JP2013509190A - 組換えビタミンk依存性タンパク質の生成法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許仮出願第61/256,802号(2009年10月30日出願。参照により本明細書に組み込まれる)に基づく優先権を主張する。
本発明は、組換えビタミンK依存性タンパク質、および同タンパク質を外来性翻訳後修飾酵素を使用せずに哺乳動物細胞において生成する方法に関する。
本明細書で使用する「クローニング」という用語は、クローンを単離および構築する操作を言う。「クローン」という用語は一般的かつ慣例的な意味を有し、単一の親細胞から生成され、遺伝子的に同一である細胞集団を言う。ある態様では、限界希釈クローニング法を用いて高産性クローンを作製する。「限界希釈クローニング法」は一般的かつ慣例的な意味を有し、ポリクローナルな細胞集団から開始してモノクローナルな細胞集団を得る操作を言う。出発(ポリクローナル)培養液を、統計学的に単一細胞が単離されるまで段階的に希釈し、これを用いてモノクローナルな培養液を得る。
本発明の態様は、少なくとも20%の生体活性を有する組換えビタミンK依存性タンパク質を産生する細胞株に関する。好ましくは、細胞株はビタミンK依存性タンパク質の翻訳後修飾に関与するタンパク質をコードする異種遺伝子物質を含有しない。好ましくは、細胞株は哺乳動物細胞株であり、より好ましくは哺乳動物細胞株はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株である。好ましくは、ビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子はチャイニーズハムスター伸長因子1(CHEF-1)プロモーターに機能的に結合している。
(a)哺乳動物細胞集団を、プロモーターに機能的に結合したビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトし;
(b)少なくとも1ラウンドのクローニングおよびスクリーニングを実施して、少なくとも10%の生体活性を有するビタミンK依存性タンパク質を少なくとも10mg/Lの量で産生する細胞クローンを同定し;
(c)必要により、段階(b)の細胞クローニングを1回またはそれ以上反復し、少なくとも10%の生体活性を有するビタミンK依存性タンパク質を10mg/L以上産生する単個細胞を同定し;そして、
(d)ビタミンK依存性タンパク質を回収すること。
Kaufmanら(上記)は、第IX因子遺伝子を含有するプラスミドにDHFRをコードする遺伝子を含有させ、高レベルのメトトレキサートによる選択圧を使用することによって、CHO細胞における第IX因子をコードする遺伝子の発現レベルを上昇させる方法を報告している。高レベルのメトトレキサートによってDHFRをコードするプラスミドを高コピー数で有する細胞が選択されるので、第IX因子も高レベルで産生される。しかしながら、この方法の限界は、それなりに高レベルの第IX因子は産生されるが、プロセシング酵素のレベルは低いままであることである。このため、この方法によって産生される第IX因子のほとんどは生物学的に活性ではない。
本発明の実施には、特に記載しない限り、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学における当業者に公知の慣例的な技術を使用する。それらの技術は文献に十分報告されている。例えば以下を参照されたい:Sambrookら, "Molecular Cloning; A Laboratory Manual", 第2版(1989);"DNA Cloning", Vols. IおよびII (D. N Glover編 1985);"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait編 1984);"Nucleic Acid Hybridization" (B. D. HamesおよびS. J. Higgins編 1984);"Transcription and Translation" (B. D. HamesおよびS. J. Higgins編 1984);"Animal Cell Culture" (R. I. Freshney編 1986);"Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986);B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984);Methods in Enzymologyシリーズ (Academic Press社), 特にVols. 154および155(それぞれ、WuおよびGrossman編、および、Wu編);"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. H. MillerおよびM. P. Calos編 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);" Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology", MayerおよびWalker編(Academic Press、ロンドン、1987);Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", 第2版 1987,(Springer-Verlag、ニューヨーク);および"Handbook of Experimental Immunology" Vols I-IV (D. M. WeirおよびC. C. Blackwell 編 1986)。背景技術および明細書において参照する全ての特許、特許出願、および文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
ベクターは複製可能なDNAコンストラクトである。組換えタンパク質を多量発現する遺伝子組み換え細胞を作製するための多くのトランスフェクション法が知られている。本発明の態様は、特定の発現ベクターの使用に依存するものではない。好ましい態様では、タンパク質をコードするcDNAを含有する発現ベクターで細胞をトランスフェクトする。
