DE69618574T2

DE69618574T2 - Vom desmingen abstammende amplifizierungssequenzen, vektoren, die diese enthalten und anwendungen derselben zur herstellung von proteinen

Info

Publication number: DE69618574T2
Application number: DE69618574T
Authority: DE
Inventors: Lin Li; Denise Paulin
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Universite Paris Diderot Paris 7
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Universite Paris Diderot Paris 7
Priority date: 1995-02-20
Filing date: 1996-02-16
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2016-02-17
Also published as: ZA961349B; JPH11500905A; DE69618574D1; FR2730735B1; AU4835696A; US5914395A; CA2211435A1; WO1996026284A1; PT811071E; DK0811071T3; IL117194A0; ATE212060T1; EP0811071A1; US6201115B1; FR2730735A1; MX9706290A; EP0811071B1; ES2168459T3; AU710697B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Amplifikationssequenzen (Enhancer) und Vektoren die diese Sequenzen enthalten, sowie die Verwendung dieser Vektoren in Zusammensetzungen zur Expression von Nucleotidsequenzen in transfizierten Zellen sowie therapeutische Anwendungen dieser Produkte und ihre Verwendung als Impfstoff.
Das Gen von Desmin, eines der ersten Muskelproteine, die bei Säugern während der Entwicklung des Embryos nachgewiesen wurden, wurde 1989 von Li et al. sequenziert (Gene, 78, 243-254).
Später wurde eine Amplifikationssequenz von 280 Basenpaaren beschrieben, die sich zwischen den Nucleotiden -693 und -973 stromaufwärts des Transkriptionsstartpunkts befindet (Li und Paulin, 1991, J. Biol. Chem., 266, 6562-6570).
Diese Amplifikationssequenz wurde nachgewiesen, indem man eine Reihe von Plasmidkonstrukten herstellte, die das bakterielle Gen trugen, das für Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) codiert, und sie dann in myogene und nichtmyogene Mäusezellen einführte. Die Autoren zeigen, dass dieser Amplifikationsbereich aus 280 Basenpaaren homologe ebenso wie heterologe Promotoren aktivieren kann, unabhängig von ihrer Orientierung, ihrer Position oder ihrem Abstand von dieser Sequenz.
Die Untersuchung dieser Sequenz wurde verfolgt (Li et al., 1993, J. Biol. Chem., 268, 10 403-10 415) und hat gezeigt, dass diese Sequenz zwei Bereiche enthält: eine, die in den Myotuben aktiv ist, und eine, die in den Myoblasten aktiv ist.
Der in den Myotuben aktive Teil liegt zwischen den Positionen -973 und -848, d.h. in einer Sequenz von 125 Nucleotiden.
Innerhalb dieser Sequenz ist der Bereich zwischen den Positionen -910 und -870 vor der Einwirkung einer DNase geschützt. Dieser Bereich enthält Bindungsstellen der Faktoren MEF2 und MyoD1. Für diesen Bereich von 40 Nucleotiden wird keine spezifische Aktivität angegeben. Insbesondere wird kein Experiment mit Konstrukten durchgeführt, die diesen isolierten Bereich enthalten. Es wird nur erwähnt, dass die Stellen MyoD1 und MEF2 für eine vollständige Amplifikationswirkung in den Myotuben notwendig sind.
Die Amplifikationswirkung der Sequenz stromaufwärts des Desmin-Gens wurde auch in einer transgenen Maus getestet (Li et al., 1993, Development, 117,947- 959). Ein Fragment von 1 kb, das die Regulationssequenz stromaufwärts des Desmin-Gens enthält, ist mit einem Reportergen verbunden, das für die β- Galactosidase von Escherichia coli codiert. Die Autoren zeigen, dass die Amplifikationswirkung des Promotors von Desmin sehr groß ist, da die Aktivität der β- Galactosidase in Gewebeschnitten sehr leicht nachzuweisen ist.
Aus dem oben analysierten Stand der Technik geht hervor, dass man die Amplifikationseigenschaften bestimmter Teile stromaufwärts des humanen Desmin-Gens kennt. Dagegen sind die für diese Amplifikationswirkung verantwortlichen Bereiche nicht identifiziert worden.
Es war also nicht möglich, sie erfolgreich zu modifizieren, um ihre Leistungsfähigkeit zu verbessern in Bezug auf die Expression von Genen oder von Nucleotidsequenzen, die ganz oder zum Teil cDNAs (komplementären DNAs) entsprechen, welche für die fraglichen Proteine codieren oder für Fragmente dieser Proteine, die Epitope tragen, welche Schutzantikörper oder Antikörper, die diese Epitope erkennen, induzieren können. Fragmente von cDNA oder genomischer DNA haben vorzugsweise eine Länge zwischen 30 Basenpaaren und 2 kb. Sie können durch chemische Synthese oder durch Spaltung der DNA, die mit dem Fachmann bekannten Techniken aus Zellen oder Mikroorganismen extrahiert wurde, mit Restriktionsenzymen hergestellt werden.
Es ist bekannt, dass die Einschleusung von DNA in diese eukaryontischen Zellen nach den Techniken, die insbesondere im Patent WO 90/11092 beschrieben sind, keine längere Expression auf hohem Niveau dieser in Form von Plasmiden eingeschleusten DNAs ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung bringt eine Verbesserung des Expressionsniveaus von genetischem Material, das in Zellen eingeschleust wurde, die durch Verwendung von Konstrukten transfiziert wurden, welche die für das Desmin-Gen identifizierten gesamten Aktivatorsequenzen oder Teile davon einsetzen und für die Expression jedes anderen Gens oder genetischen Materials (Fragmente von genomischer DNA oder cDNA usw.) in Muskelgewebe geeignet sind.
Insbesondere ist es möglich, die Sequenzen zu verwenden, um Nucleotidsequenzen zu exprimieren, die eine Immunmodulatorfunktion ausüben, zum Beispiel Cytokine, oder immunogene Eigenschaften haben, zum Beispiel das Protein VP1 des Poliovirus oder HBs des Hepatitis-B-Virus.
Eine weitere Anwendung betrifft den Bereich der Gentherapie. Insbesondere und im allgemeinen erfordern die Techniken, die die Einschleusung von DNA in Gewebe erfordern, die Verwendung von Nucleotidsequenzen oder von Vektoren, die diese enthalten, oder von Liposomen, die die Gene oder die cDNA, welche diese Sequenzen tragen, stark exprimieren. Bis heute wurde dieses Problem noch nicht befriedigend gelöst.
Die Anmelderin versuchte also zu bestimmen, welche Teile der regulatorischen Sequenzen des Desmin-Gens für die Amplifikationswirkung verantwortlich sind.
So hat sie überraschenderweise gefunden, welche Rolle eine Sequenz, die zwischen der MEF2- und der MyoD1-Stelle liegt, bei der Amplifikationswirkung spielt.
Es wird auch gezeigt, dass die Kupplung einer solchen Amplifikationssequenz mit einem Promotor die Expression von Genen oder cDNAs, die für Peptide, Polypeptide oder Proteine von therapeutischem Interesse codieren, durch direkte Einschleusung der DNA ermöglicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Amplifikationssequenz, die eine Homologie von wenigstens 90% mit der folgenden Sequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist:
TCTATAAATA X&sub1;X&sub2;X&sub3;GC Y&sub1;Y&sub2;Y&sub3;GG TATTTGGGGT TGGCAGCTGT T
wobei:
- X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; unabhängig voneinander C oder G, C oder G bzw. C oder A darstellen können;
- Y&sub1;, Y&sub2; und Y&sub3; unabhängig voneinander T oder C, C oder G bzw. T oder C darstellen können.
Vorteilhafterweise hybridisiert eine solche Sequenz unter stringenten Bedingungen, d.h. rigorosen Bedingungen, mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1.
Solche Bedingungen sind zum Beispiel die folgenden:

