IT9021178A1

IT9021178A1 - Derivati della prourochinasi

Info

Publication number: IT9021178A1
Application number: IT021178A
Authority: IT
Inventors: Anna Brandazza; Jacqueline Lansen; Gaetano Orsini; Paolo Sarmientos
Original assignee: Erba Carlo Spa
Priority date: 1990-08-02
Filing date: 1990-08-02
Publication date: 1992-02-02
Also published as: DE4125193A1; JPH04252184A; GB9116457D0; IT9021178A0; IT1243774B; GB2247022A

Description

DESCRIZIONE

Il processo della coagulazione del sangue, o processo emostatico, è di vitale importanza.

Difatti la formazione di un coagulo che si manifesta in seguito ad un danno di un tessuto impedisce un'eccessiva perdita di sangue e, allo stesso tempo, riduce la possibilità di entrata di microorganismi potenzialmente patogeni.

Una volta arrestata l'emorragia e avvenuta la riparazione tissutale, il coagulo viene spontaneamente dissolto mediante l'intervento di un sistema fibrinolitico. Quest'ultimo, come d'altra parte anche il sistema della coagulazione, è costituito da una serie di enzimi e cofattori che, attivandosi vicendevolmente, portano alla formazione finale di plasmine, in grado di degradare in frammenti solubili la massa di fibrina insolubile che costituisce il coagulo (1). Esistono tuttavia situazioni patologiche in cui un coagulo, formatosi all'interno di un vaso sanguigno non necessariamente per arrestare un processo emorragico ma come risposta allo stimolo pro-coagulante rappresentato da alterazioni morfofunzionali della parete vascolare, ne riduce progressivamente il lume. In tale situazione, definita trombosi, un'insufficienza del sistema fibrinolitico può portare ad una riduzione del flusso sanguigno all ' interno del vaso con conseguenze ipossiche od anossiche per i tessuti interessati (2).

Le aritmie cardiache su base tromboembol ica, l ' infarto del miocardio, l 'angina pectoris, l ’embolia polmonare, gli ictus, le trombosi venose profonde, le arteriopatie periferiche occlusive costituiscono manifestazioni cliniche di questa alterazione di funzionamento del sistema emostatico e fibrinolitico in quanto riconducibili alla occlusione di uno 0 più vasi sanguigni per lo sviluppo di un trombo.

Queste malattie rappresentano la più importante causa di mortalità nelle civiltà industrializzate. In una indagine condotta negli Stati Uniti, in Giappone, in Germania Occidentale, Regno Unito, Francia, Italia e Spagna è emerso che il 46,3% della mortalità totale nella popolazione è attribuibile a cause di natura trombolitica.

Per ridurre l ' incidenza di mortalità a seguito di un fenomeno trombotico, ricercatori e compagnie farmaceutiche di tutto il mondo hanno lavorato per l 'individuazione e lo sviluppo di farmaci in grado di promuovere la lisi dei trombi.

Questi farmaci vengono identificati con il termine di fibrinol itici o, più comunemente, di t rombo litici.

1 primi farmaci trombolitici commercialmente disponibili sono stati la streptokinasi (SK) e l 'urokinasi (UK) (3,4).

La loro efficacia nei confronti della terapia anticoagulante nel trattamento del le malattie tromboemboliche (trombosi venosa profonda e embol ia polmonare) è stata ampiamente dimostrata da numerosi studi cl inici condotti negl i ultimi 10 anni (3, 5, 6, 7, 8).

Nonostante tali significative premesse, l 'uso clinico di questi agenti trombol itici è sempre stato contenuto e limitato ai centri dotati di unità special istiche a causa principalmente del rischio di complicazioni emorragiche associate al trattamento.

SK e UK vengono oggi indicati con il termine di agenti trombolitici di la generazione.

Al contrario, l 'attivatore tessutale del plasminogeno (t-PA) (9) e più recentemente la pro-urochinasi umana (pro-UK) ( 10) , entrambi proteine natural i , risultano essere deboli attivatori del plasminogeno circolante ma forti attivatori del plasminogeno legato ai coaguli di fibrina. In altre parole queste molecole non causano una degradazione sistemica dei fattori della coagulazione nè di alfa 2-antiplasmina e quindi il loro uso cl inico presenta minori rischi emorragici (11 , 12, 13).

