DE3685833T2 - Dns-vakzine. - Google Patents
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Description
- Das Vaccinia Virus ist der Prototyp für die Orthopockenviren der Pockenvirenfamilie. Seine Biologie und Vermehrung wurde ausführlich von B. Moss beschrieben ("Poxviruses", in Comprehensive Virology, Hrsg. H. Fraenkel-Conrat und R. Wagner, Plenum Press, New York, Vol. 4, Seiten 405-474 [1974]; "Poxviruses", in Molecular Biology of Animal Viruses, Hrsg. D.P. Nayak, Marcel Dekker, New York, Vol. 2, Seiten 849-890 [1978]; " 5' end labelling of RNA with capping and methylating enzymes", in Gene Amplification und Analysis, Hrsg. J.G. Chirikjian und T.S. Papas, Elsevier, North-Holland, Vol. 2, Seiten 254-266 [1981]; "Priniciples of Virus replication: poxvirus", in Human Viral Diseases, Hrsg. B.N. Fields, R. Chanock, R. Shope und B. Roizman, Raven Press, New York, im Druck [1984]). Während verschiedene Typen von tierischen DNA Viren mit grossen Genomen als Klonierungsvektoren verwendet wurden, einschliesslich Adenovirus, Herpes Simplex Virus und Vaccinia Virus, haben nur Rekombinante des Letztgenannten Fremdgene exprimiert, bei gleichzeitiger Erhaltung der vollständigen Infektiosität. Zwischenzeitlich wurde viel Erfahrung bei der Verwendung von Vaccinia Viren als Lebendimpfstoff gesammelt. Sein breiter Wirtsbereich, seine grosse Kapazität für Fremd-DNA und seine Unfähigkeit onkogene Transformation zu induzieren sind alles Punkte um das Potential von Vaccinia Virus Rekombinanten als Lebendimpfstoffe zu vergrössern. Ein aktueller Uebersichtsartikel über die Verwendung von rekombinaten Vaccinia Viren als Lebendimpfstoffe wurde von G. L. Smith et al. gegeben (Biotechnology and Genetic Engeneering Reviews 2, 383-407, [1984]), der eine Beschreibung der Biologie von rekombinanten Vaccinia Viren und der Expression von Fremdgenen unter der Kontrolle von Vaccinia Promotoren einschliesst.
- Die vorliegende Erfindung handelt von Vaccinia DNA, vorzugsweise Transkriptionsregulations-Sequenzen aus der 5' flankierenden Region des Vaccinia Virus späten Gens, welches ein grundlegendes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 11000 (11kDa) kodiert, Rekombinationsvektoren, welche für den Einbau von Fremdgenen in Pockenviren geeignet sind, rekombinante, infektiöse Pockenviren, welche Fremdgene enthalten, die operativ mit einer solchen Transkriptionsregulations-Sequenz verknüpft sind und in der Lage sind, die Expression der entsprechenden Polypeptide zu bewirken, und Lebendimpfstoffe auf der Basis solcher rekombinanter, infektiöser Pockenviren. In der vorliegenden Erfindung bevorzugt vewendete Pockenviren sind Vaccinia Viren.
- Das Gen, welches für ein wichtiges, spätes 11kDa Strukturpolypeptid des Vaccinia Virus kodiert und welches von R. Wittek et al. (J. Virol. 49, 371-378 [1984]) kartiert wurde, wurde einschliesslich seiner 5'-flankierenden Region sequenziert. Die DNA Sequenz des obigen Gens und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist nachfolgend gezeigt:
- Die 5'-flankierende Region zeigt eine geringe Homologie weder im Vergleich zur entsprechenden Region von Vaccinia frühen Genen (Weir, J.P. und B. Moss, J. Virol. 51, 662-669 [1984]) noch zu Konsensussequenzen, die für die meisten eukaryotischen Gene charakteristisch sind. Ferner, wurde gefunden, dass ein DNA Fragment mit nicht mehr als ungefähr 100 Basenpaaren aus der 5'-flankierenden Region des 11kDa Gens alle notwendigen Transkriptionsregulations-Signale zur korrekten Regulation der späten Vaccinia Virus Genexpression enthält.
- Deshalb umfasst die vorliegende Erfindung eine Transkriptionsregulations-Sequenz der nachfolgenden Formel
- oder Untereinheiten (Fragmente) davon, die in der Lage sind die Expression von Fremdgenen zu regulieren.
- Desweiteren wurde gefunden, dass ein DNA Fragment von nicht mehr als 13 Basenpaaren gezählt von der Position 2 am 3'-Ende obiger Transkriptionsregulations-Sequenz ein bevorzugtes Element für die korrekte Regulation der späten Vaccinia Virus Genexpression darstellt. Deshalb gehören solche 3'-Ende Transkriptionsregulations-Sequenzen (Fragmente) auch zur vorliegenden Erfindung und werden von der vorliegenden Anmeldung mitumfasst.
- Desweiteren, umfasst die vorliegende Erfindung Variationen aller vorstehend genannter Transkriptionsregulations-Sequenzen, einschliesslich Deletionen, Insertionen, Subtitutionen, Inversionen von einzelnen oder mehreren Nukleotiden und Kombinationen davon, die in der Lage sind als ein später Pockenvirenpromotor zu funktionieren (funktionelle Variationen).
- Spezifische Beispiele für funktionelle Variationen der vorstehend genannten Transkriptionsregulations-Sequenzen sind durch die folgenden Formeln dargestellt:
- Die Erfindung schliesst auch Tandem-Wiederholungen, beispielsweise 2 - 5fache, der vorstehend genannten Transkriptionsregulations-Sequenzen ein.
- Die Erfindung schliesst ferner Rekombinationsvektoren ein, die ein chimäres Gen, welches wenigstens eine Transkriptionsregulations-Sequenz des späten Vaccinia 11kDa Hauptgens enthält, die mit einem Fremdgen, welches pro- oder eukaryotische Polypeptide kodiert, operativ verknüpft ist, DNA von einem nicht-essentiellen Bereich des Pockenvirus Genoms, welche besagtes chimäres Gen flankiert, den Replikationsursprung des Vektors und Antibiotikaresistenzgene enthalten. Die Translationsinitiationsstelle des chimären Gens wird entweder von der Transkriptionsregulations-Sequenz des Vaccinia 11kDa Hauptgens oder vom Fremdgen, welches pro- oder eukaryotische Polypeptide kodiert, geliefert. Bei der Verwendung der Translationsinitiationsstelle des Fremdgens werden Codonphasenprobleme und potentielle Probleme, die mit der biologischen Aktivität von Fusionsproteinen verknüpft sind, vermieden. Bevorzugte Rekombinationsvektoren, welche die Translationsinitiationsstelle der Transkriptionsregulations-Sequenz des Vaccinia 11kDa Hauptgens oder die Translationsinitiationsstelle des Fremdgens benutzen sind in den Beispielen 1-4 beschrieben.
- Die Rekombinationsvektoren dieser Erfindung können nach bekannten Methoden (D. Panicali und E. Paoletti, PNAS 79, 4927-4931 [1983]; D. Panicali et al., PNAS 80, 5364-5368 [1984]; G.L. Smith et al., supra; M. Mackett et al., J. Virol. 49, 857-864 [1984]) hergestellt werden und umfassen die folgenden Schritte:
- (a) Herstellung eines Vektors, der Pockenvirus DNA enthält, welche
- (i) wenigstens eine Transkriptionsregulations-Sequenz neben wenigstens einer Restriktionsendonuklease Schnittstelle, und
- (ii) DNA von nicht-essentiellen Bereichen des Pockenvirus Genoms, welche besagte Regulationssequenz und besagte Restriktionsendonuklease Schnittstelle flankiert, einschliesst; und
- (b) Einbau wenigstens eines Fremdgenes, welches pro oder eukaryotische Polypeptide kodiert, in besagte Restriktionsendonuklease Schnittstelle neben besagter Transkriptionsregulations-Sequenz.