Hybridisierung bei 65ºC über Nacht:

Puffer:

0,2% Polyvinylpyrrolidon
0,2% Ficoll 400
0,2% Rinderserumalbumin (BSA)
2x SSC
100 ug/ml Lachssperma-DNA
150 ug/ml Hefe-RNA

Waschvorgänge:

2x SSC einmal 10 Minuten bei 65ºC
2x SSC viermal 30 Minuten bei 55ºC
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Amplifikationssequenz, die eine Homologie von wenigstens 90% mit der folgenden Sequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist:
ZGGTATTT
wobei Z = T oder C sein kann.
Vorteilhafterweise hybridisiert eine solche Sequenz unter stringenten Bedingungen, d.h. rigorosen Bedingungen, mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2.
Man wird feststellen, dass die vorliegende Erfindung alle Amplifikationssequenzen, die sich von den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 um ein oder mehrere Nucleotide unterscheiden und deren Funktion nicht erheblich modifiziert ist, sowie ihre komplementären Sequenzen umfasst.
"Amplifikationssequenz" bedeutet in der vorliegenden Anmeldung eine Sequenz, die die Transcription eines oder mehrerer Gene, die sich auf demselben Chromosom befinden (cis), in hohem Maße verstärkt (auch Enhancer genannt).
Ebenfalls Bestandteil der Sequenzen gemäß der Erfindung sind die Sequenz Nr. 3 oder die Sequenz Nr. 6 oder die Sequenz Nr. 7 oder die Sequenz Nr. 11, wie sie anhand von Fig. 1 definiert sind, allein oder in Form von Polymeren von zwei bis acht identischen Fragmenten oder assoziiert an eine der vier Sequenzen.
Der Ausdruck "Vektor" wird seinerseits verwendet, um ein Nucleinsäuremolekül zu bezeichnen, in das fremde Nucleinsäurefragmente eingesetzt werden können, um sie anschließend in eine Wirtszelle einzuschleusen und sie dort zu halten.
Der Ausdruck "Liposom" betrifft jede Lipidzusammensetzung, die in der Lage ist, RNA oder DNA kovalent oder nichtkovalent zu binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Sequenz oder einen Expressionsvektor, der die Sequenz enthält, welche wenigstens folgendes umfasst:
- eine Sequenz der oben beschriebenen Art von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 in einer oder mehreren Kopien, mit Ausnahme der Sequenzen, bei denen X&sub1;, X&sub2;, X&sub3; und Y&sub2; ein Cytosin (C) darstellen und Y&sub1; und Y&sub3; ein Thymidin (T) darstellen oder Z (T) darstellt, in welchem Fall die Sequenzen SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 in wenigstens zwei Kopien vorliegen; und
- eine Sequenz, die für ein Protein codiert oder der genomischen Sequenz entspricht, die für das Protein oder einen Teil davon codiert.
Vorteilhafterweise umfasst eine solche Sequenz oder ein solcher Vektor außerdem einen oder mehrere Promotoren, die die Expression des Proteins in mit der DNA transfizierten Zellen erlauben.
Das Protein kann wenigstens folgendes sein: ein Teil eines bakteriellen Antigens, zum Beispiel die Urease von H. pylori, das Protein, das HSP(A) genannt wird als Abkürzung für "heat-shock protein A", oder das HSP(B)-Protein, oder eines viralen Antigens, zum Beispiel Oberflächen-Antigen eines Hepatitisvirus, insbesondere Hepatitis-B-Virus, und vorzugsweise das HBs-Protein in einer seiner Formen S. S-preS2 oder S-preS2-preS1. Es kann sich auch um ein Protein eines Hepatitis-A-Virus oder eines Nicht-A-nicht-B-Hepatitisvirus, wie Hepatitis-C-, -E- oder -Delta-Virus, handeln.
Die Sequenzen der Gene oder Proteine dieser Bakterien oder der Viren dieser Hepatitis-Formen sind in den folgenden Dokumenten beschrieben oder können daraus abgeleitet werden: Patent FR-79 21 811 (veröffentlicht unter der Nr. 2 464 269), FR-80 09 039 (veröffentlicht unter der Nr. 2 480 779), EP- 81 400 634 (veröffentlicht unter der Nr. 0 038 765), FR-84 03 564 (veröffentlicht unter der Nr. 2 560 890), EP-91 830 479 (veröffentlicht unter der Nr. 0 485 347) und FR 88 13 135 (Veröffentlichungs-Nr. 2 637 612), PCT-Anmeldung, die unter Nr. WO 94/26901 veröffentlicht ist, und Artikel von Najarian et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 2627-2631).
