JPH025887A - 融合タンパク質またはポリペプチドの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組み換えＤＮＡ技術による高純度のタンパク質
およびポリペプチド生成物の製法、そしてより詳しくは
所望のタンパク質またはポリペプチドを包含しかつ容易
に精製され得るものである新規な遺伝子産物の製造への
かかる技術の利用、および場合により所望のタンパク質
またはポリペプチドへのかかる遺伝子産物の変換法にも
関する。本発明はまたかかる新規な遺伝子産物にも関す
る。より詳細には、本発明は血清アルブミンに選択的に
結合しつる融合タンパク質またはポリペプチドの製法、
微生物中で復製しうる組み換えベクター、かかる組み換
えベクターを宿す宿主細菌、および本発明方法により生
産された融合タンパク質またはポリペプチドに関する。

遺伝子融合なる操作は、２個またはそれ以上の遺伝子の
コード配列を一緒にスプライスして結合遺伝子を形成さ
せて、この結合された遺伝子が適当な宿主細菌中で発現
された場合にそれぞれの遺伝子によりコーディングされ
た別々のタンパク質またはポリペプチドが１つの分子に
融合された融合生成物を産生ずるものとなす操作である
。

本発明は組み換えＤＮＡ技術に基づく方法により、所望
のタンパク質およびポリにプチドを極度に純粋に取得で
きるタンパク質の固定および精製を促進する手段を提供
するものである。本発明によりこの目的はストレプトコ
ッカス（８ｔｒｅｐｔｏ−ｏｏｏａｕｓ　）株Ｇ１４８
からのタンパク質Ｇの特異的なアルブミン結合性質を下
記に説明する遺伝子融合技術と組み合わせて利用するこ
とにより達成された。

本発明によれば、遺伝子融合を用いて、アルプミン結合
性部分をコードする第１のＤＮＡ配列を所望のタンパク
質またはポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列と
結合させて前記所望のアルブミン結合性部分を有する融
合生成物を発現しうる機能的な遺伝子となす。そのアル
ブミン結合能力ゆえに生成されたタンノクク質またはポ
リペプチドは適当な担体に固定されたヒト血清アルブミ
ン（Ｈ８Ａ）型の血清アルブミンを用いる慣用のアフイ
ニテイクロマトグラフイーにより高い効率で容易に単離
されうる。担体に結合された融合生成物は例えば所望の
タンパク質が酵素である場合はそのまま使用でき、また
はこのものはアルブミン結合性部分を含めた全体として
もしくは適当な試薬で開裂させることによりその所望の
タンパク質またはポリペプチド部分のみを担体から遊離
させることができる。

従って本発明は基本的には所望のタンパク質またはポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列がアルジミン結合性部
分をコードするＤＮＡ配列に操作的に連結されていて、
従ってこれらＤＮＡ配列が一緒になって前記所望のタン
パク質またはポリペプチドおよび前記アルブミン結合性
部分からなるアルブミン結合性融合生成物をコードする
ものとなっているＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ
クローニングベクターを提供するものである。宿主細菌
を形質転換して前記融合生成物を産生させうるためには
（ベクターがバクテリオファージである場合も含めて）
、そのベクターは結合された融合生成物をコーディング
するＤＮＡ配列に対するレプリコンおよびプロモーター
をも慣用の様式で含有する。以下にさらに説明される目
的のためＫは、前記結合されたＤＮＡ配列がそれぞれ所
望のタンパク質およびアルブミン結合性部分をコードす
るＤＮＡ配列の間に適当な開裂部位をコードする配列を
包含していて従って融合分子のアルブミン結合性部分が
前記したように開裂されうるようにすることができるＯ 前記結合されたＤＮＡ配列を発現させるのに適合しうる
宿主細菌を前記ベクターで形質転換しそしてこの宿主を
栄養培地中で培養することにより、相当するアルブミン
結合性融合タンパク質またはポＩＪ　Ａプチドが生産さ
れよう。例えばエンシエリヒア（Ｅｓａｈｅｒｉａｈｉ
ａ）、パチル（Ｂａｏｉ−Ｌｌｕｓ　）およびタフイロ
コツカス（８ｔａｐｈｙｌｏａｏ−ｏｏｕａ　）の菌株
のようなｌｌ１ｌ菌宿主が本発明による目的にとって好
ましいが、酵母および他のカビ、培養植物細胞その他の
ような他の宿主の使用ももちろん本発明の範囲に包含さ
れる。宿主の形質転換はよく知られた方法により行うこ
とができる。