- Rekombinationszwischenvektoren, welche wenigstens eine Transkriptionsregulations-Sequenz des späten Vaccinia 11kDa Hauptgens enthalten und denen noch ein Fremdgen fehlt, welches pro- oder eukaryotische Polypeptide kodiert, sind auch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung und können mittels des obigen Schrittes (a), worin die Transkriptionsregulations-Sequenz des späten Vaccinia 11kDa Hauptgens die Translationsinitiationsstelle des 11kDa Gens einschliesst oder, wahlweise, in der Region zwischen der mRNA Start und Translationsinitiationsstelle des 11kDa Gens terminiert wird, hergestellt werden.
- Die beim Zusammenbau der Rekombinationsvektoren verwendeten Vektoren können irgendein geeignetes Plasmid, Cosmid, oder Phage sein. Geeignete Vehikel die von Plasmiden, Cosmiden oder Phagen abstammen sind beispielsweise in dem Laborhandbuch "Molecular Cloning" von Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, genannt. Bevorzugte Vektoren, die von Plasmiden abstammen und zum Zusammenbau der Rekombinationsvektoren dieser Erfindung verwendet wurden, sind pBR322 und pUC8.
- Die DNA, welche verwendet wurde um das chimäre Gen zu flankieren, kann von nicht-essentiellen Bereichen des Pockenvirus Genoms hergeleitet werden. Beispiele solcher nicht-essentieller Bereiche schliessen das Thymidin Kinase (TK) Gen (J. P. Weir und B. Moss, J. Virol. 46, 530-537 [1983]) ein. Die bevorzugten nicht-essentiellen, in dieser Erfindung verwendeten Bereiche enthalten einen Bereich des Pockenvirus Thymidin Kinase Gens und DNA, die besagtem Thymidin Kinase Gen direkt benachbart ist. Besonders bevorzugt ist ein Bereich des Vaccinia Virus Thymidin Kinase Gens und Vaccinia DNA, die besagtem Vaccinia Thymidin Kinase Gen direkt benachbart ist. Die Herstellung der nicht-essentiellen Bereiche ist im Beispiel 1 detaillierter beschrieben.
- Fremdgene, die in die Rekombinationsvektoren dieser Erfindung eingebaut werden können, können aus einer grossen Anzahl von Genen (DNA Gene oder DNA Kopien von RNA Genen), welche pro- oder eukaryotische Polypeptide kodieren, ausgewählt werden. Beispielsweise können solche Gene Enzyme, Hormone, Polypeptide mit immunmodulatorischen, antiveralen oder antikrebs Eigenschaften, Antikörper, Antigene und andere nützliche Polypeptide pro- oder eukaryotischen Ursprungs kodieren. Bevorzugte Fremdgene, die in dieser Erfindung verwendet wurden, sind die Gene, welche Malaria Antigene kodieren, insbesondere das 5.1 Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum (Hope, I.A. et al., infra) und das Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) Gen der Maus (A.C.Y. Chang et al., "Phenotypic expression in E. coli of a DNA sequence coding for mouse dihydrofolate reductase", Nature 275, 617-624 [1978]).
- Plasmide der pHGS Familie sind spezifische Beispiele von Plasmid- Rekombinationsvektoren der vorliegenden Erfindung. Ihre Herstellung ist in den Beispielen 1-4 detaillierter beschrieben. E. coli Stämme, welche Plasmide enthalten, die für die Herstellung der Rekombinationsvektoren der vorliegenden Erfindung geeignet sind (E. coli HB 101 mit pHGS-1; pHGS-2 transformiert) wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Göttingen am 21. Februar 1985 unter der Hinterlegungsnummer DSM 3248, beziehungsweise 3249, hinterlegt. Andere Gram-negative Wirtszellen, wie beispielsweise E. coli C 600 (E. coli DH 1) und E. coli RR1 (ATCC No. 31343), können ebenfalls verwendet werden und sind in dem Laborhandbuch "Molecular Cloning" von Maniatis et al., supra, beschrieben.
- Geeignete infektiöse, rekombinante Pockenviren, welche die besagten chimären Gene enthalten und exprimieren, können nach bekannten Methoden (G.L. Smith et al., Biotechnology and Genetic Engeneering Reviews 2, 383-407 [1984]; M. Mackett et al., supra) hergestellt werden, welche die Schritte umfassen:
- (a) Bereitstellung wenigstens einer Zelle, die mit einem Virus der Gattung der Pockenviren infiziert ist;
- (b) Transfektion besagter Zelle mit einem Rekombinationsvektor, wobei homologe Rekombination zwischen der Pockenvirus DNA und wenigstens einem Teil der Pockenvirus DNA, welche in dem Rekombinationsvektor enthalten ist, stattfindet; und
- (c) Isolierung eines rekombinanten, infektiösen Pockenvirus, der in der Lage ist besagtes Fremdgen, welches pro- oder eukaryotische Polypeptide kodiert, zu exprimerien, aus besagter Zelle mittels selektiver Verfahren.
- Geeignete eukaryotische Wirtsorganismen, die zur Herstellung der rekombinanten, infektiösen Pockenviren verwendet werden können, schliessen CV-1, RK-13, TK-143 oder andere Zellen ein. Die bevorzugte eukaryotische Wirtszelle, die in dieser Erfindung verwendet wurde, ist RK-13.
- Die rekombinanten, infektiösen Vaccinia Viren RVV 1 bis 8 sind spezielle Beispiele der vorliegenden Erfindung. Einzelheiten ihrer Herstellung und Isolierung sind in den Beispielen 1-4 gezeigt.
- Beispiele für Proteine, die mittels der rekombinanten, infektiösen Vaccinia Viren der vorliegenden Erfindung exprimiert werden können, sind Dihydrofolat-Reduktase der Maus, die Chloramphenicol-Acetyltransferase und Malaria Oberflächenantigene, insbesondere das 5.1 Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum.
- Verfahren zur Ausprägung von chimären Genen, welche pro- oder eukaryotische Polypeptide kodieren, mittels der rekombinanten, infektiösen Pockenviren sind wohl bekannt. (G.L. Smith et al., supra; M.P. Kieny et al., Nature 312, 163-166 [1984]; G.L. Smith et al., Science 224, 397-399 [1984]; E. Paoletti et al., PNAS 81, 193-97 [1984]; D. Panicali et al., supra). Sie umfassen die Infektion eines geeigneten Wirts mit einem rekombinanten, infektiösen Pockenvirus, der das gewünschte Fremdgen operativ mit der Pockenvirus Transkriptionsregulations-Sequenz verknüpft enthält, die Inkubation des Wirts unter geeigneten Bedingungen und den Nachweis des gewünschten Polypeptids mittels immunologischer, enzymatischer und elektrophoretischer Methoden.
- Die rekombinanten, infektiösen Pockenviren können deshalb als Lebendimpfstoffe verwendet werden und zwar durch Impfung eines Tieres oder Menschen mit einem Impfstoff, welcher eine Konzentration von besagtem, rekombinantem, infektiösen Pockenvirus enthält, die ausreicht eine immunologische Antwort in besagtem Tier oder Menschen zu erzeugen, die die Herstellung von Antikörpern gegen wenigstens den antigenen Teil des Proteins, welches besagtes Fremdgen kodiert, umfasst. Bevorzugte rekombinante, infektiöse Pockenviren, die in dieser Erfindung zur vorbeugenden Immunisierung verwendet wurden, sind rekombinante, infektiöse Vaccinia Viren. Insbesondere bevorzugt sind jene, die Malaria Oberflächenantigene, insbesondere das 5.1 Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum, exprimieren.
- Rekombinante, infektiöse Vaccinia Viren zur Verwendung beim Menschen können wie von C. Kaplan beschrieben ( Br. med. Bull. 25, 131-135 [1969]) hergestellt werden. Für die Impfung geeignete Präparationen müssen zwischen 10&sup6; und 10&sup8; Plaque bildende Einheiten pro 0.05 ml enthalten. Der Impfstoff kann gefroren in wässriger Pufferlösung, welche 40 - 50 % Glyzerin enthält, oder in lyophilisierter Form aufbewahrt werden. Diese lyophilisierte Form des Impfstoffes ist für die Verwendung in unterentwickelten Gebieten unentbehrlich. Die Impfung wird als intradermale Inokulation durchgeführt. Ein Tropfen des Impfstoffes wird auf eine kleine sterilisierte Hautfläche aufgetragen und die darunterliegende Epidermis wird dann mittels einer scharfen sterilen Nadel oder mittels eines Messers schnell durchstochen. Bei Massenimpfungen werden Impfpistolen verwenden.