好適なホスト細胞には原核細胞、酵母細胞、またはより高等な真核細胞、例えば哺乳動物細胞および昆虫細胞がある。多細胞生物由来の細胞は、組換えビタミンK依存性タンパク質合成のためのホストとして特に好適であり、また哺乳動物細胞は特に好ましい。それらの細胞の細胞培養液中での培養は慣例的に行われている(Tissue Culture, Academic Press, KruseおよびPatterson編(1973))。有用なホスト細胞株の例として、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、およびWI138、HEK 293、BHK、COS-7、CV、およびMDCK細胞株がある。それらの細胞のための発現ベクターは、一般的に(必要により)複製起点、発現すべきビタミンK依存性タンパク質(単数または複数)をコードするDNAの上流に位置し、かつそれらと機能的に関連するプロモーターに加え、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位(イントロンを含有するゲノムDNAを使用する場合)、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を含む。好ましい態様では、発現はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において、米国特許第5,888,809号(参照により本明細書に組み込まれる)の発現系を用いて行う。
血液凝固因子製剤は当該分野で公知の方法によって調製することができる。ビタミンK依存性タンパク質組成物を慣例的な賦形剤、例えば結合剤(ゼラチン、ゼラチン化デンプンなど);潤滑剤(例えば硬化植物油、ステアリン酸など);希釈剤(例えばラクトース、マンノース、およびスクロース);崩壊剤(例えばカルボキシメチルセルロースおよびデンプングリコール酸ナトリウム);懸濁剤(例えばポビドン、ポリビニルアルコールなど);吸収剤(例えば二酸化ケイ素);保存剤(例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、および安息香酸ナトリウム);界面活性剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート80など);および着色剤(例えばFD&C色素など)と混合してもよい。
第IX因子遺伝子を合成し、CHEF-1プロモーターに機能的に結合させ、CHO細胞にトランスフェクトした。1次トランスフェクタントを6-ウェル・マイクロタイタープレート中で増殖させ、3重複試験でアッセイを行ってウェル中の細胞の抗原発現レベルの平均値を得た。表1に示すように、細胞を1次トランスフェクタント株T-335と称する。これは1次トランスフェクタントでの平均産生量であることに留意すべきである。細胞によって第IX因子を産生しない細胞、中度のレベルで産生する細胞、および高レベルのタンパク質を産生する細胞がある。その後、1次トランスフェクタントの第IX因子抗原産生量を測定した。この発現初期段階においては、生体活性は測定しなかった。コントロールとして、野生型第IXプロペプチド配列を別のビタミンK依存性タンパク質(プロテインC)由来のプロペプチド配列で置換した第IX因子遺伝子コンストラクトをCHO細胞にトランスフェクトし、1次トランスフェクタント細胞株T-337と称した。
比較のため、実施例1の野生型第IX因子遺伝子をCMVプロモーターを用いるコンストラクト中にクローニングし、HEK293細胞にトランスフェクトした。上記の実施例1に示すように、1次トランスフェクタントを6ウェル・マクロタイタープレート中で増殖させた。これらのサンプルの力価は0.2mg/L未満であった(データ未掲載)。CHEF-1プロモーターを用いて、更なる実験を行った。
高レベルの第IX因子を発現するクローンを同定およびキャラクタライズするために、1次トランスフェクタントを96ウェルプレート中で、限界希釈法によってクローニングした。細胞増殖のための表面積が小さいため、発現レベルは実施例1に示す6ウェル・マイクロタイタープレートで増殖させた場合より低かった。T-335の1次トランスフェクタントでの実験から、152個の単個細胞クローンを同定した。各クローンでの第IX因子抗原の発現レベルをELISA分析によって測定した。それらのクローンからの第IX因子発現レベルの分布を図1に示す。
出願人の96ウェルプレートから6ウェル・マイクロタイタープレートへの外挿が、生成される抗原および回収される生物学的に活性なタンパク質のパーセンテージのいずれについても正確であるか否かを検討するために、6ウェル・マイクロタイタープレート中で第2の限界希釈試験から11個のクローンを増殖させた。表5に示すように、結果は96ウェル・マイクロタイタープレートで報告されたものと同様であった。第IX因子抗原産生レベルは2-40mg/Lであり、回収された生物学的に活性な第IX因子のパーセンテージは10-58%であった。生物学的に活性な第IX因子のレベルは、過去にビタミンKまたは血液因子タンパク質の翻訳後プロセシングに関与するプロセシング因子の非存在下で調製した、他のビタミンK依存性タンパク質で報告されているものより、有意に高かった。
第VII因子遺伝子をCHEF-1プロモーターに機能的に結合するように合成し、CHO細胞にトランスフェクトした。これには、ヒポキサンチン・チミジン(HT)未含有培地で選択を行うためのDHFRマーカーを含有するベクターを使用した。1次トランスフェクタントをマイクロタイタープレート中で増殖させ、アッセイを行ってウェル中の細胞の抗原発現レベルの平均値を求めた。その後、1次トランスフェクタントのプールについて、半固体マトリクス・クローニング法による細胞クローニングを行った。
Claims (44)
- 少なくとも20%の生体活性を有する組換えビタミンK依存性タンパク質を産生する細胞株であって、該細胞株がビタミンK依存性タンパク質の翻訳後修飾に関与するタンパク質をコードする外来性遺伝子物質を含有しない、上記細胞株。
- 細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項1記載の細胞株。
- 哺乳動物細胞株がチャイニーズハムスター卵巣である、請求項2記載の細胞株。
- メトトレキサートによる選択を行っていない、請求項1から3のいずれかに記載される細胞株。
- ビタミンK依存性タンパク質が第II因子、第VII因子、第IX因子、第X因子、プロテインC、およびプロテインSから成る群から選択される、請求項1から3のいずれかに記載される細胞株。
- ビタミンK依存性タンパク質が第VII/VIIa因子または第IX因子である、請求項5記載の細胞株。
- チャイニーズハムスター伸長因子1(CHEF-1)プロモーターに機能的に結合したビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子を含有する、請求項1から3のいずれかに記載される細胞株。
