CN108135997A

CN108135997A - Fcv重组疫苗及其用途

Info

Publication number: CN108135997A
Application number: CN201680059134.8A
Authority: CN
Inventors: H·普雷特; F·瑞那德
Original assignee: Cimmeria Limited-Liability Co
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2015-08-20
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2018-06-08
Also published as: UY36860A; KR20180041724A; CA2996143A1; NZ740551A; MX2018002112A; EP3337503A1; US20180243399A1; AU2016308630A1; AU2016308630B2; AR105819A1; WO2017031120A1; PH12018500372A1; MA42653A; US10434165B2

Abstract

本发明涵盖FCV疫苗或组合物。所述疫苗或组合物可以是含有FCV抗原的疫苗或组合物。本发明还涵盖编码和表达可用于保护动物免受FCV感染的FCV抗原、表位或免疫原的重组载体。

Description

FCV重组疫苗及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年8月20日提交的美国临时申请62/207,638的优先权。

发明领域

本发明涉及用于在动物中对抗猫杯状病毒(feline calicivirus，FCV)感染的组合物。本发明提供了包含FCV抗原的药物组合物或疫苗，针对FCV的疫苗接种方法以及与此类方法和组合物一起使用的试剂盒。

发明背景

在1957年首次描述了猫杯状病毒(FCV)(Fastier L.B.,Am.J.Vet.Res.,1957,18:382-389)。猫杯状病毒和猫疱疹病毒是家猫和野生猫科动物上呼吸道病毒性疾病的主要来源。FCV影响大量猫科家族的动物，在临床上健康的家猫中FCV携带率为15-20％的量级(Coutts等，Vet.Rec.,1994,135:555-556；Ellis T.M.,Australian Vet.J.,1981,57:115-118；Harbour等，Vet.Rec.,1991,128:77-80；Reubel等，Feline Dendistry,1992,22:1347-1360)。在高热的初始阶段之后，这些呼吸系统疾病通常伴随着颊部溃疡(上颚、舌、唇、鼻)、鼻炎、结膜炎、可能还有厌食症和虚弱。FCV也可引起肺炎、肠炎和关节痛(跛行综合症)。

在过去的十年中，FCV相关的VSD已经出现在美国和英国。几次爆发与高(高达50％)死亡率和非典型的严重临床症状(高热、皮肤水肿、溃疡性皮炎和黄疸)相关。

FCV仅水平传播，在妊娠期间没有从母猫到其小猫的垂直传播(Johnson R.P.,Res.Vet.Sci.,1984,31:114-119)。FCV通过在受感染的动物与健康动物之间的接触或在打喷嚏时通过气道传播(Wardley R C.,Arch.Virol.,1976,52:243-249)。杯状病毒科的猫杯状病毒是一种无包膜病毒，具有单链正RNA(Radfor等，Proc.1^st Int.Symp.,CalicivirusesESVV,1997,93-99)。FCV衣壳由66kDa的单一主要衣壳蛋白即p66蛋白构成。大多数商用FCV疫苗是减毒疫苗。

也有少数灭活疫苗可供利用。Povey和同事(Povey等，Feline Practice,1978,8(3):35-42)描述了用于猫的福尔马林灭活和佐剂化的FCV制备物。US 6,534,066和US 7,850,978描述了FCV的新株用于生产FCV疫苗的用途。灭活疫苗通常含有佐剂以改善免疫应答和诱导针对猫群中出现的异源FCV株的更好保护。

然而，佐剂化的疫苗诱导比未佐剂化的疫苗更高比率的局部不良反应(Gobar等，JAVMA,2002,220(10),1477-1482)，从而增加注射部位处疫苗相关纤维肉瘤的风险(BakerR.J.,Feline Practice,1998,26(5),18-20)。

未佐剂化的FCV疫苗是通常含有F9株的经修饰的活疫苗。一些作者已经报道了在接种后杯状病毒病中有FCV F9的残余毒力(Dawson等，Vet.Rec.1993,132:346-350)。FCV修饰的活毒株与该领域中新抗原变体的出现相关(Radford等，Vaccine,1997,15(12/13),1451-1458)。因此经修饰的活疫苗的安全性值得怀疑。

FCV是杯状病毒科的成员。其具有7.7-kb的正义RNA基因组，具有三个开放阅读框架(ORF)，编码非结构蛋白、主要衣壳蛋白(Carter等，1992,Arch.Virol.,122:223-235；Tohya等，1997,J.Gen.Virol.,78(pt.2),303-305)和次要结构蛋白(Sosnovtsev等，2005,J.Virol.,79,4012-4024)。遗传上，FCV株属于一个多样的基因群，几乎没有亚种群聚的证据。这种遗传多样性伴随着抗原多样性，尽管存在足够的交叉反应性而能够将所有分离株视为属于单一血清型。

来自人杯状病毒的几个株的衣壳蛋白已经在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。通过在杆状病毒表达系统中表达衣壳前体，也已经从伞状病毒猫杯状病毒(FCV)产生了病毒样颗粒(DeSilver等，,Expression of the complete capsid and thehypervariable region of feline calicivirus in the baculovirus expressionsystem.In:First International Symposium on Caliciviruses.第131–143页)，其中用感染杆状病毒的昆虫sf9细胞的粗收集物完成猫的免疫。未灭活的杆状病毒具有佐剂效果(Hervas-Stubbs等，Journal of Immunology,2007,178:2361–2369；Margine等，Plos OneDecember 2012|第7卷|第12期|e51559)。昆虫细胞或级分被用作佐剂以增强抗原的免疫原性(US6,224,882)。Di Martino等(2007,Vet.Microbiol.,120,173–178)论述了FCV衣壳VP1蛋白在昆虫细胞中的表达以及使用表达的衣壳VP1蛋白在体外中和FCV株。然而，未进行体内攻击研究来证明表达的衣壳VP1蛋白在猫中的功效。

鉴于上述情况，显然需要具有改善的安全性和良好功效的疫苗，包括针对异源FCV株的疫苗。

考虑到动物(包括人，尽管很少)对FCV的易感性，预防FCV感染和保护动物的方法是至关重要的。因此，需要更有效、稳定和安全的针对FCV的疫苗。

发明概述

提供了包含抗原性FCV多肽及其片段和变体的组合物或疫苗。FCV抗原及其片段和变体具有免疫原性和保护性质。FCV抗原可以通过昆虫细胞中的杆状病毒表达载体产生，并装配成FCV空衣壳或FCV VLP(病毒样颗粒)。

可将抗原性多肽及其片段和变体配制成疫苗和/或药物组合物。这种疫苗或组合物可用于接种动物并提供抗同源和异源FCV株的保护。

本发明首次令人惊讶地证明了包含FCV VLP的未佐剂化组合物或疫苗(其中昆虫细胞被灭活并且细胞碎片被除去)提供了抗超毒力FCV异源攻击的优异功效。

还提供了包含至少一种抗原性多肽或其片段或变体以及使用说明的试剂盒。

附图概述

可结合附图来最好地理解以下详细描述。所述详细描述以举例方式提供，但并非旨在将本发明仅限于所描述的特定实施方案，其中：

图1描绘概述DNA和蛋白质序列的表。

图2描绘pMEB062的质粒图谱。

图3描绘表达的FCV衣壳蛋白的考马斯染色和Western印迹分析。

图4描绘感染的动力学(MOI和感染后天数)。

图5描绘FCV VLP的电子显微镜检查。

图6描绘攻击后每组存活猫的百分比。

图7显示攻击后平均直肠温度的演变。

图8描绘攻击后每组的平均体重。

图9描绘攻击后每组相对日体重增加的分布。

图10描绘攻击后每组的平均临床评分。

图11描述每组的总体评分分布。

图12描绘每组的平均FCV Ab滴度(以log₁₀OD₅₀计)。

图13描绘了攻击后每组的病毒排泄(以log₁₀细胞培养物感染剂量₅₀/mL计)的演变。

图14描绘每组的wAuC的分布。

图15描绘序列比对。

详述

提供了包含在动物中引发免疫原性应答的FCV多肽、抗原及其片段和变体的组合物。在昆虫细胞中通过杆状病毒表达载体产生抗原性多肽或其片段或变体。可将抗原性多肽或片段或变体配制成疫苗或药物组合物并用于在动物中引发或刺激保护性应答。在一个实施方案中，所述多肽抗原是FCV衣壳多肽或其活性片段或变体。可将FCV抗原装配成FCV空衣壳或FCV VLP(病毒样颗粒)。

认识到本发明的抗原性多肽可以是全长多肽或其活性片段或变体。“活性片段”或“活性变体”是指片段或变体保留多肽的抗原性质。因此，本发明包括在动物中引发免疫原性应答的任何FCV多肽、抗原、表位或免疫原。FCV多肽、抗原、表位或免疫原可以是在动物诸如绵羊、牛、山羊或猪中引发、诱导或刺激应答的任何FCV多肽、抗原、表位或免疫原，例如但不限于蛋白质、肽或其片段或变体。

本发明涉及可包含有效量的重组FCV抗原的猫科或犬科动物疫苗或组合物。该疫苗或组合物是未被佐剂化的，并且可任选地包含药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。

在一些实施方案中，动物中的应答是保护性免疫应答。

“动物”意指哺乳动物、鸟类等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可以选自马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、郊狼、豺)、猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其他大型猫科动物，和其它猫科动物，包括猎豹和山猫)、羊(例如，绵羊)、牛族动物(例如，牛)、猪(例如，猪)、山羊(例如，山羊)，禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀科鸣禽、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡)、灵长类动物(例如，狐猴、眼镜猴、猴子、长臂猿、人猿)和鱼。术语“动物”还包括处于所有发育阶段的个体动物，包括胚胎期和胎儿期。

除非另外解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一个/种”和“该/所述(the)”包括多个的所述指代物。类似地，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。

