kultivierte Säugetierzellen zu verwenden, um diese Proteine herzustellen.
  • Säugetierzellen können transfiziert werden, um klonierte DNA mit gut etablierten Laborverfahren zu exprimieren. Nicht alle Säugetierzelltypen werden jedoch transfizierte DNA-Sequenzen effizient exprimieren und Zellen, die sich als effiziente Expressoren einer transfizierten Sequenz erwiesen haben, werden in anderen Fällen nur niedrige Gehalte anderer Genprodukte produzieren. Niedrige Expressionsniveaus für transfizierte Gene können zum Abbau des Proteinproduktes intra- und/oder extrazellulär, zur Produktion einer inaktiven Form (inaktiver Formen) des Proteins oder zur Produktion einer Form (von Formen) des Proteins, die cytotoxisch sind, führen. Niedrige Gehalte an Protein oder Aktivität können auch von einer instabilen mRNA-Sequenz, proteolytischen Aktivierung oder unangemessenen, ineffizienten oder unrichtigen Verarbeitung durch die Wirtszelle herrühren. Verarbeitungsschritte, die für die Aktivität oder Sekretion eines neu synthetisierten Proteins notwendig sein können, schließen spezifische proteolytische Spaltung, Untereinheiten- Polymerisation, Disulfidbindungsbildung, post-translationale oder co-translationale Modifikation bestimmter Aminosäuren und Glycosylierung ein.
  • Diese Probleme bei der Proteinherstellung spiegeln die spezialisierte Natur von Zellen wider, die aus höheren Organismen gewonnen sind. Säugetierzellen, die aus einem bestimmten Gewebe gewonnen sind, können ein Protein, das normalerweise nicht von diesem Gewebe hergestellt wird, nicht richtig produzieren. Zusätzlich werden Säugetierzellinen, die daran angepaßt sind, in Kultur zu wachsen, aus Tumoren gewonnen oder sind in anderer Weise abnorm, was oft zu nichtvorhersagbarer Proteinverarbeitung führt.
  • Zum Beispiel haben eine Anzahl von Forschungsgruppen menschlichen Gerinnungsfaktor IX in kultivierten Säugetierzellen hergestellt (Kaufman et al., J. Biol. Chem. 261 : 9622-9628, 1986; Anson et al., Nature 315 : 683-685, 1985; Hagen et al., EP 200 421; Busby et al., Nature 316 : 271-273, 1985). Trotz Bemühungen, die Produktion von biologisch aktivem Protein durch Verwendung starker Proinotoren, Verstärker, erhöhter Genkopienzahl, etc. zu maximieren, und trotz der relativ hohen beobachteten Gehalte an Faktor IX-mRNA, übersteigen die Gehalte an aktivem Faktor IX, die von diesen transfizierten Zellinien produziert werden, etwa 5 ug/ml Zellkulturmedium nicht. In einigen Fällen werden Vorläuferformen von Faktor IX hergestellt, aber reifes Protein wird ineffektiv aus der Wirtszelle sekretiert.
  • Probleme bei der Proteinherstellung hat man früher dadurch in Angriff genommen, daß mit einer Anzahl verschiedener Zelltypen experimentiert und eine große Anzahl von Isolaten eines (einer) bestimmten transformierten oder transfizierten Stamms oder Zellinie ausgewählt und gescreent wurde. Ein solches Verfahren ist extrem arbeitsintensiv und besitzt keine Erfolgssicherheit. Folglich besteht ein Bedürfnis auf diesem Gebiet nach einem Verfahren zur systematischen und vorhersagbaren Herstellung rekombinanter Zellen, die interessierende Proteine in einer aktiven Form in wirtschaftlich machbaren Mengen exprimieren können. Die vorliegende Erfindung stellt solch ein System zur Verfügung und stellt außerdem andere verwandte Vorteile zur Verfügung.
    • Erfindungsoffenbarung
  • Kurz gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines interessierenden Proteins zur Verfügung, das die Schritte umfaßt (a) Einführen einer ersten DNA-Sequenz, die das interessierende Protein kodiert, und wenigstens einer zusätzlichen DNA-Sequenz in einer eukaryontische Wirtszelle, wobei die zusätzliche DNA-Sequenz ein Protein kodiert, das das interessierende Protein verarbeitet oder stabilisiert; (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die es ermöglichen, daß die erste DNA-Sequenz und die zusätzliche(n) DNA-Sequenz(en) exprimiert werden; und (c) Isolieren des interessierenden Proteins aus der Wirtszelle. Der Schritt des Einführens der DNA-Sequenzen in die Wirtszelle kann durch (a) Co-Transfektion oder Co-Transformation mit mehreren Vektoren, die jeder eine separate Expressionseinheit enthalten; oder (b) Transfektion oder Transformation mit einem einzelnen Vektor der mehrere Expressionseinheiten enthält, erfolgen. Wenn die Wirtszelle eine Säugetier-Wirtszelle ist, kann der Einführungsschritt auch durch Transfektion mit einem einzelnen Vektor erfolgen, der eine einzelne Expressionseinheit enthält, die in eine polycistronische Botschaft transkribiert wird. Wenn Hefe-Wirtszellen eingesetzt werden, umfaßt ein bevorzugtes Verfahren zur Einführung der DNA- Sequenzen (a) Transformation der Hefe-Wirtszelle mit einer einzelnen Expressionseinheit, die die zusätzliche(n) DNA- Sequenz(en) enthält; (b) Isolieren von Wirtszellen, die die Verarbeitungs- oder Stabilisierungsaktivität stabil produzieren; und (c) Transformation der isolierten Wirtszellen mit der ersten DNA-Sequenz, die das interessierende Protein kodiert. Vorzugsweise führt der anfängliche Transformationsschritt zur Integration der einzelnen Expressionseinheit in das Hefe-Wirtszell-Genom.
  • Bevorzugte erste DNA-Sequenzen schließen diejenigen ein, die Plasma-Serinprotease wie etwa t-PA, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Plasminogen kodieren. Bevorzugte zusätzliche DNA-Sequenzen schließen diejenigen ein, die Proteasen, Protease-Inhibitoren, Gamma-Carboxylase und Proteine, die sich an das interessierende Protein binden, kodieren.
  • In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind eukaryontische Wirtszellen offenbart, in die eine DNA-Sequenz, die ein interessierendes Protein kodiert, wie oben beschrieben, und eine oder mehrere zusätzliche DNA-Sequenzen, die ein Protein oder Proteine kodieren, die das interessierende Protein verarbeiten oder stabilisieren, wie oben beschrieben, eingeführt worden sind. Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen schließen Säugetier-Wirtszellen und Hefe-Wirtszellen ein.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids Zem99.
  • Fig. 2 veranschaulicht die Konstruktion des t-PA- Expressionsvektors Zem219.
  • Fig. 3 veranschaulicht die Konstruktion von Zem228.
  • Fig. 4 veranschaulicht das Subklonieren der alpha-1- Antitrypsin-cDNA.
  • Fig. 5 veranschaulicht die Konstruktion von Expressionsvektor Zem235.
  • Fig. 6 veranschaulicht die Nukleotidsequenz einer Plasminogen-cDNA, zusammen mit der kodierten Aminosäuresequenz.
  • Fig. 7 veranschaulicht die Produktion von Plasminogen in transfizierten BHK-Zellen (a) und in transfizierten BHK-Zellen, die alpha-1-Antitrypsin co-exprimieren (b). [Spuren 1 - Medienproben; Spuren 2 - cytoplasmatische Extrakte. Pfeile geben die Position von intaktem Plasminogen (92 kd) an].
  • Fig. 8 veranschaulicht die Konstruktion des Vektors pD5. Verwendete Symbole sind: 0-1, die Adenovirus-5-0-1- Karteneinheitssequenz; E, der SV40-Verstärker; MLP, der Adenovirus-2-major-late-Promotor; L1-3, der Adenovirus-2-tripartite-Leader; 5 t, 51 -Spleißstelle; 3',3'-Spleißstelle; p(A), Polyadenylierungssignal; DHFR, Dihydrofolat-Reduktase-Gen.
  • Fig. 9 veranschaulicht die Konstruktion des Vektors pDX. Symbole werden verwendet, wie für Fig. 8 angegeben.
  • Fig. 10 veranschaulicht die Konstruktion von Expressionsvektoren, die das S. cerevisiae-KEX2-Gen enthalten.
  • Fig. 11 veranschaulicht die Ergebnisse eines Tests auf aktiviertes Protein C auf Medienproben aus transfizierten 293-Zellen.
  • Fig. 12 veranschaulicht die gerinnungshemmende Aktivität von aktiviertem Protein C, das in transfizierten Säugetierzellen hergestellt ist.
  • Fig. 13 zeigt die Ergebnisse einer Radioimmunfällung von Faktor VII, produziert von Zellen, die Faktor IX coexprimieren (Spur 1), und von Faktor VII- transfizierten Kontrollzellen (Spur 2). Der Pfeil gibt die Position von einzelkettigem Faktor VII an.
  • Fig. 14 veranschaulicht die Konstruktion eines Hefe- Expressionsvektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die ein thrombinspaltbares Fusionsprotein kodiert. "MI-3" gibt die Insulin-Vorläufer-DNA-Sequenz an.
  • Fig. 15 veranschaulicht die Nukleotidsequenz eines synthetischen Aprotinin-Gens.
    • Beste Art und Weise zur Ausführung der Erfindung
  • Vor der Darlegung der Erfindung kann es für ein Verständnis derselben hilfreich sein, Definitionen bestimmter Ausdrücke, die hierin im weiteren verwendet werden sollen, anzugeben.
    • Stabilisieren:
  • Der Begriff Stabilisieren wird hierin verwendet, um den Schutz eines Proteins vor Abbau zu bezeichnen. Stabilisierung kann durch eine Anzahl von Mechanismen geschehen, einschließlich Inhibition eines proteolytischen Enzyms, das ansonsten das interessierende Protein abbauen würde, Bindung an das interessierende Protein, um es vor einem proteolytischen Enzym zu schützen, und Bindung an einen Co-Faktor oder ein anderes Molekül, das für die Aktivität einer Protease erforderlich ist, oder Inhibition der Wirkung desselben in anderer Weise.
  • Verarbeiten: Wie hierin verwendet, bedeutet "Verarbeiten" das Modifizieren der Struktur eines Proteins. Das Verarbeiten von Proteinen schließt solche Modifikationen ein wie spezifische proteolytische Spaltung, um ein mehrkettiges Protein herzustellen oder Peptide von Proteinvorläufern zu entfernen; Modifikation von Aminosäuren, einschließlich Carboxylierung oder Hydroxylierung; und Kohlehydrat-Addition an bestimmten Stellen. Verarbeiten kann für volle biologische Aktivität eines Proteins notwendig sein oder kann erforderlich sein, um die Sekretion eines Proteins aus einer Zelle zu ermöglichen.
    • Transfektion und Transformation:
  • Das Verfahren der Einführung klonierter DNA in Wirtszellen. Transfektion betrifft das Einführen von DNA in Säugetier-Zellinien. Das Verfahren zur Einführung von DNA in Pilz- und Bakterienzellen ist als Transformation bekannt. Eine Anzahl von Transfektions- und Transformationsverfahren sind auf diesem Gebiet bekannt.
  • Wie oben angegeben, produzieren Zellen, die klonierte DNA- Sequenzen enthalten, nicht immer Proteine, die durch diese klonierte Sequenzen kodiert werden, in wirtschaftlich machbaren Gehalten oder in biologisch aktiver Form. Dies beruht oft auf der Herkunft der Zelle oder ihrer abnormen Natur. In vielen Fällen ist es nicht möglich, eine(n) kultivierte(n) Zellinie oder Wirtszellstamm mit den notwendigen Eigenschaften zu erhalten, um sie (ihn) in die Lage zu versetzen, ein bestimmtes Protein auf dem gewünschten Niveau zu produzieren. In jedem Fall könnte das Screening einer großen Anzahl potentieller Wirtszellinien nicht machbar sein und besitzt keine Erfolgssicherheit.
  • Die vorliegende Erfindung überwindet die Nachteile verfügbarer Zellen, indem sie ein Verfahren zur Einführung eines Gens oder einer cDNA das (die) ein interessierendes Protein kodiert, zusammen mit einer oder mehreren zusätzlichen DNA-Sequenzen, die ein Protein oder Proteine kodieren, die das interessierende Protein verarbeiten und stabilisieren, in eine eukaryontische Wirtszelle zur Verfügung stellen. Verarbeitungsproteine schließen Proteasen ein, die ein Vorläuferprotein an einer bestimmten Stelle spalten, um die reife und/oder aktive Form des Proteins bereitzustellen, z. B. Peptidasen, die Signalpeptide oder Propeptide entfernen oder die ein einzelkettiges Polypeptid zu einer mehrkettigen Form spalten. Andere Beispiele für Verarbeitungsproteine sind diejenigen, die Aminosäuren modifizieren, wie etwa Gamma- Carboxylase, ein Enzym, das spezifische Glutaminsäurereste bestimmter Gerinnungsfaktoren und anderer calciumbindender Proteine modifiziert. Andere Verarbeitungsproteine schließen Enzyme, die für die Umwandlung von Asparaginsäure in β- Hydroxyasparaginsäure verantwortlich sind, eine Modifikation, die für die Aktivität von Protein C notwendig ist; diejenigen, die für die Addition von Kohlehydratketten ein Glykoproteine verantwortlich sind; und diejenigen, die für Myristoylierung, C-terminale Aminosäureentfernung, Hydroxylierung von Prolinresten, Sulfatierung und C-terminale Amidierung verantwortlich sind, ein. Stabilisierungsproteine schließen Protease-Inhibitoren, die den proteolytischen Abbau des interessierenden Proteins blockieren; Proteine, die sich an das interessierende Protein binden, wodurch es als ein Substrat nicht-verfügbar gemacht wird; Proteine, die sich an Co-Faktoren, Ionen oder andere Moleküle, die von einer Protease gebraucht werden, binden; und Proteine, die Co- Faktoren inaktivieren, ein. Man wird anerkennen, daß eine bestimmte eurkaryontische Wirtzelle so transfiziert oder transformiert werden kann, daß sie mehrere Verarbeitungsproteine, mehrere Stabilisierungsproteine oder eine Kombination von Stabilisierungs- und Verarbeitungsproteinen produzieren kann.
  • Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der unerwarteten Entdeckung, daß eine Vielzahl von Verarbeitungsproteinen außerhalb ihrer nativen Umgebungen funktionieren werden. Zum Beispiel ist hierin offenbart, daß Faktor IX, ein Enzym, das normalerweise im Blut funktioniert, Faktor VII intrazellulär aktivieren kann. Zusätzlich ist festgestellt worden, daß das Produkt des Hefe-KEX2-Gens normaler in Säugetierzellen funktioniert. Die beobachtete Verarbeitung zeigt, daß sowohl das interessierende Protein als auch das Verarbeitungsprotein unerwarteterweise auf dasselbe Zellkompartiment ausgerichtet sind. Die beobachtete Funktion dieser Verarbeitungsproteine ist auch in Anbetracht der Tatsache überraschend, daß die interessierenden Proteine in großen Mengen oder in einer intakten oder aktiven Form in einer rekombinanten Zelle nicht produziert werden können.
  • Durch Charakterisieren eines natürlich auftretenden interessierenden Proteins und, soweit erforderlich, des Gens oder der cDNA, das (die) es kodiert, kann man die Natur der Verarbeitungsschritte ableiten, die bei seiner Biosynthese betroffen sind. Die Charakterisierung der rekombinanten Form des Proteins wird enthüllen, ob es richtig verarbeitet worden ist oder nicht und, wenn nicht, welche Verarbeitungsschritte ausgelassen wurden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ward richtige Verarbeitung durch Bereitstellung der fehlenden Aktivität oder Erhöhung einer begrenzenden Aktivität bereitgestellt werden. Diese Aktivität kann als das Protein bereitgestellt werden, das normalerweise das interessierende Protein verarbeitet, oder als ein verwandtes Protein das normalerweise eine ähnliche Funktion in einem anderen Zusammenhang erfüllt, wie etwa ein Protein aus einem anderen Zelltyp. Ein Beispiel für den letzteren Fall ist die Verwendung des Hefe-KEX2-Gens, um das Verarbeitungsprotein bereitzustellen, das Protein C oder einen Vorläufer von aktiviertem Protein C zur zweikettigen Form spaltet. Blockierungen in der Sekretion eines interessierenden Proteins können durch Charakterisierung der intrazellulären und sekretierten Formen des rekombinanten Proteins bestimmt werden. Auf diese Weise wird der fehlende oder begrenzende Verarbeitungsschritt bestimmt.
  • In einigen Fällen wird man die Identität des Proteins, das die fehlende Aktivität bereitstellt, kennen. In diesem Fall wird das gewünschte Gen oder die gewünschte cDNA kloniert und in die ausgewählte Wirtszelle eingeführt.
  • Wenn das Protein, das für die fehlende Aktivität verantwortlich ist, nicht bekannt ist, wird das interessierende Protein analysiert, die Natur des fehlenden Verarbeitungsschrittes wird bestimmt und ein Protein wird ausgewählt, von dem bekannt ist, daß es diese Funktion erfüllt. Ein geeignetes Protein kann aus bekannten und verfügbaren DNA-Sequenzen ausgewählt werden, die Proteine mit ähnlicher Aktivität kodieren. Viele solcher Verarbeitungsproteine sind charakterisiert worden. Zum Beispiel haben Kettner und Shaw (Neth. in Enzymology 80 : 826- 842, 1981) die Spezifitäten einer Anzahl von Proteasen charakterisiert. Alternativ kann eine DNA-Sequenz, die das benötigte Verarbeitungsprotein kodiert, durch Transfektion von Zellen mit einer Säugetier-Expressionsbibliothek und Selektionieren derjenigen, die die benötigte Aktivität zeigen, identifiziert werden.