- Nachdem nun diese Erfindung allgemein beschrieben wurde, kann sie auf der Basis der folgenden Beispiele besser verstanden werden, wenn sie im Zusammenhang mit den folgenden Figuren betrachtet werden:
- Die verwendeten Symbole sind:
- stellt das Vaccinia Virus TK-Gen dar;
- stellt die Transkriptionsregulations-Sequenz des Vaccinia Virus 11kDa Proteins dar;
- stellt das Gen für das 5.1 Antigen von Plasmodium falciparum dar.
- stellt das Gen für die Dihydrofolat-Reduktase der Maus dar.
- Figur 1 Teil a) ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pBR-J, welches aus pBR-322 und dem Hind III "J" Fragment des Vaccinia Virus besteht, welches das Vaccinia Virus TK-Gen enthält.
- Teil b) ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pBR-F1, welches aus pBR-322 und der rechtshändigen Seite des Vaccinia Virus Hind III-F Fragments, welches die Transkriptionsregulations-Sequenzen des 11kDa Proteins des Vaccinia Virus enthält, besteht.
- Figur 2 ist eine schematische Darstellung der Zwischenklonierung des Vaccinia Virus TK-Gens plus flankierender Sequenzen in das Plasmid pUC-8, endend mit dem Plasmid pUC-TK.
- Figur 3 ist eine schematische Darstellung des Einbaus der Transkriptionsregulations-Sequenzen des Vaccinia Virus 11kDa Proteins in das TK-Gen, endend mit dem Plasmid pUC-TK/11kDa.
- Figur 4 ist eine schematische Darstellung der Konversion der flussaufwärts gelegenen Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease EcoRI der Transkriptionsregulations-Sequenzen des 11kDa Proteins in eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease XmnI, endend mit dem Plasmid pHGS-1.
- Figur 5 Teil a) ist eine schematische Darstellung der Isolierung und radioaktiven Markierung der Nuklease S1 Probe für Transkripte, die an den Transkriptionsregulations-Sequenzen des 11kDa Proteins, welches in das TK-Gen eingebaut ist, starten.
- Teil b) ist eine schematische Darstellung der Isolierung und radioaktiven Markierung der Nuklease S1 Probe für Transkripte, die an den regulatorischen Sequenzen des TK-Gens starten.
- Figur 6 Der obere Teil ist eine Darstellung der Kartierung der RNA Transkripte ( ) mit S1 Nuklease.
- Der untere Teil ist die Röntgenexposition der S1 Nuklease Kartierung des TK Transkripts (250 Bp) und 11kDa Transkripts (260 Bp). RNA von infizierten Zellen wurde nach 3 Stunden (Spur 1 und 2) bzw. 7 Stunden (Spur 3 und 4) nach Infektion gesammelt.
- Figur 7 Der obere Teil stellt die Kartierung von RNA Transkripten ( ) mit S1 Nuklease dar. Der untere Teil ist die Röntgenexposition der S1 Nuklease Kartierung von RNA Transkripten von Zellen, die mit RVV-2 (pHGS-2, Spur 1 und 2), bzw. RVV-3 (pHGS-2 Δ15, Spur 3 und 4) infiziert wurden. RNA wurde nach 4 Stunden (Spur 1 und 4), bzw. 8 Stunden (Spur 2 und 3) nach Infektion extrahiert. Die mit "M" markierte Spur besteht aus ³²P-markierten pBR-322 Hpa II Fragmenten, die die Längenposition (in Bp), wie angezeigt, angeben. Die Position der S1 geschützten Bande,welche RNA Transkripten entspricht, die an den Regulationssequenzen des TK-Gens bzw. dem eingebauten 11kDa beginnen, sind angezeigt.
- Figur 8 zeigt eine schematische Darstellung der Klonierung des Plasmodium falciparum 5.1 Antigens (Hope et al., supra) in das Plasmid pHGS-2, endend mit dem Plasmid pHGS-2/5.1.
- Figur 9 zeigt die indirekte Immunofluoreszenz von mit dem Virus RVV-4 infizierten Zellen, welche das Plasmodium falciparum 5.1 Antigen enthalten. Tafel A zeigt Zellen, die bei 450-490 nm fotographiert wurden, Tafel B zeigt Zeilen, die mit Phasenkontrast fotographiert wurden.
- Figur 10 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pHGS-2/DHFR.
- Figur 11 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pHGS-2/DHFR-E.
- Figur 12 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pHGS-A/DHFR.
- Figur 13 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pHGS-F/DHFR.
- Figur 14 der obere Teil zeigt die Kartierung von RNA Transkripten ( ) mit S1 Nuklease. Die Länge der erwarteten Bande ist angezeigt (350 Bp). Der untere Teil ist die Röntgenexposition der S1 Nuklease Kartierung von RNA Transkripten von Zellen, die mit RVV-6 (pHGS-2/DHFR), RVV-7 (pHGS-A/DHFR) und RVV-8 (pHGS-F/DHFR) infiziert wurden. Frühe RNA wurde 6 Stunden nach Infektion der Zellen mit den verschiedenen Viren, die in Gegenwart von 100 ug/ml Cycloheximid inkubiert worden waren, extrahiert (Spuren die mit + bezeichnet sind). Späte RNA wurde 8 und 24 Stunden nach Infektion extrahiert (Spuren die mit 8 bzw. 24 gekennzeichnet sind). Die Spur die mit "M" gekennzeichnet ist besteht aus ³²P-markierten pBR-322 Hpa II Fragmenten, welche die Längenpositionen (in Bp), wie angegeben, anzeigen. Die Positionen der S1 geschützen Banden, welche den RNA Transkripten entsprechen, die an den translozierten (mutierten) 11kDa Regulationssequenzen beginnen, sind angezeigt.
- Die folgenden Methoden wurden, wie von Maniatis et al., supra beschrieben, durchgeführt, wenn nicht anderst angegeben: Verdauungen mit Restriktionsendonukleasen bei 37ºC (Seiten 100-101); Dephosphorylierung mit bakterieller Alkalischer Phosphatase (BAP) bei 37ºC (Seiten 133-134); Ligierung mit T4 DNA Ligase bei 14ºC (Seiten 390-391); Transformation von DNA in CaCl&sub2;-Zellen von E. coli HB101 und Selektion von Transformanten auf Agarplatten, enthaltend LB-Medium plus 100 ug/ml Ampicillin (Seiten 250-251); DNA Plasmidherstellung (Seiten 86-94); Auffüllen von einzelsträngigen DNA-Enden mit dem grossen Fragment der DNA Polymerase I (Klenow Fragment) bei 14ºC (Seiten 113-114); DNA Trennung und Fragmentreinigung aus Agarose Gelen (Seiten 164 bis 167); Verwendung von syntetischen DNA-Linkern bei der Zwischenklonierung (Seiten 392-397); Entfernung von einzelsträngigen DNA-Enden mit S1 Nuklease bei Raumtemperatur (Seite 140); Isolierung von mRNA aus tierischen Zellen (Seiten 191-193); S1 Nuklease Kartierung von mRNA (Seiten 207-209); DNA Sequenzierung nach der Maxam-Gilbert Technik (Seiten 475-478).
- Kultivierte Zellen: Hasenniere (RK-13) (Christofinis, G.J. und Beale, A.J., J.Path.Bact. 95, 377-381 [1968]); Humane Osteosarcoma Zellen, die mit dem Sarcoma Virus der Maus transformiert sind (Humane TK-143 Zellen mit der Hinterlegungsnummer GM 5887, Human genetic mutant Cell Repository, Institute for Medical Research, Copewood St., Camden, N.J. 08103, USA). Die Aufbewahrung der Zellen erfolgte bei den angezeigten Temperaturen in Eagle's minimal essential Medium (E-MEM), ergänzt mit 5 % fötalem Kalbsserum, 100 ug/ml Streptomycin und 100 IU/ml Penicillin , bei 80 % Feuchtigkeit und 5 % CO&sub2;.