注意到，在本公开中，特别是在权利要求和/或段落中，术语诸如“包含”、“包含的”、“包括”等可以具有在美国专利法中赋予其的含义；例如，它们可以意指“包括”、“包含的”、“含有”等；并且术语“基本上由...组成”具有美国专利法中赋予其的含义，例如其允许未明确列举的要素，但排除现有技术中发现的要素或影响本发明的基本或新颖特征的要素。

本发明的抗原性多肽能够起到抗FCV的保护作用。也就是说，它们能够刺激动物的免疫应答。“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原可包含杀死的、减毒的或活的完整生物体；生物体的亚单元或部分；含有具有免疫原性特性的插入物的重组载体；在呈递给宿主动物时能够诱导免疫应答的DNA片段或部分；多肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，所述免疫原或抗原可以包含毒素或抗毒素。

如本文中所用，术语“免疫原性蛋白质、多肽或肽”包括在一旦向宿主施用后就能够引发针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答的意义上具有免疫活性的多肽。优选地，所述蛋白质片段是其具有与总蛋白质基本上相同的免疫活性的形式。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由或由其组成。如本文中所用，“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指包含一个或多个表位并由此引发上述的免疫应答的蛋白质片段。此类片段可使用本领域公知的任何数量的表位作图技术来鉴定。参见，例如Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris，编辑1996)。例如，线性表位可以通过例如在固体载体上同时合成大量的肽(所述肽对应于蛋白质分子的部分)，以及使肽与抗体反应而肽仍然附接于载体上来确定。此类技术在本领域中是已知的，并且在例如美国专利第4,708,871号；Geysen等，1984；Geysen等，1986中进行了描述。类似地，通过确定氨基酸的空间构象，例如通过X射线晶体学和二维核磁共振，可以容易地鉴定构象表位。参见，例如Epitope Mapping Protocols(同上)。尤其适用于小泰勒尔梨浆虫(T.parva)的蛋白质的方法在PCT/US2004/022605(通过引用整体并入本文)中进行了完整描述。

如所讨论的，本发明包括抗原性多肽的活性片段和变体。因此，术语“免疫原性蛋白质、多肽或肽”还涵盖对序列的缺失、添加和取代，只要该多肽起到产生如本文所定义的免疫学反应的作用即可。术语“保守变异”表示氨基酸残基被另一种生物学上相似的残基替换，或核酸序列中核苷酸的替换，使得编码的氨基酸残基不变或为另一种生物学上相似的残基。在这一点上，特别优选的取代在性质上通常是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些取代。例如，氨基酸总体上分为四个家族：(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电荷的极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变异的实例包括一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一个疏水性残基的取代，或一个极性残基对另一个极性残基的取代，诸如精氨酸对赖氨酸的取代、谷氨酸对天冬氨酸的取代或谷氨酰胺对天冬酰胺的取代等；或用不会对生物学活性产生重大影响的结构上相关的氨基酸对氨基酸的类似保守性替换。具有与参考分子基本上相同的氨基酸序列，但具有基本上不影响蛋白质的免疫原性的微小氨基酸取代的蛋白质因而在参考多肽的定义范围内。本文包括由这些修饰产生的所有多肽。术语“保守变异”还包括使用取代的氨基酸替代未取代的亲本氨基酸，条件是针对取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。

术语“表位”是指特定B细胞和/或T细胞发生响应的抗原或半抗原上的位点。该术语也可与“抗原性决定簇”或“抗原性决定簇位点”互换使用。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫测定中鉴定，显示一种抗体阻断另一种抗体对靶抗原结合的能力。

对组合物或疫苗的“免疫应答”/“免疫学反应”是宿主中对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。通常，“免疫应答”/“免疫学反应”包括但不限于一种或更多的以下作用：特异性针对包含在目标组合物或疫苗中的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫应答，使得对新感染的抗性将会增强和/或疾病的临床严重程度降低。这种保护将通过受感染宿主正常显示的症状的减少或缺乏、更快的恢复时间和/或感染宿主中降低的病毒滴度来证明。

合成抗原也包括在定义中，例如多表位、侧翼表位和其它重组或合成衍生抗原。参见，例如Bergmann等，1993；Bergmann等，1996；Suhrbier，1997；Gardner等，1998。为了本发明的目的，免疫原性片段通常包括所述分子的至少约3个氨基酸，至少约5个氨基酸，至少约10-15个氨基酸或约15-25个氨基酸或更多的氨基酸。片段的长度没有严格的上限，其可包含几乎全长的蛋白质序列，或甚至是包含蛋白质的至少一个表位的融合蛋白质。

因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是其包含编码FCV多肽的表位或抗原决定簇的核苷酸或基本上由其组成或由其组成。编码FCV多肽的片段的多核苷酸可包含编码多肽的序列的最少15个核苷酸，约30-45个核苷酸，约45-75或至少57、87或150个连续或邻接的核苷酸或基本上由其组成或由其组成。表位确定程序，例如产生重叠肽文库(Hemmer等，1998)、肽扫描(Geysen等，1984；Geysen等，1985；Van der Zee R.等，1989；Geysen，1990；Multipin.RTM.肽合成试剂盒de Chiron)和算法(Groot等，1999；PCT/US2004/022605)可用于本发明的实践中。

术语“核酸”和“多核苷酸”是指直链或支链的、单链或双链的RNA或DNA或其杂交体。该术语还包括RNA/DNA杂交体。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、带分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶(uracyl)、其它糖和连接基团诸如氟核糖和硫醇盐，以及核苷酸分支。可以在聚合后进一步修饰核苷酸序列，诸如通过与标记组分缀合。此定义中包括的其它类型的修饰是帽、用类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的取代，以及用于将多核苷酸附接至蛋白质、金属离子、标记组分、其它多核苷酸或固体载体的装置的引入。多核苷酸可通过化学合成获得或衍生自一种微生物。

术语“基因”广泛地用于指与生物功能相关的任何多核苷酸区段。因此，基因包括内含子和外显子(如在基因组序列中)，或者仅包括编码序列(如在cDNA中)和/或其表达所需的调控序列。例如，基因也指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段，以及包含调控序列的核酸片段。

本发明还包含编码FCV抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可以是聚合的并且具有任何长度，并且可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和任意组合的类似物。

术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，用来指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是线性或分支的，其可包含经修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且其可被除氨基酸外的化学部分打断。所述术语还包括已被天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合。

“分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质或细胞器)是指已经基本上从其中天然存在所述组分的生物细胞中的其他生物组分(例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)分离或纯化出来的组分。已经“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。

如本文所用，术语“纯化的”不需要绝对的纯度；相反，其仅仅是一个相对术语。因此，例如，纯化的多肽制品是其中多肽比其在天然环境中更富集的制品。即多肽与细胞组分中分离开。所谓“基本上纯化的”是指这样的纯化状态，其中多肽代表至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％或更多细胞组分或材料已被除去。同样，该多肽可以是部分纯化的。“部分纯化的”旨在指少于60％的细胞组分或材料被去除。这同样适用于多核苷酸。本文公开的多肽可以通过本领域已知的任何方式纯化。

如上所述，抗原性多肽或其片段或变体是由昆虫细胞中的杆状病毒表达载体产生的FCV抗原性多肽。所公开的多核苷酸的片段和变体以及由此编码的多肽也包括在本发明中。“片段”意指多核苷酸的一部分或由其编码的抗原性氨基酸序列的一部分。多核苷酸的片段可编码保留天然蛋白质的生物学活性并因此具有免疫原性活性的蛋白质片段，如本文其他地方所述。多肽序列的片段保留在动物中诱导保护性免疫应答的能力。

“变体”旨在表示基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包括在天然多核苷酸内的一个或多个位点处缺失和/或添加一个或多个核苷酸和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处取代一个或多个核苷酸。如本文中所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。也可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽与由参考多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列同一性来评估本发明的特定多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体。“变体”蛋白质旨在表示通过在天然蛋白中的一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸而从天然蛋白质衍生的蛋白质。本发明涵盖的变体蛋白质具有生物活性，即它们具有引发免疫应答的能力。

在一个方面，本发明提供了来自FCV分离株的FCV多肽。在另一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：3或4所示序列的多肽及其变体或片段。

另一方面，本发明涉及FCV空衣壳或FCV VLP(病毒样颗粒)。

此外，FCV多肽的同系物也意图在本发明的范围内。如本文中所用，术语“同源物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似的功能，但在不相关的生物体中分别进化的两种多核苷酸或多肽。术语“直系同源物”是指来自不同物种，但已经通过物种形成从共同的祖先基因进化而来的两种多核苷酸或多肽。通常，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内的复制相关联的两种多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可以是相关的。野生型FCV多肽的类似物、直系同源物和旁系同源物与野生型FCV多肽的不同可以在于翻译后修饰、氨基酸序列差异或两者。具体而言，本发明的同源物通常会表现出与野生型FCV多核苷酸序列的全部或部分有至少80-85％、85-90％、90-95％或95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，并且将表现出相似的功能。变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指含有多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列改变并存在于天然群体(例如，病毒的种或品种)中。此类天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽内的1-5％变异。等位基因变异体可通过对许多不同物种中的目标核酸序列进行测序来鉴定，这可通过使用杂交探针鉴定这些物种中同一基因遗传基因座来容易地进行。任何和所有此类核酸变异和由此获得的氨基酸多态性或变异(其为天然等位基因变异的结果，并且不改变目标基因的功能活性)，都旨在本发明的范围内。

如本文中所用，术语“衍生物”或“变体”是指具有一个或多个保守氨基酸变异或其他次要修饰的多肽或编码多肽的核酸，所述变异或修饰使得(1)当与野生型多肽相比较时相应的多肽具有基本上等同的功能或(2)针对多肽产生的抗体与野生型多肽具有免疫反应性。这些变体或衍生物包括对FCV多肽一级氨基酸序列具有较小修饰的多肽，所述修饰可产生与未修饰的对应多肽相比具有基本上相同活性的肽。此类修饰可能是有意的，如通过定点诱变产生的，或可以是自发的。术语“变体”还涵盖对序列的缺失、添加和取代，只要该多肽起到产生如本文所定义的免疫学应答的作用即可。