La presente invenzione riguarda derivati del la prourochinasi che presentano proprietà enzimatiche e f ibrinol itiche migliorate rispetto al la pro-UK e che quindi offrono possibil ità di trattamenti trombo litici alternativi.

La Pro-UK è una proteina avente una struttura a singola catena di 411 aminoacidi , 12 ponti disolfuro, glicosilata in posizione 302 e con un peso molecolare di 54 Kd ( 14).

In vitro è proteoi 1 iticamente inattiva e può essere trasformata nella forma attiva ad opera della plasmine che idrol izza specificamente il legame peptidico tra gli aminoacidi lys 158- ile 159 generando una struttura a doppia catena unita da un ponte disolfuro (UK) .

La catena A (20.000 daltons ) contiene 157 aminoacidi ed un dominio detto "kringle" . Questa catena presenta inoltre il dominio responsabi le per il legame ad un recettore cel lulare ( 15) .

La catena B (30.000 daltons) consiste di 253 aminoacidi e contiene il dominio catal itico.

Nel la molecola del la Pro-UK la plasmine è in grado di operare un' idrolisi anche fra gli amminoacidi glul43-leul44 generando una molecola a basso peso molecolare biologicamente attiva (16) .

Questo secondo sito di taglio presenta una specificità per la plasmine inferiore rispetto al primo.

Per meglio comprendere le caratteristiche del la presente invenzione, si farà qui di seguito specifico riferimento agli uniti disegni in cui :

- La Fig. 1 è una rappresentazione schematica del la prourochinasi umana e dei suoi possibi l i ponti disolfuro. La struttura bidimensionale è ricavata sul la base di omologie con altre proteasi seriniche. Le frecce indicano i punti di taglio in urochinasi a doppia catena ad alto e basso peso molecolare

- La Fig. 2 è una rappresentazione schematica del plasmide pFC 16 utilizzato per l'espressione del gene codificante per la prourochinasi umana in E. coli. I derivati della prourochinasi umana sono stati prodotti con p 1 asini d Ί strettamente isogenici.

- La Fig. 3 è una schema dell'approccio di mutagenesi utilizzato per isolare i geni codificanti per i derivati della prourochinasi umana. 6 primers sono stati sintetizzati. Tra questi, 02, 03 e 06 contengono le modifiche desiderate, rispettivamente 138-Glu, 139-Glu e 303-Glu. Inoltre 02, 03 e 04 portano un’ulteriore modifica che crea un sito di restrizione Mrol che comunque non altera la sequenza amminoacidica della prourochinasi umana. - La Fig. 4 è uno schema riassuntivo delle manipolazioni generiche effettuate per isolare i plasmidi pFC146, pFC 147 e pFC148.

Nella struttura della Pro-UK si distinguono 3 domini (Fig. 1):

- il "finger"

- il "kringle"

- la regione proteolitica.

Il "finger" (aa. cysll-ser47) contiene il sito di interazione della molecola con il recettore specifico cellulare per l 'UK. Il "kringle" (aa. Iys48-lysl35) è molto simile a quelli contenuti nelle molecole del plasminogeno e del t-PA, che sono deputati al legame alla fibrina. A differenza di questi ultimi, però, non sembra avere nessuna specifica affinità per la fibrina.

La regione proteolitica (aa. lys 136-1 eu4 Π ) contiene il sito che interagisce con il plasminogeno.

Utilizzando tecniche di inutagenesi sito-specifica, abbiamo effettuato diverse sostituzioni aminoacidiche all ' interno della regione proteolitica.

Inaspettatamente, abbiamo trovato che i derivati ottenuti introducendo residui aminoacidi carichi negativamente al posto delle serine in posizione 138 e/o 139 e/o 303, una volta convertiti nella forma attiva a doppia catena, si dimostrano più resistenti al Γ inattivazione da parte di inibitori plasmatici come il "PAI-1" (plasminogen activator-inhibitor-1 ) rispetto alla pro-UK.

Tali derivati mantengono peraltro le proprietà enzimatiche e fibrinol itiche della pro-UK e offrono quindi la possibilità di effettuare un trattamento fibrinol itico migliorato grazie al fatto che le rispettive attività enzimatiche risultano meno sensibili all’ inattivazione da parte degli inibitori plasmatici .

La presente invenzione si riferisce a derivati dell 'inzima f ibrinol itico umano pro-urochinasi (pro-UK) o di suoi analoghi e al processo per la loro preparazione mediante tecnologie di DNA ricombinante.