  • Wo Proteinstabilisierung erwünscht ist, werden Zellen, die transfiziert oder transformiert sind, um das interessierende Protein zu produzieren, in der Gegenwart verschiedener Stabilisierungsproteine gezüchtet und auf Produktion des intakten interessierenden Proteins untersucht. Im allgemeinen werden die Zellen mit einem Radioisotop markiert werden und Proteine werden durch Radioimmunfällung und Gelelektrophorese oder durch andere herkömmliche Techniken analysiert-werden. Das Vorhandensein des intakten interessierenden Proteins in Kulturmedium zeigt, daß das Stabilisierungsprotein das interessierende Protein vor Abbau schützt. Stabilisierung kann auch zu Phänotyp-Änderungen in der Wirtszelle führen. Zum Beispiel kann Protease-Aktivität Zellablösung bewirken, was durch Hemmen dieser Aktivität korrigiert werden kann. Die Korrektion wird durch das Vorhandensein des normalen (adhärenten) Phänotyps angezeigt.
  • Wenn das gewünschte Verarbeitungs- oder Stabilisierungsprotein identifiziert worden ist, werden die DNA-Sequenz, die es kodiert, und die DNA-Sequenz, die das interessierende Protein kodiert, in ausgewählte Wirtszellen eingeführt, wie unten beschrieben. Zellen, die die eingeführten Sequenzen exprimieren, werden selektioniert und auf Produktion des interessierenden Proteins in der gewünschten Form oder auf dem gewünschte Niveau gescreent. Zellen, die diese Kriterien erfüllen, werden dann kloniert und in den Produktionsmaßstab überführt.
  • Interessierende Proteine, die unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, schließen eine Vielzahl von Plasma-Serinproteasen ein, wie etwa Gerinnungsfaktoren VII, IX und X, aktivierten Faktor VII (bezeichnet als Faktor VIIa), aktivierten Faktor X (Faktor Xa), Protein C, aktiviertes Protein C, Protein S, Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), Plasminogen und Analoga und Derivate dieser Proteine, obgleich praktisch jedes interessierende Protein hergestellt werden könnte. Die Verfahren sind besonders geeignet für die Herstellung dieser Serinproteasen aufgrund der post-translationalen Verarbeitung, die für ihre Aktivität und/oder Sekretion durch die Wirtszelle notwendig ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können Gerinnungsfaktoren, die Gamma-Carboxylierung spezifischer Glutaminsäurereste für ihre biologische Aktivität erfordern, auf hohen Niveaus von Zellen sekretiert werden, in die eine DNA-Sequenz eingeführt worden ist, die Gamma-Carboxylase kodiert. Von den Erfindern ist festgestellt worden, daß der Gamma-Carboxylierungsschritt in Säugetier-Zellinien die üblicherweise für die Herstellung rekombinanter Gerinnungsfaktoren verwendet werden, begrenzend ist. Außerdem kann die Erfindung die Herstellung von biologisch aktiven gamma-carboxylierten Proteinen in Nicht- Säugetierwirtszellen, wie etwa Hefezellen, ermöglichen.
  • Gerinnungsfaktor VII kann in aktivierter Form hergestellt werden, indem Zellen mit DNA-Sequenzen transfiziert werden, die Faktor VII und Faktor IX kodieren. Die Vorläuferform von Faktor VII wird durch den Faktor IX aktiviert und Faktor VIIa wird von den Zellen sekretiert. Alternativ kann ein Protein mit der biologischen Aktivität von Faktor VIIa durch Co- Expression einer DNA-Sequenz, die ein Derivat oder Analog von Faktor VII kodiert, und einer DNA-Sequenz, die Faktor IX kodiert, hergestellt werden. DNA-Sequenzen, die Derivate und Analoga von Faktor VII kodieren, sind beschrieben in den anhängigen U.S.-Patentanmeldungen Serial Nos. 724,311 und 810,002, sowie in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung EP 200,421, die hierin durch Bezugnahme mit einbezogen sind. Da gezeigt worden ist, daß die aktivierte Form von Faktor VII therapeutischen Wert besitzt, wäre es wünschenswert, die aktivierte Form direkt herzustellen. Direkte Herstellung würde die Ausbeuten erhöhen, die Anzahl von Produktionsschritten verringern und Probleme eliminieren, die mit der Aktivierung von Blutprodukten zusammenhängen.
  • In einer anderen Ausführungsform wird eine DNA-Sequenz, die Protein C, aktiviertes Protein C oder einen modifizierten Vorläufer von Protein C oder aktiviertem Protein C kodiert, in eine Zellinie inseriert, die so transfiziert worden ist, daß sie das Hefe-KEX2-Gen exprimiert. Dieses Gen kodiert eine Endopeptidase, die nach einer zweibasigen Aminosäuresequenz spaltet (Fuller et al., in Leive, Hrg., Microbiology: 1986, 273-278, 1986). Die Verarbeitung kann weiter erhöht werden, indem Zellen auch mit dem Hefe-KEX1-Gen transfiziert werden (Dmochowska et al., Cell 50 : 573-584, 1987), das ein Enzym kodiert, das die basischen Aminosäuren vom C-Terminus der leichten Kette von Protein C entfernt. Modifizierte Protein C- Vorläufer sind beschrieben in den anhängigen, gemeinsam übertragenen U.S. Serial Nos. 924,462 und 130,370 und der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung EP 266,190, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit einbezogen sind. Bevorzugte Vorläufer von Protein C und aktiviertem Protein C schließen die Aminosäuresequenz R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4;-X-R&sub5;- R&sub6;-R&sub7;-R&sub8; ein, worin R&sub1;-R&sub8; Lys oder Arg sind und X eine Peptidbindung oder ein Abstandspeptid mit von eins bis zwölf, vorzugsweise von zwei bis acht Aminosäuren ist, an der Spaltungsstelle zwischen der leichten und der schweren Kette.
  • Aktiviertes Protein C kann auch in einer Zellinie hergestellt werden, die mit DNA-Sequenzen transfiziert worden ist, die einen Vorläufer für aktivertes Protein C, Thrombin und Thrombomodulin kodieren. Das Thrombin spaltet den Vorläufer des aktivierten Proteins C (zweikettige Form von Protein C) in der Gegenwart von Thrombomodulin und aktiviertes Protein C wird von den Zellen sekretiert. Vorläufer für aktiviertes Protein C sind beschrieben in den U.S.-Patentanmeldungen Serial Nos. 924,462 und 130,370 und in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung EP 266,190, die hierin durch Bezugnahme mit einbezogen sind.
  • Faktor VIIa und Faktor IXa können in einer Zellinie hergestellt werden, die so transfiziert ist, daß sie Faktor X co-exprimiert. Der Faktor X spaltet den Faktor VII oder Faktor IX, was zur Sekretion des aktivierten Gerinnungsfaktors führt.
  • In noch einer anderen Ausführungsform wird die Produktion von t-PA oder einem t-PA-Analog oder -Derivat erhöht, indem eine Wirtszellinie so transfiziert wird, daß sie sowohl t-PA oder ein t-PA-Analog oder -Derivat und einen Protease-Inhibitor produziert. Geeignete Protease-Inhibitoren in dieser Hinsicht schließen TIMP (Gewebeinhibitor von Metalloproteasen), Trypsin-Inhibitoren und Aprotinin ein, wobei Aprotinin besonders bevorzugt ist. Analoga und Derivate von t-PA sind beschrieben in den anhängigen U.S. Serial Nos. 822,005 (die der veröffentlichten Japanischen Patentanmeldung 63, 133,988 entspricht); 004,995; 053,412; 053,411; 058,061; 058,217; und 125,629 und in den europäischen Patentanmeldungen Veröffentlichungsnummern 196,920; 201,153 und 240,334, die hierin durch Bezugnahme mit einbezogen sind. Expression von t- PA auf wirtschaftlich machbaren Niveaus ist schwierig gewesen, weil die Serinprotease-Aktivität von t-PA zur Ablösung von Zellen von Trägeroberflächen führt. Dies erfordert die Verwendung von Mitteln, wie etwa Aprotinin, in den Wachstumsmedien. Die Verwendung von Aprotinin in den Medien ermöglicht auch die Herstellung der einzelkettigen Form von t- PA, einem wünschenswerten therapeutischen Produkt. Aprotinin ist jedoch sowohl kostspielig als auch in der Verfügbarkeit beschränkt.
  • Plasminogen kann in intakter Form unter Verwendung von Zellen hergestellt werden, die so transfiziert sind, daß sie sowohl Plasminogen als auch einen Protease-Inhibitor produzieren. Varianten von Plasminogen (wie beschrieben in U.S.- Patentanmeldung Serial No. 053,412) können ebenfalls hergestellt werden. Ein besonders bevorzugter Protease- Inhibitor in dieser Hinsicht ist alpha-1-Antitrypsin, obgleich Varianten von alpha-1-Antitrypsin (U.S.-Patent No. 4,711,848) und andere Proteasen-Inhibitoren ebenfalls eingesetzt werden können. Intrazelluläre Plasminogen-Aktivierung und anschließender Abbau haben die Fähigkeit begrenzt, rekombinantes Plasminogen in vernünftigen Gehalten herzustellen. Inhibition von Plasminogen-Aktivität durch AAT würde dieses Problem verbessern.
  • Andere Beispiele für Protein-Stabilisator-Kombinationen schließen Stabilisation von Protein C durch Co-Expression von Protein S, Stabilisierung von Faktor VIII durch Co-Expression von von-Willebrund-Faktor und Stabilisierung von Faktor VIII durch Co-Expression von Gewebefaktor ein. BiP (Haas und Wabl, Nature 306 : 387-389, 1983) kann ebenfalls verwendet werden, um verschiedene Proteine zu stabilisieren. Eine cDNA, die BiP kodiert, ist von Munro und Pelham beschrieben (Cell 46 : 291- 300, 1986).
  • DNA-Sequenzen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch Standardverfahren, die auf diesem Gebiet bekannt sind, kloniert werden. Genom- oder cDNA-Sequenzen können verwendet werden. Viele solcher Klone sind in der Literatur beschrieben worden, einschließlich DNAs, die t-PA (Pennica et al., Nature 301 : 214-221, 1983), Faktor VII (Hagen et al., aaO; Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2412-2416, 1986), Faktor IX (Kurachi und Davie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 6461-6464, 1982), Plasminogen (Malinowski et al., Biochemistry 23 : 4243-4250, 1984; Forsgren et al., FEBS Lett. 213 : 254, 1987), alpha-1-Antitrypsin (Long et al., Biochemistry 23 : 4828-4837, 1984; Kawasaki, U.S.-Patent No. 4,559,311), Protein C (Foster und Davie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 4766-4770, 1984; Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 4673-4677, 1985), Prothrombin (Friezner-Degan et al., Biochemistry 22 : 2087-2097, 1983), Faktor VIII (Toole et al., Nature 312 : 342-347, 1984), von-Willebrand-Faktor (Lynch et al., Cell 41 : 4956, 1985; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 4393-4397, 1987), Gewebefaktor (Spicer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 5148-5152, 1987) und Faktor X (Leytus et al., Biochemistry 25 : 5098-5102, 1986) kodieren. Zusätzliche Klone können durch Screening von Cosmid-, Genom- oder cDNA-Bibliotheken mit Oligonukleotidsonden, die auf der Basis von Aminosäuresequenz-Daten konstruiert sind, oder mit klonierten DNA-Fragmenten; oder durch die Verwendung von Expressionsbibliotheken, die mit Antikörpern gegen das interessierende Protein (Young und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 1194-1198, 1983), durch Ligunden-Blotting (Sikela und Hahn, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 3038-3042, 1987) oder durch Aktivitätstests gescreent werden, erhalten werden.
  • Die klonierten DNA-Sequenzen werden in geeignete Expressionsvektoren inseriert, die ihrerseits verwendet werden, um geeignete eukaryontische Wirtszellen zu transfizieren oder zu transformieren.
  • Expressionsvektoren zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung in Säugetierzellen werden einen Promotor umfassen, der in der Lage ist, die Transkription eines klonierten Gens oder einer klonierten cDNA, das (die) in eine Säugetierzelle eingeführt ist, zu steuern. Virale Proinotoren sind wegen ihrer Effizienz in der Steuerung der Transkription bevorzugt. Ein besonders bevorzugter Promotor ist der major-late-Promotor aus Adenovirus 2. Andere geeignete Promotoren schließen den SV40-Promotor (Subramani et al., Mol.
  • Cell Biol. 1 : 854-864, 1981) und den MT-1(Metallothionein-Gen)- Promotor (Palmiter et al., Science 222 : 809-814, 1983) ein. Solche Expressionsvektoren können auch einen Satz von RNA- Spleißstellen enthalten, die flußabwärts vom Promotor und flußaufwärts von der Insertionsstelle für die klonierte DNA- Sequenz oder innerhalb der klonierten Sequenz selbst angeordnet sind. Bevorzugte RNA-Spleißstellen können aus Adenovirus- und/oder Immunglobulin-Genen erhalten werden. Ebenfalls enthalten in den Expressionsvektoren ist ein Polyadenylierungssignal, das flußabwärts der Insertionsstelle angeordnet ist. Besonders bevorzugt sind virale Polyadenylierungssignale, wie etwa die early- oder late- Polyadenylierungssignale aus SV40 oder das Polyadenylierungssignal aus der Adenovirus-5-Elb-Region. Expressionsvektoren, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können auch eine nicht-kodierende virale Leadersequenz umfassen, wie etwa den Adenovirus-2- tripartite-Leader, der zwischen dem Promotor und den RNA- Spleißstellen angeordnet ist. Bevorzugte Vektoren können auch Transkriptionsverstärkersequenzen, wie etwa den SV40- Verstärker, und Translationsverstärkersequenzen, wie etwa die Sequenzen, die die Adenovirus-VA-RNAs kodieren, einschließen.
  • Vektoren, die klonierte DNA-Sequenzen enthalten, können in kultivierte Säugetierzellen durch z. B. Calciumphosphatmediätisierte Transfektion (Wigler et al., Cell 14 : 725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7 : 603, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52 : 456, 1973) oder Elektroporation (Neumann, EMBO J. 1 : 841-845, 1982) eingeführt werden. Eine kleine Fraktion der Zellen integriert die DNA in das Genom oder hält die DNA in nicht-chromosomalen Kernstrukturen. Um diese Integranten zu identifizieren, wird ein Gen, das einen selektionierbaren Phänotyp verleiht (ein selektionierbarer Marker), im allgemeinen zusammen mit dem interessierenden Gen in die: Zellen eingeführt. Bevorzugte selektionierbare Marker schließen Gene ein, die Resistenz gegen Arzneimittel verleihen, wie etwa Neomycin, Hygromycin und Methotrexat. Wenn Calciumphosphat-mediatisierte Transfektion eingesetzt wird, können selektionierbare Marker in die Zelle auf einem separaten Plasmid zur gleichen Zeit wie das interessierende Gen eingeführt werden oder sie können auf demselben Plasmid eingeführt werden. Wenn auf demselben Plasmid, können der selektionierbare Marker und das interessierende Gen unter der Kontrolle verschiedener Promotoren oder desselben Promotors stehen, wobei die letztere Anordnung das erzeugt, was als eine dicistronische oder polycistronische Botschaft bekannt ist. Konstrukte diesen Typs sind auf diesem Gebiet bekannt (z. B. Europäische Patentveröffentlichung Nr. 117,058; U.S.-Patent 4,713,339). Nachdem die Zellen die DNA aufgenommen haben, läßt man sie für einen bestimmten Zeitraum wachsen, typischerweise 1-2 Tage, um die Expression des interessierenden Gens zu beginnen. Arzneimittelselektion wild dann angewendet, um auf das Wachstum von Zellen zu selektionieren, die den selektionierbaren Marker exprimieren. Wenn Methotrexat- Selektion verwendet wird, ermöglicht die schrittweise Erhöhung der Arzneimittelkonzentration die Selektion auf erhöhte Kopienzahl der klonierten Sequenzen, was zu erhöhten Expressionsniveaus führt. Klone solcher Zellen können auf die Produktion des interessierenden Proteins gescreent werden. Nützliches Screeningverfahren schließen immunologische Tests und Aktivitäts-Test ein.
  • Bevorzugte Säugetier-Zellinien zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung schließen die COS(ATCC CRL 1650)-, BHK(ATCC CCL 10)- und 293(ATCC 1573)-Zellinien sowie Derivate und Isolate dieser Zellinien ein, obgleich andere Zellinien zur Produktion bestimmter Proteine bevorzugt sein können. Eine bevorzugte BHK-Zellinie ist die tk&supmin;ts13-BHK-Zellinie (Waechter und Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 1106-1110, 1982), hierin: im weiteren als tk&supmin;BHK-Zellen bezeichnet.
  • Andere nützliche adhärente Zellinien schließen Ratten-Hep I- Zellen (ATCC CRL 1600), Ratten-Hep II-Zellen (ATCC CRL 1548), TCMK-Zellen (ATCC CCL 139), menschliche Lungenzellen (ATCC CCL 75.1), menschliche Hepatomzellen (ATCC HTB-52), Hep G2-Zellen (ATCC HB 8065), Mäuse-Leberzellen (ATCC CC 29.1) und DUKX- Zellen (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 4216- 4220, 1980) ein. Nützliche Suspensions-Zellinien schließen AtT-20 (ATCC CCL 89), MOLT-4 (ATCC CRL 1582), BW5147.G.1.4.OUA®.1 (ATCC CRL 1588), S194/5.XXO.BU.1 (ATCC TIB 20), EL4.BU.1.OUAr.1.1 (ATCC TIB 41), Sp 2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581), J558L (Oi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 825- 829, 1983) und Raji (ATCC CCL 86) ein.