Das Protein kann auch ein Protein oder ein Teil eines Proteins des HIV-1-Virus, des HIV-2-Virus oder des HTLV-1-Virus, insbesondere das Env-Protein (das der Virushülle entspricht) oder das Gag-Protein, sein. Die Sequenz des Teils des Proteins oder des Peptids wird in Abhängigkeit der Funktion ausgewählt, die man exprimieren möchte. Die minimalen Nucleotidsequenzen liegen vorteilhafterweise zwischen 20 und 50 Basenpaaren.
Im Falle des Virus HTLV-1 können die Proteine oder die Sequenzen, die für diese Proteine codieren, diejenigen sein, die in den folgenden Dokumenten beschrieben sind, oder sie können aus diesen Dokumenten abgeleitet werden: Anmeldungen PCT/WO 93/06843, PCT/WO 90/15820, EP-0 352 060 und EP-0 269 445 sowie Artikel von Gray et al. (1990, Virology, 177, 391-395), Tanaka et al. (1991, J. Immunol., 147, 354-360) und Nakamura et al. (1987, Int. J. Cancer, 40, 403-407).
Allgemein gesagt, kann es sich bei dem Protein um ein oder mehrere der Proteine von immuntherapeutischem Interesse oder von Interesse als Impfstoff handeln, wie Proteine von immuntherapeutischem Interesse, zum Beispiel Interleukine, Wachstumsfaktoren, zum Beispiel Fibroblasten- (FGF) oder Nerven- Wachstumsfaktoren (NGF), oder das Maltase-Gen, Proteine, die eine humorale, cytotoxische oder zelluläre Immunantwort induzieren können, oder Proteine, die die Aktivität eines Gens ergänzen können, das bei dem zu behandelnden Individuum normalerweise exprimiert wird, aber jetzt nicht mehr exprimiert wird, entweder durch Mutation oder Deletion seiner Sequenz.
Das Protein kann auch ein Hybridprotein sein, das zum Beispiel aus wenigstens einem Teil von Desmin und wenigstens einem Teil eines Proteins, dessen Defizienz man kompensieren möchte, besteht. In diesem Fall kann die Sequenz oder der Vektor eine Aktivator- oder Amplifikationssequenz des Desmin-Gens, eine Sequenz, die für wenigstens einen Teil von Desmin codiert, und eine Sequenz, die für das Protein codiert, dessen Defizienz man kompensieren möchte, umfassen.
Man wird bemerken, dass sich die Amplifikationssequenzen ohne Unterschied stromaufwärts oder stromabwärts der Sequenz, die für ein Protein oder ein Fragment desselben oder für ein Peptid, das 10 bis 50 Aminosäuren umfasst, codiert, und ihres Promotors befinden können und dass sie in beiden möglichen Richtungen orientiert sein können.
Neben einer Sequenz, die für ein Protein oder ein Fragment desselben codiert, und einer Amplifikationssequenz kann die Sequenz oder der Vektor auch andere regulatorische Sequenzen des Typs Krox umfassen, wie die Sequenz Krox 24 (P. Lemaire et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 3456-3467).
Der Promotor kann ein einzelner Promotor sein oder mit einem anderen Promotor assoziiert sein, der die Expression des oben definierten Proteins ermöglicht. Es kann sich also um einen internen Promotor des zu exprimierenden Gens oder der cDNA, die für das zu exprimierende Protein oder sein Fragment codiert, handeln. Es kann sich auch um einen zu dem Wirt homologen Promotor handeln, wie um den Promotor eines Gens eines Proteins des Cytoskeletts, insbesondere das des Desmins, wie es von Bolmont et al. (Journal of submicroscopic cytology and pathology, 1990, 22, 117-122) oder Li et al. (Gene, 1989, 78, 243-254) beschrieben wurde.
Es kann sich auch um einen heterologen Promotor handeln, wie den eines Virus, zum Beispiel den der Thymidin-Kinase des Herpesvirus (HSV).
Neben dem Promotor, der sich stromaufwärts der Sequenz befindet, die für das Protein oder sein Fragment codiert, kann die Sequenz auch eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, die sich stromabwärts der für das Protein codierenden Sequenz befindet.