Sono compresi nello scopo dell ’ invenzione anche i geni strutturali codificanti per detti derivati, i vettori plasmidici contenenti detti geni e gli opportuni ospiti batterici trasformati con detti vettori.

Un primo oggetto dell ' invenzione è perciò costituito da derivati della prourochinasi umana, o di suoi analoghi, caratterizzati da una minore affinità nei confronti di inibitori plasmatici come il "PAI-1" (plasminogen activator inhibitor) e dal mantenimento delle proprietà enzimatiche e fibrinolitiche della molecola naturale.

Gli analoghi della prourochinasi umana possono essere, ad esempio, mutanti per delezione, inserzione o inversione della stessa pro-urochinasi umana come pure i corrispondenti enzimi, naturali o di sintesi, ottenuti da specie diverse da quella umana, ad esempio da bovino, da ovino o in generale da mammifero.

In particolare l 'invenzione si riferisce a derivati della prourochinasi umana o di suoi analoghi in cui da uno a tre residui aminoacidici presenti nella sequenza della proteina, sono stati sostituiti da altrettanti aminoacidi carichi negativamente. In particolare i residui di Serina in posizione 138 e/o in posizione 139 e/o in posizione 303 sono stati sostituiti da acido aspartico o acido glutammico, preferibilmente acido glutammico.

Costiuisce inoltre oggetto del la presente invenzione un metodo di produzione dei derivati descritti attraverso la tecnologia del DNA ricombinante.

Secondo questo metodo detti derivati vengono ottenuti per rnutagenesi sito-specifica del gene codificante la pro-urochinasi o i suoi analoghi e successiva introduzione dei geni mutati in un opportuno vettore di espressione capace di dirigere la sintesi dei nuovi derivati in un microorganismo ospite adeguato.

Un ulteriore oggetto del l ' invenzione è rappresentato dai geni comprendenti poi inucleotidi sintet izzati chimicamente e codificanti i derivati del la pro-urochinasi sopra def initi . Costituiscono altresi oggetto del la presente invenzione vettori di espressione ricombinante contenenti detti geni e capaci di dirigere la sintesi di detti derivati .

L ' invenzione ha inoltre come oggetto anche i microorganismi ospiti trasformati con detti vettori di espressione e quindi in grado di produrre detti derivati .

Infine sono compresi nel lo scopo del l ' invenzione le composizioni farmaceutiche contenenti i derivati del la pro-urochinasi sopra definiti assieme ad uno o più eccipienti e/o diluenti e/o "carriers" farmacologicamente accettabi li . Dette composizioni farmaceutiche possono essere preparate in modo convenzionale utilizzando procedimenti ed ingredienti convenzionali .

In particolare i derivati del la pro-urochinasi oggetto della presente invenzione possono essere sommini strati per via parenterale nel corso di terapie anti trombotiche. La dose di enzima utilizzata per i l trattamento può essere compresa, ad esempio, tra 10 e 100 mg totali sotto forma di bolus in un 'unica somministrazione oppure come infusione endovenosa continua per circa 12 ore in ragione di circa 10-100 mg totali/ora.

Come esempi di questa invenzione, abbiamo preparato derivati della prourochinasi nei quali le serine sono state individualmente sostituite da residui di acido glutammico. In particolare, gli esempi specifici sono:

1) un derivato del la prourochinasi umana nel quale la serina in posizione 138 è stata sostituita da acido glutammico. Questo derivato, denominato ProUK-138-Glu, è stato prodotto in cel lule ricombinanti di Escher ichia coli.

2) un derivato della prourochinasi umana nel quale la serina in posizione 139 è stata sostituita da acido glutammico. Questo derivato, denominato ProUK-139-Glu, è stato anch 'esso prodotto in cellule ricombinanti di Escher ichia coli.

3) un derivato del la prourochinasi umana nel quale la serina in posizione 303 è stata sostituita da acido glutammico. Questo derivato, denominato ProUK-303-Glu, è stato anch 'esso prodotto in cellule ricombinanti di Escherichia coli.

Ulteriori derivati della prourochinasi umana che abbiano altre o maggiori cariche negative nelle regioni 138 e 139 o 303 o possibili combinazioni di queste sono anch'essi contemplati nella presente invenzione. Inoltre, tali modificazioni possono anche essere apportate ad altri derivati o mutanti della prourochinasi umana e non soltanto alla molecola intatta. Tali modifiche possono anche essere apportate su prourochinasi di natura diversa da quella umana (bovina, ovina, ecc.).