术语“保守变异”表示用另一种生物学相似的残基对氨基酸残基替代，或核酸序列中的核苷酸的这种替代，其使得编码的氨基酸残基不变或为另一种生物学上相似的残基。在这一点上，如上所述，特别优选的取代在性质上通常是保守的。

本公开的多核苷酸包括遗传密码的简并性，例如对特定宿主优化的密码子用法的序列。如本文中所用，“优化的”是指经遗传工程改造以增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码FCV多肽的优化的多核苷酸，可修饰FCV蛋白基因的DNA序列以：1)包含在特定物种中高度表达的基因优选的密码子；2)在核苷酸碱基组成中包含基本上在所述物种中发现的A+T或G+C含量；3)形成所述物种的起始序列；或4)消除引起RNA去稳定化、不合适的聚腺苷酸化、降解和终止或形成二级结构发夹结构或RNA剪接位点的序列。通过利用真核生物和原核生物或特定物种中密码子用法的分布频率可以实现所述物种中FCV蛋白表达的增加。术语“优选密码子用法的频率”是指由特定宿主细胞在使用核苷酸密码子来指定给定的氨基酸时显示的偏好。存在20种天然氨基酸，其中大多数由不止一种密码子指定。因此，只要由核苷酸序列编码的FCV多肽的氨基酸序列在功能上没有变化，则所有简并核苷酸序列都包括在本公开中。

两个氨基酸序列之间的序列同一性可通过NCBI(国家生物技术信息中心)成对blast和blosum62矩阵，使用标准参数来确定(参见，例如，可在“国家生物技术信息中心”服务器上以及在Altschul等中获得的BLAST或BLASTX算法；因此，本文件通过术语“blast”谈到了使用算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵)。

关于序列的“同一性”可以指具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以两个序列中较短的一个中的核苷酸或氨基酸的数目，其中两个序列的比对可以根据Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)，例如，使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长和为4的空位罚分来测定，并且包含比对的序列数据的计算机辅助分析和解释可使用商购可得的程序(例如，Intelligenetics^TM Suite,Intelligenetics Inc.CA)来方便地进行。当RNA序列被认为是相似的，或者与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)等同。因此，RNA序列在本发明的范围内并且可通过将DNA序列中的胸苷(T)认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)等同而从DNA序列衍生而来。

可使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA)测定两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性或两个核苷酸序列之间的序列同一性。

以下文献提供了用于比较序列的相对同一性或同源性的算法，并且另外地或可选地关于前述内容，这些参考文献中的教导可以用于测定百分比同源性或同一性：NeedlemanSB和Wunsch CD；Smith TF和Waterman MS；Smith TF，Waterman MS和Sadler JR；Feng DF和Dolittle RF；Higgins DG和Sharp PM；Thompson JD，Higgins DG和Gibson TJ；和DevereuxJ，Haeberlie P和Smithies O。并且，无需过多实验，本领域技术人员可以参考许多其他程序或参考文献来测定百分比同源性。

杂交反应可以在不同的“严格度”条件下进行。增加杂交反应严格度的条件是公知的。参见例如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook等，1989)。

本发明还包括包含在载体分子或表达载体中并可操作地连接至启动子元件和任选地连接至增强子的FCV多核苷酸。

“载体”是指包含要在体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源多核苷酸可包含用于预防或治疗目的的目标序列，并且可以任选地以表达盒的形式存在。如本文中所用，载体不必能够在最终靶细胞或受试者中复制。该术语包括克隆载体和病毒载体。

术语“重组”意指半合成或合成来源的多核苷酸，其在天然环境中不存在，或是以在自然界中不存在的排列连接至另一个多核苷酸。

“异源”意指来源于与同其比较的其余实体在遗传上不同的实体。例如，可通过基因工程技术将多核苷酸置于源自不同来源的质粒或载体中，并且是异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出并且可操作地连接至除所述天然序列外的编码序列的启动子是异源启动子。

本发明涉及可包含有效量的重组FCV抗原和药学上或兽医学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或媒介物的绵羊、牛、山羊和猪疫苗或者药物或免疫学组合物。

本文所述的主题部分涉及与在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中制备的FCV抗原相关的组合物和方法，所述FCV抗原具有高免疫原性并且保护动物免受来自同源和异源FCV毒株的攻击。

组合物

本发明涉及可包含有效量的重组FCV抗原和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物的FCV疫苗或组合物。在一个实施方案中，重组FCV抗原由昆虫细胞中的杆状病毒表达载体表达。

本发明的一个实施方案涉及包含FCV空衣壳或FCV VLP(病毒样颗粒)的疫苗或组合物。通过表达FCV衣壳蛋白获得FCV空衣壳或FCV VLP(病毒样颗粒)。

本发明还涉及制备这些疫苗的方法，抗原用于产生这些疫苗的用途以及使用它们的接种方法。

本发明还涉及与病毒的天然序列相比被修饰的核苷酸序列(特别是cDNA)和氨基酸序列。本发明还涉及经修饰的核苷酸序列的表达产物以及包含这些修饰的FCV抗原和病毒。

本发明包括在动物诸如绵羊、牛、山羊或猪中引发免疫原性应答的任何FCV多肽、抗原、表位或免疫原。FCV多肽、抗原、表位或免疫原可以是引发、诱导或刺激动物诸如猫科动物或犬科动物中的应答的任何FCV多肽、抗原、表位或免疫原，诸如但不限于蛋白质、肽或其片段。

在其中FCV免疫组合物或疫苗是重组免疫组合物或疫苗的一个实施方案中，所述组合物或疫苗包含重组载体并且是不含佐剂的，并且可以任选地包含药物或兽医学可接受的赋形剂、载体或媒介物；重组载体是可包含编码FCV多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的杆状病毒表达载体。FCV多肽、抗原、表位或免疫原可以是衣壳蛋白及其任何片段。

在一个实施方案中，编码一种或多种FCV抗原的核酸分子是编码FCV衣壳蛋白的cDNA。在另一个实施方案中，编码一种或多种FCV抗原的核酸分子是编码FCV衣壳蛋白的片段的cDNA。

在另一个实施方案中，FCV抗原可以来源于如US 7,850,978中所述的FCV株FCV100869、FCV 431、FCV G1、FCV RMI6、FCV RMI9、FCV 94580、FCV 33585、FCV 89391和FCV88287、如U S6,534,066中描述的FCV RMI1、FCV RMI2、FCV RMI3、FCV RMI5、FCV RMI6、FCVRMI7、FCV RMI9、FCV A2、FCV F1、FCV G1、FCV G3、FCV F3031、FCV H3-2、FCV H1-4、FCV431、FCV 388b、FCV 337和FCV J5。

本发明涉及可包含有效量的重组FCV抗原的FCV组合物或疫苗。FCV组合物或疫苗不含佐剂。FCV组合物或疫苗可以任选地含有药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。

一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：3或4所示序列的FCV多肽及其变体或片段。

在另一个方面，本发明提供了与本发明的抗原性多肽，特别是与具有SEQ ID NO：3或4所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。

在另一个方面，本发明提供了上文鉴定的FCV多肽(SEQ ID NO：3或4)的片段和变体，其可以由本领域技术人员使用公知的分子生物学技术来容易地制备。

变体是具有与SEQ ID NO：3或4所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的同源多肽。

FCV多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO:3或4所示序列的FCV多肽或其变体的至少8个、10个、15个或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，FCV多肽的片段包括在全长FCV多肽上发现的特定抗原性表位。

在另一个方面，本发明提供编码FCV多肽的多核苷酸，诸如编码具有如SEQ ID NO：3或4所示序列的多肽的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO:3或4所示序列的多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的多肽，或包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸的其保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段，或这些多肽的组合。

在另一个方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列或其变体的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO：1或2所示序列的多核苷酸之一或其变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可包含另外的序列，诸如在同一转录单位内的另外的编码序列、控制元件诸如启动子、核糖体结合位点、5'UTR、3'UTR、转录终止子、多腺苷酸化位点、处于同一或不同启动子控制下的另外的转录单位、允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞转化的序列以及诸如对于提供本发明的实施方案所期望的任何此类构建体。

用于表达FCV多肽、抗原、表位或免疫原的元件有利地存在于本发明的载体中。这以最小的方式包含起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子以及任选地还有多腺苷酸化载体(对于某些载体诸如质粒，和某些病毒载体例如除痘病毒外的病毒载体)，基本上由其组成，或由其组成。当多核苷酸编码多蛋白片段例如FCV肽时，有利地，在载体中，将ATG置于阅读框的5'，并将终止密码子置于3'。可以存在用于控制表达的其他元件，例如增强子序列、稳定化序列诸如内含子和允许蛋白质分泌的信号序列。

本发明还涉及包含载体诸如表达载体的制剂，例如治疗性组合物。制剂可包含一种或多种载体，例如表达载体，诸如体内表达载体，其包含并表达一种或多种FCV多肽、抗原、表位或免疫原。在一个实施方案中，所述制剂在药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物中包含并表达多核苷酸，所述多核苷酸包含编码(且有利地表达)FCV抗原、表位或免疫原的多核苷酸，基本上由其组成或由其组成。因此，根据本发明的一个实施方案，制剂中的另外一种或多种载体包含编码FCV多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种其它蛋白质或其片段并且在适当的环境下该载体表达其的多核苷酸。

根据另一个实施方案，制剂中的一种或多种载体包含编码FCV多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种蛋白质或其片段的多核苷酸，或基本上由其组成或由其组成，所述一种或多种载体表达所述多核苷酸。在另一个实施方案中，制剂包含一种、两种或更多种载体，所述载体包含编码及有利地在体内表达FCV多肽、抗原、融合蛋白或其表位的多核苷酸。