Schließlich kann eine solche Sequenz oder ein solcher Vektor auch Sequenzen umfassen, die die homologe Rekombination bei dem behandelten Organismus spezifisch für das zu ersetzende Gen ermöglichen, wobei die Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts der für ein Protein codierenden Sequenz und gegebenenfalls der natürlichen Aktivatorsequenzen und/oder des oder der Promotoren gesetzt werden. Aufgrund der Gegenwart solcher Sequenzen wird das unerwünschte Gen, das sich in dem behandelten Organismus befindet, durch das Gen ersetzt, das der Vektor oder die Sequenz tragen und von dem man möchte, dass es in dem Organismus exprimiert wird.
Ein solches Verfahren zur homologen Rekombination kann von dem Typ sein, der von Le Mouellic et al. (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87,4712-4716) oder in der Anmeldung PCT/WO 91/06667 beschrieben wurde.
Ein Vektor, wie er oben definiert wurde, kann außerdem einen in dem Mikroorganismus, wie einem Bakterium, aktiven Replikationsstartpunkt umfassen.
Ein solcher Vektor kann auch ein Gen umfassen, das seine Selektion in dem Mikroorganismus ermöglicht, wie ein Antibiotikum-Resistenzgen. Es kann sich um ein Plasmid handeln.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Mikroorganismus um Escherichia coli.
Die Expressionsvektoren, die die zu exprimierenden Sequenzen und die transfizierbaren Sequenzen enthalten, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, können nach Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind, insbesondere durch chemische Synthese, wie die von Applied Biosystem vermarktete Methode, oder nach gentechnischen Verfahren. Solche Verfahren sind insbesondere in T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Ed. New York, oder einer seiner aktuellen Neuauflagen beschrieben.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf zwei Plasmide, deren Identifikationszeichen E03D CAT bzw. DMT tk CAT sind (siehe die folgenden Beispiele 1 und 2) und die am 16. Dezember 1994 bei der Sammlung CNCM des Institut Pasteur unter den jeweiligen Eintragungsnummern I-1508 und I-1509 hinterlegt wurden, Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine pharmakologisch wirksame Menge eines der Expressionsvektoren oder einer der Nucleotidsequenzen umfasst, die wenigstens eine der oben beschriebenen Aktivatorsequenzen gemäß der Erfindung umfassen, die ohne Vektor in den zu transfizierenden Zellen exprimierbar sind.
Eine solche Zusammensetzung kann auch pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Medikament oder einen Impfstoff, das bzw. der diese Sequenzen und Vektoren enthält.
Obwohl die Erfindung nicht auf eine bestimmte Therapie beschränkt ist, sind die Vektoren und Sequenzen vorzugsweise zur Verwendung zu Impfzwecken und insbesondere zur Injektion in Muskelgewebe bestimmt. Bei einer solchen Ausführungsform der Erfindung ist der gewählte Promotor vorteilhafterweise ein Promotor eines Gens oder einer cDNA, das bzw. die für ein Muskelprotein oder ein Fragment davon codiert.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Fig. 1 veranschaulicht die Wirkung einer Mutation in der Amplifikationssequenz des Vektors DMT tk CAT auf die Aktivität des für CAT codierenden Gens, das er trägt.
Fig. 2 ist ein Autoradiogramm eines Gels mit Zellextrakten der Linien C 2,7 (Napf C2) und CCL 136 (Napf Rd), die mit dem markierten MT-Oligonucleotid inkubiert wurden. Die durch die Zahl 1 angezeigte Position entspricht dem MT- Protein-Komplex.
Fig. 3 ist ein Autoradiogramm eines Filters, das durch Southwestern-Blot zwischen den Zellextrakten der Linien C 2,7 und CCL 136 (Napf RD) und dem markierten MT-Oligonucleotid erhalten wurde. Molekulargewichtsmarker (Sigma) wurden ab dem Napf MW wandern gelassen.