I nuovi derivati della prourochinasi umana sono stati ottenuti utilizzando la tecnica di amplificazione genica mediante l'enzima Taq Polimerasi (17). tale tecnologia si basa sulle proprietà termostabili dell'enzima stesso che consentono, attraverso una serie di cicli termici di denaturazione, rinaturazione ed elongazione in vitro, di amplificare specifici frangienti di DNA a partire da un DNA stampo e da due specifici iniziatori (primers).

Le diverse modifiche sito-specifiche, sono state prodotte introducendo nella sequenza di uno dei due primers le opportune variazioni. Come templato si è utilizzato lo stesso vettore d'espressione della prourochinasi umana pFC16 (18) (Fi g . 2). In tale plasmide, il gene della prourochinasi umana è stato posto sotto il controllo di sequenze regolatrici in grado id promuoverne l'espressione in Escherichia coli.

(vedi Fig. 3) . Tale sito, pur causando una variazione a l ivel lo del la sequenza nucleotidica del gene non altera in alcun modo la sequenza aminoacidica del la prourochinasi umana.

Il processo di amplificazione è stato fatto utilizzando la Taq polimerasi del la Perkin Elmer Cetus seguendo le condizioni suggerite dal la casa fornitrice. In particolare, 100 ^ul di una miscela contenente 1 ng di DNA templato (pFCÌ6), 8 ng^ul dei rispettivi primers, 0,2 mM dNTP, 50 mM KC1, 10 mM Tris pH 8,3, 10 mM MgCl2, 0,01% gelatina e 2 unità di Taq polimerasi (Perkin Elmer Cetus) sono stati sottoposti a 30 cicli termici di V30" a 92°C e 2 '30" a 72°C. Al termine del processo di ampl ificazione i diversi frammenti amplificat i sono stati digeriti con degl i opportuni enzimi di restrizione (Fig. 4) e subclonati nella porzione vettoriale BglII-MroI del pFC16. Si sono cosi ottenuti tre nuovi vettori d'espressione che sono stati classificati rispettivamente pFC146, pFC147 e pFCl48.

Tutte le manipolazioni genetiche sono state effettuate come descritto da Maniatis e col laboratori ( 19) .

I diversi mutanti sono stati poi verificati per sequenziamento diretto dei rispettivi pi asmi di utilizzando il sistema Sequenasell (United States Biochemical Corporation) . Espressione Dei Geni Mutati : I tre plasmidi pFC146, pFC147 e pFC148, analogamente al pFC16, presentano il gene codificante Questo plasmide e le sue caratteristiche sono già state decritte in una precedente domanda di brevetto (18).

Dopo il processo di amplificazione, si sono ottenuti frammenti di DNA omologhi al templato tranne che per le mutazioni precedentemente introdotte a livello del primer. Con il reinserimento dei nuovi frammenti nel plasmide originario, in sostituzione dell'analogo frammento non mutagenizzato, si sono costruiti direttamente nuovi plasmidi di espressione, isogenici al pFC 16, in grado di promuovere la produzione dei nuovi dervati in ceppi di Escherichia coli. La costruzione dettagliata di questi nuovi plasmidi è indicata nelle didascalie delle figure 3 e 4 nonché nei Materiali e Metodi qui di seguito definiti come Mutagenesi ed Espansione dei geni mutanti.

Mutagenesi : I tre derivati della prourochinasi umana specificamente descritti in questa domanda di brevetto, sono stati costruiti a partire dal plasmide pFC16 contenente il gene della prourochinasi umana, mediante amplificazione genica in vitro con l'uso dell'enzima Taq poliinerasi. In Fig. 3 è schematizzata la strategia utilizzata nella costruzione degli oligonucleotidi utilizzati come primers. Nel caso dei mutanti ProUK-138-Glu e prollK-139-Glu, per problemi di subclonaggi successivi, è stato necessario passare attraverso l'amplificazione di due distinti frammenti con l'introduzione di un nuovo sito di restrizione Mrol nel punto di giunzione per il corrispondente derivato della prourochinasi umana sotto il controllo del promotore triptofano (Ptrp) e della "Shine Dalgarno1' del batteriofago MS-2 (MS-2 RBS) . Si è ottenuta l'espressione dei mutanti ricombinanti inserendo i diversi plasmidi in un ceppo di E. coli tipo B (Collezione Istituto Pasteur N. 54125 - Parigi). Le condizioni di trasformazione, coltivazione dei ceppi ricombinanti, induzione dell'espressione ed analisi dei livelli di espressione sono essenzialmente equivalenti a quelle già descritte per pFC16 (18).