根据本发明的另一个实施方案，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，特别是体内表达载体。在一个具体的非限制性实例中，pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；Luke等，1997；Hartikka等，1996，参见，例如，美国专利第5,846,946号和第6,451,769号)可用作用于插入多核苷酸序列的载体。pVR1020质粒衍生自pVR1012并含有人tPA信号序列。在一个实施方案中，人tPA信号包含登录号为HUMTPA14的Genbank中的氨基酸M(1)至氨基酸S(23)。在另一个具体的非限制性实例中，用作用于插入多核苷酸序列的载体的质粒可包含登录号为U28070的Genbank中的氨基酸M(24)至氨基酸A(48)的马IGF1的信号肽序列。关于可在实践中参考或采用的DNA质粒的另外的信息见于例如美国专利第6,852,705号、第6,818,628号、第6,586,412号、第6,576,243号、第6,558,674号、第6,464,984号、第6,451,770号、第6,376,473号和第6,221,362号中。

术语质粒涵盖包含根据本发明的多核苷酸和其在所希望的宿主或靶标的一个或多个细胞中体内表达所必需的元件的任何DNA转录单位；并且在这一点上，需要指出的是超螺旋或非超螺旋的环形质粒以及线性形式旨在本发明的范围内。

除了编码FCV抗原、表位或免疫原(任选地与异源肽序列融合)的多核苷酸以外，每个质粒还包含或含有变体、类似物或片段，其任选地可操作地连接至启动子或处于启动子控制之下或依赖于启动子，或基本上由其组成。一般地，使用在真核细胞中具有功能的强启动子是有利的。强启动子可以是但不限于人或鼠来源的，或任选地具有另一种来源(诸如大鼠或豚鼠)的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，超级启动子(Ni，M.等，Plant J.7,661-676,1995.)。CMV-IE启动子可包含实际的启动子部分，其可以与或可以不与增强子部分结合。可参考EP-A-260 148、EP-A-323 597、美国专利第5,168,062号、第5,385,839号和第4,968,615号以及PCT申请第WO87/03905。CMV-IE启动子有利地是人CMV-IE(Boshart等，1985)或鼠CMV-IE。

更一般而言，启动子具有病毒、植物或细胞来源。可用于实施本发明的除CMV-IE外的强病毒启动子是SV40病毒的早/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可有用地用于实施本发明的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子，诸如例如，结蛋白启动子(Kwissa等，2000)或肌动蛋白启动子(Miyazaki等，1989)。

质粒可包含其他表达控制元件。特别有利的是包含稳定化序列例如内含子序列，例如玉米醇脱氢酶内含子(Callis等，Genes&Dev.1(10):1183-1200,Dec.1987)、hCMV-IE的第一个内含子(PCT申请第WO1989/01036号)、兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等，1979)。在另一个实施方案中，质粒可以包含3'UTR。3'UTR可以是但不限于土壤杆菌属(agrobacterium)胭脂碱合酶(Nos)的3'UTR(Nopaline synthase:transcript mappingand DNA sequence.Depicker,

A.等J.Mol.Appl.Genet.,1982；Bevan,NAR,1984,12(22):8711-8721)。

关于质粒和除痘病毒外的病毒载体的多腺苷酸化信号(polyA)，可以更多地使用牛生长激素(bGH)基因的poly(A)信号(参见US5,122,458)，或兔γ-珠蛋白基因的poly(A)信号或SV40病毒的poly(A)信号。

“宿主细胞”是指已被遗传改变或能够通过施用外源多核苷酸(诸如重组质粒或载体)而在遗传上改变的原核或真核细胞。当提及遗传改变的细胞时，该术语既指最初改变的细胞，也指其后代。

在一个实施方案中，重组FCV抗原在昆虫细胞中表达。在另一个实施方案中，将昆虫细胞灭活并除去细胞碎片。

使用方法

在一个实施方案中，本文公开的主题涉及对绵羊、牛、山羊或猪接种疫苗的方法，所述方法包括向绵羊、牛、山羊或猪施用有效量的疫苗，所述疫苗可包含有效量的重组FCV抗原和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。

在本发明的一个实施方案中，该方法包括单次施用用根据本发明的乳剂配制的疫苗组合物。例如，在一个实施方案中，免疫学或疫苗组合物包含杆状病毒表达的FCV抗原，包括多肽和VLP(病毒样颗粒)或空衣壳。电子显微镜观察表明，用杆状病毒表达载体转化的昆虫细胞产生FCV VLP或FCV空衣壳，因此根据本发明的免疫学或疫苗组合物涵盖包含FCVVLP或FCV空衣壳的那些免疫学或疫苗组合物。

在一个实施方案中，本文公开的主题涉及对绵羊、牛、山羊或猪接种的方法，其包括向绵羊、牛、山羊或猪施用由杆状病毒载体在昆虫细胞中产生的FCV抗原。

在一个实施方案中，本文公开的主题涉及引发免疫应答的方法，所述方法包括向绵羊、牛、山羊或猪施用包含由杆状病毒载体在昆虫细胞中产生的FCV抗原的疫苗。

在一个实施方案中，本文公开的主题涉及制备疫苗或组合物的方法，所述方法包括分离由杆状病毒载体在昆虫细胞中产生的FCV抗原，并任选地将其与药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或载体组合。在另一个实施方案中，该方法还包括灭活昆虫细胞和除去细胞碎片的步骤。

将同源和异源FCV株用于攻击以测试疫苗的功效。施用可以皮下或肌内施用。施用可以是无针的(例如Pigjet或Bioject)。

在本发明的一个实施方案中，可以采用初免-加强方案，其由至少一次初次施用和至少一次加强施用(使用至少一种共同的多肽、抗原、表位或免疫原)组成。通常，初次施用中使用的免疫组合物或疫苗在性质上与用作加强剂的那些不同。然而，应该注意的是，相同的组合物可以用作初次施用和加强。这个施用方案被称为“初免-加强”。

根据本发明的初免-加强可包括将重组病毒载体用于表达编码抗原性多肽或其片段或变体的FCV编码序列或其片段。具体地，病毒载体可表达编码抗原性多肽的FCV基因或其片段。本文设想的病毒载体包括但不限于痘病毒[例如，痘苗病毒或减毒痘苗病毒、禽痘病毒或减毒禽痘病毒(例如，金丝雀痘、鸡痘、鸠痘(dovepox,)、鸽痘、鹌鹑痘、ALVAC、TROVAC；参见例如US 5,505,941、US 5,494,8070)、浣熊痘病毒、猪痘病毒等]、腺病毒(例如人腺病毒、犬腺病毒)、疱疹病毒(例如犬疱疹病毒、火鸡疱疹病毒、马立克氏病病毒、传染性喉气管炎病毒、猫疱疹病毒、喉气管炎病毒(ILTV)、牛疱疹病毒、猪疱疹病毒)、杆状病毒、逆转录病毒等。在另一个实施方案中，禽痘表达载体可以是金丝雀痘病毒载体，诸如ALVAC。在另一个实施方案中，禽痘表达载体可以是鸡痘病毒载体，例如TROVAC。将待表达的本发明的FCV抗原插入在特定痘病毒启动子例如昆虫痘病毒桑灯蛾42K启动子(Barcena，Lorenzo等2000)、痘苗启动子7.5kDa(Cochran等，1985)、痘苗启动子I3L(Riviere等，1992)、痘苗启动子HA(Shida，1986)、牛痘启动子ATI(Funahashi等，1988)、痘苗启动子H6(Taylor等，1988b；Guo等，1989；Perkus等，1989)等的控制之下。

在本发明的初免-加强方案的另一方面，施用包含本发明的FCV抗原的组合物，然后施用包含重组病毒载体的疫苗或组合物(所述重组病毒载体包含FCV抗原并在体内表达FCV抗原)，或灭活的病毒疫苗(US 7,850,978，US 6,534,066)或包含FCV抗原的组合物或者包含或表达FCV抗原的DNA质粒疫苗或组合物。同样，初免-加强方案可包括施用包含含有FCV抗原并在体内表达FCV抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物，或包含FCV抗原的灭活病毒疫苗或组合物，或者包含或表达FCV抗原的DNA质粒疫苗或组合物，然后施用包含本发明的FCV抗原的组合物。还应注意到，初次和二次施用可包含含有本发明的FCV抗原的组合物。

初免-加强方案包括使用至少一种共同的多肽和/或其变体或片段的至少一次初次施用和至少一次加强施用。用于初次施用的疫苗在性质上可与用作较后的加强疫苗的疫苗不同。初次施用可包括一次或多次施用。类似地，加强施用可包括一次或多次施用。

基于病毒载体的用于目标物种哺乳动物的组合物，例如基于非痘病毒的病毒载体的组合物的剂量体积通常为约0.1ml至约5.0ml，约0.1ml至约3.0ml和约0.5ml至约2.5ml。

疫苗的功效可以在最后一次免疫后约2至4周，通过用FCV的强毒株诸如FCV株33855攻击动物诸如猫科动物或犬科动物来检测。

这些FCV株的进一步细节可见于欧洲生物信息学信息(EMBL-EBI)网页，其中所有相关核苷酸序列通过引用并入本文。本发明人设想了可将所有FCV株(本文中所列的和仍待鉴定的那些VFC株)根据本公开的教导进行表达，以产生例如有效的疫苗组合物。将同源和异源株用于攻击以测试疫苗的功效。可以对动物进行皮内、皮下、喷雾、鼻内、眼内、气管内和/或口服攻击。

初免-加强施用可以有利地相隔1至6周，例如相隔约4周进行。根据一个实施方案，还设想了有利地使用基于病毒载体的疫苗或灭活的FCV疫苗的半年加强剂或一年加强剂。在第一次施用时，动物有利地为至少6-8周龄。

用于初免-加强方案中的包含本发明重组抗原性多肽的组合物不含佐剂，并且可以任选地包含在药学或兽医学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中。本发明的方案保护动物免受FCV影响和/或预防感染动物中的疾病进展。

本领域技术人员应该理解，本文的公开内容是通过示例的方式提供的，并且本发明不限于此。根据本文的公开内容和本领域的知识，本领域技术人员可以确定用于每个注射方案的施用次数、施用途径和剂量，而无需任何过度的实验。