Beispiel 1:

Herstellung des Expressionsvektors DMT tk CAT:

Unter Verwendung von zwei Primern.
(1) DesHindIII 5'-GAAAGCTTCTCCTCTATAAATACC-3' oder (2) DesXbal 5'-CCTCTAGAGTCAACCCAACCTCT-3', wurde ein Fragment aus 84 Basenpaaren, das eine Bindungsstelle (GGCAGCTGTT) für den trans-Aktivatorfaktor MyoD1, eine Bindungsstelle (CTATAAATACC) für den Faktor MEF2 und eine MT genannte Stelle (GGTATTT) enthält, ausgehend vom Promotor des humanen Desmin-Gens amplifiziert. Dieses Fragment von 84 bp wurde in die Restriktionsstellen HindIII-XbaI des Plasmids pBLCAT2 (Lucknow und Schütz, 1987, Nucl. Acid Res., 15, 5490) eingesetzt, das den Grundpromotor des Thymidin-Kinase-Gens des Herpes-simplex-Virus und den codierenden Bereich des bakteriellen Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT)-Gens enthält.
Aufgrund des Zusammenspiels der Stelle MT mit den Stellen MyoD1 und MEF2 erhöht dieses 84-bp-Fragment die Expression des Indikatorgens CAT in den differenzierten Muskelzellen, den Myotuben, auf das 60fache.