  • Im allgemeinen wird eine Wirtszellinie auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, das interessierende Protein auf einem hohen Niveau zu produzieren, oder ihrer Fähigkeit, wenigstens einige der Verarbeitungsschritte ausführen, die für die biologische Aktivität des Proteins notwendig sind, ausgewählt. Auf diese Weise kann die Anzahl klonierter DNA-Sequenzen, die in die Wirtszellinie transfiziert werden müssen, minimiert werden und die Gesamtausbeute an biologisch aktivem Protein kann maximiert werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es einem jedoch, praktisch jedes Protein in praktisch jeder Zellinie, die in vitro kultiviert werden kann, zu produzieren.
  • DNA-Sequenzen, die das interessierende Protein und das (die) Verarbeitungs- und/oder Stabilisierungsprotein (e) kodieren, können in die Zelle auf demselben Vektor oder auf verschiedenen Vektoren eingeführt werden. Es ist bevorzugt, einen einzelnen Vektor mit einem selektionierbaren Marker zu verwenden, um Probleme zu minimieren, die aus Markerinstabilität resultieren können. Gene oder cDKAs auf einem Vektor können durch separate Promotoren oder durch einen einzelnen Promotor kontrolliert werden. Bei der letzteren Anordnung, die zu einer polycistronischen Botschaft führt, werden die Gene oder cDNAs durch Translations-Stop- und -Start-Signale getrennt. Wenn mit einer großen Anzahl von DNA-Sequenzen transfiziert wird, können praktische Beschränkungen der Vektorgröße die Verwendung von zwei oder mehr Vektoren erfordern, jeder mit seinem eigenen selektionierbaren Marker. Zwei oder mehr Vektoren können natürlich verwendet werden, wann immer Co-Expression eines interessierenden Proteins und eines Stabilisierungs- oder Verarbeitungsproteins gewünscht ist.
  • Andere eukaryontische Zellen, einschließlich Hefe und Fadenpilze, können auch bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese niederen eurkaryontischen Wirte stellen bestimmte Vorteile gegenüber Säugetier-Zellinien bereit, einschließlich Einfachheit und Wirtschaftlichkeit der Kultivation und Vorhandensein industrieller Fermentationskapazität. Durch Manipulieren von Zellen, wie hierin beschrieben, können Pilzzellen und andere eukaryontische Zellen, die in der Lage sind, klonierte DNA-Sequenzen zu exprimieren, verwendet werden, um praktisch jedes interessierende Protein zu produzieren.
  • Zum Beispiel können Zellen von Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) mit klonierten fremden DNA-Sequenzen transformiert und zu hoher Zelldichte kultiviert werden und werden die klonierte DNA exprimieren und die fremden Proteine sekretieren. In einigen Fällen werden die fremden Proteine jedoch nicht sekretiert oder sind aufgrund des Fehlens einer richtigen Verarbeitung oder proteolytischen Abbaus inaktiv. Hefezellen können zum Beispiel Proteine nicht gammacarboxylieren oder komplexe Kohlehydratketten vom Säugetiertyp an Glycoproteine anfügen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann dieses Fehlen der Verarbeitung durch Transformieren von Hefe-Wirtszellen mit DNA-Sequenzen, die das (die) fehlende(n) Protein(e) (z. B. Gamma-Carboxylase, Glycosylierungsenzyme) kodieren, überwunden werden. Abbau von fremden Proteinen kann überwunden werden, indem die Zellen so transformiert werden, daß sie Protease-Inhibitoren oder Proteine, die sich an das interessierende Protein binden, produzieren. Ein Beispiel eines geeigneten Bindungsproteins ist BiP. Bindungsproteine können auch die Sekretion eines fremden Proteins durch Verändern seiner Konformation erhöhen. Zusätzlich können Hefezellen so transformiert werden, daß sie fremde Proteasen produzieren, was sie in die Lage versetzt, aktive Formen von fremden Proteinen zu produzieren und zu sekretieren (z. B. Säugetier-Serinproteasen), die spezifische Spaltung für die Sekretion und/oder biologische Aktivität benötigen. Verknüpfungspunkte zwischen sekretorischen Peptiden und reifen Proteinen können künstlich erzeugt werden, so daß Spaltung durch eine co-exprimierte Protease (z. B. Thrombin) das reife Protein freisetzt.
  • Eukaryontische Mikroorganismen, wie etwa die Hefe Saccaromyces cerevisiae, oder Fadenpilze, einschließlich Aspergillus- Spezies, können gemäß bekannten Verfahren transformiert werden. Aspergillus-Spezies können zum Beispiel gemäß dem Verfahren von Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 1740-1747, 1984) transformiert werden. Besonders bevorzugte Spezies von Aspergillus schließen A. nidulans, A. niger, A. oryzae und A. terreus ein. Techniken zur Transformation von Hefe sind z. B. von Beggs (Nature 275 : 104-108, 1978) beschrieben. Expressionsvektoren zur Verwendung in Hefe schließen YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 1035-1039, 1979), YEp13 (Broach et al. , Gene 8 : 121-133, 1979), pJDB248 und pJDB219 (Beggs, aao) und Derivate derselben ein. Solche Vektoren werden in allgemeinen einen selektionierbaren Marker umfassen, wie etwa den Nährstoffmarker TRP1, der Selektion in einen Wirtsstamm ermöglicht, der eine trp1-Mutation trägt, oder dem selektionierbaren POT1-Marker, der Selektion in einem tpi&supmin;- Stamm ermöglicht, der in reichem Medium gezüchtet wird (Kawasaki und Bell, EP 171,142). Bevorzugte Promotoren zur Verwendung in Hefe-Expressionsvektoren schließen Promotoren aus Hefe-Glycolyse-Genen (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 : 12073-12080, 1980; Alber und Kawasaki, J. Mol, Appl. Genet. 1 : 419-434, 1982; Kawasaki, U.S.-Patent No. 4,599,311) oder Alkohol-Dehydrogenase-Genen (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., Hrg., S. 335, Plenum, New York, 1982; und Ammerer, Meth. in Enzymology 101 : 192-201, 1983) ein. Um die Sekretion eines interessierenden Proteins, das in einem Hefe-Transformanten produziert worden ist, zu erleichtern und richtige Verarbeitung zu erreichen, wird im allgemeinen eine Signalsequenz vorgesehen sein. Vorzugsweise wird die Signalsequenz aus einem Hefe-Gen erhalten, das ein sekretiertes Protein kodiert. Eine besonders bevorzugte Signalsequenz ist die Präpro-Region des MFal-Gens (Kurjan und Herskowitz, Cell 30 : 933-943, 1982; Kurjan et al., U.S.-Patent 4,546,082 und Singh, EP 123,544).
  • Co-Expression von DNA-Sequenzen in Hefe kann auf mehrere Arten erreicht werden. Es ist bevorzugt, daß die Expressionseinheit für das Verarbeitungs- oder Stabilisierungsprotein in der Wirtszell-Genom integriert und ein Isolat, das die Verarbeitungs- oder Stabilisierungsaktivität stabil produziert, ausgewählt wird. Ein Expressionsvektor, der die DNA-Sequenzen für das interessierende Protein enthält, wird dann in den Wirtsstamm transformiert. Alternativ können die zwei Expressionseinheiten auf verschiedenen autonom replizierenden Expressionsvektoren mit verschiedenen selektionierbaren Markern oder auf einem einzelnen Expressionsvektor liegen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine DNA-Sequenz, die ein fremdes Verarbeitungsprotein kodiert, in eine DNA- Sequenz inseriert, die ein Hefeprotein mit einer ähnlichen Funktion kodiert. Die Insertion wird so geplant, daß Hefesequenzen, die die Verarbeitungsfunktion(en) des Hefeproteins kodieren, durch die fremde Sequenz ersetzt werden. Ein besonders bevorzugtes derartiges Hefeprotein ist das KEX2-Genprodukt. Dieses Protein ist analysiert worden und seine katalytischen und anderen Domänen sind charakterisiert worden (Fuller et al., Yeast Cell Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1987, S. 181). Die resultierende hybride Sequenz, die die fremde DNA-Sequenz und Hefesequenzen, die Transport- und Zellokalisierungs-Domänen kodieren, umfaßt, wird dann mit einem Hefe-Promotor und -Terminator verknüpft. Vorzugsweise ist der Promotor ein starker Promotor, wie etwa der TPII-Promotor. Dieses Konstrukt kann auch flankierende Sequenzen enthalten, um die Expressionseinheit zu einer bestimmten Integrationsstelle im Wirtszell-Genom zu lenken.
  • Proteine, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, können aus zellkonditionierten Medien durch eine Vielzahl von auf diesem Gebiet bekannten Verfahren gereinigt werden, die entsprechend den physikochemischen Eigenschaften des bestimmten Proteins ausgewählt werden können. Geeignete Verfahren schließen Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Kombinationen dieser Verfahren ein.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Proteine können in Zusammensetzungen für pharmazeutische, industrielle, Forschungs- und andere Zwecke eingesetzt werden. Für den pharmazeutischen Einsatz werden die Proteine im allgemeinen mit einem physiologisch annehmbaren Trägermittel oder Verdünnungsmittel, wie etwa sterilem Wasser oder steriler Kochsalzlösung, kombiniert und in Einzeldosen in sterilen Ampullen abgepackt werden. Alternativ können die Proteine in lyophilisierter Form abgepackt vor der Anwendung rekonstituiert werden. Die Verabreichung wird im allgemeinen durch Injektion oder Infusion erfolgen. Pharmazeutische Zusammensetzungen können außerdem zusätzliche Proteine oder andere Verbindungen von therapeutischem Wert, Adjuvantien, Lokalanästhetika, etc. enthalten.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angeboten.
    • BEISPIELE
  • Ausgenommen, wo dies angegeben ist, wurden herkömmliche molekularbiologische Techniken eingesetzt. Restriktionsendonukleasen und andere Modifikationsenzyme (z. B. T4- Polynukleotid-Kinase, alkalische Phosphatase vom Kalb, DNA- Polymerase 1, Klenow-Fragment, T4-Polynukleotid-Ligase) wurden erhalten von Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs oder Boehringer-Mannheim und verwendet gemäß den Vorschriften der Lieferanten oder wie beschrieben bei Maniatis et al., Hrg., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982. Oligonukleotide wurden auf einem DNA-Synthesizer Applied Biosystems Model 380A synthetisiert und mit Polyacrylamid- Gelelektrophorese auf denaturierenden Gelen gereinigt.
    • Beispiel 1 Herstellung von Gewebeplasminogenaktivator
  • Gewebeplasminogenaktivator (t-PA)-cDNAs sind in der Literatur beschrieben worden. Siehe z. B. Pennica et al. (aaO), Kaufman et al. (Mol. Cell. Biol. 5 : 1750-1759, 1985) und Verheijen et al. (ENBO J. 5 : 3525-3530, 1986). Ein cDNA-Klon, der die Kodierungssequenz für reifen t-PA umfaßt, wurde im Labor der Erfinder unter Verwendung von mRNA aus der Bowes-Melanom- Zellinie (Rijken und Collen, J. Biol. Chem. 256 : 7035-7041, 1981) als Ausgangsmaterial konstruiert. Diese cDNA wurde dann verwendet, um das Plasmid pDR1296 zu konstruieren. E. coli- Stamm JM83, transformiert mit pDR1296, ist bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer 53347 hinterlegt worden.
  • Die cDNA in pDR1296 wurde so verlängert, daß sie die Kodierungssequenz für das Präpro-Peptid von t-PA einschloß, indem sie mit einem Fragment verknüpft wurde, das aus synthetisierten Oligonukleotiden konstruiert worden war. Das synthetisierte Präpro-Fragment wurde in mit Bam HI verdautes pUC8 inseriert. Plasmid pIC19R (Marsh et al., Gene 32 : 481-486, 1984) wurde mit Sma I und Hind III verdaut. Die ori-Region von SV40 von Kartenposition 270 (Pvu II) bis Position 5171 (Hind III) wurde dann an linearisiertes pIC19R ligiert, um Plasmid Zem67 herzustellen. Dieses Plasmid wurde dann mit Bgl II gespalten und die Terminatorregion aus dem Gen für das menschliche Wachstumshormon (De Noto et al., Nuc. Acids Res. 9 : 3719-3730, 1981) wurde als ein Bgl II-Bam HI-Fragment inseriert, um Plasmid Zem86 herzustellen (Fig. 1). Die synthetisierte t-PA-Präpro-Sequenz wurde aus dem pUC8-Vektor durch Verdauung mit Bam HI und Xho II entfernt. Dieses Fragment wurde in mit Bgl II verdautes Zem86 inseriert, um Plasmid Zem88 herzustellen. Plasmid pDR1296 wurde mit Bgl II und Bam HI verdaut und das t-PA-cDNA-Fragment wurde isoliert und in mit Bgl II und Bam HI verdaut und das t-PA-cDNA- Fragment wurde isoliert und in mit Bgl II geschnittenes Zem88 inseriert. Das resultierende Plasmid wurde mit Zem94 bezeichnet.
  • Der Vektor Zem99, der den MT-1-Promotor, die vollständige t- PA-Kodierungssequenz und den Terminator aus menschlichem Wachstumshormon (hGH) umfaßt, wurde dann zusammengebaut, wie in Fig. 1 dargestellt. Ein Kpn I-Bam HI-Fragment, das den MT- 1-Promotor umfaßte, wurde aus MThGHIII (Palmiter et al., Science 222 : 809-814, 1983) isoliert und in pUC18 inseriert, um Zem93 zu konstruieren. Plasmid EV142, das MT-1- und hGH- Sequenzen im pBR322-Derivat pBX322 (Palmiter et al., aaO) umfaßt, wurde mit Eco RI verdaut und das Fragment, das die MT- 1-Promotor- und hGH-Terminator-Sequenzen umfaßte, wurde isoliert. Dieses Fragment wurde in mit Eco RI verdauten pUC13 kloniert, um Plasmid Zem4 zu konstruieren. Zem93 wurde dann durch Verdauung mit Bam HI und Sal I linearisiert. Zem4 wurde mit Bgl II und Sal I verdaut und der hGH-Terminator wurde gereinigt. Die t-PA-Präpro-Sequenz wurde aus dem pUC9-Vektor als ein Sau 3A-Fragment entfernt. Die drei DNA-Fragmente wurde dann verknüpft und ein Plasmid mit der Struktur von Zem97 (Fig. 2) wurde ausgewählt. Zem97 wurde mit Bgl II geschnitten und das Bgl II-Bam HI-t-PA-Fragment aus pDR1296 wurde inseriert. Der resultierende Vektor wurde mit Zem99 bezeichnet.
  • Plasmid pSV2-DHFR (Subramani et al.,aaO) wurde mit Cfo I verdaut und das Fragment, das die DHFR-cDNA und die 3'- gebundenen SV40-Sequenzen enthielt, wurde isoliert, repariert und an Bam HI-Linker ligiert. Nach Verdauung mit Bam HI wurde ein ungefähr 800 bp langes Fragment, das die gesamte cDNA und die SV40-Terminatorregion enthielt, gereinigt und an mit Bam HI verdauten pUC8 ligiert. Wie in Fig. 2 dargestellt, wurde Zem67 mit Bgl II verdaut und mit dem Bam HI-DHFR-SV40-Fragment ligiert, um Plasmid Zem176 zu erzeugen. Plasmid Zem93 wurde mit Sst I verdaut und erneut ligiert, um Plasmid Zem106 zu erzeugen, in dem ungefähr 600 bp Sequenz 5' zum MT-1-Promotor eliminiert waren. Plasmid Zem106 wurde mit Eco RI verdaut und an das Eco RI-Fragment ligiert, das das DHER-Gen aus Plasmid Zem176 enthielt. Das resultierende Plasmid wurde mit Zts13 bezeichnet. Plasmid Zts13 wurde mit Bam HI verdaut und an das Bam HI-Fragment aus Plasmid Zem99 ligiert, das die gesamte t- PA-Kodierungsregion und die hGH-Terminatorsequenz enthielt.
  • Das resultierende Plasmid wurde mit Zts15 bezeichnet. Zts15 wurde teilweise mit Bam HI verdaut, repariert und erneut ligiert, um Plasmid Zem219 zu erzeugen, in dem die 3'-Bam HI- Stelle zerstört war (Fig. 2). Zem219 wurde dann teilweise mit XbaI verdaut, repariert und erneut ligiert, um Plasmid Zem219a zu erzeugen, in dem die 3'-Xba I-Stelle zerstört war (Fig. 5).
  • Eine DNA-Sequenz, die Aprotinin kodiert, wurde dann in Zem219a anstelle der Sequenz, die reifen t-PA kodiert, inseriert. Zem219a wurde mit Bgl II und Xba I verdaut und das Vektorfragment wurde gewonnen. Plasmid pKFN-414, ein Plasmid auf pUC-Basis, das ein synthetisches Aprotinin-Gen enthält, wurde mit Ava II und Xba I verdaut und das 150 bp lange Aprotinin-Fragment wurde gewonnen. (Die Sequenz des synthetischen Aprotinin-Gens ist in Fig. 15 dargestellt.) Diesem Fragment fehlt das 5'-Ende der Aprotinin- Kodierungssequenz. Oligonukleotide ZC1908 (Sense-Strang, 5' GAT CTA GGC CTG ATT TCT GTT TGG AAC CTC CAT ACA CTG 3') und ZC1909 (Anti-Sense, 5' GAC CAG TGT ATG GAG GTT CCA AAC AGA AAT CAG GCC TA 3') wurden anneliert, um das 5'-Ende der Aprotinin- Sequenz bereitzustellen und eine Bgl II-Stelle, um die Aprotinin-Sequenz im Rahmen mit der t-PA-Präpro-Sequenz zu verknüpfen. Das 150 bp Aprotinin-Fragment, die annelierten Oligonukleotide und das Zem219a-Fragment wurden dann verknüpft, um Zem252 zu konstruieren.