本发明设想了至少一次向动物施用有效量的根据本发明制备的治疗性组合物。动物可能是雄性、雌性、怀孕雌性和新生儿。该施用可以通过各种途径进行，包括但不限于肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射或者经鼻内或口服给药。根据本发明的治疗性组合物还可通过无针装置(例如用Pigjet、Dermojet、Biojector、Avijet(Merial，GA，USA)、Vetjet或Vitajet装置(Bioject，Oregon，USA))施用。施用质粒组合物的另一种方法是使用电穿孔(参见，例如Tollefsen等，2002；Tollefsen等，2003；Babiuk等，2002；PCT申请第WO99/01158号)。在另一个实施方案中，通过基因枪或金颗粒轰击将治疗性组合物递送至动物。

在一个实施方案中，本发明提供了施用治疗有效量的用于递送FCV抗原或表位并在靶细胞中表达其的制剂。治疗有效量的确定对于本领域普通技术人员而言是常规实验。在一个实施方案中，所述制剂包含含有表达FCV抗原或表位的多核苷酸的表达载体以及药学或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂。在另一个实施方案中，药学或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂促进转染或将其他将多核苷酸转移至宿主动物和/或改善载体或蛋白质在宿主中的保留的其它手段。

在一个实施方案中，本文公开的主题提供了用于区分被感染的动物与接种疫苗的动物的检测方法。

本文公开了本发明的疫苗或组合物的使用允许检测动物中的FCV感染。本文公开了本发明的疫苗或组合物的使用允许通过区分被感染的动物与接种疫苗的动物来检测动物的感染。

制品

在一个实施方案中，本文公开的主题涉及用于实施引发或诱导免疫应答的方法的试剂盒，其可包含任何一种重组FCV免疫组合物或疫苗，或灭活的FCV免疫组合物或疫苗，重组FCVV组合物或疫苗以及进行该方法的说明。

本发明的另一个实施方案是用于进行在动物中诱导针对FCV的免疫学或保护性应答的方法的试剂盒，其包含含有本发明的FCV抗原的组合物或疫苗和重组FCV病毒免疫组合物或疫苗，以及用于进行以有效量递送以在动物中引发免疫应答的方法的说明书。

本发明的另一个实施方案是用于进行在动物中诱导针对FCV的免疫学或保护性应答的方法的试剂盒，其包含含有本发明的FCV抗原的组合物或疫苗和灭活的FCV免疫组合物或疫苗，以及用于进行以有效量递送以在动物中引发免疫应答的方法的说明书。

本发明的另一方面涉及如上所述的根据本发明的用于初免-加强免疫接种的试剂盒。所述试剂盒可包含至少两个小瓶：含有根据本发明的用于初免-接种的疫苗或组合物的第一小瓶，和含有根据本发明的用于加强-接种的疫苗或组合物的第二小瓶。试剂盒可以有利地含有用于额外的初次-接种或额外的加强-接种的另外的第一或第二小瓶。

以下实施方案涵盖在本发明中。在一个实施方案中，公开了包含FCV抗原或其片段或变体以及药物或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物的组合物。在另一个实施方案中，公开了上述组合物，其中FCV抗原或其片段或变体包含含有FCV抗原的至少15个氨基酸的免疫原性片段。在一个实施方案中，公开了其中FCV抗原或其片段或变体部分纯化的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中FCV抗原或其片段或变体基本上纯化的上述组合物。

在一个实施方案中，公开了其中FCV抗原或其片段或变体是FCV多肽的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中FCV多肽是衣壳蛋白或其片段的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中FCV抗原或其片段或变体与SEQ ID NO：3或4所示序列具有至少80％序列同一性的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中FCV抗原由与SEQ ID NO：1或2所示序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的上述组合物。在另一个实施方案中，公开了接种对FCV易感的动物的方法，所述方法包括向动物施用上述组合物。在一个实施方案中，公开了接种对FCV易感的动物的方法，其包括初免-加强方案。在一个实施方案中，公开了在昆虫细胞中表达的基本上纯化的抗原性多肽，其中所述多肽包含：与具有如SEQ IDNO：3或4所示序列的多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在任何实施方案中，动物优选是猫科动物或犬科动物。在一个实施方案中，公开了诊断动物的FCV感染的方法。在另一个实施方案中，用于初免-加强接种的试剂盒包含至少两个小瓶(其中第一小瓶含有本发明的组合物，并且第二小瓶含有用于加强-接种的组合物)，包含含有重组病毒载体的组合物或包含灭活病毒组合物的组合物或含有或表达FCV抗原的DNA质粒组合物。

药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂是本领域技术人员公知的。例如，药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明的方法的其它药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂包括但不限于聚(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是有助于施用载体(或在体外从本发明的载体表达的蛋白质)的任何化合物或化合物的组合；有利地，载体、媒介物或赋形剂可促进载体的转染和/或改善载体(或蛋白质)的保存。剂量和剂量体积在本文中在一般性描述中进行了讨论，并且也可由本领域技术人员结合本领域的知识阅读本公开来确定，而无需任何过度实验。

佐剂可包括油包水乳剂。油包水乳剂的实例包括油基油包水疫苗乳剂，其在4℃下是稳定的且流动的，包含：6-50v/v％的含有抗原的水相，优选12至25v/v％，50至94v/v％的全部或部分含有不可代谢的油(例如，矿物油诸如石蜡油)和/或可代谢的油(例如，植物油，或脂肪酸，多元醇或醇酯)的油相，0.2至20p/v％(优选3至8p/v％)表面活性剂，后者全部或部分上或在混合物中是聚甘油酯，所述聚甘油酯优选为聚甘油(聚)蓖麻油酸酯或聚氧乙烯蓖麻油或氢化聚氧乙烯蓖麻油。可用于油包水乳剂中的表面活性剂的实例包括乙氧基化脱水山梨糖醇酯(例如，可获自AppliChem,Inc.,Cheshire,CT的聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)和脱水山梨糖醇酯(例如，可获自Sigma Aldrich,St.Louis,MO的脱水山梨糖醇单油酸酯)。

其他公知的佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，诸如具有一个或多个非甲基化CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等，1996；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，诸如由M.Powell,M.Newman,PlenumPress 1995出版的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”的第147页描述的SPT乳剂，和同一著作的第183页中描述的乳剂MF59，(4)包含季铵盐的阳离子脂质，例如DDA(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)在本申请中引用的和通过引用并入本申请的任何文献中论述的其它佐剂，或(9)其任意组合或混合物。

在基于杆状病毒/昆虫细胞表达的多肽的免疫组合物和/或疫苗的情况下，剂量可包括约1μg至约2000μg，约50μg至约1000μg和约100μg至约500μg的FCV抗原、表位或免疫原。剂量可包括约10²至约10²⁰，约10³至约10¹⁸，约10⁴至约10¹⁶，约10⁵至约10¹²个VLP。剂量体积可以在约0.1ml至约10ml之间，在约0.2ml至约5ml之间。

现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

使用J.Sambrook等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版，ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,2014)描述的标准分子生物学技术进行DNA插入物、质粒和重组病毒载体的构建。

实施例1在杆状病毒/昆虫细胞系统中构建和表达FCV衣壳抗原

FCV衣壳基因(2007bp)编码由原肽(propetide)(1-124)和衣壳蛋白(成熟链，125-668)组成的668个氨基酸的多肽。克隆编码成熟蛋白质(125-668)的序列(SEQ ID NO：3)，并对相应的DNA序列针对于昆虫细胞进行密码子优化(SEQ ID NO：1)。潜在的功能域如下表1中所示。

表1在成熟链上注释的潜在功能域

(FCV衣壳蛋白/株100869*：125-668)

株100869*：US7,850,978中公开的FCV株

质粒pMEB062的生成

使用载体和插入物的XbaI和Bam HI位点将针对昆虫表达优化的FCV衣壳(SEQ IDNO：1)克隆至商业质粒pVL1392(Pharmingen)中以生成表达质粒pMEB062(图2)。

重组杆状病毒BacMEB062的生成

所用的杆状病毒载体是通过致死性缺失修饰的AcNPV(BaculoGold DNA,Pharmingen)，其仅通过同源重组拯救。

使用质粒pMEB062通过同源重组生成编码在多角体蛋白启动子控制之下的株100869的FCV衣壳基因(US7,850,978,Merial USA)的重组杆状病毒。根据制造商的方案(Baculogold,Pharmingen)，用质粒pMEB062和Bsu36I三切割线性化的AcNPV DNA共转染草地贪夜蛾(Sf)9昆虫细胞。将来自共转染上清液的重组杆状病毒进行噬斑纯化两次。在27℃下以25cm2单层瓶规模扩增5个克隆(第1代)。使用特异于FCV衣壳抗原的单克隆抗体，通过Western印迹分析感染的细胞和上清液的FCV衣壳表达。克隆3显示正确的Western印迹图谱。以50mL的规模将该克隆在27℃下于Erlenmeyer(悬浮液)中以105rpm进一步扩增(第2代)。以200mL的规模进行第三次传代(第3代)以获得用于蛋白质表达的病毒原液。然后通过空斑测定法滴定该病毒原液。用含有2％FCS的SF900II培养基进行病毒原液的获得。滴定后，将重组杆状病毒原液(第3代)用于在无血清培养基中生产蛋白质。

杆状病毒BacMEB062的表达分析

预期的重组体具有表2所示的特征。

表2

用产生的杆状病毒BacMEB062或野生型杆状病毒(AcNPV)以1、3和10pfu/ml的感染复数(MOI)感染昆虫细胞(Sf9)。在28℃下，在不含FCS的Sf900II培养基中，在105rpm下生长昆虫细胞1至4天。通过将完全Sf9裂解物和培养物上清液进行SDS-PAGE(4-20％，Invitrogen)然后进行考马斯蓝染色(Simplyblue SafeStain，Invitrogen)或通过利用针对FCV衣壳蛋白的单克隆抗体的western印迹来分析蛋白质产生。