Le referenze citate con numeri tra parentesi nella parte introduttiva della presente descrizione sono le seguenti: (1) Collen, D. e Lijnen, H.R.

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(13) Gurewich, V., e Pannell, R.; Fibrin binding and zymogenic properties of single Chain urokinase (Pro-Urokinase) ; Seminars in Thromb. and Haemost. 13, n. 2, 146, 1987.

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(17) PCR Technology; Ed. Erlich H.A. 1989 Stockton Press; (18) European Patent Application No. 365.894.

(19) Maniatis T., Fritsch E.F. e Sambrook 0. ; Molecular cloning, A Laboratory rnanual Cold Spring Harbour 1982.

Claims

R I V E N D I C A Z I O N I 1) Derivati della pro-urochinasi umana, o di suoi analoghi, caratterizzati da una minore affinità nei confronti degli inibitori plasmatici .
2) Dervati secondo la rivendicazione 1 in cui detti analoghi sono costituiti da mutanti per delezione, inserzione o inversione della pro-urochinasi umana.
3) Derivati secondo la rivendicazione 1 in cui detti analoghi sono costituiti da pro-urochinasi ottenute da specie diverse da quella umana.
4) Derivati secondo la rivendicazione 3 in cui la pro-urochinasi viene ottenuta da un mammifero.
5) Derivati secondo la rivendicazione 1 in cui da uno a tre residui aminoacidi presenti nella sequenza della pro-urochinasi umana o dei suoi analoghi, sono stati sostiuiti da altrettanti aminoacidi carichi negativamente.
6) Derivati secondo la rivendicazione 5 in cui detti residui sono le serine in posizione 138, 139 e 303 e detti aminoacidi carichi negativamente sono acido glutammico o acido aspartico.
7) Processo per la produzione di derivati della pro-urochinasi come definiti nelle rivendicazioni da 1 a 6, attraverso l ' impiego delle tecnologie del DNA ricombinante.
8) Processo secondo la rivendicazione 7 in cui detti derivati vengono ottenuti per mutagnesi sito specifica del gene codificante la pro-urochinasi umana o i suoi analoghi e successiva introduzione dei geni mutanti in un opportuno vettore di espressione capace di dirigere la sintesi dei nuovi derivati in un microorganismo ospite adeguato.
9) Processo secondo la rivendicazione 8 in cui il vettore di espressione è il plasmide pFC 146 ed i l microorganismo ospite è E. coli .
10) Processo secondo la rivendicazione 8 in cui il vettore di espressione è il plasmide pFC147 ed il microorganismo ospite è E. col i .
11 ) Processo secondo la rivendicazione 8 in cui il vettore di espressione è il plasmide pFC148 ed il microorganismo ospite è E. col i .
12) Un gene comprendente un polinucleotide sintetizzato chimicamente e codificante per i derivati della pro-urochinasi come definiti nel le rivendicazioni da 1 a 6.
13) Un vettore di espressione ricombinante contenente un gene secondo la rivendicazione 12 e capace di dirigere la sintesi di un derivato del la pro-urochinasi secondo la rivendicazione 6.
14) I l vettore di espressione pFC146.
15) I l vettore di espressione pFC147.
16) Il vettore di espressione pFC148.
17) Un microorganismo ospite trasformato con un vettore di espressione secondo la rivendicazione 16.
18) Un ceppo di E. coli tipo B trasformato con il vettore di espressione pFC146.
19) Un ceppo di E. coli tipo B trasformato con il vettore di espressione pFC 147.
20) Un ceppo di E. coli tipo B trasformato con il vettore di espressione pFC!48.
21) L'uso del promotore Ptrp per l'espressione in un ceppo di E. coli tipo B dei geni secondo la rivendicazione 12.
22) L'uso della Shine-Dalgarno del fago MS-2 per l'espressione in un ceppo di E. coli tipo B dei geni secondo la rivendicazione 12.
23) Una composizione farmaceutica contenente un derivato della pro-urochinasi come definito nelle rivendicazioni da 1 a 6 assieme ad un diluente e/o "carrier" farmaceuticamente accettabile.