  • Die Plasmide Zem219a und Zem252 wurden in tk&supmin;BHK-Zellen mit dem Calciumphosphat-Verfahren co-transfiziert. Transfizierte Zellen wurde mit Methotrexat selektioniert und auf Produktion von t-PA gescreent. Positive Klone wurden radioaktiv markiert und Kulturmedien wurden auf Aprotinin-Produktion unter Verwendung eines Kaninchen-anti-Aprotinin-Antikörpers gescreent. Aprotinin-produzierende Klone wurden ausgewählt.
    • BEISPIEL 2 Herstellung von Plasminogen A. Klonieren von alpha-1-Antitrypsin-cDNA
  • Eine cDNA, die für die vorherrschende Form von Human-α-1- Antitrypsin (AAT) kodiert, wurde aus einer cDNA-Bibliothek aus menschlicher Leber mit herkömmlichen Verfahren unter Verwendung der Pavian-Sequenz (Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 6826-6830, 1980; und Chandra et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 103 : 751-758, 1981) als eine DNA- Hybridisierungssonde isoliert. Die Bibliothek wurde konstruiert, indem cDNA aus menschlicher Leber in die Pst I- Stelle des Plasmids pBR322 (Bolivar et al., Gene 2 : 95-113, 1977) inseriert wurde. Die AAT-cDNA wurde aus der Bibliothek als ein 1500 Basenpaare (bp) langes Pst I-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in die Pst I-Stelle von pUC13 inseriert, um das Plasmid pUCα1 herzustellen. In pUCα1 ist die AAT- Sequenz auf dem 3'-Ende von Xba I- und Eco RI-Stellen im Polylinker flankiert. Diese cDNA-Sequenz wurde verwendet, um das Plasmid pFATPOT, dargestellt in Fig. 4, zu konstruieren. Plasmid pFATPOT ist bei der ATCC als ein Transformant des Saccharomyces cerevisiae-Stammes E18, Zugangsnummer 20699, hinterlegt worden.
  • Die AAT-cDNA wurde dann mit dem TPI1 (Triosephosphat- Isomerase-Gen)-Terminator im Plasmid pMVR1 verknüpft. Dieses Plasmid umfaßt außerdem den TPI1-Promotor und wurde in der folgenden Art und Weise zusammengebaut. Plasmid pIC7 (Marsh et al., Gene 32 : 481-486, 1984) wurde mit Eco RI verdaut, die Fragmentenden wurden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) stumpfendig gemacht und die lineare DNA wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase erneut zirkularisiert. Das resultierende Plasmid wurde verwendet, um E. coli RR1 zu transformieren. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten hergestellt und auf den Verlust der Eco RI-Stelle gescreent. Ein Plasmid mit dem richtigen Restriktionsmuster wurde als pIC7RI* bezeichnet. Das TPI1-Promotorfragment wurde aus Plasmid pTPlC10 (Alber und Kawasaki, J. Molec. Appl. Genet. 1 : 419-434, 1982) erhalten, wie in Fig. 4 dargestellt. Dieses Plasmid wurde an der einzigen Kpn I-Stelle innerhalb des TPII-Gens geschnitten, die TPI1-Kodierungsregion wurde mit Bal31-Exonuklease entfernt und ein Eco RI-Linker (Sequenz: GGAATTCC) wurde dem 3'-Ende des Promotors hinzugefügt. Verdauung mit Bgl 11 und Eco RI lieferte ein TPI1-Promotorfragment mit kohäsiven Bgl II- und Eco RI-Enden. Dieses Fragment wurde dann mit Plasmid YRp7' (Stinchcomb et al., Nature 282 : 3943, 1979) verknüpft, das mit Bgl II und Eco RI geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid, TE32, wurde mit Eco RI und Bam HI gespalten, um einen Teil des Tetracyclinresistenz-Gens zu entfernen. Das linearisierte Plasmid wurde dann durch die Zugabe des zuvor beschriebenen Eco RI-Bam HI-Linkers erneut zirkularisiert, um Plasmid TEA32 herzustellen. Plasmid TEA32 wurde mit Bgl 11 und Eco RI verdaut und das ungefähr 900 bp lange TPII-Promotor- Teilfragment wurde gelgereinigt. Plasmid pIC19H (Marsh et al., aaO) wurde mit Bgl II und Eco RI geschnitten und das Vektorfragment wurde gelgereinigt. Das TPII-Promotorfragment wurde dann an das linearisierte pIC19H ligiert und die Mischung wurde verwendet, um E. coli RR1 zu transformieren. Plasmid-DNA wurde hergestellt und auf das Vorhandensein eines ungefähr 900 bp langen Bgl II-Eco RI-Fragmentes gescreent. Ein richtiges Plasmid wurde ausgewählt und mit pICTPIP bezeichnet. Plasmid pIC7RI* wurde mit Hind III und Nar I verdaut und das 2500 bp lange Fragment wurde gelgereinigt. Das TPI1-Promotor- Teilfragment (ca. 900 bp) wurde aus pICTPIP unter Verwendung von Nar I und Sph I entfernt und wurde gelgereinigt. pEATPOT wurde mit Sph I und Hind III verdaut und das 1750 bp lange Fragment, das einen Teil des TPI1-Promotors, die AAT-cDNA und den TPI1-Terminator umfaßte, wurde gelgereinigt. pIC7RI*- Fragment, das TPI1-Promotorfragment und das TPI1-Promotor-AAT- TPI1-Terminator-Fragment aus pFATPOT wurden dann in einer Dreifachligation kombiniert, um pMVR1 herzustellen (Fig. 4).
    • B. Konstruktion eines alpha-1-Antitrypsin-Expressionsvektors und Transfektion von BHK-Zellen
  • Zur Expression und Sekretion von alpha-1-Antitrypsin durch transfizierte Säugetierzellen wurde das Bam HI-Xba I-Fragment aus Plasmid pMVR1, das die gesamte Kodierungsregion für AAT von Aminosäure Nr. 2 an enthielt, isoliert und in mit Bam HI, Xba I verdautes Zem219a (Beispiel 1) inseriert.
  • Um den AAT-Expressionsvektor zu konstruieren, wurde Zem219a mit Bgl II und Xba I verdaut und die t-PA-Kodierungssequenz wurde entfernt. Oligonukleotide ZC1173 (5' GAT CTT CA3') und ZC1174 (5' GAT CTG AA3') wurden anneliert, um einen Bgl II-Xho II-Adaptor zu bilden. Das AAT-Fragment, der Adaptor und der linearisierte Vektor wurden dann in einer dreiteiligen Ligation verknüpft, um Zem235 zu konstruieren (Fig. 5). Der Adaptor richtete die Leserahmen der t-PA-Präpro- und AAT- Sequenzen richtig aus und stellte den Glu-Codon wieder her, der am 5'-Ende der AAT-Sequenz fehlte.
  • Plasmid Zem235 wurde in tk&supmin;BHK-Zellen durch Elektroporation transfiziert. Methotrexat-Selektion wurde nach 48 Stunden angewendet und nach zwei Wochen wurde eine Anzahl von Klonen ausgewählt, erweitert und auf Gehalte an in die Kulturmedien sekretiertes alpha-1-Antitrypsin, charakterisiert. Ein Klon, der AAT mit einer Rate von etwa 20 ug/ml/Tag sekretierte, wurde ausgewählt und mit 235-6 bezeichnet.
    • C. Konstruktion eines Plasminogen-Extressionvektors und Transfektion von Zellen
  • Eine cDNA, die Plasminogen kodiert, wurde von Dr. Mark Markson von der University of Washington, Seattle, Washington erhalten. Der Klon war aus einer Lambda-Phagen-Bibliothek isoliert worden, die mit einem Teil-cDNA-Klon gescreent worden war, der von Malinowski et al. (aaO) beschrieben ist. Die Sequenz der cDNA ist in Fig. 6 dargestellt.
  • Lambda-Phagen-DNA wurde aus dem positiven Klon gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt. Phagen-DNA wurde einer teilweisen Eco RI-Teilverdauung unterworfen und ein ungefähr 2800 bp langes Eco RI-Fragment, das die gesamte Kodierungsregion enthielt, wurde gewonnen und in die Eco RI-Stelle von pUC19 kloniert, um Plasmid pUC19-Plg zu konstruieren.
  • Das 183 bp lange Bal I-Eco RI-Fragment, das das 5'-Ende der Kodierungssequenz enthielt, wurde aus pUC19-Plg isoliert und in mit Sma I, Eco RI verdauten pUCl8 kloniert, um am 5'-Ende eine Bam HI-Stelle hinzuzufügen. Das resultierende Plasmid wurde mit Bam HI und Eco RI verdaut und das 190 bp lange Fragment wurde isoliert.
  • Plasmid pUCl9-Plg wurde mit Eco RI und Eco RV verdaut und das Fragment, das die Mittelregion der cDNA enthielt, wurde isoliert.
  • Um den 3'-Teil der Plasminogen-cDNA zu erhalten, wurde ein Fragment, das am Codon für Aminosäure 541 begann, in pucli8 subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit Eco RV und Xba I verdaut und das ungefähr 660 bp lange 3'-Plasminogen- Fragment wurde isoliert.
  • Die drei Plasminogen-cDNA-Fragmente (Bam HI-Eco RI, Eco RI-Eco RV und Eco RV-Xba I) wurden mit Bam HI, Xba I verdautem Zem219b zur Ligation kombiniert, um Plasmid 219b-Plg zu erzeugen. (Zem219b wurde abgeleitet von Zem219a, indem dieser Vektor mit Bam HI und Xba I verdaut, die t-PA-cDNA-Sequenzen entfernt und das Vektorfragment mit einem Bam HI-Xba I-Adaptor ligiert wurde.) Das Bam HI-Plasminogen-Fragment wurde dann aus Zem219b-Plg entfernt und in mit Bam HI verdautes Zem228 inseriert. Um Zem228 zu konstruieren, wurde Zem67 mit Hind III und Bgl II verdaut und das Hind III-Bam HI-neo+SV40- Terminator-Fragment aus pSV2neo (Southern und Berg, J. Mol. ADDl. Genet. 1 : 327-341, 1982) wurde inseriert. Der resultierende Vektor wurde mit Zem220 bezeichnet. Plasmid Zem93 wurde mit Sst I verdaut, um flußaufwärtige MT-1- Sequenzen zu entfernen, und der Vektor wurde erneutzirkularisiert, um Zem106 zu konstruieren. Zem220 wurde mit Eco RI verdaut und das Fragment, das die Expressionseinheit von SV-40-Promotor-neo-SV40-Terminator enthielt, wurde gewonnen und mit mit Eco RI verdautem Zeml06 verknüpft. Der resultierende Vektor, bezeichnet mit Zem223, enthielt die SV40- und NT-1-Promotoren in entgegengesetzter Orientierung. Zem223 wurde mit Bam HI verdaut und ein 237 bp langes Bcl I- Bam HI-SV40-Terminator-Fragment wurde inseriert. Das resultierende Plasmid wurde mit Zem228 bezeichnet (Fig. 3). Der von Zem228 abgeleitete Plasminogen-Expressionsvektor wurde mit Zem228-Plg bezeichnet.
  • Zem228-Plg wurde in die AAT-exprimierende Zellinie 235-6 mit dem Elektroporationsverfahren transfiziert, im wesentlichen wie von Neumann (aaO.) beschrieben. Kolonien wurde ausgewählt und auf Plasminogen-Produktion durch enzym-verknüpften Immunsorbenstest (ELISA) getestet. Der Test verwendete ein polyklonales Ziegen-Antiserum gegen Human-Plasminogen (American Diagnostica) als den Fänger-Antikörper. Immunreaktives Material wurde mit Hilfe von biotinyliertem polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen Human-Plasminogen und Avidin-konjugierter Meerrettich-Peroxidase nachgewiesen.
  • Zehn positive Klone wurden in Gewebekulturschalen mit sechs Vertiefungen gegeben. Als die Zellen 80-90% konfluent waren, wurden sie für eine Stunde in Cystein-Mangelmedium gegeben. 50 Mikrocurie ³&sup5;S-Cystein wurden zu jeder Vertiefung zugegeben (1 ml Kulturvolumen/Vertiefung), die Zellen wurden über Nacht inkubiert und die Medien wurden für den Test geerntet.
  • Die Zellen wurden mit kaltem PBS gewaschen und ein Extrakt wurde hergestellt, um auf cytoplasmatisches Plasminogen zu testen. Die Zellen wurden in 1 ml RIP-A-Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 1% Desoxycholat, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 0,7 M NaCl) suspendiert. Die Lysate wurden zweimal auf Trockeneis ausgefroren und in der Kälte für 15 Minuten bei 10.000 UPM zentrifugiert. Die Überstände wurden dann für Radioimmunfällung verwendet.
  • Medien und Zellextrakt-Proben wurden auf Plasminogen mit Radioimmunfällung getestet. Proben (in einem Volumen von 0,1 bis 1,0 ml) wurden mit 5-10 ul Präimmun-Serum kombiniert, auf Eis für 1 Stunde inkubiert und dann mit 50-100 ul Staphylococcus aureus (Pansorbin, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) vermischt und für 1 Stunde auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation wurden die Überstände mit 5 ul polyklonalem Kaninchen-Antiserum gegen Human-Plaminogen (Boehringer- Mannheim) vermischt und auf Eis für eine Stunde inkubiert. 50 ul staphylococcus aureus wurden zugegeben und die Mischung wurde für eine Stunde auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert und die Pellets wurden mit 1 ml PBS, das 0,5% NP-40, 0,1% SDS enthielt, gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden pelletiert, in 50 ul PBS plus 50 ul 2X Ladepuffer (0,1 N Tris pH 6,8, 16% Glyzerin, 3,2% SDS, 8%- Mercaptoethanol, 0,002% Bromphenolblau) erneut suspendiert, 5 Minuten gekocht und einer Elektrophorese auf einem 10%igen Polyacrylamidgel unterzogen. Proteine wurden durch Silberanfärbung und Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • Die Testergebnisse zeigten, daß AAT-produzierende Zellen Plasminogen in voller Länge in die Kulturmedien sekretierten. Im Gegensatz dazu sekretierten Kontroll-BHK-Zellen (d. h. Zellen, die mit 219b-Plg, nicht aber mit Zem235 transfiziert worden waren) keine nachweisbaren Mengen an Plasminogen und enthielten abgebautes Plasminogen im Cytoplasma (Fig. 7).
    • Beispiel 3 Herstellung von Protein C A. Protein-C-cDNA-Klonierung
  • Eine cDNA, die für einen Teil des menschliches Proteins C kodiert, wurde hergestellt, wie beschrieben von Foster und Davie (aaO). Kurz gesagt wurde eine λgt11-cDNA-Bibliothek mit herkömmlichen Verfahren aus mRNA aus menschlicher Leber hergestellt. Klone wurden unter Verwendung von ¹²&sup5;I-markiertem affinitätsgereinigten Antikörper gegen menschliches Protein C gescreent und Phagen wurden aus positiven Klonen mit dem Plattenlysatverfahren (Maniatis et al., aaO) hergestellt, gefolgt von Banden auf einem Cäsiumchlorid-Gradienten. Die cDNA-Inserts wurden unter Verwendung von Eco RI entfernt und in Plasmid pUC9 subkloniert (Vieira und Messing, Gene 19 : 259- 268, 1982). Restriktionsfragmente wurden in die Phagenvektoren M13mp10 und M13mp11 (Messing, Meth. in Enzymology 101 : 20-77, 1983) subkloniert und mit dem Didesoxyverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463-5467, 1977) sequenziert. Ein Klon wurde ausgewählt, der DNA enthielt, die der bekannten Teilsequenz von menschlichem Protein C (Kisiel, J. Clin. Invest. 64 : 761-769, 1979) entsprach, und Protein C, beginnend bei Aminosäure 64 der leichten Kette und sich über die schwere Kette hin und in die 3'-Nichtkodierungsregion hinein erstreckend, enthielt. Dieser Klon wurde mit λHC1375 bezeichnet. Ein zweiter cDNA-Klon, der für Protein C von Aminosäure 24 an kodierte, wurde identifiziert. Das Insert aus diesem Klon wurde in pUC9 subkloniert und das Plasmid mit pHCλ6L bezeichnet. Dieser Klon kodiert einen Großteil von Protein C, einschließlich der Kodierungsregion der schweren Kette, des Terminationscodons und der 3'- Nichtkodierungsregion.
  • Das cDNA-Insert aus λHC1375 wurde unter Verwendung von 32 dNTPs einer nick-Translation unterzogen und verwendet, um eine menschliche Genombibliothek in Phage λCharon 4A (Maniatis et al., Cell 15 : 687-702, 1978) unter Verwendung des Plaque- Hybridisierungsverfahrens von Benton und Davis (Science 196 : 181-182, 1977), wie modifiziert von Woo (Meth. in Enzymoloay 68 : 381-395, 1979), zu sondieren. Positive Klone wurden isoliert und plaque-gereinigt (Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 4673-4677, 1985, hierin durch Bezugnahme miteinbezogen). Phagen-DNA, die aus positiven Klonen (Silhavy et al., in Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) hergestellt wurde, wurde mit Eco RI oder Bgl II verdaut und die Genom-Inserts wurden gereinigt und in pUC9 subkloniert. Insert- Restriktionsfragmente wurden in M13-Vektoren subkloniert und sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen und die DNA- Sequenz des gesamten Gens zu bestimmen.
  • Ein Genom-Fragment, das ein Exon enthielt, das den Aminosäuren -42 bis -19 des Präpro-Peptids von Protein C entsprach, wurde isoliert, der nick-Translation unterzogen und als eine Sonde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek zu screenen, konstruiert mit der Technik von Gubler und Hoffman (Gene 25 : 263-269, 1983) unter Verwendung von mPNA aus Hep G2-Zellen. Diese Zellinie wurde aus menschlichen Hepatocyten gewonnen und es hatte sich bereits früher erwiesen, daß sie Protein C synthetisiert (Fair und Bahnak, Blood 64 : 194-204, 1984). Zehn positive Klone, die cDNA umfaßten, die in die Eco RI-Stelle von Phage λgt11 inseriert war, wurden isoliert und mit einer Oligonukleotidsonde gescreent, die der 5'-Nichtkodierungsregion des Protein C-Gens entsprach. Ein Klon war auch mit dieser Sonde positiv und seine gesamte Nukleotidsequenz wird bestimmt. Die cDNA enthielt 70 bp 5'-nicht-translierte Sequenz, die gesamte Kodierungssequenz für menschliches Präpro-Protein C und die gesamte 3'-Nichtkodierungsregion, die der zweiten Polyadenylierungsstelle entsprach.