如在图3中通过考马斯所观察到的，在感染细胞的上清中表达了预期大小为60kDa的条带(左图)。通过使用特异性单克隆抗体的Western印迹检测该蛋白证实了如图3(右图)所示的考马斯染色结果。

动力学显示FCV衣壳表达的最佳条件是MOI＝1和感染后4天(图4)。

电子显微镜分析揭示了衣壳蛋白正确自装配为直径为40nm的VLP和杯状病毒样病毒体的正确形态，浓度为10¹⁰VLP/mL(图5)。

总之，用转染质粒pMEB062生成的杆状病毒BacMEB062显示出FCV蛋白衣壳在上清液中的高水平表达，并且通过电子显微镜检查证明了这些蛋白质自动装配成VLP。

实施例2用杆状病毒表达的FCV衣壳蛋白接种猫，随后进行毒力攻击

本研究的目的是评估猫杯状病毒(FCV)病毒样颗粒(VLP)疫苗的功效。在感染了含有FCV 100869株的衣壳基因的重组杆状病毒的昆虫细胞中产生VLP(实施例1)。将杆状病毒BacMEB062在Sf9细胞中生长7天(MOI为0.1)。通过利用在线圆盘堆叠式离心机离心来清除上清液收获物以消除细胞碎片。通过过滤上清液而部分消除活杆状病毒。通过β-丙内酯(1/300e，12℃，24小时)使上清中剩余的活杆状病毒失活。通过在注射2次疫苗的初级疗程后3周用异源VS-FCV株攻击猫来评估功效。

研究时间表概括于下表3中。

表3实验计划

SQ*＝皮下途径

FCV株33855**：感染滴度10^8.5CCID₅₀/mL

一个剂量的未稀释FCV VLP的体积＝2.5mL

一个剂量的1/10稀释FCV VLP(未稀释的FCV VLP在不含Mg和不含Ca的PBS中稀释至1/10)的体积＝2.5mL

对总共30只SPF猫(14只雄性和16只雌性)进行称重和临床检查以检查其身体状况。在D0，猫为8至10周龄。根据窝产仔、性别和年龄将猫依次分配至3个组(A至C)，每组10只猫。

在D3，将所有动物称重。在D0和D28，在全身麻醉下在干燥管中收集血液样品。将血清储存在-20℃直至滴定。

在D0和D28，A组的每只动物接受1个剂量的未稀释FCV VLP，并且B组的每只猫在肩胛骨之间通过皮下途径接受1个剂量的稀释至1/10的FCV VLP。

在D3，将肩胛间区域夹住并在注射前消毒。

C组的猫未接种疫苗。

从D3至攻击前一天，每天进行猫的临床检查。

在D49攻击当天中，监测到所有猫处于良好的总体状况。将攻击株在37℃解冻并在生理盐水缓冲液(pH 7.1)中稀释至1/400，从而获得滴定为约10^5.5CCID₅₀/mL的悬浮液，并在接种前将其保持在碎冰上。

在通过肌肉注射全身麻醉后，在每个鼻孔中向每只猫施用0.25mL稀释的攻击株并使其口服0.5mL。

在攻击后14天内对所有动物进行每日的总体和局部检查。如评分表4中所列，更特别地检查猫的典型FCV感染的临床体征。

在攻击前三天，然后在攻击后(pc)4天、8天、11天和14天(即在D46、D53、D57、D60和D63)将猫称重。

表4定义症状强度的临床评分

在攻击前一天以及攻击后2天、4天、6天、8天、11天和14天(即，在D47、D51、D53、D55、D57、D60和D63)收集咽拭子。将它们在-70℃下储存在富含抗生素和胎牛血清的F15培养基(3mL生长培养基/拭子)中直至病毒分离。

在攻击当天(D49)和14天后(D63)或在通过肌内注射全身麻醉下死亡日收集血液样品。将血清在-20℃下储存直至用FCV抗体滴定。

在D0、D28、D49和D63收集的血清中通过ELISA滴定FCV抗体。从在D51、D53、D57、D60和D63收集的咽拭子分离FCV并在CrFK(Crandell-Rees猫肾)细胞上滴定FCV。

结果

死亡率

死亡率结果示于图6中。相较于对照组中的0％(0/10),攻击后存活猫的百分比在两个接种组中均为100％(10/10)。

攻击后，接种的猫均未死亡或均未在监测期间对其进行无痛致死，而所有对照均如此，在攻击后(pc)第4天(D53)发现1只死亡，在临床检查期间在攻击后第6天(D55)死亡1只，并且在攻击后第5天与攻击后第11天之间(在D54与D60之间)由于严重的临床症状而使8只无痛致死。

温度

图7显示攻击后的平均直肠温度。

在对照组中，直肠温度迅速升高并在第2天达到峰值，然后降低。所有对照呈现明显的高热(最大值＝41.6℃)。在高热峰期后，直肠温度下降，并且在10个对照中，5个出现严重低温(RT在34.5℃与36.8℃之间)。

攻击后，两个接种组的直肠温度略微升高直至第7天(D56)，然后恢复到正常范围。在10只猫中，A组中有4只(未稀释的FCV VLP)和B组中有3只(1/10稀释的FCV VLP)没有出现任何高热(RT的评分＝0)。在来自A组10只猫中的5只和来自B组10只猫中的4只中观察到显著的高热(RT>40.0℃)(在两个接种组中最大值＝41.0℃)。

随着时间推移的直肠温度变化在两组之间差异显著(p<0.001)。攻击后两天(即在D51，高热的峰值)，相较于两个接种组，对照组中的直肠温度在统计学上显著更高(ANOVA，p<0.001)。对于D50至D53期间，相较于A组(平均+1.4℃，p<0.001)和相较于B组(平均+1.1℃，p<0.001)，对照组中的温度显著更高。

重量

图8显示了从D5至D63的监测期间每组的平均体重(以g为单位)(不包括死猫)。图9显示了攻击后每组的相对平均日增重。

从D0至攻击，所有猫均规律增重。

在攻击前(即D46)，组间体重没有显著差异(Kruskal-Wallis，p＝0.977)。

攻击后，在对照组的所有猫中均观察到体重减轻。对照体重减轻直至死亡。平均每日相对体重增加为-4％。在来自A组(未稀释的FCV VLP)的4/10只猫和来自B组(1/10稀释的FCV VLP)的5/10只猫中观察到体重减轻。攻击后14天，所有接种的猫均获得了比攻击前初始体重更好的体重。两个接种组的相对体重增加平均为1％。

与两个接种组相比，对照组的相对每日增重显著更低(ANOVA，p<0.001)。两个接种组之间的相对每日重量没有统计学上显著的差异。

在攻击后4天、8天和11天(即D53、D57和D60)，对照猫的重量显著低于来自组A和B的猫的重量，平均差异范围从315g(D53：组B对比对照)至981g(D60：组A对比对照)。

无论哪天，在A组与B组小猫之间没有观察到显著差异。从D53到D63，在组A与B之间没有观察到显著差异(p＝0.250)。

临床体征

所有对照从攻击后第2天至第6天一直呈现出总体状况的改变，直至死亡或无痛致死。在10/10对照中观察到冷漠，并且在即将无痛致死之前在2只猫中观察到抑郁。

在监测期间，在接种组中未观察到总体状况的改变。

表5每组的严重临床症状

死亡数目：攻击后死亡或无痛致死的猫数量

总体评分

图10和图11中给出了攻击后每组的临床评分及其分布。

相较于对照组的9.74，A组的平均总体评分为0.61，B组为0.50。在10只猫中，A组的3只猫和B组的2只猫的总体评分等于0。在攻击后这些猫没有显示任何临床体征。

与对照组相比，两个接种组的总体评分均在统计学上显著降低(ANOVA，p<0.001)。两个接种组之间的总体评分没有统计学上的显著差异。

FCV血清学

图12显示监测期间平均FCV Ab滴度的演化。

所有的猫在D0对于FCV都是血清阴性的。

在第一次或第二次注射FCV VLP疫苗后，在所有猫中观察到血清转化。攻击前，接种组的平均Ab滴度相似。FCV攻击在接种的猫中引发了加强效应。

在攻击之前所有对照都保持阴性。攻击之后，只有2只直至攻击后第11天幸存下来的猫发生了血清转换。其他猫在死亡时仍为FCV血清阴性。

FCV排出

图13显示攻击后每组病毒排出的演变，图14显示每组的wAuC。

在攻击之前，猫均不脱落病毒。

攻击后，病毒排出增加并在A组和B组中于攻击后第2天和第4天达到峰值，然后迅速下降。攻击后14天(即D63)，在A组中，A组中没有一只猫仍然脱落病毒，而在B组中只有2只猫仍然脱落病毒，但数量很低(1.2或1.7log₁₀CCID₅₀/mL)。

攻击后，对照组的所有猫均脱落病毒直至死亡或无痛致死。在死亡或无痛致死之前在咽拭子中测量的滴度仍然很高(从4.2至6.2log₁₀CCID₅₀/mL)。

A组中排出的FCV的最大量的范围为2.2至4.7log₁₀CCID₅₀/mL，B组为3.2至4.2log₁₀CCID₅₀/mL，而C组的猫排出5.2至6.2log₁₀CCID₅₀/mL的最大量。

平均而言，三个治疗组之间存在显著的总体差异(p<0.001，ANOVA)。成对比较显示，对照组中的猫的wAuC高于A组(p<0.001)和B组(p<0.001)的猫。A组与B组之间没有显著差异

仅考虑两个接种组，该模型的结果显示，日相互作用没有显著影响(p＝0.373)，表明时间趋势不因接种组而不同。有时间效应(p<0.001)，但没有组效应(p＝0.147)。成对比较显示，仅在D53，FCV VLP未稀释组(A组)中病毒滴度显著低于FCV VLP1/10稀释组(B组)(p＝0.049)。