宿主Ｉａｍの培Ｉｎより産生された融合分子のタンｌ−
ｅり質０部分がアルブミン請合能力を有するゆえに、そ
の融合分子は適当な担体に固定されたＨ８Ａ　ＩＣより
細胞培養物から非常に効率的に単離されうる０もし融合
生成物が周囲の培地中に分泌される場合は担体への結合
は培地がら直接行うことができる。他方融合生成物が細
胞内に留まる場合はかかる結合を行うに先立ち細胞を破
壊しなければならない。細胞壁の破壊は慣用の方法、例
えば高圧、超音波処理、ホモジナイゼーション、ガラス
ピーズとの振盪等により行われうる０生成物がダラム陰
性細菌におけるように２つの細胞膜の間の細胞同辺腔内
にはまり込んでいる場合は、生成物を浮遊培地中に放出
させるのに浸透ショック法が用いられつる。

Ｈ８Ａを用いる融合生成物の単離に先立ち培養剛肥また
は増殖培地を任意の他の処理Ｋかけることももちろん本
発明の範囲内に包含される。

慣用の方法においては固定化は適当な培地中でスラリー
化したＨ８Ａ結合担体を用いてパッチ式で、または活性
化された担体のカラムを用いて行われつる。本発明の目
的にとって充分にＩＳＡを結合できる任意の慣用の担体
物質が使用されうる。ＩＳＡをかかる担体物質に結合ま
たは固定させる方法はよく知られており、そしてここで
詳細に記載する必要はないと考える。マイクロタイター
ウェルの表面に被覆の手段としてＩＳＡを吸着させるこ
ともできる。

ＩＳＡ−担体に結合された融合タンパク質またはポリハ
プチドの放出または脱着は慣用の方法、例えば酢酸緩衝
液（ｐＨ２，７）によるようなｐＨの低下、高濃度の塩
またはカオトロピックイオンでの処理、または融合タン
パク質またはポリペプチドをＨ８Ａ担体吸着剤からはず
すために過剰の可溶性ＨＢｋを用いる競合的溶離により
行われつる。もちろん脱着法は、個々の所望のタンパク
質またはポリハプチドに関しその所望の活性がその方法
により失われるかまたはかなり低下することのないよう
に選択されるべきである。得られる溶出液から、融合タ
ン・署り質またはポリペプチドは容易に単離でき、そし
て所望の場合はさらにゲル濾過、イオン交換等のような
精製工程Ｋかけることができる。

得られる精製されたタンパク質またはポリペプチドは以
下に記載されるようにそれ自体で価値ある生成物であり
、それゆえ本発明はさらに、適合しうる宿主を前記ベク
ターで形質転換し、該宿主を栄養培地中で培養し、融合
タンパク質またはポリペプチドをＨ８Ａ支持支持へのそ
の選択的結合により該宿主培養物から単離し、そして場
合により融合タン／−？り質またはポリペプチドを担体
から放出させる工程からなる、高度に精製された融合タ
ンパク質またはポリペプチド生成物の製法、ならびにそ
れｋより得られかかる単離された融合生成物をも提供す
るものである。