Beispiel 2:

Herstellung des Expressionsvektors E03D CAT:

Ein Fragment aus 280 Basenpaaren (-973 bis -693), das den Enhancer des humanen Desmin-Gens enthält, wird vor den Bereich von 228 bp (Li und Paulin 1991, 1993, supra) gesetzt, der den Grundpromotor des humanen Desmin-Gens und den codierenden Bereich des bakteriellen Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT)-Gens enthält.
Ein Fragment von 280 Basenpaaren (-973 bis -693), das den Enhancer des humanen Desmin-Gens enthält, wurde durch DNA-Polymerase (Klenow) mit glatten Enden versehen und in die HindIII-Restriktionsstelle eingesetzt, die ebenfalls durch DNA-Polymerase (Klenow) mit glatten Enden versehen worden war.
Dieser Enhancer funktioniert nicht nur in differenzierten Muskelzellen, sondern auch in einkernigen Muskelzellen, den Myoblasten. Dieses Fragment aktiviert die Expression des Gens in den Myotuben auf das 100fache und in den Myoblasten auf das 10fache.

Beispiel 3:

Wirkungen von Mutationen im Amplifikationsbereich des Desmin-Gens auf die Aktivität eines Reportergens in den Myotuben

Der Vektor DMT tk CAT, dessen Herstellung in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde durch die Technik der ortsspezifischen Mutagenese mutiert (Kunkel et al., 1985, PNAS, 82, S. 488-492). Diese mutierten Vektoren wurden in kultivierte Myoblasten transfiziert, und die CAT-Aktivität wurde nach der Methode bestimmt, die von Li et al. beschrieben wurde (1991 und 1993, supra).
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Figur zusammengefasst. Elf Konstrukte, die von 4 bis 14 nummeriert sind und verschiedene unterstrichene Mutationen aufweisen, wurden auf ihre Wirkung auf die CAT-Aktivität getestet. Die nichtmutierte Amplifikationssequenz ist die auf Position 3 dargestellte.
Es ist sehr deutlich zu sehen, dass die Mutationen der Konstrukte 6 und 7 zu einer Überamplifikation der CAT-Aktivität in Bezug auf das Konstrukt Nr. 3 führen.
Die beiden Expressionsvektoren der Beispiele 1 und 2 können verwendet werden, um Vektoren zu konstruieren, um das Gen von therapeutischem Interesse in den Muskelzellen zu exprimieren, indem man das CAT-Gen durch das gewählte Gen ersetzt. Die Stellen EcoRI und BamHI können verwendet werden, um das CAT-Gen zu entfernen.
Das CAT-Gen kann ersetzt werden: zur Immunisierung oder Impfung von Säugern durch nackte DNA oder genomische DNA, die den Genen entspricht, die für die Hülle und das Gag-Protein des Virus HTLV 1 codieren (Gary et al., 1990; Virology 177, 391-395; Tanaka et al., 1991, J. Immunology 147 : 354-360; Nakamura et al 1987; Int. 1. Cancer 40: 403-407); das Gen, das für die gesamte oder einen Teil der Hülle des Hepatitis-B-Virus oder Humanpapillome, wie HPV16, HPV33 usw., codiert; das Gen, das für die Hülle von FIV codiert; oder zur Gentherapie durch die Gene, die die Interleukine und die Wachstumsfaktoren (FGF, NGF, MG-CSF usw.) codieren und im Rahmen einer Gentherapie einer Myopathie aufgrund eines Maltasemangels eingesetzt werden können.

Beispiel 4:

Bestimmung eines Proteins, das spezifisch an die MT-Seguenz (GGTATTTI bindet.

Material und Verfahren

1) Gel-Shift-Assay

Zellkernextrakte aus den Muskelzelllinien C 2,7 (Li und Paulin, 1991, J. Biol. Chem., 266, 6562-6570) und Rhabdomyosarkom (erhältlich bei der ATCC unter der Nr. CCL 136) werden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit radioaktiv markiertem MT-Oligonucleotid inkubiert. Die Gemische unterzieht man anschließend einer Elektrophorese auf einem 5%igen Acrylamidgel. Nach 3 Stunden Elektrophorese wird das Gel getrocknet und autoradiographiert.
Die Gemische werden in einem Volumen von 20 ul angefertigt, das 750 ng ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA, 3 ug Zellkernextrakt, 15 mM Hepes, pH 8, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 2 mM MgCl&sub2;, 70 mM NaCl, 15% Glycerin enthält.