- 10 ug Vaccinia Virus (VV) DNA (Wildtypstamm) wurden vollständig mit 100 Einheiten der Restriktionsendonuklease Hind III verdaut. Das Hind III J-Fragment (ungefähr 5 kb), welches das VV Thymidin Kinase (TK) Gen (Weir, J.P. und Moss, B., J.Virology 46, 530-537 [1983]) und F-Fragment (ungefähr 14 kb) enthält, wurde aus Agarose isoliert. Ein ug des Plasmids pBR-322 (J.G. Sutcliffe, "Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR-322", Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43, S. 77-90 [1979]) wurde mit einer Einheit der Restriktionsendonuklease Hind III vollständig verdaut, freie Enden wurden mit einer Einheit der bakteriellen Alkalischen Phosphatase (BAP) während einer Stunde dephosphoryliert. Zwanzig ng Hind III linearisierter pBR-322 DNA und 100 ng des Hind III J-Fragments bzw. F-Fragment wurden mit einer Einheit T4 DNA Ligase ligiert und in E. coli HB101 Zellen transformiert. Es wurden jeweils 4 Ampicillin resistente Transformanten ausgewählt und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde mittels Standardverfahren isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Gegenwart von Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Hind III, EcoRI und Kpn I, im Fall des J-Fragments, und Hind III Sal I und Bgl I, im Fall des F-Fragments, analysiert. Ein Plasmid, welches nach Elektrophorese auf Agarose Gelen das erwartete Muster zeigte, wurde pBR-J bzw. pBR-F genannt.
- Ein ug des Plasmids pBR-F wurde vollständig mit 2 Einheiten der Restriktionsendonuklease Cla I verdaut, die DNA wurde auf ein 0.8 % Agarose Gel geladen und ein Fragment von 5.6 kb (bestehend aus dem Plasmid pBR 322 und 1.25 kb des Inserts) wurden, wie beschrieben, isoliert. Fünfzig ng dieses Plasmids wurden mittels einer Einheit T4 Ligase wieder verknüpft und die DNA wurde in HB101, wie beschrieben, transformiert. Vier Ampicillin resistente Transformanten wurden ausgewählt und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde mittels Standardmethoden isoliert und bezüglich Grösse und Gegenwart von Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Hind III, Cla I und EcoRI analysiert. Ein Plasmid, welches nach Elektrophorese auf Agarose Gelen das erwartete Muster zeigte, wurde pBR-F1 genannt.
- Zwei ug des Plasmids pBR-J wurden vollständig mit 5 Einheiten der Restriktionsendonuklease Hpa II verdaut und die einzelsträngigen DNA- Enden wurden mit 4 Einheiten des grossen Fragments der DNA Polymerase I (Klenow Fragment) aufgefüllt. Die DNA wurde anschliessend vollständig mit 5 Einheiten der Restriktionsendonuklease Hind III verdaut, die DNA auf 0.8 % Agarose Gel aufgetrennt und ein 1310 Bp DNA Fragment wurde aus dem Agarose Gel isoliert. Zwei ug des Plasmids pUC-8 (J. Vierra und J. Messing, "The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic-universal primers", Gene 19, Seiten 259-268 [1982]) wurden vollständig mit 5 Einheiten der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut und die einzelsträngigen DNA-Enden wurden mittels 2 Einheiten S1 Nuklease während einer Stunde bei Raumtemperatur in S1 Puffer entfernt. Diese DNA wurde anschliessend vollständig mit 5 Einheiten der Restriktionsendonuklease Hind III verdaut freie Enden wurden mit 2 Einheiten BAP während einer Stunde dephosphoryliert, die DNA auf einem 0.8 % Agarose Gel aufgetrennt und ein Fragment von 2.7 kb wurde, wie vorstehend beschrieben, aus der Agarose isoliert. Fünfzig ng dieses pUC-8 Fragments wurden mit 200 ng des gereinigten 1310 Bp VV Fragments mittels einer Einheit T4 DNA Ligase ligiert und die ligierte DNA in HB101 transformiert. Acht Ampicillin resistente Transformanten wurden ausgewählt und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde mittels Standardverfahren isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Gegenwart der Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Hind III, EcoRI und Xba I analysiert. Ein Plasmid, welches nach Elektrophorese auf Agarose Gelen das erwartete Muster zeigte, wurde pUC-TK genannt.
- Fünfzig ug des Plasmids pBR-F1 wurden vollständig mit 200 Einheiten der Restriktionsendonukleasen EcoRI und Xba I verdaut, die DNA wurde auf einem 1.2 % Agarose Gel aufgetrennt. Ein DNA Fragment mit 104 Bp wurde isoliert, einzelsträngige DNA-Enden wurden mit 4 Einheiten des Klenow Fragments aufgefüllt und synthetische EcoRI Linker (CGAATTCG) wurden angeknüpft. Dieses neue DNA Fragment mit Eco Linkern (110 Bp) besteht aus der 11kDa Transkriptionsregulations-Sequenz des VV. Zwei ug des Plasmids pUC-TK wurden mit 5 Einheiten der Restriktionsendonuklease EcoRI vollständig verdaut, freie Enden wurden mittels 2 Einheiten BAP dephosphoryliert, die DNA wurde auf einem 0.8 % Agarose Gel aufgetrennt und das lineare 4 kb DNA Fragment wurde isoliert und extrahiert. Fünfzig ng des EcoRI linearisierten pUC-TK Vektors wurden mit 10 ng des 110 Bp Promotorfragments mittels 1 Einheit T4 DNA Ligase ligiert und in HB101 transformiert. Acht Ampicillin resistente Transformanten wurden selektioniert und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Gegenwart der Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen EcoRI und Hph I analysiert. Ein Plasmid, welches nach Elekrotphorese auf 6 % Agrylamid Gelen das erwartete Muster zeigte, wurde pUC-TK/11kDa genannt.
- Zehn ug pUC-TK/11kDa wurden teilweise (bis zu 5 %) mit einer Einheit der Restriktionsendonuklease EcoRI bei 37ºC für 30 Min verdaut, einzelsträngige DNA-Enden wurden mit 4 Einheiten des Klenow Fragments bei 14ºC aufgefüllt. Die DNA wurde auf 0.8 % Agarose Gel aufgetrennt und die linearisierte Form des Plasmids pUC-TK/11kDa (4104 Bp) wurde isoliert und 10 ng wurden mittels 2 Einheiten T4 DNA Ligase selbst ligiert und in HB101 transformiert. Sechszehn Ampicillin resistente Transformanten wurden selektioniert und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Gegenwart der Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen EcoRI, Xmn I und Hind III analysiert. Plasmide, welche nach Elektrophorese auf Agarose Gel das erwartete Muster zeigten, wurden ausgewählt und das 148 Bp Cla I-EcoRI Fragment wurde sequenziert. Ein Plasmid, welches die auf Seite 3 gezeigte Sequenz zeigte, welche die Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease EcoRI einschliesst und voran gestellt hat, wurde pHGS-1 genannt.
- An 33ºC adaptierte RK-13 Zellen wurden mit 0.1 Plaque formenden Einheiten (pfu) pro Zelle mit der temperatursensitiven Mutante ts7 (Drillien, R. und Spehener, D., Virology 131, 385-393 [1983]) des Vaccinia Virus infiziert. Nach 2 Stunden bei permissiver Temperatur von 33ºC wurden die Zellen mit einem Calciumphosphat DNA Präzipitat wie beschrieben (Weir, J.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 79, 1210-1214 [1982]) transfiziert. Sechzig ng Vaccinia Wildtyp DNA (WR Stamm), die mit 20 ng des geeigneten rekombinanten Plasmids (pHGS-1) ko-präzipitiert worden war, welches die Transkriptionsregulations-Sequenz des Vaccinia Virus 11kDa Gens in den Körper des TK Gens eingebaut enthält, wurden pro 2x10&sup6; Zellen verwendet. Nach zweitägiger Inkubation bei 39.5ºC wurden die Zellen mittels Ultraschall aufgebrochen und die Menge TK negativer (TK&supmin;) Viren bei den Nachkommen wurde mittels Titration auf Human-TK&supmin;143-Zellen in Gegenwart von 100 ug/ml Bromodeoxyuridin bestimmt. Ein ungefähr 200-facher Anstieg an Viren mit einem TK-&supmin;Phenotyp wurde in Zellen gefunden, die mit Wildtyp DNA und den rekombinanten Plasmiden transfiziert worden waren, gegenüber denjenigen, die in Zellen gefunden wurden, welche mit Wildtyp DNA alleine transfiziert worden waren. Plaques wurden gepickt und das Virus wurde ein zweites Mal auf Human-TK&supmin;143-Zellen in Gegenwart von 30 ug/ml Bromodeoxyuridin Plaque-gereinigt. Virusvorräte wurden dann auf RK-13 Zellen in Abwesenheit von Bromodeoxyuridin hergestellt. Das Virus RVV-1 wurde betreffend die Anwesenheit des 11kDa Promotors, welcher in das TK- Gen eingebaut ist, mittels Blot-Hybridisierung (Mackett, M., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 79, 7415-7419 [1982]) selektioniert.