当在最大滴度上(p＝0.173)和在浓度峰值日(p＝0.179)比较它们时，在两个接种组之间没有观察到差异。

讨论

在用表达FCV100869株的衣壳基因的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中产生病毒样颗粒(VLP)。在第0天和第28天，将该新的FCV疫苗(未稀释(每剂2.5 10¹⁰VLP)或1/10稀释(每剂2.5 10⁹VLP))注射给9周的SPF猫。

通过在第二次接种后3周用异源VS-FCV株进行攻击来评估该新FCV疫苗的功效。

在接种之前，所有猫对于FCV都是血清阴性的，与其SPF状态一致。

未稀释的或稀释至1/10的FCV VLP疫苗的一次注射足以在大多数猫中诱发血清转换。在第二次注射FCV FCV VLP疫苗后三周，所有猫均呈现抗FCV的ELISA Ab。

攻击被验证，并且非常严峻。所有对照组发展出FCV典型临床体征：持续至少1至3天的显著高热(RT>40.0℃)(10/10)、口鼻溃疡(10/10)、体重减轻(10/10)、脱水(10/10)、身体状况改变(10/10)、大量鼻涕(9/10)、眼分泌物(8/10)、面部或肢体水肿(7/10)、皮肤溃疡或坏死(6/10)、黄疸(3/10)和呼吸困难(1/10)。除一只猫只有少量溃疡外，所有猫的口鼻溃疡都很大和/或很多。另外，在攻击后第4天，一只猫被发现死亡，一只猫在攻击后第6天死亡，5只猫在攻击后第5天与第11天之间由于疾病的严重程度而被无痛致死。

在接种组中，3只注射未稀释的FCV VLP(A组)和2只注射了1/10FCV VLP(B组)的猫没有产生任何FCV特异性症状。在另外的接种组中观察到的临床症状不如对照组严重。生长未受到攻击的影响。

在接种组中没有观察到总体状况的改变，没有大量的鼻涕，没有眼分泌物，没有面部或肢体/水肿，没有观察到呼吸困难。

在未稀释的与1/10稀释的FCV VLP疫苗之间没有观察到临床体征的显著差异。

在超强毒力攻击后，未稀释和1/10稀释的FCV VLP疫苗可防止猫死亡、面部或肢体水肿、呼吸困难，并降低皮肤坏死和口鼻溃疡的频率和严重程度。

攻击在所有接种组中诱导了加强效应。在对照组中，只有2只存活至攻击后第10天的猫才产生了低的抗体反应。

对于临床症状或病毒脱落未观察到FCV VLP疫苗的剂量效应。

本研究表明，在9周龄的SPF猫中以2.5 10¹⁰VLP或2.5 10⁹VLP的剂量间隔4周施用2次FCV VLP疫苗注射显著降低了临床体征的严重程度(预防死亡、面部或肢体水肿、呼吸困难以及减少皮肤坏死和口鼻溃疡的频率和严重程度)，并且在用异源VS-FCV株进行强毒攻击后显著减少了病毒脱落。

序列表

<110> Merial, Inc.

Poulet, Herve

Reynard, Frederic

<120> FCV重组疫苗及其用途

<130> MER 15-267.PCT

<150> 62/207,638

<151> 2015-08-20

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码来自FCV 100869-1株的FCV衣壳蛋白(125-668)的经过密码子优化的DNA

<400> 1

atggctgacg acggttccat caccgctccc gagcagggca ccctggtcgg tggtgtgatc 60

gccgagccct ccgctcagat gtccgctgct gctgacatgg ctaccggcaa gtccgtggac 120

tccgagtggg aggctttctt ctccttccac acctccgtga actggtccac ctccgagacc 180

cagggcaaga tcctgttcaa gcaggctctg ggtcccctgc tgaaccccta cctgacccac 240

ctggccaagc tgtacgtggc ttggtccggt tccatcgacg tgcgcttctc catctccggt 300

tccggcgtgt tcggtggcaa gctggctgct atcgtggtgc cccctggtgt cgaccccgtg 360

cagtccacct ccatgctgca gtacccccac gtgctgttcg acgctcgtca ggtggagccc 420

gtggtgttca ccatccccga cctgcgttcc accctgtacc acctgatgtc cgacaccgac 480

accacctccc tggtgatcat gatctacaac gacctgatca acccctacgc taacgacgct 540

aactcctccg gttgcatcgt gaccgtggag accaagcccg gttccgactt caagttccat 600

ctcctgaagc ctcctggttc catgctgacc cacggttccg tgccctccga cctgatcccc 660

aagtcctcct ccctgtggat cggtaaccgt tactggaccg acatcaccga cttcgtgatc 720

cgtcccttcg tgttccaagc taaccgtcac ttcgacttca accaggaaac cgctggttgg 780

tccacccccc gtttccgtcc catcaccgtg accatctccc agaagggtgg cgagaagctg 840

ggtatcggta tcgctaccga cttcatcgtg cccggtatcc ccgacggttg gcctgacacc 900

accatcccat ccaagctgac ccccgctggt gactacgctg tgaccacctc caacggtact 960

gacatcacca cccctcgtga gtacgactcc gctaacgaga tcgtgaacaa caccaacttc 1020

aagtccatgt acatctgcgg tgctctgcag cgtgcttggg gtgacaagaa gatctccaac 1080

accgctttca tcaccaccgc taccgtggag ggtaacaacc tcgagccctc caacgtgatc 1140

aaccctacca agatcgctgt gttccaggac aaccacgtga accgtgacgt gcagacctcc 1200

gacgtgaccc tggctctgct gggttacacc ggtatcggcg aggaagctat cggtgctgac 1260

cgtgacaagg tggtgcgcat ctccgtgctg cccgagaccg gtgctcgtgg tggtaaccac 1320

cccatcttct acaagaacac cgtgaagctg ggttacgtga tccgttctat cgacgtgttc 1380

aactcccaga tcctgcacac ctcccgtcag ctgtccctga acaactacct gctgcccccc 1440

gactccttcg ctgtgtaccg tatcatcgac gctaacggta gctggttcga catcggcatc 1500

gactccgacg gtttctcctt cgtgggcgtg tccaacatcg gcaagctcga gttccccctg 1560

tccgcttcct acatgggtat ccagctggct aagatccgtc tggcttccaa catccgttcc 1620

accatgacca agctc 1635

<210> 2

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码来自FCV 100869-1株的FCV衣壳蛋白(125-668)的野生型DNA

<400> 2

atggcggatg acggttccat cacagcgcct gagcaaggaa cgctggttgg aggagtcatt 60

gctgaaccta gtgcccaaat gtcagcggcc gctgatatgg ccacaggtaa aagcgttgac 120

tctgagtggg aggcgttctt ttccttccac accagtgtca actggagtac atctgaaacc 180

cagggaaaga ttcttttcaa acaggcctta gggcccttgc taaatcccta tctcacccat 240

cttgctaaac tatatgtggc atggtccggc tctattgatg tcagattctc tatctctggt 300

tcgggtgtgt tcggtggaaa gcttgcagca attgtagtgc caccaggggt cgaccctgtg 360

caaagtactt caatgttgca gtacccccat gttctgtttg acgctcgtca agtggaacct 420

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accacctcct tagtcattat gatttataat gacctaatca acccttatgc taatgatgct 540

aattcttcgg gatgcatagt cactgttgag actaaacctg gctctgattt caaattccac 600

ctcttaaaac cccccggttc aatgctaaca catggctctg ttccatctga cttgattccc 660

aagtcatcct cactatggat tggaaaccgc tattggactg acatcactga ttttgtaatt 720

cgaccatttg ttttccaggc gaataggcac tttgacttca atcaggagac agcggggtgg 780

agcactccta ggtttcggcc aattactgtc accataagtc agaaaggagg ggaaaagctc 840

ggaattggga tcgcaactga ctttattgtc ccaggaatcc ctgatggttg gccagatacc 900

acaattcctt caaaactgac ccctgcaggt gactacgcag tcaccacaag taatgggact 960

gacatcacaa caccaagaga gtatgattcg gctaacgaga ttgtaaacaa caccaatttt 1020

aaaagcatgt atatatgtgg ggctttgcaa agggcctggg gtgataagaa aatttcaaac 1080

actgctttca taaccactgc tacagtcgag ggaaataatc ttgaacctag caatgtgatt 1140

aaccctacaa agattgccgt gttccaagac aatcatgtta accgcgacgt gcaaacatca 1200

gatgtcacac tggctctcct tggctacacg ggcattggtg aagaagcaat tggtgccgac 1260

agagacaagg tagtacgcat tagtgtccta cctgagactg gagcacgtgg tgggaatcac 1320

ccaatctttt ataaaaacac cgtgaaattg ggctatgtaa ttagaagcat tgatgtgttc 1380

aactcccaaa ttttgcacac ctccaggcaa ctttctctta ataactatct cttaccacct 1440

gactccttcg cagtttatag aattattgat gctaatggat cttggtttga tataggtatt 1500

gattcagatg gtttctcttt tgttggtgtt tctaatattg gtaaacttga gtttcctctc 1560

tctgcctcct acatgggaat tcaattggca aagattcggc ttgcctcaaa cattaggagt 1620

acaatgacaa aacta 1635

<210> 3

<211> 545

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自FCV 100869-1株的FCV衣壳蛋白(125-668)

<400> 3

Met Ala Asp Asp Gly Ser Ile Thr Ala Pro Glu Gln Gly Thr Leu Val

1 5 10 15

Gly Gly Val Ile Ala Glu Pro Ser Ala Gln Met Ser Ala Ala Ala Asp

20 25 30

Met Ala Thr Gly Lys Ser Val Asp Ser Glu Trp Glu Ala Phe Phe Ser

35 40 45

Phe His Thr Ser Val Asn Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gln Gly Lys Ile

50 55 60

Leu Phe Lys Gln Ala Leu Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Thr His