    • B. Konstruktion von Vektor DD5
  • Der Vektor pD5 wurde abgeleitet von pDHFRIII, wie in Fig. 8 dargestellt. Die Pst I-Stelle unmittelbar flußaufwärts der DHFR-Sequenz in pDHFRIII (Berkner und Sharp, Nuc. Acids Res 13 : 841-857, 1985) wurde in eine Bam HI-Stelle umgewandelt, indem 10 ug Plasmid mit 5 Einheiten Pst I für 10 Minuten bei 37ºC in 100 ul Puffer A (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl&sub2;, 6 mM NaCl, 7 mM β-MSH) verdaut wurden. Die DNA wurde Phenolextrahiert, EtOH-gefällt und in 40 ul Puffer B (50 mM Tris pH 8, 7 mM MgCl&sub2;, 7 mM β-MSH), der 10 mM dCTP und 16 Einheiten T4- DNA-Polymerase enthielt, erneut suspendiert und bei 12ºC für 60 Minuten inkubiert. Im Anschluß an EtOH-Fällung wurde die DNA an 2,5 ug kinasierte Bam HI-Linker in 14 ul Puffer C (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT&sub1; 1,4 mM ATP), der 400 Einheiten T4-Polynukleotid-Ligase enthielt, für 12 Stunden bei 12ºC ligiert. Im Anschluß an Phenolextraktion und EtOH-Fällung wurde die DNA in 120 ul Puffer D (75 mM KCl, 6 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT) erneut suspendiert, mit 100 Einheiten Bam HI für 60 Minuten bei 50ºC verdaut und dann einer Elektrophorese durch Agarose unterzogen. Das 4,9 kb lange DNA- Fragment, das pBR322- und Vektor-Sequenzen enthielt, (10 ug) wurde aus dem Gel isoliert, in 10 ul Puffer C, der 50 Einheiten T4-Polynukleotid-Ligase enthielt, für 2 Stunden bei 12ºC ligiert und verwendet, um E. coli HB101 zu bransformieren. Positive Kolonien wurden durch DNA- Herstellungs-Schnellanalyse identifiziert und Plasmid-DNA (bezeichnet mit pDHFR') wurde hergestellt.
  • Plasmid pD1 wurde dann erzeugt, indem zunächst pSV40 (das mit Bam HI verdaute SV40-DNA, kloniert in die Bam HI-Stelle von pML-1 umfaßte [Lusky und Botchan, Nature 293 : 79-81, 1981]) (25 ug) in 100 pl Puffer D mit 25 Einheiten Bcl I für 60 Minuten bei 50ºC gespalten wurde, gefolgt von der Zugabe von 50 Einheiten Bam HI und zusätzlicher Inkubation bei 37ºC für 60 Minuten. Plasmid pDHFR' wurde mit Bam HI linearisiert und mit Kalbs-Intestinalphosphatase behandelt. DNA-Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und das 4,9 kb lange pDHFR'-Fragment und das 0,2 kb lange SV40-Fragment wurden isoliert. Diese Fragmente (200 ng pDHFR'-DNA und 100 ng SV40-DNA) wurden in 10 ul Puffer C, der 100 Einheiten T4- Polynukleotid-Ligase enthielt, für 4 Stunden bei 12ºC inkubiert und das resultierende Konstrukt (pDi) wurde verwendet, um E. coli RRI zu transformieren.
  • Wie in Fig. 8 dargestellt, wurde Plasmid pD1 modifiziert, indem die "Gift"-Sequenzen in der pBR322-Region deletiert wurden (Lusky und Botchan, aaO). Die Plasmide pD1 (6,6 ug) und pML-1 (Lusky und Botchan, aaO) (4 ug) wurden in 50 ul Puffer A mit jeweils 10 Einheiten Eco RI und Nru I für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese. Das 1,7 kb lange pD1-Fragment und das 1,8 kb lange pML-1-Fragment wurden isoliert und miteinander (jeweils 50 ng) in 20 ul Puffer C, der 100 Einheiten T4-Polynukleotid-Ligase enthielt, für 2 Stunden bei 12ºC ligiert, gefolgt von Transformation in E. coli HB101. Kolonien, die das gewünschte Konstrukt (bezeichnet mit ppD1) enthielten, wurden durch Herstellungsschnellanalyse identifiziert. 10 ug ppD1 wurde dann mit jeweils 20 Einheiten Eco RI und Bgl II in 50 ul Puffer A für 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Die DNA wurde einer Elektrophorese durch Agarose unterzogen und das gewünschte 2,8 kb lange Fragment (Fragment C), das die pML-1-, 3'- Spleißstellen- und Poly A-Sequenzen umfaßte, wurde isoliert.
  • Um die restlichen Fragmente zu erzeugen, die bei der Konstruktion von pD5 verwendet werden, wurde pDHFRIII modifiziert, um die Sac II(Sst II)-Stelle in entweder eine Hind III- oder Kpn I-Stelle umzuwandeln. 10 ug pDHFRIII wurden mit 20 Einheiten Sst II für 2 Stunden bei 37ºC verdaut, gefolgt von Phenolextraktion und Ethanolfällung. Erneut suspendierte DNA wurde in 100 ul Puffer B, der 10 mM dCTP und 16 Einheiten T4-DNA-Polymerase enthielt, für 60 Minuten bei 12ºC inkubiert, Phenolextrahiert, dialysiert und Ethanolgefällt. DNA (5 ug) wurde mit 50 ng kinasierten Hind III- oder Kpn I-Linkern in 20 ul Puffer C, der 400 Einheiten T4-DNA- Ligase enthielt, für 10 Stunden bei 12ºC ligiert, Phenolextrahiert und Ethanol-gefällt. Nach erneuter Suspension in 50 ul Puffer A wurden die resultierenden Plasmide mit 50 Einheiten Hind III oder Kpn I, wie angemessen, verdaut und einer Elektrophorese durch Agarose unterzogen. Gelisolierte DNA (250 ng) wurde in 30 ul Puffer C&sub1; der 400 Einheiten T4- DNA-Ligase enthielt, für 4 Stunden bei 12ºC ligiert und verwendet, um E. coli RR1 zu transformieren. Die resultierenden Plasmide wurden mit pDHFRIII (Rind III) und pDHFRIII (Kpn I) bezeichnet. Ein 0,4 kb langes Eco RI-Kpn I- Fragment (Fragment A) wurde dann aus pDHFRIII (Kpn I) durch Verdauung mit Eco RI und Kpn I, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, gereinigt.
  • Die SV40-Verstärker-Sequenz wurde in pDHFRIII (Hind III) wie folgt inseriert: 50 ug SV40-DNA wurden in 120 ul Puffer A mit 50 Einheiten Hind III für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert und das Hind III-C-SV40-Fragment (5171-1046 bp) wurde gelgereinigt. Plasmid pDHFRIII (Hind III) (10 ug) wurde 250 ng Kalbs- Intestinalphosphatase für 1 Stunde bei 37ºC behandelt, Phenolextrahiert und Ethanol-gefällt. Das linearisierte Plasmid (50 ng) wurde mit 250 ng Rind III-C-SV40-Fragment in 16 ul Puffer C für 3 Stunden bei 12ºC unter Verwendung von 200 Einheiten T4-Polynukleotid-Ligase ligiert und in E. coli HB101 transformiert. Ein 0,9 kb langes Kpn I-Bgl II-Fragment (Fragment B) wurde dann aus diesem Plasmid isoliert.
  • Für die endgültige Konstruktion von pD5 wurden die Fragmente A und B (jeweils 50 ng) und 10 ng Fragment C mit 200 Einheiten T4-Polynukleotid-Ligase für 4 Stunden bei 12ºC ligiert und die Mischung wurde in E. coli RRI transfiziert. Positive Kolonien wurden durch Herstellungsschnellanalyse nachgewiesen und eine Herstellung von pD5 im Großmaßstab (Fig. 8) wurde durchgeführt.
    • C. Konstruktion von Expressionsvektor D594
  • Die Expression von Protein C-cDNA wurde in Vektor pDX erreicht. Dieser Vektor wurde von pD11 und pD5' abgeleitet. Plasmid pD5' ist identisch mit pD5, mit der Ausnahme, daß das SV40-Polyadenylierungssignal (d. h. das SV40-Bam HI[2533 bp]- Bcl I[2770 bp]-Fragment) sich in der late-Orientierung befindet. So enthält pD5' eine Bam HI-Stelle als die Stelle der Geninsertion. Plasmid pD11 unterscheidet sich von pD5 darin- daß das Hind III(5171 bp im SV40-Genom)-Kpn I(294 bp in SV40)-Fragment, das Verstärker-Sequenzen enthält, sich in der entgegengesetzten Orientierung befindet.
  • Um pDX zu erzeugen, wurde die Eco RI-Stelle in pD11 durch Eco RI-Spaltung, Inkubation mit SI-Nuklease und anschließende Ligation mit BclI-Linkern in eine Bcl I-Stelle umgewandelt. DNA wurde aus einer positiv identifizierten Kolonie hergestellt und das 1,9 kb lange Xho I-Pst I-Fragment, das die geänderte Restriktionsstelle enthielt, wurde über Agarose-Gelelektrophorese hergestellt. In einer zweiten Modifikation wurde mit Bcl I geschnittener pD5' mit kinasierten Eco RI-Bcl I-Adaptoren (konstruiert aus den Oligonukleotiden ZC525, 5' GGAATTCT 3'; und ZC526, 5' GATCAGAATTCC 3') ligiert, um eine Eco RI-Stelle an der Position für die Insertion eines Gens in den Expressionsvektor zu erzeugen. Positive Kolonien wurden durch Restriktionsendonukleaseanalyse identifiziert und DNA hieraus wurde verwendet, um ein 2,3 kb langes Xho I-Pst I- Fragment zu isolieren, das die modifizierte Restriktionsstelle enthielt. Die zwei oben beschriebenen DNA-Fragmente wurden zusammen mit T4-DNA-Ligase inkubiert und in E. coli HB101 transformiert und positive Kolonien wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Eine Herstellung einer derartigen DNA, bezeichnet mit pDX (Fig. 9), wurde dann durchgeführt. Dieses Plasmid enthält eine einzige Eco RI- Stelle für die Insertion fremder Gene.
  • Die Protein C-cDNA wurde dann in pDX als ein Eco RI-Fragment inseriert. Rekombinante Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse gescreent, um diejenigen zu identifizieren, die das Protein C-Insert in der richtigen Orientierung in Bezug auf die Promotor-Elemente besaßen, und Plasmid-DNA (bezeichnet mit pDX/PC) wurde aus einem richtigen Klon hergestellt. Weil das cDNA-Insert in pDX/PC ein ATG-Codon in der 5'-Nicht-Kodierungsregion enthält, wurde Deletionsmutagenese auf der cDNA vor der Transfektion und den Expressionsexperimenten durchgeführt. Deletion der drei Basenpaare wurde gemäß Standardverfahren der Oligonukleotidgerichteten Mutagenese durchgeführt. Der Vektor auf pDX-Basis, der die modifizierte cDNA enthielt, wurde mit p594 bezeichnet.
    • D. Expression von Protein C in einer KEX2- transfizierten Zellinie
  • Das Saccharomyces cerevisiae-KEX2-Cen wurde aus einer Hefe- Genombibliothek isoliert, indem transformierte mutante kex2- Zellen auf Produktion eines α-Faktor-Halos auf einem Rasen geeigneter Tester-Zellen gescreent wurden. Ein Klon wurde erhalten, der alle berichteten Defekte von kex2-Mutationen komplementierte (mating, α-Faktor-Produktion, Reifung von Killer-Toxin und Sporulation in einem homozygoten diploiden kex2-Stamm). Das Gen wurde in einen pUC-Vektor unter der Kontrolle des Hefe-GAL1-Promotors subkloniert. Das resultierende Plasmid, bezeichnet mit p1515, ist bei der American Type Culture Collection als ein E. coli HB101- Transformant unter Zugangsnummer 67569 hinterlegt worden. Wie in Fig. 10 dargestellt, wurde p1515 mit Hind III verdaut und ein 2,1 kb langes Fragment wurde gewonnen. Dieses Fragment wurde an mit Hind III geschnittenen pUC18 ligiert, um Plasmid pUC18/KEX2 zu konstruieren. Das KLX2-Fragment (2,1 kb) wurde dann aus pUC18/KEX2 isoliert, indem das Plasmid teilweise mit Hind III und bis zur Vervollständigung mit Bam HI verdaut wurde. Der Rest der KEX2-Sequenz wurde dann als ein 0,43 kb langes Fragment aus einer Bam HI + Hind III-Verdauungsmischung von p1515 isoliert. Die zwei KEX2-Fragmente wurden dann in die Bam HI-Stelle der Vektoren Zem228 und Zem229 ligiert (Fig. 10). (Zem229 ist ähnlich zu Zem228, enthält aber ein DHFR-Gen anstelle des Neomycinresistenz-Gens. Eine Klonierungsstelle ist flankiert vom MT-1-Promotor und SV40-Terminator). Die resultierenden Plasmide wurden mit KEX2/Zem228 bzw. KEX2/Zem229 bezeichnet.
  • Die BHK-Zellinie tk&supmin;ts13 wurde mit den Plasmiden p594 und pSV2- DHFR mit dem Calciumphosphat-Verfahren co-transfiziert. Transfizierte Zellen wurden mit 250 nM Methotrexat (MTX) selektioniert und klonale Zellinien wurden isoliert. Eine klonale Zellinie, die Protein C in das Kulturmedium mit 1,5 pg/Zelle/Tag sekretierte, wurde selektioniert und mit PC594- 204/BHK bezeichnet.
  • 10 ug KBX2/Zem228 wurden in die PC594-204/BHK-Zellinie mit dem Calciumphosphat-Verfahren transfiziert. Die Zellen wurden in der Gegenwart von 250 nM NTX zu allen Zeitpunkten kultiviert.
  • Klone wurden mit 500 ug/ml G418 selektioniert und zwölf klonale Zellinien wurden selektioniert.
  • Die selektionierten Klone wurden mit ³&sup5;S-Cystein in cysteinfreiem MEM (Gibco), das 1% fötales Kalbsserum enthielt, für 24 Stunden pulsmarkiert. Die Kulturmedien wurden gesammelt und auf das Vorhandensein von einzelkettigen und gespaltenem zweikettigen Protein C durch Immunfällung mit einem monoklonalen Antikörper zu Protein C untersucht. 250 ul Medien wurden mit 10 ug des Antikörpers kombiniert und die Mischung wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. 100 ul Staph A-Zellsuspension (Pharmacia, Piscataway, NJ) wurden zugegeben und die Inkubation wurde bei 37ºC für eine Stunde fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und der Pellet wurde in TBS erneut suspendiert. Die Zellen wurden wieder pelletiert und der Pellet wurde in 60 ul Gelpuffer, der 1% β-Mercaptoethanol enthielt, erneut suspendiert. Die Suspension wurde für drei Minuten auf 100ºC erhitzt, dann einer Elektrophorese auf einem SDS- Polyacrylamidgel unterzogen. Proteine wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Stammzellinie, PC594- 204/BHK, zeigte ungefähr 70% des Proteins C in der einkettigen Form, mit den restlichen 30% in der zweikettigen Form. Eine der G418-selektionierten KEX2-Zellinien, bezeichnet mit PC594-204/KEX2-1, produzierte 95% zweikettiges Protein C, mit den restlichen 5% in der einkettigen Form.
    • E. Modifikation der Protein C-Verarbeitungsstelle
  • Um die Verarbeitung von einzelkettigem Protein C zur zweikettigen Form zu erhöhen, wurden zwei zusätzliche Argininreste in das Protein eingeführt, was zu einer Spaltungsstelle führte, die aus vier basischen Aminosäuren bestand. Der resultierenden mutante Vorläufer von Protein C wurde mit PC962 bezeichnet. Er enthielt die Sequenz Ser-His- Leu-Arg-Arg-Lys-Arg-Asp an der Spaltungsstelle zwischen der leichten und der schweren Kette (Tabelle 3). Die Verarbeitung der Arg-Arg-Bindung führte zu einem zweikettigen Protein C- Molekül.
  • Das mutante Molekül wurde erzeugt, indem die klonierte cDNA durch ortsspezifische Mutagenese (im wesentlichen wie beschrieben von Zoller und Smith, DNA 3 : 479-488, 1984) unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids ZC962 (5' AGT CAC CTG AGA AGA AAA CGA GAC A 3') verändert wurde. Plasmid p594 wurde mit Sst I verdaut, das ungefähr 87 bp lange Fragment in M13mp11 kloniert und einzelsträngige Matrizen-DNA wurde isoliert. Im Anschluß an die Mutagenese wurde ein richtiger Klon durch Sequenzierung identifiziert. Replikativform-DNA wurde isoliert und mit Sst I verdaut, um das mutagenisierte Fragment zu isolieren, das mit mit Sst I geschnittenem p594 in einer zweiteiligen Ligation verknüpft wurde. Klone, die das Sst I-Fragment in der gewünschten Orientierung inseriert aufwiesen, wurden durch Restriktionsenzymkartierung identifiziert. Der resultierende Expressionsvektor wurde mit pDX/PC962 bezeichnet.