- Zehn ug des Plasmids pHGS-1 wurden teilweise (bis zu 10 %) mit 2 Einheiten der Restriktionsendonuklease Taq I verdaut. Die DNAs wurden anschliessend vollständig mit 20 Einheiten der Restriktionsendonukiease Hind III verdaut, auf Agarose Gel aufgetrennt und ein 1135 Bp DNA Fragment wurde isoliert. Hundert ng dieses Fragments wurden mit 25 ng des Plasmids pBR-322, welches vollständig mit je 1 Einheit der Restriktionsendonukleasen Hind III und Cla I verdaut worden war, mit 1 Einheit T4 DNA Ligase ligiert und in HB101 transformiert. Vier Ampicillin resistente Transformanten wurden ausgewählt und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Gegenwart der Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Hind III, EcoRI und Cla I analysiert. Plasmide, welche das erwartete Muster auf Agarose Gelen zeigten, wurden ausgewählt und dazu verwendet die S1 Nuklease DNA Proben wie folgt herzustellen: Zehn ug des Plasmids wurden mit 20 Einheiten der Restriktionsendonukleasen Cla I und Hind III vollständig verdaut, freie Enden wurden mit 10 Einheiten BAP dephosphoryliert, ein 1.6 kb DNA Fragment wurde isoliert und 0.1 pMole wurden vor ihrer Verwendung mit einer Einheit Polynukleotidkinase (PNK) und 1 pMol γ-³²P-Deoxyadenosintriphosphat markiert, und die DNA wurde anschliessend vollständig mit einer Einheit der Restriktionsendonuklease RsA I verdaut.
- Fünf ug des Plasmids pUC-TK wurden vollständig mit der Restriktionsendonuklease ClaI verdaut, freie Enden wurden mit 5 Einheiten BAP dephosphoryliert, die DNA wurde anschliessend vollständig mit der Restriktionsendonuklease Hind III verdaut, die DNA wurde auf 0.8 % bei niedriger Temperatur schmelzender Agarose aufgetrennt und ein 737 Bp DNA Fragment wurde isoliert. Die S1 Probe wurde mit PNK und γ-³²P-Deoxyadenosintriphosphat, wie beschrieben, markiert.
- Zwei Petrischalen (5 cm ∅) mit einer konfluenten Einzelschicht RK-13 Zellen wurden jeweils mit 10 pfu pro Zelle des rekombinanten Virus RVV-1 infiziert und nach 3, bzw. 7 Stunden wurden die RNA extrahiert. Die RNAs wurden in 100 ul 0.2 % SDS resuspendiert, in zwei gleiche Teile geteilt und 20'000 cpm der ³²P-markierten S1 Probe für das TK-Gen, bzw. die 11kDa Transkriptionsregulations-Sequenz, wurden hinzugefügt und die verschiedenen Mischungen wurden mit 1/10 des Volumens mit Natrium Actetat (NaOAc) und dem 2 1/2-fachen des Volumens mit Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde in 50 ul S1 Hybridisierungspuffer gelöst, für 3 Min. auf 100ºC erhitzt und für 16 Stunden bei 42ºC inkubiert bevor 450 ul einfach S1 Nuklease Puffer und 25 Einheiten des Enzymes S1 Nuklease hinzugefügt wurden. Die Verdauung wurde nach einer Stunde mit EDTA (Endkonzentration 50 mM) und SDS (Endkonzentration 0.5 %) gestoppt. Natriumhydroxid wurde zu einer Endkonzentration von 0.25 N hinzugefügt und nach einer Stunde bei 45ºC wurde die Mischung mittels 3M HOAc auf pH 7 neutralisiert. Die restliche DNA wurde mit 5 ug tRNA als Tärger präzipitiert, mit 80 % Ethanol gewaschen in 20 ul Formamid-Ladepuffer gelöst und 10 ul wurden auf ein 8 % Acrylamid-8M Harnstoffsequenzgel aufgetragen. Das Gel wurde für 24 Stunden mittels Kodak Röntgenfilm und einer Verstärkerfolie exponiert. Die Röntgenexposition ist in Abbildung 6 gezeigt. 3 Stunden nach Infektion können nur Trankskripte des TK-Promotors detektiert werden (Spur 1), während 7 Stunden nach Infektion eine starke S1 geschützte Bande nachgewiesen werden kann, die vom eingebauten 11kDa Promotor (260Bp) ausgeht, und nur geringe Mengen an TK-Transkripten. Deshalb kann geschlossen werden, dass die eingebaute 11kDa Regulationssequenz spät nach Infektion funktioniert.
- Drei ug des Plasmids pHGS-1 wurden vollständig mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut, die DNA wurde bei 37ºC mit einer Einheit T4 DNA Polymerase in T4 Polymerase Puffer (Maniatis et al., supra) mit Deoxythymidin-Triphosphat und einer Endkonzentration von 100 uM inkubiert. Nach 30 Min. wurde die Reaktion durch Erhitzen auf 65ºC für 10 Min. beendet. Die Mischung wurde 10-fach mit S1 Nuklease Puffer verdünnt und einzelsträngige DNA-Enden wurden mit 2 Einheiten S1 Nuklease während einer Stunde entfernt. Synthetische Bam HI Linker (5'-AAAGGATCCTTT-3') wurden an die stumpfen DNA-Enden ligiert und 100 ng der DNA wurden mit einer Einheit T4 DNA Ligase selbst ligiert und mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease EcoRI während einer Stunde verdaut und in HB101 transformiert. Achtzig Ampicillin resistente Transformanten wurden selektioniert und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Anwesenheit der Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Bam HI analysiert. DNAs, welche die Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Bam HI enthalten, wurden ausgewählt. Von jeder dieser DNAs wurden 20 ug mit 50 Einheiten der Restriktionsendonukleasen Bam HI und Cla I vollständig verdaut. Die DNAs wurden auf Acrylamid Gelen aufgetrennt und DNA Fragmente mit einer Länge von 156 bzw. 141 Bp wurden isoliert und nach Markierung der Fragmente an der Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Bam I mittels 1 Einheit Klenow Fragment und α-³²P-Deoxyguanidintriphosphat nach der Methode von Maxam-Gilbert sequenziert. DNAs mit einer der folgenden Sequenzen, die der Sequenz 5'-AAAGGATCC-3' (den Bam HI Linker darstellend) vorangestellt ist, wurden ausgewählt: Nr. 1: Nr. 2:
- Fünf ug der DNAs mit der Sequenz Nr. 1, bzw. 2 wurden mit 10 Einheiten der Restriktionsendonukleasen Bam HI und Hind III vollständig verdaut. Die DNA wurde auf einem Agarose Gel aufgetrennt und DNA Fragmente von 888 bzw. 873 wurden isoliert und 100 ng wurden jeweils mit 50-molarem Ueberschuss der synthetischen DNA Fragmente 5'-GATCCCCGGG-3' und 5'- AATTCCCGGG-3' mittels 1 Einheit T4 DNA Ligase ligiert. Die DNA wurde anschliessend mit 300 Einheiten der Restriktionsendonuklease EcoRI während 8 Stunden verdaut, auf ein 6% Acrylamid Gel geladen und Fragmente von 898 bzw. 883 wurden isoliert.