2) Southwestern-Blot

Zellkernextrakte werden ausgehend von den Muskelzelllinien C 2,7 und Rhabdomyosarkom hergestellt. Man unterzieht 40 ug Proteine einer Elektrophorese auf 10%igem SDS-PAGE-Gel. Die Proteine werden auf ein Nitrocellulosefilter übertragen. Das Filter wird eine Stunde lang bei 37ºC in einer Lösung, die 5% entrahmte Milch, 50 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT enthielt, und dann in einem Puffer, der die radioaktiv MT-Sonde enthielt, inkubiert. Das Filter wird dreimal in demselben Puffer gewaschen und autoradiographiert.

Ergebnisse

Die Gel-Shift-Experimente (Fig. 2) zeigen, dass die MT-Sequenz (GGTATTT) in der Lage ist, einen Kernfaktor, der aus murinen (C 2,7) und humanen (Rhabdomyosarkom) Muskelzelllinien hervorgegangen ist, spezifisch zu binden.
Das durch Southwestern-Blot erhaltene Autoradiogramm (Fig. 3) zeigt, dass der Kernfaktor, der an die MT-Sequenz bindet, ein Protein von 35 kDa ist.
Dieses Protein ist in Muskelzellen, wie den C-2,7-Zellen und Rhabdomyosarkom, vorhanden.
Die Menge dieses Proteins nimmt im Verlaufe der Muskeldifferenzierung zu.

Sequenzprotokoll

(1) Allgemeine Angaben:
(i) Anmelder:
(A) Name: Institut Pasteur
(B) Straße: 28, rue du docteur Roux
(C) Stadt: Paris
(E) Land: Frankreich
(F) Postcode: 75724
(A) Name: Université Paris 7
(B) Straße: 2, place Jussieu
(C) Stadt: Paris
(E) Land: Frankreich
(F) Postcode: 75251
(ii) Titel der Erfindung: Amplifikationssequenzen, Vektoren, die diese Sequenzen enthalten, und ihre Verwendung in Zusammensetzungen zur Expression von Nucleotidsequenzen in transfizierten Zellen, therapeutische Anwendungen
(iii) Anzahl der Sequenzen: 2
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Art des Mediums: Diskette
(B) Computer: IBM-PC-kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(v) Aktuelle Anmeldungsdaten:
Anmeldungsnummer: WO PCT/WO 96
(vi) Frühere Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: FR 95 01 937
(B) Einreichungsdatum: 20. Februar 1995
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 1:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 41 Basenpaare
(B) Art: Nucleotid
(D) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(vi) Herkunft:
(A) Organismus: Homo sapiens
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Allel
(B) Position: Ersatz (11, "g")
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Allel
(B) Position: Ersatz (12, "g")
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Allel
(B) Position: Ersatz (13, "a")
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Allel
(B) Position: Ersatz (16, "c")
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Allel
(B) Position: Ersatz (17, "g")
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Allel
(B) Position: Ersatz (18, "c")
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:
TCTATAAATA CCCGCTCTGG TATTTGGGGT TGGCAGCTGT T
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 2:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 8 Basenpaare
(B) Art: Nucleotid
(D) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(vi) Herkunft:
(A) Organismus: Homo sapiens
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Allel
(B) Position: Ersatz (1, "c")
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2:
TGGTATTT

Claims

1. Amplifikationssequenz, die eine Homologie von wenigstens 90% mit der folgenden Sequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist:

TCTATAAATA X&sub1;X&sub2;X&sub3;GC Y&sub1;Y&sub2;Y&sub3;GG TATTTGGOGT TGGCAGCTGT T

wobei:

- X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; unabhängig voneinander C oder G, C oder G bzw. C oder A darstellen können;

- Y&sub1;, Y&sub2; und Y&sub3; unabhängig voneinander T oder C, C oder G bzw. T oder C darstellen können.

2. Sequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter stringenten bzw. rigorosen Bedingungen mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 hybridisiert.

3. Amplifikationssequenz, die eine Homologie von wenigstens 90% mit der folgenden Sequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist:

ZGGTATTT

wobei Z = T oder C sein kann.

4. Sequenz gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter stringenten bzw. rigorosen Bedingungen mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 hybridisiert.

5. Sequenz, die wenigstens folgendes umfasst:

- eine Amplifikationssequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer oder mehreren Kopien, mit Ausnahme der Sequenzen, bei denen X&sub1;, X&sub2;, X&sub3; und Y&sub2; ein Cytosin (C) darstellen und Y&sub1; und Y&sub3; ein Thymidin (T) darstellen oder Z (T) darstellt, in welchem Fall die Sequenzen SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 in wenigstens zwei Kopien vorliegen; und

- eine Sequenz, die für ein Protein codiert oder der genomischen Sequenz entspricht, die für das Protein oder einen Teil davon codiert.