  • Plasmid pDX/PC962 wurde mit pSV2-DHFR (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1 : 854-864, 1981) mit dem Calciumphosphat-Verfahren (im wesentlichen wie beschrieben von Graham und van der Eb, aaO) in tk&supmin;ts13 BHK-Zellen co-transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (MEN), das 10% fötales Kalbsserum, 1· PSN-Antibiotikamischung (Gibco 600-5640), 2,0 mM L-Glutamin und Vitamin K (5 ug/ml) enthielt, gezüchtet. Die Zellen wurden in 250 nM Methotrexat (MTX) für 14 Tage selektioniert und die resultierenden Kolonien wurden mit dem Immunfiltertest (McCracken und Brown, BioTechniques, 82-87, März/April 1984) gescreent. Platten wurden mit PBS oder No Serum Medium (Dulbecco's plus Penicillin-Streptomycin, 5 ug/ml Vitamin K) gespült. Teflon®-Netz (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) wurde dann über die Zellen gelegt. Nitrocellulosefilter wurden mit PBS oder No Serum Medium, wie geeignet, angefeuchtet und über das Sieb gelegt. Nach vier Stunden Inkubation bei 37ºC wurden die Filter entfernt und in 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% Gelatine für 30 Minuten bei Raumtemperatur gegeben. Die Filter wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rütteln in mit Biotin markiertem polyklonalen Schafs- Antikörper gegen Protein C, 1 ug/ml im selben Puffer, inkubiert. Die Filter wurden dann im Puffer gewaschen und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rütteln in mit Avidin konjugierter Meerrettich-Peroxidase (Boehringer-Mannheim), 1 : 1000 im selben Puffer, inkubiert. Die Filter wurden in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA, 1 mM NaCl, 0,25% Gelatine, 0,4% Sarkosyl, 0,05% NP-40, dann in H&sub2;O gewaschen und in Farbreagenz (60 mg HRP-Farbentwicklungsreagenz [Bio-Rad], 20 ml Methanol, 100 ul H&sub2;O&sub2; in 100 ml 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl) inkubiert. Die Reaktion wurde durch Überführung der Filter in H&sub2;O gestoppt. Sechs der am intensivsten reagierenden Kolonien wurden durch Zylinderklonierung ausgewählt und einzeln in 10 cm-Platten gezüchtet.
  • Protein C-Produktionsniveaus aus nahezu konfluenten Kulturen wurden durch enzym-verknüpften Immunsorbenstest (ELISA) gemessen. Affinitätsgereinigter polyklonaler oder für die schwere Kette spezifischer monoklonaler Antikörper zu menschlichem Protein C (100 ul einer 100 ug/ml-Lösung in 0,1 M Na&sub2;CO&sub3;, pH 9,6) wurde zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben und die Platten wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit PBS (5 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,15 M NaCl) das 0,05% Tween-20 enthielt, gewaschen und dann mit 100 ul 1% Rinderserumalbumin, 0,05% Tween-20 in PBS bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Platten wurden dann mehrmals mit PBS gespült., dann luftgetrocknet und bei 4ºC aufbewahrt. Um die Proben zu testen, wurden 100 ul jeder Probe für 1 Stunde bei 37ºC in den beschichteten Vertiefungen inkubiert und die Vertiefungen wurden mit 0,05% Tween-20 in PBS gespült. Die Platten wurden dann für 1 Stunde bei 37ºC mit einem mit Biotin konjugierten, affinitätsgereinigten polyklonalen Schafs- Antikörper zu Protein C (30 ng/ml) in PBS, das 1% Rinderserumalbumin und 0,05% Tween-20 enthielt, inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS gespült und wieder für 1 Stunde bei 37ºC mit mit Avidin konjugierter alkalischer Phosphatase in PBS, das 1% Rinderserumalbumin und 0,5% Tween-20 enthielt, inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann mit PBS gespült und die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde durch die Zugabe von 100 ul Phosphatase-Substrat (Sigma 104; 600 ug/ml) in 10% Diethanolamin, pH 9,8, das 0,3 mM MgCl&sub2; enthielt, gemessen. Die Extinktion bei 405 nm wurde auf einem Mikrotiterplatte-Ablesegerät abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1 Klon Zellzahl ELISA pg/Zelle/Tag
  • Der Klon BHK/962-1 wurde in einer Kultur mit größerem Naßstab gezüchtet und mehrere hundert Mikrogramm Protein C wurden durch Affinitätschromatographie auf einer Säule gereinigt die durch Kopplung von 7 ng polyklonalem Schafs-Antikörper gegen menschliches Protein C an 2 Gramm CNBr-aktivierte Sepharose-4B (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) hergestellt worden war.
  • Zellkulturmedium wurde auf die Säule aufgebracht, die Säule wurde mit 100 ml TBS (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl) gewaschen und das Protein C wurde mit TBS, das 3 N KSCN enthielt, oder mit pH 11,5-Puffer (25 mM Kaliumphosphat, pH 11,5, 0,2 N NaCl, 2% Tween 80, 0,5% NaN&sub3;) eluiert. Western-Blot-Analyse zeigte, daß das mutante Protein C zu ungefähr 95% in der zweikettigen Form vorlag, verglichen mit etwa 20% zweikettigem Protein C, das aus BHK-Zellen erhalten wird, die mit der nativen Sequenz transfiziert sind.
  • Milligramm-Mengen von Protein C wurden entweder aus stabilen BHK-Zellklonen, die das mutante PC962-Protein exprimieren, oder stabilen 293-Zellklonen, die das Wildtyp-Protein C exprimieren (p594-transfizierte Zellen), unter Verwendung einer Säule mit monoklonalem Antikörper, die spezifisch ist auf die Calcium-induzierte Konformation von Protein C, gereinigt. Zellkulturmedien wurden auf die Säule in Gegenwart von 5 mM CaCl&sub2; aufgebracht. Protein C wurde aus der Säule mit TBS, das 10 mM EDTA enthielt, eluiert. Die Verwendung dieses Reinigungsverfahrens erlaubte die Reinigung von vollständig aktivem Protein C, ohne dieses denaturierenden Bedingungen auszusetzen. Das gereinigte Protein C wurde analysiert durch SDS/PAGE, gefolgt von Silberanfärbung, und erwies sich als > 95% rein.
  • Das BHK-produzierte PC962-Protein wurde auf seine Fähigkeit getestet, zu einer Form aktiviert zu werden, die sowohl amidolytische als auch gerinnungshemmende Aktivitäten zeigt. Affinitätsgereinigte Proteinproben wurden ausgiebig gegen TBS dialysiert, dann durch Inkubation bei 37ºC für 1 Stunde mit 0,1 Volumenteil von 1 Einheit/ml Protac C (American Diagnostica) aktiviert. Amidolytische Aktivität wurde durch Zugabe von Aliquoten der Aktivierungsmischung zu 100 ul 1 mM Protein C-Substrat (Spectrozyme PCa, American Diagnostica) in einer Mikrotitervertiefung und Messen der Veränderung in A&sub4;&sub0;&sub5; über die Zeit unter Verwendung eines Mikrotiterplatten- Ablesegerätes gemessen. Gerinnungshemmende Aktivität des aktivierten Proteins C wurde getestet, wie beschrieben von Sugo et al. (aaO). Das affinitätsgereinigte PC962-Protein erwies sich als vollständig aktiv sowohl im Amidolyse- als auch im Gerinnungshemmungstest. Es wurde gezeigt, daß die Elution aus der Antikörpersäule mit pH 11,5-Puffer ein Protein mit höherer Aktivität lieferte als dasjenige, das unter Verwendung von 3 M KSCN-Elution erhalten wurde.
  • Klonale Zellinien aus der pDX/PC962-Transfektion in BHK-Zellen wurden mit einem Grenzverdünnungsverfahren isoliert. Eine Platte von MTX-selektionierten Kolonien (ungefähr 300 Kolonien) wurde trypsinisiert, ausgezählt und in Mikrotitervertiefungen mit einem Mittelwert von 0,5 Zelle/ Vertiefung replattiert. Diese wurden in selektiven Medien gezüchtet, die 250 nM MTX enthielten. Etwa 50% der Vertiefungen enthielten Kolonien. Vertiefungen, die identifizierbare Kolonien enthielten (1-2 mm Durchmesser), wurden mit ELISA auf Protein C-Gehalt in den Medien getestet. Für diesen Test wurde frisches Medium zu allen Vertiefungen zugegeben, die Platten wurde für 75 Minuten inkubiert, dann wurde das Medium entfernt und getestet. 5 Kolonien, die 75- Minuten-Akkumulationen von mehr als 50 ng/ml ergaben (was über 1000 ng/ml/Tag entspricht), wurden für eine Kultur in größerem Maßstab in 10 cm-Platten verteilt. Protein C- Produktionsniveaus für diese Klone lagen im Bereich von 1,1 bis 2,8 pg/Zelle/Tag.
  • Ein zweites Plasmid, bezeichnet mit PC229/962, wurde durch Inserieren der PC962-cDNA in Plasmid Zem229 konstruiert. Ein Eco RI-Eragment, das die PC962-cDNA aus pDX/PC962 enthielt, wurde mit synthetischen Eco RI-Bam HI-Oligonukleotid-Adaptoren an Zen229 ligiert, das mit Bam HI geschnitten und mit Phosphatase behandelt worden war. Der resultierende Vektor ist PC229/962.
  • Plasmid PC229/962 wurde in BHK-Zellen mit dem Calciumphosphat- Verfahren transfiziert. Zellen wurden in Dulbecco's MEM kultiviert, das 10% fötales Kalbsserum und 5 ug/ml Vitamin K enthielt. Das 48-Stunden-Übergangs-Expressionsniveau aus dieser Transfektion betrug ungefähr 25 ng/ml. Nach 2 Tagen wurden die transfizierten Zellen in selektive Medien verteilt, die 250 nM MTX enthielten, und für zusätzliche 14 Tage kultiviert. Drei Platten aus dieser Transfektion, die jeweils ungefähr 200 Kolonien enthielten, wurden mit dem Immunfiltertest gescreent und die 24 am intensivsten reagierenden Kolonien wurden durch Zylinderklonierung ausgewählt. Diese wurden einzeln in 10 cm-Platten gezüchtet und ihre Protein C-Produktionsniveaus wurden gemessen. Kolonien, die zwischen 1,1 und 2,3 pg/Zelle/Tag produzierten, wurden für die Produktion von stabilen, Protein C- produzierenden Zellinien verwendet.
  • Expressionsvektor pDX/PC962 und Plasmid pKO-neo wurden mit dem Calciumphosphat-Verfahren in 293-Zellen co-transfiziert. Transfizierte Zellen wurde nach 48 Stunden in Medien verteilt, die 500 ug/ml G418 enthielten. Nach 10 Tagen in selektiven Medien wurden Immunfiltertests durchgeführt und zwei Klone wurden durch Zylinderklonierung ausgewählt. Es wurde festgestellt, daß die Protein C-Produktion im Bereich von 1 bis 2 ug/Zelle/Tag lag. Die Kulturen wurden im Maßstab hochgefahren und Protein C wurde durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt. Es wurde festgestellt, daß mehr als 95% des Proteins C in der zweikettigen Form vorlagen.
  • Die Struktur des mutanten 962-Proteins, hergestellt aus BHK- und 293-Zellen, wurde mit derjenigen von Wildtyp-Protein C aus 293-Zeilen und aus Plasma verglichen. Analyse durch SDS/PAGE, gefolgt von Silberanfärbung, zeigte, daß alle rekombinanten Proteine schwere und leichte Ketten enthielten, die mit denjenigen des Plasma-Proteins zusammen wanderten. Das Wildtyp-Protein C, das in 293-Zellen synthetisiert worden war, enthielt eine signifikante Menge (ungefähr 20%) von einzelkettigem, nicht-verarbeiteten Protein mit Mr = 66.000, wohingegen das mutante Protein, das in einem der beiden Zelltypen produziert worden war, nahezu vollständig zu zwei Ketten verarbeitet war. N-terminale Sequenzanalyse zeigte, daß sowohl die leichten als auch die schweren Ketten der rekombinanten Wildtyp- und mutanten BHK/PC962-Proteine richtig verarbeitet waren. Das Ausmaß der Gamma-Carboxylierung der rekombinanten Proteine wurde mit zwei verschiedenen ELISA- Systemen gemessen. Das erste System erkannte sowohl gammacarboxylierte als auch nicht-carboxylierte Formen des Proteins, während das zweite spezifische Antikörper verwendete, die nur Protein C erkennen, das eine glainduzierte Konformationsänderung in der Gegenwart von Calcium durchlaufen hat. Die Analyse zeigte, daß ungefähr 60% des rekombinanten Proteins C, das in BHK-Zellen produziert worden war, und 90%-95% desjenigen, das in 293-Zellen produziert worden war, genügend gamma-carboxyliert war, um durch die spezifischen Antikörper erkannt zu werden.
  • Die drei rekombinanten Proteine wurden auch auf Amidolyse- und Gerinnungshemmungsaktivität analysiert und die Ergebnisse wurden mit der Aktivität von Plasma-Protein C verglichen. PC962 aus BHK-Zellen und Wildtyp-Protein C aus 293-Zellen zeigten beide vollständige Amidolyseaktivität. Im Gerinnungshemmungstest hatte Protein C aus BHK-Zellen im wesentlichen dieselbe spezifische Aktivität wie Plasma-Protein C, wohingegen sowohl das Wildtyp- als auch das mutante PC962- Proteine aus 293-Zellen konsistent ungefähr 20% größere spezifische Aktivität zeigten. Eine Einheit Protein C- Aktivität ist definiert als die Menge in 1 ml normalem Humanplasma, die 4 ug Protein C pro 1 ml enthält (Gardiner und Griffin, Prog. Hematol. 13 : 265-278, 1983) (spezifische Aktivität = 250 Einheiten/mg). Wildtyp-Protein C, das in 293- Zellen produziert worden war, lag konsistent bei über 300 Einheiten/mg.
    • F. Expression von aktiviertem Protein C
  • Die cDNA-Sequenz für Protein C wurde durch ortsspezifische Mutagenese verändert, um den Teil zu deletieren, der das Aktivierungspeptid kodiert. Die veränderte Sequenz wurde dann in BHK- und 293-Zellen transfiziert und stabil transfizierte Zellen wurden selektioniert. Aktives Protein C wurde in Kulturmedien-Proben aus beiden Zellinien nachgewiesen.
  • Um die Aktivierungspeptid-Kodierungssequenz zu deletieren, wurde Plasmid p594 mit Sst I verdaut und das 880 bp lange Fragment wurde gereinigt und in die Sst I-Stelle von M13mp10 inseriert (Messing, Methods Enzymol. 101 : 20-77, 1983). Die 12 Aktivierungspeptid-Codons wurden durch Oligonukleotid-gerichtete Deletionsmutagenese (Zoller und Smith, DNA 3 : 479-488, 1984) unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids ZC829 (5' CTG AAA CGA CTC ATT GAT 3') deletiert. Replikativform-DNA wurde aus mutanten Phagenklonen hergestellt und mit Sst I verdaut. Das Protein C-Fragment ( 840 bp) wurde isoliert und in mit Sst I verdauten p594 inseriert. Die resultierenden Plasmide wurden auf richtige Orientierung des Sst I-Fragmentes durch Restriktionskartierung unter Verwendung von Bgl II gescreent. Ein richtiges Plasmid wurde selektioniert und mit pPC829 bezeichnet. Plasmid pPC829 wurde sequenziert, um das Vorhandensein der gewünschten Kodierungssequenz zu verifizieren.
  • Plasmid pPC829 wurde in tk&supmin;BHK-Zellen (mit Plasmid pSVDHFRT (Lee et al., Nature 294 : 228-232, 1982)) und 293-Zellen (mit pKO-neo (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 : 327-341, 1982)) durch Calciumphosphat-Mitfällung (Graham und van der Eb, aaO) co-transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Kulturmedien abgeerntet und mit ELISA auf Protein C getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Gleichzeitig wurden die Kulturen 1 : 5 in Medien verteilt, die 500 ug/ml G418 (293-Zellen) oder 250 nM Methotrexat (tk&supmin;BHK-Zellen) enthielten. Nach 10 Tagen in der Gegenwart selektiver Medien wurden stabil transfizierte Kolonien mit Immunfiltertest auf Protein C-Produktion gescreent.
  • Positive Kolonien wurden ausgewählt und in selektiven Medien (die, je nach dem, 500 ug/ml G418 oder 250 nM Methotrexat enthielten) für 10 Tage gezüchtet. Die Kulturmedien wurden mit Farbtest auf APC-Aktivität getestet. Die Medienproben wurden zu Mikrotitervertiefungen zugegeben, die 100 ul 0,2 mM Spectrozyme PCa (American Diagnostica #336) in 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl enthielten. Die Platten wurden bei 37ºC inkubiert und die A405 wurde in verschiedenen Zeitintervallen gemessen. Repräsentative Ergebnisse aus einer transfizierten 293-Zellinie (bezeichnet mit 829-20) sind in Fig. 11 dargestellt. Medien aus positiven Kolonien von Linie 829-20 zeigten konsistent höhere Aktivität mit dem Farbsubstrat für APC, als dies Kontrollmedien taten, die mit nichttransfizierten 293-Zellen für dieselbe Zeitdauer (10 Tage) inkubiert worden waren.
    • TABELLE 2 ÜBERGANGSEXPRESSION VON AKTIVIERTEM PROTEIN C (ELISA)
  • Zellinie Protein ng/ml in Medium
  • BHK 2,7
  • 293 30
  • Eine DNA-Sequenz, die einen Vorläufer für aktiviertes Protein C mit der Verarbeitungsstellensequenz Arg-Arg-Lys-Arg kodiert, wurde durch Mutagenese der Wildtyp-Protein C-Sequenz konstruiert. Die resultierende Sequenz (bezeichnet mit 1058) war analog zu derjenigen, die PC962 kodiert, ihr fehlte aber der Teil, der das Aktivierungspeptid kodiert (Tabelle 3).