- Zwei ug des Plasmids pHGS-1 wurden vollständig mit 5 Einheiten der Restriktionsendonukleasen EcoRI und Hind III verdaut, die DNA wurde auf einem Agarose Gel aufgetrennt und ein 3.2 kb Fragment wurde isoliert. Fünfundzwanzig ng dieses 3.2 kb Fragments wurden mit 50 ng der 898, bzw. 883 DNA Fragmente mittels 1 Einheit T4 DNA Ligase ligiert und die DNAs in HB101 transformiert. Jeweils 4 Ampicillin resistente Transformanten wurden selektioniert und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Gegenwart der Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen EcoRI, Sma I und Bam HI analysiert. Jeweils ein Plasmid, welches das erwartete Muster nach Elektrophorese auf Agarose Gelen zeigte, wurde pHGS- 2 (enthaltend Sequenz Nr. 1), bzw. pHGS-2Δ15 (Nr. 2) genannt.
- Die rekombinanten Viren RVV-2 bzw. RVV-3 wurden, wie vorstehend beschrieben, mittels der Plasmide pHGS-2 bzw. pHGS-2Δ15 konstruiert. Jeweils ein Virus wurde auf die Gegenwart der mutierten 11kDa Transkriptionsregualtions-Sequenz (Nr. 1 bzw. 2), welche in das TK-Gen eingebaut ist, mittels Blot-Hybridisierung (Mackett et al., supra) selektioniert.
- Die Herstellung der S1 Nuklease Proben für die Transkripte der Transkriptionsregulations-Sequenz Nr. 1 bzw. Nr. 2, welche in das TK-Gen eingebaut sind, war wie in Beispiel 1, Abschnitt F.a beschrieben, unter Verwendung der Plasmide pHGS-2 bzw. pHGS-2Δ15.
- 4 bzw. 8 Stunden nach Virusinfektion wurden RNA Transkripte, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung der Viren RVV-2 bzw. RVV-3 und der S1 Proben für RNA Transkripte, die vom TK-Promotor bzw. den 11kDa Transkriptionsregulations-Sequenzen (enthaltend Sequenzen Nr. 1 bzw. 2) ausgehen, hergestellt. Die Röntgenfilmexposition ist in Abbildung 7 gezeigt. Bei 4 Stunden nach Infektion (Spur 1 und 4) können nur Transkripte, die vom TK-Promotor ausgehen, entdeckt werden. Diese Transkripte sind 8 Stunden nach Infektion nicht mehr nachweisbar, während bei Zellen, die mit dem Virus RVV-2 (pHGS-2 eingebaut) infiziert sind, eine starke S1 geschützte Bande erkannt werden kann. Jedoch mit RVV-3 (pHGS-2Δ15 eingebaut) erscheint keine S1 geschützte Bande, wodurch gezeigt wird, dass die Deletion von 15 Bp 5' vom ATG zu einer Inaktivierung von Transkripten führt, die von der mutierten Transkriptionsregulations-Sequenz ausgehen.
- Hundert ng eines Plasmodium falciparum cDNA Fragments mit flankierenden EcoRI Linkern, welches das Merozoiten 5.1 Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum (Hope, I.A. et al., Nucleic Acids Research, 13, 369-379 [1985]) enthält, wurden unter Verwendung von 1 Einheit T4 DNA Ligase in 50 ng pHGS-2 bzw. pHGS-2Δ15 ligiert, mit der Restriktionsendonuklease EcoRI vollständig verdaut, freie Enden wurden mittels 1 Einheit BAP dephosphoryliert. Die ligierten DNAs wurden anschliessend in HB101 transformiert und jeweils 4 Ampicillin resistente Transformanten wurden selektioniert und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Anwesenheit von Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen EcoRI und Hinc II analysiert. Jeweils ein Plasmid, welches das erwartete Muster nach Elektrophorese auf Agarose Gelen zeigte, wurde pHGS-2/5.1 bzw. pHGS-2Δ15/5.1 genannt.
- Die rekombinanten Viren RVV-4 und RVV-5 wurden, wie zuvor beschrieben, unter Verwendung der Plasmide pHGS-2/5.1 und pGHS- 2Δ15/5. 1 konstruiert und selektioniert.
- RK-13 Zellen wurden bis 80 % Konfluenz wachsen gelassen und mit 0.1 Plaque bildenden Einheiten (pfu) pro Zelle mit rekombinantem Vaccinia Virus RVV-4 bzw. RVV-5, die das Malaria 5.1 Antigen durch homologe Rekombination stabil in das Virus Genom integriert enthalten, beimpft. Eine Stunde nach Infektion der Zellen wurden diese mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und frisches Medium wurde zu den Zellen hinzugefügt. Die Infektion mit dem Virus wurde für weitere 16 Stunden fortgesetzt. Zellen wurden aus den Kulturschalen geschabt, mittels Zentrifugation bei 2000xg geerntet und einmal mit PBS gewaschen. Ungefähr 10&sup4; Zellen wurden auf einem Mikroskopglas verteilt, luftgetrocknet, mit -20ºC Azeton während 10 Min. fixiert und wiederum an der Luft getrocknet. Die fixierten Zellen wurden bei 37ºC während 20 Min. in PBS verdünntem Kaninchen anti-5.1 Antigen inkubiert, 3 X anschliessend mit PBS gewaschen und erneut luftgetrocknet. Danach wurden die fixierten Zellen bei 37ºC für 20 Min. mit in PBS verdünntem Ziegen anti-kaninchen FITC Serum inkubiert, 3 X mit PBS gewaschen, einmal mit destiliertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet. PBS-Glyzerin (1:1) wurde auf die Zellen gegeben und die Zellen mit einem Mikroskopdeckglas abgedeckt. Die Zellen wurden bezüglich ihrer Fluoreszenz bei 450-490 nm unter einem Mikroskop analysiert. Das Ergebnis ist in Figur 9 gezeigt. Tafel A zeigt fluoreszierende Zellen, die mit dem Virus RVV-4 infiziert wurden und Tafel B infizierte Zellen in sichtbarem Licht. Zellen, die mit dem Virus RVV-5 infiziert wurden, zeigten keine Fluoreszenz, wodurch gezeigt wurde, dass Deletionen flussaufwärts von 11kDa-ATG zu einer Inaktivierung der Regulationssequenzen führt. Die Entfernung des G Restes von ATG hat jedoch keinen Einfluss auf die Transkription oder Translation.
- Zwei ug des Plasmids pHGS-2 wurden vollständig mit jeweils 2 Einheiten der Restriktionsendonukleasen Bam HI und EcoRI verdaut. Die DNA wurde auf einem 0.8 % Agarose Gel aufgetrennt und der Bam HI-EcoRI Vektor wurde isoliert ( 4 kb).
- Zwei ug des Plasmids pDS-1, to 1&spplus; (bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Göttingen am 11. Dezember 1984 unter der Hinterlegungsnummer DSM 3135 hinterlegt) wurden mit jeweils zwei Einheiten der Restriktionsendonukleasen Bam HI und EcoRI vollständig verdaut und ein Fragment von ungefähr 920 Bp, welches das Dihydrofolat- Reduktase (DHFR) Gen der Maus enthält, wurde isoliert. Zwanzig ug des Bam HI und EcoRI verdauten Vektors pHGS-2 und 100 ug des Bam HI-EcoRI Fragments, welches das Dihydrofolat-Reduktase Gen der Maus enthält, wurden mit 1 Einheit T4 DNA Ligase ligiert und die DNA wurde in HB101 transformiert. Acht, gegen 100 ug/ml Ampicillin resistente Transformanten wurden selektioniert und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Anwesenheit der Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen EcoRI, Bam HI und SacI analysiert. Ein Plasmid, welches das erwartete Muster zeigte, wurde pHGS-2/DHFR genannt.