- 生物学的に活性な組換えビタミンK依存性タンパク質の生成法であって、
(a)プロモーターに機能的に結合したビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子を哺乳動物細胞集団にトランスフェクトし;
(b)少なくとも1ラウンドのクローニングおよびスクリーニングを実施し、少なくとも10%の生体活性を有するビタミンK依存性タンパク質を少なくとも10mg/Lの量で産生する細胞クローンを同定し;
(c)必要により、段階(b)の細胞クローニングを1回またはそれ以上反復し、少なくとも10%の生体活性を有するビタミンK依存性タンパク質を10mg/L以上産生する単個細胞を同定し;そして
(d)ビタミンK依存性タンパク質を回収する、
の各工程を含む、上記生成法。 - ビタミンK依存性タンパク質が第II因子、第VII因子、第IX因子、第X因子、プロテインC、およびプロテインSから成る群から選択される、請求項8記載の方法。
- ビタミンK依存性タンパク質が第IX因子である、請求項9記載の方法。
- クローニングが限界希釈クローニング法である、請求項10記載の方法。
- ビタミンK依存性タンパク質が第VII因子である、請求項9記載の方法。
- クローニングが半固体マトリクス・クローニング法である、請求項12記載の方法。
- プロモーターがチャイニーズハムスター伸長因子1(CHEF-1)プロモーターである、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 段階(b)の前に少なくとも10mg/LのビタミンK依存性タンパク質抗原を産生する細胞をあらかじめ選択することを更に含む、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- ビタミンKを含有する培地中で細胞株を培養する、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- ビタミンKを含有しない培地中で細胞株を培養する、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 少なくとも20%のビタミンK依存性タンパク質が生物学的に活性である、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 少なくとも30%のビタミンK依存性タンパク質が生物学的に活性である、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 少なくとも40%のビタミンK依存性タンパク質が生物学的に活性である、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 少なくとも58%のビタミンK依存性タンパク質が生物学的に活性である、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 少なくとも70%のビタミンK依存性タンパク質が生物学的に活性である、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 少なくとも85%のビタミンK依存性タンパク質が生物学的に活性である、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 少なくとも95%のビタミンK依存性タンパク質が生物学的に活性である、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 少なくとも99%のビタミンK依存性タンパク質が生物学的に活性である、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- ビタミンK依存性タンパク質が少なくとも20mg/Lの量で生成される、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- ビタミンK依存性タンパク質が少なくとも30mg/Lの量で生成される、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- ビタミンK依存性タンパク質が少なくとも40mg/Lの量で生成される、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項8から13のいずれかに記載される方法。
- 請求項8から11のいずれかに記載される方法で生成された組換え第IX因子タンパク質。
- 請求項8、9、12、または13のいずれかに記載される方法で生成された組換え第VII因子タンパク質。
- 請求項30記載の第IX因子タンパク質または請求項31記載の第VII因子タンパク質を含有する医薬組成物。
- 請求項30記載の組換え第IX因子タンパク質または請求項31記載の第VII因子タンパク質を含有するキット。
- それを必要とする患者に有効量の請求項32記載の医薬組成物を投与することを含む、血友病の治療法。
- 少なくとも10%の生体活性を有する組換え第IX因子。
- 少なくとも20%の生体活性を有する、請求項35記載の組換え第IX因子。
- 少なくとも30%の生体活性を有する、請求項35記載の組換え第IX因子。
- 少なくとも40%の生体活性を有する、請求項35記載の組換え第IX因子。
- 少なくとも58%の生体活性を有する、請求項35記載の組換え第IX因子。
- 少なくとも70%の生体活性を有する組換え第VII/VIIa因子タンパク質。
- 少なくとも85%の生体活性を有する組換え第VII/VIIa因子タンパク質。
- 少なくとも99%の生体活性を有する組換え第VII/VIIa因子タンパク質。
- 少なくとも20%の生体活性を有する組換えビタミンK依存性タンパク質を産生する細胞株であって、該細胞株が以下:
(a)チャイニーズハムスター伸長因子1(CHEF-1)プロモーターに機能的に結合したビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子を哺乳動物細胞集団にトランスフェクトし;そして
(b)少なくとも1ラウンドのクローニングおよびスクリーニングを実施し、少なくとも10%の生体活性を有するビタミンK依存性タンパク質を少なくとも10mg/Lの量で産生する細胞クローンを同定する;
ことによって作製される、上記細胞株。 - クローニングが限界希釈クローニング法または半固体マトリクス・クローニング法である、請求項43記載の方法。
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