  • Die Protein C-Sequenz, die in Plasmid p594 vorliegt, wurde in einer Einzelmutagenese verändert, um die Codons für das Aktivierungspeptid zu deletieren und die Arg-Arg-Codons an der Verarbeitungsstelle zu inserieren. Mutagenese wurde auf dem 870 bp langen Sst I-Fragment aus p594 durchgeführt, im wesentlichen wie oben beschrieben, unter Verwendung von Oligonukleotid ZC1058 (5' CGC AGT CAC CTG AGA AGA AAA CGA CTC ATT GAT GGG 3').
  • Die mutagenisierte Sequenz wurde verwendet, um Expressionsvektor pDX/PC1058 (analog zu pDX/PC962) zu konstruieren, und der Vektor wurde in BHK-Zellen cotransfiziert, wie oben beschrieben. Das Protein wurde auf einer Säule mit polyklonalem Antikörper gereinigt, die mit pH 11,5-Puffer eluiert wurde.
  • Die Aktivität des PC1058-Proteins wurde verglichen mit derjenigen von aktiviertem Plasma-Protein C und aktiviertem PC962. Plasma-Protein C und PC962 (5 ug/ml) wurden durch Behandlung mit 1/10 Volumenteil Protac C (American Diagnostica) für 2 Stunden aktiviert. Gerinnungshemmungsaktivität wurde getestet, indem 50 ul Humanplasma mit 50 ul aktiviertem Protein C kombiniert und die Mischungen bei 37ºC für 150 Sekunden inkubiert wurden. Zu dieser Mischung wurden 50 ul aktiviertes Cephaloplastin (American Scientific Products, McGaw Park, IL) zugegeben und die Mischung wurde bei 37ºC für 300 Sekunden inkubiert. 100 ul 20 mM CaCl&sub2; wurden zugegeben und die Gerinnungszeit wurde aufgezeichnet. Die Daten sind in Fig. 12 dargestellt.
    • G. Expression von aktiviertem Protein C und KEX2
  • Ein pDX/PC1058-transfizierter BHK-Klon (pDX/PC1058-3//BHK), der große Mengen Protein C produziert, wurde identifiziert und mit KEX2/Zem229 mit dem Calciumphosphat-Verfahren transfiziert. Transfizierte Zellen wurden mit 500 ug/ml G418 und 250 nM Methotrexat selektioniert.
  • Ein selektionierter Klon, bezeichnet mit KEX2-1058//BHK, wurde mit ³&sup5;S-Cystein in cysteinfreiem DMEM (Gibco), das 1% fötales Kalbsserum enthielt, für 24 Stunden pulsmarkiert. Die Kulturmedien wurden gesammelt und auf das Vorhandensein von einzelkettigem und gespaltenem, zweikettigen aktivierten Protein C durch Immunfällung mit einem monoklonalen Antikörper zu Protein C untersucht. 250 ul Medien wurden mit 10 ug Antikörper kombiniert und die Mischung wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. 100 ul Staph A-Zellsuspension (Pharmacia, Piscataway, NJ) wurden zugegeben und die Mischung wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und der Pellet wurde in 60 ul Gelpuffer, der 1% β-Mercaptoethanol enthielt, erneut suspendiert. Die Suspension wurde für 3 Minuten auf 100ºC erhitzt und dann einer Elektrophorese auf einem SDS- Polyacrylamidgel unterzogen. Proteine durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Der KEX2-1058//BHK-Klon zeigte ungefähr 100% Spaltung des Proteins in die zweikettige Form.
  • Aktiviertes Protein C wurde aus dem KEX2-1058//BHK-Klon hergestellt, der in Dulbecco's MEM, das min 10% fötalem Kalbsserum, 250 nM Methotrexat und 500 ug/ml G418 ergänzt worden war, bis zur Konfluenz gezüchtet worden war. Die konfluenten Zellen wurden in Dulbecco's MEM, das mit 1 ug/ml Fibronectin, 2 pg/ml Insulin, 5 ug/ml Transferrin, 5 ug/ml Vitamin K, 1· PSN-Antibiotikamischung (Gibco 600-5640), 2,0 mM L-Glutamin, 250 nM Methotrexat und 500 ug/ml G418 ergänzt worden war, überführt. Die Medien wurden alle 1 bis 2 Tage über einen Zeitraum von 7 Tagen gesammelt und bei 200 eingefroren. Die eingefrorenen Medienproben wurden aufgetaut und durch einen 0,45 um-Filter filtriert, um alle Zellbruchstücke zu entfernen. Festes Calciumchlorid wurde bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben und festes Natriumazid wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,02% (W/V) zugegeben. Aktiviertes Protein C wurde aus den Medien unter Verwendung einer Säule mit monoklonalem Antikörper entfernt, die für die Calcium-induzierte Konformation von Protein C spezifisch war. Die behandelten Medien wurden auf die Säule aufgebracht und aktivertes Protein C wurde TBS eluiert, das 10 mM EDTA enthielt. Protein C-Konzentration wurde durch Extinktion bei 280 nM und durch ELISA bestimmt.
  • Protein C-Aktivität wurde durch Gerinnungstest gemessen. Affinitätsgereinigtes Plasma-Protein C wurde mit ACC-C (Agkistrodon contortrix contortrix-Protease [Kisiel et al., J. Biol. Chem. 262 : 12607-12613, 1987], erhalten von W. Kisiel, University of New Mexico, Albuquerque, N.M.), verdünnt in 50 mM Tris, 100 mM NaCl und 0,1% Rinderserumalbumin, mit einem Verhältnis von 500 : 1 (APC:ACC-C) für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Affinitätsgereinigtes aktiviertes Protein C aus KEX2-1058//BHK-Zellen wurden für 2 Stunden für 37ºC inkubiert. Gerinnselbildung wurde in einem MLA Electra 800 Coagulation Timer (Medical Laborabory Automation, Inc., Pleasantville, NY) gemessen. 100 ul aktiviertes Plasma-Protein C oder aktiviertes KEX2-1058-Protein C wurden zu einer MLA-Küvette zugegeben und für 50 Sekunden erwärmt um die Temperatur auf 37ºC anzuheben. 100 ul Dade Actin ES (American Scientific Products) wurden zugegeben und die Testlösungen wurden für 100 Sekunden inkubiert. 100 ul 25 mM CaCl&sub2; wurden zu jeder Küvette zugegeben. Die für die Gerinnselbildung erforderliche Zeit wurde gemessen. Die Ergebnisse der Gerinnungstests zeigten, daß aktiviertes Protein C, das von KEX2-1058//BHK-Zellen produziert worden ist, ungefähr 100% aktiv ist, relativ zu aktiviertem Plasma-Protein C.
  • Die carboxy-terminale Sequenz der leichten Kette von KEX2- 1058-Protein C wurde verglichen mit der carboxy-terminalen Sequenz der leichten Kette von kommerziell erhältlichem Protein C (American Diagnostica), unter Verwendung von CNBr- Spaltung am einzigen Methionin-Rest der leichten Kette, um ein Peptid freizusetzen, das in seiner Gesamtheit durch N- terminale Sequenzanalyse sequenziert werden konnte.
  • Affinitätsgereinigtes Protein C aus KEX2-1058//BHK-Zellen, gezüchtet in Dulbecco's MEM, das mit 1% fötalem Kalbsserum, 250 nM Methotrexat und 500 ug/ml G418 ergänzt worden war, wurde zunächst durch die Zugabe eines zehnfachen molaren Überschusses (pro Cys-Rest) von Dithiothreit (DTT) in 0,2 M Tris-HCl, pH 8,3, und Guanidin-HCl bis zu einer Endkonzentration von 6,0 M reduziert. Die Mischung wurde bei 65ºC für 4-6 Stunden inkubiert. Iodessigsäure, pH 7,0, oder Iodessigsäureamid wurde zum reduzierten Protein in einem vierfachen molaren Überschuß gegenüber der molaren Konzentration von DTT hinzugegeben und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Lösung wurde gegen 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 8,5, für 24 Stunden bei 22ºC dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde auf eine HPLC-Poly-F-Säule (DuPont) aufgebracht, um die leichte Kette zu isolieren. Ein 500facher molarer Überschuß von CNBr pro Methionin-Rest wurde zur gereinigten leichten Kette in 70%iger Ameisensäure unter Stickstoff für 30 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkel zugegeben. Das CNBr-Verdauungs-produkt wurde auf einem Sequenator American Biosysbems Inc. Model 470A (Marine-on-St. Croix, MN) aufgebracht. Die resultierenden Sequenzen zeigten, daß die C-terminale Sequenz von sowohl dem kommerziell erhältlichen, gereinigten Protein C als auch dem KEX2-l058- Protein mit Glu endete, was zeigte, daß die leichten Ketten beider Proteine mit Aminosäure 149 enden.
    • H. Konstruktion und Expression von p1645/Zem229R.
  • Die DNA-Sequenz, die die Aminosäuren 9-11 des Aktivierungspeptids kodiert, das durch die Proteinsequenz von Plasmid p962 kodiert wird (Tabelle 3; die Aminosäuren, die zu der Sequenz hinzugefügt worden sind, die Wildtyp-Protein C kodiert, erscheinen fettgedruckt und Zwischenräume zwischen Aminosäuren werden nur verwendet, um die Sequenzen der leichten und der schweren Kette aneinander auszurichten), wurde durch eine DNA- Sequenz ersetzt, die die Aminosäuren Arg-Arg-Lys kodiert. Mit p1645 transfizierte Zellen sekretierten aktiviertes Protein C in die Kulturmedien. Plasmid p962 wurde mit Sal I und Sst I verdaut und das 730 bp lange Fragment wurde gereinigt und in M13mp10 inseriert, das durch Verdauung mit Sal I und Sst I linearisiert worden war. Die synthetischen Oligonukleotide ZC1645 (5' GAA GAC CAA ACA ACA AAA CGG CTC ATT GAT 3') und ZC550 (5' TCC CAG TCA CGA CGT 3') wurden verwendet, um die einzelsträngige Matrizen-DNA zu mutagenisieren, die aus der resultierenden Phage durch ortsgerichtete in-vitro-Mutagenese hergestellt worden war (Zoller und Smith, aaO). Die mutante Phage wurde einer Didesoxysequenzierung unterzogen, um die Mutagenese zu bestätigen. Replikativform(rf)-DNA aus einem bestätigten mutanten Klon, bezeichnet mit 1645t wurde hergestellt und wurde mit Sst I und Pst I verdaut, um das 411 bp lange Fragment zu isolieren. Plasmid p229/962 (Beispiel 3.E.) wurde mit Eco RI und Pst I verdaut, um das 592 bp lange Probein C-Fragment zu isolieren. Plasmid p229/962 wurde auch mit Eco RI und Sst I verdaut, um das 700 bp lange Protein C- Fragment zu isolieren. Das 411 bp lange Protein C-Fragment aus der 1645 rf, das 411 bp lange Protein C-Fragment aus p229/962 und das 700 bp lange Protein C-Fragment wurden in einer vierteiligen Ligation mit pZem229R verknüpft, das mit Eco RI linearisiert und mit Kalbs-Intestinalphosphatase behandelt worden war, um Selbstligation zu verhindern. (Plasmid pZem229R ist ähnlich zu Zem229, mit der Ausnahme, daß die Eco RI- Stellen durch teilweise Verdauung, Stumpfendigmachen durch Klenow-Einfüllung, Religation, anschließende Verdauung mit Bam HI und Religation mit Bam HI-Eco RI-Adaptoren zerstört worden sind.) Ein richtiges Plasmid wurde selektioniert und mit pPC1645/229R bezeichnet. Tabelle 3 Aminosäuresequenzen von Spaltungsstellen-Mutanten
  • Plasmid pPC1645/229R wurde in tk&supmin;BHK-Zellen durch Calciumphosphat-Mitfällung (Graham und van der Eb, aaO) transfiziert. Transfizierte Zellen wurden einer Selektion mit 1 uM Methotrexat unterzogen und Medien wurden mit ELISA auf Protein C getestet (Beispiel 3.E.). Ein positiver Klon wurde in Dulbecco's MEM, das mit 10% fötalem Kalbsserum und 1 uM Methotrexat ergänzt worden war, gezüchtet, bis die Zellen Konfluenz erreichten. Die konfluenten Zellen wurden in Dulbecco's MEN, das mit 1% fötalem Kalbsserum und 1 uM Methotrexat ergänzt worden war, überführt. Die Medien wurden alle 1; bis 2 Tage über einen Zeitraum von 7 Tagen gesammelt und bei -20ºC eingefroren. Die eingeforeren Medienproben wurden aufgetaut und durch einen 0,45 um-Filter filtriert, um alle Zellbruchstücke zu entfernen. Festes Calciumchlorid wurde bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben und festes Natriumazid wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,02% (W/V) zugegeben. Protein C wurde aus den Medien unter Verwendung einer Säule mit monoklonalem Antikörper gewonnen, die für die Calcium-induzierte Konformation von Protein C spezifisch war. Die behandelten Medien wurden auf die Säule aufgebracht und Protein C wurde mit TBS, das 10 mM EDTA enthielt, eluiert. Protein C-Konzentration wurde durch Extinktion bei 280 nM und durch ELISA bestimmt.
  • Aktiviertes Protein C, das aus pPC1645/229-transfizierten Zellen hergestellt worden war, wurde mit einer äquivalenten Menge von PC229/962-Protein C, das aus transfizierten Zellen hergestellt worden war, unter Verwendung eines Farbtests verglichen. Ein ug affinitätsgereinigtes Protein C, verdünnt in 40 ul TBS + EDTA, wurde zu jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben. 40 ul 2 mM Spectrozyme PCa (American Diagnostica Inc., New York, NY) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und bei 37ºC inkubiert, bis genügende Farbentwicklung auftrat. Aktivität wurde als ein Anstieg in der Extinktion bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse zeigten, daß das aktivierte Protein C, das von pPC1645/229 transfizierten Zellen produziert worden war, 5-10% aktiver war als das von PC229/962 produzierte Protein C.
    • I. Konstruktion und Expression von pPC1880/229R
  • Die DNA-Sequenz, die Protein C in Plasmid 1645 kodiert, wurde weiter modifiziert, um die erste, zweite, siebente und achte Alainosäure des Aktivierungspeptids (Tabelle 3) zu entfernen. Einzelsträngige 1645-Matrizen-DNA wurde hergestellt und wurde ortsgerichteter in-vitro-Mutagenese (Zoller und Smith, aaO) unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide ZC1880 (5' AAA CGA GAC ACA GAC CAA AGA AGA 3') und ZC550 unterzogen. Positive Klone wurden einer Didesoxysequenzierung unterzogen, um die Mutagenese zu bestätigen. Ein positiver Klon wurde identifiziert und wurde mit 1880 bezeichnet.
  • Replikativform-DNA, hergestellt aus Klon 1880, wurde mit Sst I und Pst I verdaut, um das 411 bp lange Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wurde mit Eco RI und Pst I verdaut, um das 562 bp lange Protein C-Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wurde auch mit Eco RI und Pst I verdaut, um das 562 bp lange Protein C-Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wurde auch mit Eco RI und Pst I verdaut, um das 700 bp lange Protein C-Fragment zu isolieren. Das 411 bp lange Protein C-Fragment aus der 1880 rf und die 700 bp und 562 bp langen Fragmente aus PC229/962 wurden mit pZem229R, das mit Eco RI verdaut worden war, in einer vierteiligen Ligation verknüpft. Ein richtiges Plasmid wurde selektioniert und wurde mit pPC1880/229R bezeichnet.
  • Plasmid pPC1880/229R wurde in tk&supmin;BHK-Zellen transfiziert und getestet, wie zuvor beschrieben.
    • J. Konstruktion und Expression von pPC1954/229R
  • Die Kodierungssequenz des Aktivierungspeptids, die in Plasmid 1645 vorliegt, wird verändert, um den zweiten bis siebenten Aminosäurecodon des Aktivierungspeptids zu entfernen, was zu einer Fusion zwischen dem ersten und achten Aminosäurecodon des Aktivierungspeptids, der in 1645 vorliegt, führt. Einzelsträngige 1645-Matrizen-DNA wird hergestellt und ortsgerichteter in-vitro-Mutagenese unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide ZC1954 (5' GAG AAG AAA ACG AGA CCA AAG AAG AAA AC 3') und ZC550 unterzogen. Positive Klone werden sequenziert, um die Mutagenese zu bestätigen. Ein positiver Klon wird selektioniert und mit 1954 bezeichnet. Die Aminosäuresequenz an der Verknüpfungsstelle der leichten und der schweren Kette des kodierten Proteins ist in Tabelle 3 dargestellt.
  • Replikativform-DNA wird aus Klon 1954 hergestellt und wird mit Sst I und Pst I verdaut, um das ungefähr 400 bp lange mutagenisierte Protein C-Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wird mit Eco RI und Pst I und mit Sst I und Eco RI verdaut, um das 562 bp lange Eco RI-Pst I-Fragment bzw. das 700 bp lange Protein C-Fragment zu isolieren. Das ungefähr 400 bp lange Protein C-Fragment aus der 1954 rf und die 700 bp und 562 bp langen Fragmente aus PC229/962 werden mit pZem229R, das mit Eco RI verdaut worden ist, in einer vierteiligen Ligation verknüpft. Ein richtiges Plasmid wird selektioniert und mit pPC1954/229R bezeichnet.
  • Plasmid pPC1954/229R wird in tk&supmin;BHK-Zellen durch Calciumphosphat-Mitfällung transfiziert. Zellen werden selektioniert und getestet, wie zuvor beschrieben.