- Zwei ug des Plasmids pHGS-2 wurden vollständig mit zwei Einheiten der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut, die freien Enden wurden mit einer Einheit bakterieller Alkalischer Phosphatase (BAP) dephosphoryliert und der EcoRI verdaute Vektor wurde aus bei niedriger Temperatur schmelzender under (LM) Agarose isoliert. Zwei ug des Plasmids pDS-1, to 1&spplus; wurden vollständig mit zwei Einheiten der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut und ein Fragment von ungefähr 920 Bp, welches das DHFR-Gen der Maus enthält, wurde aus LM Agarose isoliert. Zwanzig ug des EcoRI verdauten Vektors pHGS-2 und 100 ug des EcoRI-Fragments wurden mit einer Einheit T4 DNA Ligase ligiert und die DNA in HB101 transformiert. Acht, gegen 100 ug/ml Ampicillin resistente Transformanten wurden selektioniert und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Anwesenheit von Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen EcoRI und SacI analysiert. Ein Plasmid, welches das erwartete Muster nach Agarose Gelelektrophorese zeigte, wurde pHGS-2/DHFR-E (Fig. 11) genannt.
- Zehn ug des Plasmids pHGS-2/DHFR-E wurden mit 10 Einheiten der Restriktionsendonukleasen EcoRI und SacI vollständig verdaut und ein ungefähr 275 Bp Fragment wurde aus 8 % Acrylamid Gel isoliert. Zweihundert ug des 275 Bp EcoRI-SacI Fragments wurden mit jeweils 50 pMolen der synthetischen Fragmente 5'-TATAAATA-3' und 5'-AATTTATTTATA-3' in Ligase Puffer, enthaltend 50 mM NaCL, unter Verwendung von einer Einheit T4 DNA Ligase ligiert. Nach der Ligierung während 2 Stunden bei 14ºC wurde die DNA mit einer Einheit der Restriktionsendonuklease SacI vollständig verdaut und ein 283 Bp Fragment, welches die vorstehend genannten, synthetischen Sequenzen enthält, wurde isoliert.
- Zwei ug des Plasmids pHGS-2Δ15 wurden vollständig mit vier Einheiten der Restriktionsendonuklease Bam HI verdaut und die 5' Ueberhänge wurden mit dem grossen Fragment der E. coli DNA Polymerase I (Klenow Fragment) aufgefüllt und das Enzym wurde durch Inkubation bei 65ºC für 10 Min. inaktiviert. Anschliessend wurde die DNA vollständig mit einer Einheit ClaI verdaut und ein 152 Bp Fragment wurde aus einem 8 % Acrylamid Gel isoliert.
- Zwei ug des Plasmids pHGS-2/DHFR wurden vollständig mit jeweils 2 Einheiten der Restriktionsendonukleasen ClaI und SacI verdaut und der Vektor von ungefähr 4.6 kb wurde aus LM Agarose isoliert. Hundert ug des EcoRI-SacI Fragments, welches die genannten synthetischen Fragmente enthält, und Hundert ug des Clal-Bam HI Fragments, welches Teile der 11kDa Transkriptionsregulations-Sequenz enthält, wurden mit 20 ug ClaI-SacI verdautem Vektor pHGS-2/DHFR mittels einer Einheit T4 DNA Ligase ligiert und die DNA in HB101 transformiert. 16 Ampicillin resistente Transformanten wurden selektioniert und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Anwesenheit der Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen EcoRI und SacI analysiert. Ein Plasmid, welches das erwartete Muster nach Elektrophorese auf Acrylamid Gelen zeigte, wurde sequenziert. Das Plasmid wurde pHGS-A/DHFR genannt, enthaltend die Sequenz: Nr. 3:
- Zehn ug des Plasmids pHGS-2/DHFR wurden vollständig mit jeweils 10 Einheiten der Restriktionsendonukleasen Barn HI und SacI verdaut und ein 268 Bp Fragment wurde aus einem 8 % Acrylamid Gel isoliert. Zweihundert ug des BamHI-SacI Fragments wurden mit jeweils 50 pMolen der synthetischen Fragmente 5'-TCTATCGATTAAATAAA-3' und 5'-GATCTTTATTTAATCGATAGA-3' in Ligasepuffer, enthaltend 50 mM NaCL (Endkonzentration), mit einer Einheit T4 DNA Ligase ligiert. Nach der Ligierung während 2 Stunden bei 14ºC wurde die DNA mit einer Einheit der Restriktionsendonuklease SacI verdaut und das 290 Bp Fragment, welches die obengenannte Sequenz enthält, wurde isoliert. Zehn ug des Plasmids pHGS-2Δ15 wurden vollständig mit jeweils 10 Einheiten der Restriktionsendonukleasen ClaI und DraI verdaut und ein 130 Bp Fragment wurde aus einem 8 % Acrylamid Gel isoliert.
- Jeweils hundert ug des Bam HI-SacI Fragments, welches die genannten synthetischen Fragmente enthält, und des ClaI-DraI Fragments, welches Teile der 11kDa Transkriptionsregulations-Sequenz enthält, wurden mit 50 ug ClaI- SacI verdautem Vektor pHGS-2/DHFR mit einer Einheit T4 DNA Ligase ligiert und die DNA wurde in HB101 transformiert. Sechszehn Ampicillin resistente Transformanten wurden selektioniert und Kulturen in LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, wachsen gelassen. DNA dieser Kulturen wurde isoliert und bezüglich ihrer Grösse und Anwesenheit der Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen SacI und ClaI analysiert. Ein Plasmid, welches nach Elektrophorese auf Acrylamid Gelen das erwartete Muster Zeigte, wurde sequenziert. Das Plasmid wurde pHGS-F/DHFR genannt, enthaltend die Sequenz: Nr. 4:
- Die rekombinanten Viren RVV-6, RVV-7 bzw. RVV-8 wurden, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung der Plasmide pHGS-2/DHFR, pHGS-A/DHFR und pHGS-F/DHFR konstruiert. Jeweils ein Virus wurde betreffend die Anwesenheit des chimären Gens, bestehend aus der mutierten 11kDa Transkriptionsregulations-Sequenz (Nr.1, 3 bzw. 4) und dem in das VV TK-Gen eingebauten DFWR Gen, mittels Blot-Hybridisierung (Mackett et al., supra) selektioniert.
- Jeweils 10 ug der Plasmide pHGS-2/DHFR, pHGS-A/DHFR und pHGS-F/DHFR wurden vollständig mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease AccI verdaut, die freien Enden wurden mit einer Einheit BAP dephosphoryliert und das Enzym wurde durch die nachfolgenden Extraktionen mit Phenol, Phenol-Chloroform (1:1,v/v) und Chloroform entfernt. Die DNAs wurden präzipitiert und die freien Enden wurden unter Verwendung von Polynukleotidkinase in Gegenwart von 2-fach molarem Ueberschuss an ³²P-γ-ATP phosphoryliert. Das Enzym wurde bei 65ºC während 10 Min. inaktiviert und die DNAs wurden mit 5 Einheiten der Restriktionsendonuklease Hind III vollständig verdaut. Fragmente mit ungefähr 1200 Bp wurden aus LM Agarose isoliert, welche die asymetrisch, an der Schnittstelle fuhr die Restriktionsendonuklease AccI markierte S1 Proben darstellen.
- Einzelschichten von RK-13 Zellen wurden mit 5 pfu pro Zelle mit den rekombinanten Viren RVV-6, RVV-7 bzw. RVV-8 infiziert. Frühe RNA wurde 6 Stunden nach Infektion von Zellen, die in Medium, enthaltend 100 ug/ml Cycloheximid (Sigma) inkubiert worden waren, präpariert. Späte RNAs wurden aus Virus infizierten Zellen 8 und 24 Stunden nach Infektion isoliert. Die S1 Kartierung wurde wie im Beispiel 1, Abschnitt G beschrieben, unter Verwendung der markierten S1 Proben für die DHFR Transkripte, die wie in Abschnitt F beschrieben hergestellt wurden, durchgeführt.
- Die Röntgenfilmexposition ist in Fig. 14 gezeigt. DHFR Transkripte sind in RNA von infizierten, in Gegenwart von Cycloheximid inkubierten Zellen, nicht nachweisbar, was darauf hindeutet, dass die 11kDa Regulationssequenzen Nr. 1, 3 und 4 in der frühen Transkription nicht aktiv sind (Fig. 14, Spuren die mit + gekennzeichnet sind).