65 70 75 80

Leu Ala Lys Leu Tyr Val Ala Trp Ser Gly Ser Ile Asp Val Arg Phe

85 90 95

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala Ile Val

100 105 110

Val Pro Pro Gly Val Asp Pro Val Gln Ser Thr Ser Met Leu Gln Tyr

115 120 125

Pro His Val Leu Phe Asp Ala Arg Gln Val Glu Pro Val Val Phe Thr

130 135 140

Ile Pro Asp Leu Arg Ser Thr Leu Tyr His Leu Met Ser Asp Thr Asp

145 150 155 160

Thr Thr Ser Leu Val Ile Met Ile Tyr Asn Asp Leu Ile Asn Pro Tyr

165 170 175

Ala Asn Asp Ala Asn Ser Ser Gly Cys Ile Val Thr Val Glu Thr Lys

180 185 190

Pro Gly Ser Asp Phe Lys Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Met

195 200 205

Leu Thr His Gly Ser Val Pro Ser Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ser Ser

210 215 220

Leu Trp Ile Gly Asn Arg Tyr Trp Thr Asp Ile Thr Asp Phe Val Ile

225 230 235 240

Arg Pro Phe Val Phe Gln Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gln Glu

245 250 255

Thr Ala Gly Trp Ser Thr Pro Arg Phe Arg Pro Ile Thr Val Thr Ile

260 265 270

Ser Gln Lys Gly Gly Glu Lys Leu Gly Ile Gly Ile Ala Thr Asp Phe

275 280 285

Ile Val Pro Gly Ile Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr Ile Pro Ser

290 295 300

Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala Val Thr Thr Ser Asn Gly Thr

305 310 315 320

Asp Ile Thr Thr Pro Arg Glu Tyr Asp Ser Ala Asn Glu Ile Val Asn

325 330 335

Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr Ile Cys Gly Ala Leu Gln Arg Ala

340 345 350

Trp Gly Asp Lys Lys Ile Ser Asn Thr Ala Phe Ile Thr Thr Ala Thr

355 360 365

Val Glu Gly Asn Asn Leu Glu Pro Ser Asn Val Ile Asn Pro Thr Lys

370 375 380

Ile Ala Val Phe Gln Asp Asn His Val Asn Arg Asp Val Gln Thr Ser

385 390 395 400

Asp Val Thr Leu Ala Leu Leu Gly Tyr Thr Gly Ile Gly Glu Glu Ala

405 410 415

Ile Gly Ala Asp Arg Asp Lys Val Val Arg Ile Ser Val Leu Pro Glu

420 425 430

Thr Gly Ala Arg Gly Gly Asn His Pro Ile Phe Tyr Lys Asn Thr Val

435 440 445

Lys Leu Gly Tyr Val Ile Arg Ser Ile Asp Val Phe Asn Ser Gln Ile

450 455 460

Leu His Thr Ser Arg Gln Leu Ser Leu Asn Asn Tyr Leu Leu Pro Pro

465 470 475 480

Asp Ser Phe Ala Val Tyr Arg Ile Ile Asp Ala Asn Gly Ser Trp Phe

485 490 495

Asp Ile Gly Ile Asp Ser Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val Ser Asn

500 505 510

Ile Gly Lys Leu Glu Phe Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Met Gly Ile Gln

515 520 525

Leu Ala Lys Ile Arg Leu Ala Ser Asn Ile Arg Ser Thr Met Thr Lys

530 535 540

Leu

545

<210> 4

<211> 668

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自FCV 100869-1株的FCV衣壳蛋白(1-668)

<400> 4

Met Cys Ser Thr Cys Ala Asn Val Leu Lys Tyr Tyr Asp Trp Asp Pro

1 5 10 15

His Phe Arg Leu Ile Ile Asn Pro Asn Lys Phe Leu Ser Val Gly Phe

20 25 30

Cys Asp Asn Pro Leu Met Cys Cys Tyr Pro Glu Leu Leu Pro Glu Phe

35 40 45

Gly Thr Val Trp Asp Cys Asp Gln Ser Pro Gln Gln Ile Tyr Leu Glu

50 55 60

Ser Ile Leu Gly Asp Asp Glu Trp Ser Ser Thr Tyr Asp Ala Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Val Pro Pro Met His Trp Asp Asn Ala Gly Lys Ile Phe Gln

85 90 95

Pro His Pro Gly Val Leu Met His Tyr Ile Ile Gly Glu Val Ser Lys

100 105 110

Ala Trp Asp Pro Asn Leu Pro Leu Phe Arg Leu Glu Ala Asp Asp Gly

115 120 125

Ser Ile Thr Ala Pro Glu Gln Gly Thr Leu Val Gly Gly Val Ile Ala

130 135 140

Glu Pro Ser Ala Gln Met Ser Ala Ala Ala Asp Met Ala Thr Gly Lys

145 150 155 160

Ser Val Asp Ser Glu Trp Glu Ala Phe Phe Ser Phe His Thr Ser Val

165 170 175

Asn Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gln Gly Lys Ile Leu Phe Lys Gln Ala

180 185 190

Leu Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Thr His Leu Ala Lys Leu Tyr

195 200 205

Val Ala Trp Ser Gly Ser Ile Asp Val Arg Phe Ser Ile Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala Ile Val Val Pro Pro Gly Val

225 230 235 240

Asp Pro Val Gln Ser Thr Ser Met Leu Gln Tyr Pro His Val Leu Phe

245 250 255

Asp Ala Arg Gln Val Glu Pro Val Val Phe Thr Ile Pro Asp Leu Arg

260 265 270

Ser Thr Leu Tyr His Leu Met Ser Asp Thr Asp Thr Thr Ser Leu Val

275 280 285

Ile Met Ile Tyr Asn Asp Leu Ile Asn Pro Tyr Ala Asn Asp Ala Asn

290 295 300

Ser Ser Gly Cys Ile Val Thr Val Glu Thr Lys Pro Gly Ser Asp Phe

305 310 315 320

Lys Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Met Leu Thr His Gly Ser

325 330 335

Val Pro Ser Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ser Ser Leu Trp Ile Gly Asn

340 345 350

Arg Tyr Trp Thr Asp Ile Thr Asp Phe Val Ile Arg Pro Phe Val Phe

355 360 365

Gln Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gln Glu Thr Ala Gly Trp Ser

370 375 380

Thr Pro Arg Phe Arg Pro Ile Thr Val Thr Ile Ser Gln Lys Gly Gly

385 390 395 400

Glu Lys Leu Gly Ile Gly Ile Ala Thr Asp Phe Ile Val Pro Gly Ile

405 410 415

Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr Ile Pro Ser Lys Leu Thr Pro Ala

420 425 430

Gly Asp Tyr Ala Val Thr Thr Ser Asn Gly Thr Asp Ile Thr Thr Pro

435 440 445

Arg Glu Tyr Asp Ser Ala Asn Glu Ile Val Asn Asn Thr Asn Phe Lys

450 455 460

Ser Met Tyr Ile Cys Gly Ala Leu Gln Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys

465 470 475 480

Ile Ser Asn Thr Ala Phe Ile Thr Thr Ala Thr Val Glu Gly Asn Asn

485 490 495

Leu Glu Pro Ser Asn Val Ile Asn Pro Thr Lys Ile Ala Val Phe Gln

500 505 510

Asp Asn His Val Asn Arg Asp Val Gln Thr Ser Asp Val Thr Leu Ala

515 520 525

Leu Leu Gly Tyr Thr Gly Ile Gly Glu Glu Ala Ile Gly Ala Asp Arg

530 535 540

Asp Lys Val Val Arg Ile Ser Val Leu Pro Glu Thr Gly Ala Arg Gly

545 550 555 560

Gly Asn His Pro Ile Phe Tyr Lys Asn Thr Val Lys Leu Gly Tyr Val

565 570 575

Ile Arg Ser Ile Asp Val Phe Asn Ser Gln Ile Leu His Thr Ser Arg

580 585 590

Gln Leu Ser Leu Asn Asn Tyr Leu Leu Pro Pro Asp Ser Phe Ala Val

595 600 605

Tyr Arg Ile Ile Asp Ala Asn Gly Ser Trp Phe Asp Ile Gly Ile Asp

610 615 620

Ser Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val Ser Asn Ile Gly Lys Leu Glu

625 630 635 640

Phe Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Met Gly Ile Gln Leu Ala Lys Ile Arg

645 650 655

Leu Ala Ser Asn Ile Arg Ser Thr Met Thr Lys Leu

660 665

Claims

1.一种包含猫杯状病毒(FCV)抗原的组合物或疫苗。

2.权利要求1的组合物或疫苗，其中所述FCV抗原形成FCV VLP或空衣壳。

3.权利要求1或2的组合物或疫苗，其中所述FCV抗原在昆虫细胞中由杆状病毒载体表达。

4.权利要求3的组合物或疫苗，其中所述昆虫细胞被灭活并且细胞碎片被去除。

5.权利要求1-4中任一项的组合物或疫苗，其中所述FCV抗原是FCV衣壳蛋白。

6.权利要求1-5中任一项的组合物或疫苗，其中所述FCV抗原包含与SEQ ID NO：3或4所示序列具有至少90％序列同一性的多肽。

7.权利要求1至6中任一项的组合物或疫苗，其中所述FCV抗原由与SEQ ID NO：1或2所示序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸编码。

8.权利要求1-7中任一项的组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗未被佐剂化，并且任选地包含药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。

9.一种质粒，其包含编码具有如SEQ ID NO：3或4所示序列的FCV抗原的多核苷酸。

10.权利要求8的质粒，其中所述多核苷酸具有如SEQ ID NO：1或2所示的序列。

11.权利要求8或9的质粒，其中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。

12.一种表达FCV空衣壳或FCV VLP的稳定转化的昆虫细胞。

13.一种在昆虫细胞中表达的基本上纯化的FCV空衣壳或FCV VLP，其中所述FCV空衣壳或VLP包含与SEQ ID NO：3或4所示序列具有至少90％序列同一性的多肽，其中所述昆虫细胞被灭活并且细胞碎片被除去。

14.一种对FCV感染易感的动物进行接种或在动物中引发针对FCV的免疫应答的方法，其包括至少一次施用权利要求1-8中任一项的组合物或者权利要求13的FCV空衣壳或VLP。