6. Sequenz, die einer Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 komplementär ist.

7. Sequenz gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie außerdem einen oder mehrere Promotoren umfasst, die die Expression des Proteins in mit der DNA transfizierten Zellen erlauben.

8. Sequenz gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen internen Promotor des Gens oder der cDNA umfasst.

9. Sequenz gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen zu dem Gen heterologen Promotor umfasst.

10. Sequenz gemäß einem der Ansprüche 5 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie Sequenzen umfasst, die die homologe Rekombination eines zu ersetzenden Gens bei einem Organismus erlauben, wobei die Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts der für ein Protein codierenden Sequenz und gegebenenfalls des Promotors gesetzt werden.

11. Sequenz gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz des Krox-Typs trägt.

12. Sequenz gemäß einem der Ansprüche 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor derjenige des Gens von Desmin oder der Thymidin- Kinase ist.

13. Sequenz gemäß einem der Ansprüche 5 und 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das codierte Protein ein Protein ist, das therapeutische oder Impfstoffeigenschaften aufweist.

14. Sequenz gemäß einem der Ansprüche 5 und 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem codierten Protein um wenigstens folgendes handelt: ein Teil eines bakteriellen Antigens, zum Beispiel Urease, das HSP(A)-Protein von H. pylori oder das HSP(B)-Protein, oder eines viralen Antigens, zum Beispiel Oberflächen-Antigen eines Hepatitisvirus, insbesondere Hepatitis-B-Virus, und vorzugsweise das HBs-Protein, eines Hepatitis-A-Virus oder eines Nicht-A-nicht-B-Hepatitisvirus, wie Hepatitis-C-, -E- oder -Delta-Virus, oder auch ein Teil eines Proteins des HIV-1-Virus, des HIV-2-Virus oder des HTLV-1-Virus, insbesondere das Env-Protein (das der Virushülle entspricht) oder das Gag-Protein, und allgemein ein Protein von immuntherapeutischem Interesse, zum Beispiel Interleukine, Wachstumsfaktoren, zum Beispiel Fibroblasten- (FGF) oder Nerven- Wachstumsfaktoren (NGF), Proteine, die eine humorale oder cytotoxische Immunantwort induzieren können, oder Proteine, die die Aktivität eines Gens ergänzen können, das bei dem zu behandelnden Individuum normalerweise exprimiert wird, aber jetzt nicht mehr exprimiert wird, entweder durch Mutation oder Deletion seiner Sequenz, wie das Maltase-Gen.

15. Vektor, der eine Sequenz gemäß einem der Ansprüche 5 bis 14 umfasst.

16. Vektor gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Replikationsstartpunkt umfasst, der in einem Mikroorganismus aktiv ist.

17. Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Replikationsstartpunkt trägt, der in Escherichia coü aktiv ist.

18. Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Resistenzgen trägt, das in einem Mikroorganismus exprimiert wird.

19. Vektor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Plasmid handelt.

20. Mikroorganismus, der eine Sequenz oder einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 5 bis 18 trägt.

21. Mikroorganismus gemäß Anspruch 20, wie er beim CNCM unter der Nr. I- 1508 oder I-1509 hinterlegt und eingetragen ist.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine pharmakologisch wirksame Menge einer Sequenz oder eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 5 bis 18 umfasst.

23. Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie pharmakologisch annehmbare Arzneimittelhilfsstoffe umfasst.

24. Medikament oder Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Vektor oder eine Sequenz gemäß einem der Ansprüche 5 bis 18 umfasst.

25. Verwendung der Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 22 oder 23 oder des Medikaments gemäß Anspruch 24 zur Gewinnung eines Medikaments zur medizinischen Behandlung für die Expression von Nucleotidsequenzen mit immunmodulatorischer Funktion, zum Beispiel Cytokinen, oder immunogenen Eigenschaften, zum Beispiel VP1-Protein des Poliovirus oder HBs-Protein des Hepatitis-B-Virus, sowie zur Gewinnung eines Medikaments für die Gentherapie durch Einführung von DNA in Gewebe, die die Verwendung von Sequenzen oder Vektoren benötigen, die die in diesen Sequenzen enthaltenen Gene in hohem Maße exprimieren.