- DHFR Transkripte (durch Pfeil gekennzeichnet) sind 8 und 24 Stunden nach Infektion in mit RVV-6, RVV-7 bzw. RVV-8 Viren infizierten Zellen nachweisbar (Fig. 14, Spuren, die mit 8 bzw. 24 gekennzeichnet sind). Die Mengen der DHFR Transkripte, die von den mutierten 11kDa Regulationssequenzen Nr. 3 und 4 abstammen und die in den Insertionsvektoren pHGS-A/DHFR bzw. pHGS-F/DHFR vorhanden sind, sind wenigstens 3- bis 4-fach verstärkt im Vergleich zu DHFR Transkripten, die von der 11kDa Regulationssequenz Nr. 1 hergeleitetet sind, welche in dem Insertionsvektor pHGS-2/DHFR vorhanden ist.
Claims (31)
1. Eine Transkriptionsregulations-Sequenz mit der Formel
oder Untereinheiten davon, welche die genetische Information enthalten
um als ein später Pockenvirus Promotor zu wirken.
2. Eine Transkriptionsregulations-Sequenz gemäss Anspruch 1 mit der
Formel
3. Eine Transkriptionsregulations-Sequenz gemäss Anspruch 1 mit der
Formel
4. Eine Transkriptionsregulations-Sequenz gemäss Anspruch 1 mit der
Formel
5. Eine Transkriptionsregulations-Sequenz gemäss Anspruch 1 mit der
Formel
5' CTAT GCTAT AAAT 3'
6. Eine Rekombinationsvektor enthaltend
(a) den vektoriellen Replikationsstartpunkt,
(b) ein Antibiotikaresistenzgen,
(c) ein chimäres Gen, welches aus wenigstens einer
Transkriptionsregulations-Sequenz gemäss den Ansprüchen 1 - 5 besteht, die
operativ mit einem Fremdgen, welches pro - oder eukaryotische
Polypeptide kodiert, verknüpft ist, und
(d) DNA von nicht-essentiellen Bereichen des Pockenvirus Genoms,
welche besagtes chimäres Gen flankiert.
7. Ein Rekombinationsvektor gemäss Anspruch 6, worin der
Translationsstartort des chimären Gens von der Pockenvirus
Transkriptionsregulations-Sequenz geliefert wird.
8. Ein Rekombinationsvektor gemäss Anspruch 6, worin der
Translationsstartort des chimären Gens vom Fremdgen, welches
pro - oder eukaryotische Polypeptide kodiert, geliefert wird.
9. Ein Rekombinationsvektor gemäss einem der Ansprüche 6 - 8,
der ein Plasmid ist, welches in gram-negativen Bakterien replizieren
kann.
10. Ein Rekombinationsvektor gemäss Anspruch 9, der in einem E. coli
Stamm replizieren kann.
11. Ein Rekombinationsvektor gemäss einem der Ansprüche 6 und 8 - 10,
worin besagtes Fremdgen ein Malaria Antigen kodiert.
12. Ein Rekombinationsvektor gemäss Anspruch 11, worin das Malaria
Antigen ein sporozoiten und/oder merozoiten Oberflächenantigen
von Plasmodium falciparum ist.
13. Ein Rekombinationsvektor gemäss Anspruch 12, worin das Malaria
Antigen das 5.1 Antigen ist.
14. Ein Rekombinationsvektor gemäss einem der Ansprüche 6 - 13,
worin besagte Pockenvirus DNA Vaccinia Virus DNA ist.
15. Ein Rekombinationsvektor gemäss Anspruch 14 mit der
Bezeichnung pHGS-1, wie in E. coli HB 101 mit der
Hinterlegungsnummer DSM 3248 enthalten.
16. Ein Rekombinationsvektor gemäss Anspruch 14 mit der Bezeichnung
pHGS-2, wie in E. coli HB 101 mit der Hinterlegungsnummer
DSM 3249 enthalten.
17. Ein rekombinanter, infektiöser Pockenvirus, welcher ein chimäres
Gen enthält, das aus einer Transkriptionsregulations-Sequenz gemäss
einem der Ansprüche 1 - 5 besteht, die operativ mit einem Fremdgen,
welches pro - oder eukaryotische Polypeptide kodiert, verknüpft ist
und welcher in der Lage ist besagtes Fremdgen zu exprimieren.
18. Ein rekombinanter, infektiöser Pockenvirus gemäss Anspruch 17,
worin der Translationsstartort des chimären Gens von der
Pockenvirus Transkriptionsregulations-Sequenz geliefert wird.
19. Ein rekombinanter, infektiöser Pockenvirus gemäss Anspruch 17,
worin der Translationsstartort des chimären Gens vom Fremdgen,
welches pro - oder eukaryotische Polypeptide kodiert, geliefert wird.
20. Ein rekombinanter, infektiöser Pockenvirus gemäss Anspruch 17 und
19, worin besagtes Fremdgen ein Malaria Antigen kodiert.
21. Ein rekombinanter, infektiöser Pockenvirus gemäss Anspruch 20,
worin das Malaria Antigen ein sporozoiten und/oder merozoiten
Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum ist.
22. Ein rekombinanter, infektiöser, Pockenvirus gemäss Anspruch 21,
worin das Malaria Antigen das 5.1 Antigen ist.
23. Ein rekombinanter, infektiöser Pockenvirus gemäss einem der
Ansprüche 17 - 22, der ein infektiöser, rekombinanter Vaccinia
Virus ist.
24. Ein infektiöser Vaccinia Virus gemäss Anspruch 23 mit der
Bezeichnung RVV-1, erhältlich durch Transfektion einer
eukaryotischen Wirtszelle mit dem wie in Anspruch 15 definierten
Rekombinationsvektor pHGS-1.
25. Ein infektiöser Vaccinia Virus gemäss Anspruch 23 mit der
Bezeichnung RVV-2, erhältlich durch Transfektion einer
eukaryotischen Wirtszelle mit dem wie in Anspruch 16 definierten
Rekombinationsvektor pHGS-2.
26. Ein Verfahren zur Herstellung eines Rekombinationsvektors gemäss
einem der Ansprüche 6 - 16, welches die Schritte einschliesst:
(a) Herstellung eines Vektors, der Pockenvirus DNA enthält, welche
(i) wenigstens eine Transkriptionsregulations-Sequenz neben
einer Restriktionsendonuklease Schnittstelle, und
(ii) DNA von nicht-essentiellen Bereichen des Pockenvirus
Genoms, welche besagte Regulationssequenz und besagte
Restriktionsendonuklease Schnittstelle flankiert, einschliesst;
und
(b) Einbau wenigstens eines Fremdgens, welches pro-oder
eukaryotische Polypeptide kodiert, in die besagte
Restriktionsendonuklease Schnittstelle neben besagter
Transkriptionsregulations-Sequenz.
27. Das Verfahren gemäss Anspruch 26, worin besagte Pockenvirus
DNA Vaccinia Virus DNA ist.
28. Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten, infektiösen
Pockenvirus gemäss einem der Ansprüche 17 - 25, welches die
Schritte einschliesst:
(a) Herstellung eines Rekombinationsvektors gemäss Anspruch 26
oder 27;
(b) Bereitstellung wenigstens einer mit einem Virus der Gattung
der Pockenviren infizierten Zelle;
(c) Transfektion besagter Zelle mit besagtem Rekombinationsvektor,
wobei homologe Rekombination zwischen der DNA von besagtem
Pockenvirus und wenigstens einem Teil von besagter
Pockenvirus DNA, welche in besagtem Rekombinationsvektor enhalten
ist, stattfindet; und
(d) Isolierung eines rekombinanten, infektiösen Pockenvirus, der in
der Lage ist besagtes Fremdgen, welches pro - oder eukaryotische
Polypeptide kodiert, zu exprimieren, aus besagter Zelle mittels
selektiver Verfahren.
29. Das Verfahren gemäss Anspruch 28, worin besagte Pockenvirus DNA
Vaccinia Virus DNA ist.
30. Lebendimpfstoffe enthaltend einen rekombinanten, infektiösen
Pockenvirus gemäss einem der Ansprüche 17 - 23 und einen
physiologisch verträglichen Träger.
31. Verwendung eines rekombinanten, infektiösen Pockenvirus gemäss
einem der Ansprüche 17 - 25 zur vorbeugenden Immunisierung.
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- 1995-02-20 JP JP7030352A patent/JPH07265085A/ja active Pending
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