    • K. Konstruktion und Expression von pPC1953/229R
  • Die Kodierungssequenz des Aktivierungspeptids, die in Plasmid 1645 vorliegt, wird verändert, um den ersten bis achten Aminosäurecodon des Aktivierungspeptids zu entfernen, was zu einer Fusion zwischen dem ersten und dem zweiten Satz von Arg- Arg-Lys-Arg-Aminosäurecodons, die in 1645 vorliegen, führt. Einzelsträngige 1645-Matrizen-DNA wird hergestellt und wird ortspezifischer in-vitro-Mutagenese unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide ZC1953 (5' ACC TCA GAA GAA AAC GAA GAA GAA AAC GGC TCA T 3') und ZC550 unterzogen. Positive Klone werden sequenziert, um die Mutagenese bestätigen. Ein positiver Klon wird selektioniert und mit 1953 bezeichnet. Die Aminosäuresequenz der Verbindungsstelle zwischen der leichten Kette und der schweren Kette des kodierten Proteins ist in Tabelle 3 dargestellt.
  • Replikativform-DNA wird aus Klon 1953 hergestellt und wird mit Sst I und Pst I verdaut, um das ungefähr 400 bp lange mutagenisierte Protein C-Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wird mit Eco RI und Pst I und mit Sst I und Eco RI verdaut, um das 562 bp lange Eco RI-Pst I-Fragment bzw. das 700 bp lange Protein C-Fragment zu isolieren. Das ungefähr 400 bp lange Protein C-Fragment aus der 1953 rf und die 700 bp und 562 bp langen Fragmente aus PC229/962 werden mit pZem229R, das mit Eco RI verdaut worden ist, in einer vierteiligen Ligation verknüpft. Ein richtiges Plasmid wird selektioniert und wird mit pPC1953/229R bezeichnet. Plasmid pPC1953/229R wird in tk&supmin; BHK-Zellen durch Calciumphosphat-Mitfällung transfiziert Zellen werden selektioniert und getestet, wie zuvor beschrieben.
    • Beispiel 4 Co-Expression der Gerinnungsfaktoren VII und IX
  • Plasmid FIX/pD2 (Busby et al., Nature 316 : 271-273, 1985) wurde mit Bam HI verdaut und das 1,4 kb lange Faktor IX-Fragment wurde gewonnen. Dieses Fragment wurde dann mit pD5' verknüpft, das mit Bam HI verdaut und mit Kalbsintestinal-Phosphatase behandelt worden war. Das resultierende Plasmid wurde mit FIX/pD5' bezeichnet.
  • Um Faktor VII und Faktor IX zu co-exprimieren, wurden 10 ug EIX/pD5', 10 ug FVII(565-2463)/pDX (Hagen et al., EP 200,421; ATCC 40205) und 1 ug DHFRres-pD5' (ein von pD5' abgeleitetes Plasmid, das ein Methotrexat-resistentes DHFR-Gen enthält) [Levinson et al., EP 117,060]) verwendet, um tk&supmin;BHK-Zellen zu transfizieren. Transfizierte Zellen wurden in der Gegenwart von Methotrexat selektioniert, dann auf Produktion von Faktor VII und Faktor IX durch Immunfiltertests unter Verwendung von Antikörpern zu beiden Proteinen getestet. Kolonien, die sowohl für Faktor VII- als auch für Faktor IX-Produktion positiv waren, wurden selektioniert, hochgezüchtet und mit ³&sup5;S-Cystein gepulst. Kulturmedien und intrazelluläre Proteine wurden mit den Faktor VII- und IX-Antikörpern immungefällt und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Zellen, die Faktor VII und Faktor IX co-exprimierten, produzierten zweikettigen Faktor VII (d. h. Faktor VIIa). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die nur Faktor VII produzierten, nur die einzelkettige Form des Proteins (Fig. 13).
    • Beispiel 5 Co-Expression in Saccharomyces cerevisiae
  • Das S. cerevisiae-BAR1-Gen kodiert ein als Barrier bekanntes sekretiertes Protein. Der sekretorische Peptidteil des BAR1- Genproduktes oder das sekretorische Peptid plus der dritten (C-terminalen) Domäne von Barrier kann verwendet werden, um die Sekretion fremder Proteine, die in S. cerevisiae produziert werden, zu erleichtern (MacKay, WO 87/02670 und MacKay et al., Europäische Patentanmeldung 88 116 335.6, die beide hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einbezogen sind).
  • Wie in der europäischen Patentanmeldung 88 116 335.6 beschrieben, wurde ein Expressionsvektor konstruiert, der die Sequenz enthielt, die das Signalpeptid und die dritte Domäne von Barrier kodiert, verknüpft mit der Kodierungssequenz für den B(1-29)Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Insulinvorläufer (Markussen et al., EP 163,529; hierin im weiteren als M1-3 bezeichnet) Dieser Vektor, bezeichnet mit pSW195 (Fig. 14), enthält den Hefe-TPI1-Promotor und -Terminator. Die Barrier- und Insulin- Sequenzen werden mit der Aminosäuresequenz Lys-Arg verknüpft.
  • Um die Verarbeitung des Fusionsproteins durch Thrombin zu ermöglichen, wurde die Lys-Arg-Verknüpfungssequenz zu Pro-Arg mutagenisiert. Spaltung an dieser Stelle durch Thrombin wird zur Sekretion des nicht-gebundenen Insulinvorläufers führen.
  • Wie in Fig. 14 dargestellt, wurde Plasmid pSW195 mit Sph I und Sal I verdaut, um das 1,7 kb lange Fragment zu isolieren, das die BAR1-Insulinfusion und den TPI1-Terminator umfaßte. Dieses Fragment wurde mit M13mp18 ligiert, der zuvor vollständig mit Sph I und Sal I verdaut worden war. Der resultierende Phagenklon wurde mit mp18-ZV172 bezeichnet. Oligonukleotid ZC1083 (5' TCC TTG GAT CCA AGA TTC GTT 3') wurde verwendet, um mp18-ZV172 unter Verwendung des Uracilverfahrens zu mutagenisieren (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 488-492, 1985). Die resultierenden Mutanten wurden sequenziert, um die Mutagenese zu bestätigen, und ein positiver Klon wurde mit ZV172/1083 bezeichnet. Aus Gründen der Bequemlichkeit wurde das Insert, das in ZV172/1083 vorliegt, in pUC18 subkloniert. Das 1,7 kb Sph I-Sal I-Insert aus ZV172/1083 wurde isoliert und mit pUC18 ligiert, der zuvor vollständig mit Sph I und Sal I verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pZV180, wurde vollständig mit Sal I verdaut. Die kohäsiven Enden des linearisierten ZV180 wurden unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) stumpfendig gemacht und an kinasierte Bgl II-Linker ligiert. Überschüssige Linker wurden durch Verdauung mit Bgl II entfernt. Die mit Linker versehene DNA wurde dann vollständig mit Sph I geschnitten, um das 1,7 kb lange Insert zu isolieren. Das 1,7 kb lange Insert, das einen Teil des TPI1- Promotors, die BAR1-MI-3-Fusion und den TPI1-Terminator umfaßte, wurde in Sph I-Bam HI-Teil-TPI1-Promotor- Vektorfragment von Plasmid pSW207 ligiert, um pSV187 zu konstruieren. (pSW207 wurde abgeleitet von pCPOT [ATCC 39685] indem das 750 bp lange Sph I-Bam HI-Fragment von pCPOT, das 2- (Mikron- und pBR322-Sequenzen enthielt, durch ein 186 bp langes Sph I-Bam HI-Fragment ersetzt wurde, das abgeleitet ist von dem pBR322-Tetracyclin-Resistenz-Gen; die Sph I-Stelle zerstört und eine Not I-Stelle in das Tetracyclin-Resistenz- Gen inseriert wurde; das resultierende Plasmid mit Not I und Bam HI verdaut wurde; und ein Not I-Bam HI-TPI1- Promotorfragment anstelle der von pBR322 abgeleiteten Not I- Bam HI-Sequenz inseriert wurde).
  • Die Thrombin-cDNA wird aus einer Prothrombin-cDNA isoliert, die in die Pst I-Stelle von pBR322 kloniert ist (Friezner- Degan et al., aaO). Das KEX2-Gen aus p1515 (Beispiel 3) wird verdaut und manipuliert, um die katalytische Domäne zu entfernen, und die restlichen Sequenzen werden mit der Thrombin-cDNA verknüpft. Eine Expressionseinheit wird hergestellt, indem das hybride Gen mit dem TPI1-Promotor und - Terminator verknüpft wird. Die Kodierungsregion des Hefe-BAR1- Gens wird dann durch diese Expressionseinheit ersetzt. Das resultierende Konstrukt, das die Expressionseinheit, flankiert von BAR1-Gen-Nichtkodierungs-Sequenzen, umfaßt, wird verwendet, um S. cerevisiae zu transformieren. Die transformierten Zellen werden kultiviert und auf Produktion von Thrombin durch Enzymaktivitätstest gescreent. Eine für Thrombin-Produktion positive Kolonie wird dann mit pZV187 transformiert. Die Zellen werden kultiviert und der Insulinvorläufer wird aus den Medien isoliert.
  • Aus dem vorstehenden wird man anerkennen, daß, obgleich besondere Ausführungsformen der Erfindung hierin zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen durchgeführt werden können, ohne den Geist und den Schutzumfang der Erfindung zu umgehen. Demgemäß soll die Erfindung nicht beschränkt werden, mit Ausnahme durch die beigefügten Ansprüche.
  • ATCC 20699, 39685, 53347 und 67569 sind alles Hinterlegungen, die unter dem Budapester Vertrag durchgeführt worden sind, und wurden durchgeführt am 13. April 1984, 9. Mai 1984, 10. Dezember 1985 bzw. 3. Dezember 1987.
  • Die United States Patent Application No. 053412 ist verfügbar.
  • Die in der vorstehenden Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in jeder ihrer Kombinationen, Gegenstand für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.

Claims (14)

  1. l. Eine eukaryontische Wirtszelle, die transfiziert oder transformiert mit einer ersten DNA-Sequenz ist, die ein interessierendes Protein kodiert, daß ausgewählt ist aus t-PA, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, aktiviertem Protein C, Protein S, Plasminogen, Insulin und Derivaten und Analoga derselben, und wenigstens einer zusätzlichen DNA- Sequenz kodiert, wobei besagte zusätzliche DNA-Sequenz ein Protein, das das interessierende Protein verarbeitet oder stabilisiert.
  2. 2. Die Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die eukaryontische Wirtszelle eine Säugetier-Wirtszelle oder eine Hefe-Wirtszelle ist.
  3. 3. Die Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die zusätzliche DNA- Sequenz ausgewählt ist aus Sequenzen, die Proteasen, Protease- Inhibitoren und Proteine, die sich an das interessierende Protein binden, kodieren.
  4. 4. Die Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die erste DNA-Sequenz Faktor VII kodiert und die zusätzliche DNA-Sequenz Faktor IX kodiert.
  5. 5. Die Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die erste DNA-Sequenz Protein C oder aktiviertes Protein C kodiert und die zusätzliche DNA-Sequenz das Hefe-KEX2-Gen kodiert.
  6. 6. Die Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die erste DNA-Sequenz t-PA kodiert und die zusätzliche DNA-Sequenz einen Protease- Inhibitor kodiert, der ausgewählt ist aus TIMP, Trypsin- Inhibitoren und Aprotinin.
  7. 7. Die Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die erste DNA-Sequenz Plasminogen kodiert und die zusätzliche DNA-Sequenz alpha-1- Antitrypsin oder eine Variante desselben kodiert.
  8. 8. Die Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die erste DNA-Sequenz Protein C kodiert und die zusätzliche DNA-Sequenz Protein S kodiert.
  9. 9. Die Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die erste DNA-Sequenz Faktor VII kodiert und die zusätzliche DNA-Sequenz Gewebefaktor kodiert.
  10. 10. Ein Verfahren zur Herstellung eines interessierenden Proteins, welches umfaßt:
    Kultivieren einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1-9 unter Bedingungen, die es ermöglichen, daß die erste DNA- Sequenz und die zusätzliche(n) DNA-Sequenz(en) exprimiert werden; und
    Isolieren des interessierenden Proteins aus der Wirtszelle.
  11. 11. Das Verfahren nach Anspruch 10, welches vor dem Kultivationsschritt Co-Transfektion oder Co-Transformation der Wirtszelle mit mehreren Vektoren, die jeder eine separate Expressionseinheit enthalten, einschließt.
  12. 12. Das Verfahren nach Anspruch 10, welches vor dem Kultivationsschritt Transfektion oder Transformation der Wirtszelle mit einem einzelnen Vektor, der mehrere Expressionseinheiten enthält, einschließt
  13. 13. Das Verfahren nach Anspruch 10, welches vor dem Kultivationsschritt Transfektion der Wirtszelle mit einem einzelnen Vektor einschließt, der eine einzelne Expressionseinheit enthält, die in eine polycistronische Botschaft transkribiert wird, wobei die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.
  14. 14. Säugetierzellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert sind, der in der Lage ist zur Integration in Säugetier-Wirtszell-DNA, wobei der Expressionsvektor einen Promotor umfaßt, der operabel verknüpft ist mit einer DNA- Sequenz, die für ein Protein kodiert, das im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie menschliches aktiviertes Protein C besitzt, wobei besagte Sequenz außerdem für die Aminosäuresequenz L-R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4;-X-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-R&sub8;-H, kodiert, worin L im wesentlichen die leichte Kette von aktiviertem Protein C ist, R&sub1;-R&sub8; Lys oder Arg sind, X eine Peptidbindung oder ein Abstandspeptid mit 1-12 Aminosäuren ist und H im wesentlichen die schwere Kette von aktiviertem Protein C ist, wobei besagte Zellen außerdem mit dem KEX1- oder KEX2-Gen von Saccharomyces cerevisiae transfiziert sind.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5648254A (en) * 1988-01-15 1997-07-15 Zymogenetics, Inc. Co-expression in eukaryotic cells
FR2645174B1 (fr) * 1989-03-31 1994-01-07 Transgene Sa Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant
US5879926A (en) * 1989-03-31 1999-03-09 Transgene S.A. Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin
NL9000917A (nl) * 1989-10-25 1991-05-16 Holland Biotechnology Farmaceutisch preparaat met endoproteolytische activiteit; werkwijze voor endoproteolytische processing van (precursor) eiwitten en voor de (micro) biologische bereiding van eiwitten.
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
JP3153236B2 (ja) * 1989-12-22 2001-04-03 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 端が切り取られた軽鎖を有する組換えプロテインｃ
US5116944A (en) * 1989-12-29 1992-05-26 Neorx Corporation Conjugates having improved characteristics for in vivo administration
EP0506821B1 (de) * 1989-12-29 1998-02-04 Zymogenetics, Inc. Hybrides protein c
US5358932A (en) * 1989-12-29 1994-10-25 Zymogenetics, Inc. Hybrid protein C
WO1991012320A1 (en) * 1990-02-09 1991-08-22 Zymogenetics, Inc. Activated protein c with truncated light chain
EP0477739A3 (en) * 1990-09-27 1992-12-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Glycosyl-phosphatidylinositol-specific phospholipase d
ATE158816T1 (de) * 1990-11-26 1997-10-15 Genetics Inst Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung
US5965789A (en) * 1991-01-11 1999-10-12 American Red Cross Engineering protein posttranslational modification by PACE/furin in transgenic non-human mammals
NL9102009A (nl) * 1991-11-29 1993-06-16 Stichting Katholieke Univ Produktie van bioactieve peptiden met recombinante cellen.
US6348327B1 (en) 1991-12-06 2002-02-19 Genentech, Inc. Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells
WO1993022448A1 (en) * 1992-05-01 1993-11-11 Teijin Limited Fed batch culture method for protein secreting cells
US5474914A (en) * 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
DK52293D0 (de) * 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
US5639940A (en) 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
DK0732340T3 (da) * 1995-03-14 2004-10-25 Akzo Nobel Nv Ekspression af porcine reproduktions- og respirationssyndromviruspolypeptider i den samme celle
US5851800A (en) * 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
JP2001500732A (ja) * 1996-09-11 2001-01-23 オーソ―マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 前立腺がんを治療するためのＴＮＦ―β様タンパク質、ならびに関連する核酸分子、医薬組成物および方法
EP0941312A1 (de) * 1996-09-24 1999-09-15 The Procter & Gamble Company Menschlicher kdel-rezeptor
GB2318732A (en) 1996-11-01 1998-05-06 Johnson & Johnson Medical Wound healing compositions containing alpha-1-antitrypsin
DK1012307T3 (da) * 1997-08-22 2005-09-05 Roche Diagnostics Gmbh Autokatalytisk aktiverbare zymogene proteaseforstadier og deres anvendelse
ATE408020T1 (de) 1998-11-06 2008-09-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Verfahren zur herstellung von faktor vii
US20020094340A1 (en) 1998-12-01 2002-07-18 Andrew D. Murdin Chlamydia antigens and corresponding dna thereof
WO2008135498A2 (en) * 2007-05-04 2008-11-13 Novo Nordisk A/S Prevention of protein degradation in mammalian cell cultures

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1207253A (en) * 1981-08-17 1986-07-08 Lee D. Simon T4 dna fragment as a stabilizer for proteins expressed by cloned dna
WO1985001959A1 (en) * 1983-11-02 1985-05-09 Integrated Genetics, Inc. Production of heterodimeric human fertlity hormones
WO1987004187A1 (en) * 1986-01-03 1987-07-16 Genetics Institute, Inc. METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII:c-TYPE PROTEINS
IL83192A (en) * 1986-07-18 1992-11-15 Gist Brocades Nv Method for the preparation of proteins with factor viii activity by microbial host cells;expression vectors,host cells,antibodies
EP0302925A4 (de) * 1987-01-30 1989-04-24 Biogen Nv Verfahren zur herstellung vom faktor viii in hoher ausbeute.
CA1331157C (en) * 1987-04-06 1994-08-02 Randal J. Kaufman Method for producing factor viii:c-type proteins

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Publication number Publication date
AU2670688A (en) 1989-06-08
ES2059478T3 (es) 1994-11-16
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EP0319944A2 (de) 1989-06-14
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EP0319944B1 (de) 1994-09-21

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