かかる融合生成物の価値ある使用の一つはアルブミン結
合性部分に融合されたタンパク質が酵素である場合に得
られる。かかる場合融合生成物のＩ（ＳＡ結合活性がＩ
ＳＡを結合され、ている担体物質への酵素の固定に利用
される。かかる酵素リアクター系によりいくつかの利点
が得られる。酵素はＨ８Ａ結合を介して担体に結合され
るので、すべての酵素分子が正確に同じ方法で担体に結
合され、従ってその最大活性が得られよう。酵素活性が
許容できない低レベルまで減少した場合は、かかる系は
ｐＨ変化例えばｐＨを低下させることにより担体から酵
素を慣用的に脱着させそして次に活性酵素を含有する融
合生成物をこれに結合させることにより容易に再生され
うる。問題の融合酵素をＨＢｋ結合担体に結合または吸
着させることは適当に予め処理された細胞または細胞培
地から直接に行うことができるし、または他のＩＳＡ結
合吸着剤に吸着および脱着させたのち精製された状態で
行うこともできる。

かかる融合タンパク質のもう一つの価値−ある用途は１
ＩｓＡのような診断テストに使用される抗原の固定化、
特に該抗原に対する特異的な抗体の存在および／または
量を測定するためのアッセイに用いられる。本発明を用
いることにより、アルブミン結合性部分に融合されたは
プチドまたはタンパク質からなる抗原がＩＳＡ・で被覆
された表面に固定される。次にその抗原部分に対する特
異的な抗体の量が標識されたタン、Ｊり質Ａまたは抗−
抗体が関与する知られた方法により分析されうる。ぼプ
チドまたはタンパク質抗原をかかる融合タンパク質を利
用して固定化することによりいくつかの利点が得られる
。すべての分子が同じ方法で結合され、そして固定化操
作に先立ち何ら融合タンパク質を精製する必要がないこ
とで、何故ならアルブミン結合性部分を有しないタンパ
ク質は洗去されうるからである。さらに、この固定化は
何ら化学的結合を必要とけずそして抗原−固形支持体系
は単にｐＨを低下させて結合された融合タンパク質を表
面１　ｄ　Ｈ８Ａから脱着させるのみで再生されうる。

かかる融合タン７ぐり質のさらにもう一つの価値ある用
途は、アルブミン結合性部分に融合されたペプチドまた
はタンパク質リガンドを固定させる本発明を用いてＨ８
Ａマトリックスをより特異的なアフイニテイマトリック
スに変換することである。かかる方法においそは、Ｈ８
ＡｊＪシムはヒトまたは動物血清からの抗原に対する特
異的な抗体を精製するのに使用されうる。このことは特
異的な抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体を濃縮または排除する必要がある場合に有利
である。後者は生物学的１ｃ！要なタンパク質に対する
自己抗体を有する患者の体外療法ｋｉｉ要でありうる。

融合されたタンパク質またはポリペプチドのアルブミン
結合性タンノク質部分はある条件下で開裂させることが
でき、それたより純粋な所望のタンパク質またはポリペ
プチドが得られる。

それゆえ本発明のもう一つの目的は、適合しうる宿主を
前記ベクターで形質転換し、該宿主を栄養培地中で培養
し、該融合タンパク質またはポリペプチドをＨ８Ａ支持
支持へのその選択的結合により細胞培養物から単離し、
そして担体に結合された融合生成物から直接釦かまたは
これを担体から脱着させたのち該融合タンパク質または
ポリペプチドのアルブミン結合性部分から所望のタンパ
ク質またはポリにプチドを開裂させる工程からなる、高
純度の所望のタンノック質またはポリペプチドの製法を
提供することである。

融合タンパク質またはポリペプチドを開裂させうるに必
要な条件は、もちろん、適当な手段により認識され開裂
されつる独特の開裂部位をそのものが有していることで
ある。かかる開裂部位は化学的または酵素的手段により
認識されうるものでかつ生産される融合生成物のそれぞ
れ所望のタンパク質またはポリペプチドとアルブミン結
合性部分との間に位置するものである独特のアミノ酸配
列であることができる。かかる特異的なアミノ酸配列は
所望のタンパク質またはポリにプチド内に存在してはな
らず、そして好ましくは融合生成物の結合性部分中に存
在してはならない。酵素性試薬の例には、プロテアーゼ
例えば第Ｘａ因子（これはある場合にはアミノ酸配列Ｎ
Ｈｚ−Ｉｔｅ−Ｇｔｕ−Ｇｔｙ−Ａｒｇ−ＣＯＯＨを認
識する）；キモシン（レンニン）（これはＭｅｔ−Ｐｈ
、ｅ結合を開裂させる）；カリクレインＢ（これはＸ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｙ中のＡｒｇのカルボキシル側を開裂
させる）；エンテロキナーゼ（これは配列Ｘ−（Ａｓｐ
）ｎ−Ｌｙｓ−Ｙ　（式中ｎ　＝　２〜４である）を認
識しそしてＬｙｅのカルボキシル側でこれを開裂させる
）；トロンビン（これは特定のアルギニル結合で開裂さ
せる）があげられる。化学的試薬の例には、臭化シアン
（ＣＮＢｒ　’）　（これはＭｅｔのあとを開裂させる
）：ヒドロキシルアミン（これはＡｓｎ−ＧＡｙ結合を
開裂させる）；蟻酸（これは高濃度（〜７０チ）でＡｓ
ｐ−Ｐｒｏを特異的に開裂させる）があげられる。

前記のことから判るとおり、本発明の決定的に重要な部
分とは、本発明の融合タンパク質またはポリペプチドを
コードする結合された遺伝子を含有しておりそして宿主
細胞を形質転換させてそれを発現させ融合生成物を産生
させうるちのである組み換えＤＮＡ構造物またははフタ
−を提供することである。本発明はいかにしてそれが得
られたかに関係なく例えば画業上よく知られた種々の制
限酵素による切断、連結、形質転換および選別技術を用
いて得られたすべてのかかるベクターならびに任意の適
当なベクター物質および宿主細菌を包含するものである
。従って所望のタンパク質またはポリにプチドをコード
するＤＮＡ配列が適当なベクター中に挿入されそして次
にアルブミン結合性部分をコーディングするＤＮＡ配列
が挿入されるかまたはその逆であることもできる。ある
いは２種のＤＮＡ配列がベクターに同時に導入されても
よい。それぞれのＤＮＡ配列の一部分をはフタ−中に挿
入することもできる。さらに２４３１のＤＮＡ配列はア
ルブミン結合性をコードする配列または所望のタン／４
り質もしくはポリペプチドをコードする配列のいずれか
を、結合された遺伝子の５′−末端すなわち開始部分に
配置することができる。適当な制限部位の具備を含め正
確な読み枠を保持してかかる挿入および組み合せを達成
するための特殊な技術それ自体は画業上よく知られてい
る。

本発明はまた前記組み換えＤＮＡ配列を包含し、そして
その６′−末端で生＊ｉ伝子がＤＮＡレベルで融合され
た組み換えＤＮＡ分子にも関する。この配ｆｌｌＫより
かかる分子は融合タンパク質を適当な宿主中で発現する
能力を得る。かかる生産遺伝子はソマトメジンのそれで
あることができる。例をあげれば、生長ホルモンまたは
因子例えばｈＧＩＥ！　（ヒト生長ホルモン）、工ＧＦ
　−Ｉ　、ＩＧＦ−■、ＮＧＦ　（神経生長因子）、Ｅ
ＧＦ　（表皮生長因子）およびＰＤＧＦ　（血小板由来
性因子）である。生産遺伝子はまたインターフェロン、
インターロイキン−２、インシュリン、二二一ロぼプチ
ト、胃腸はプチド、組織プラスミノーゲン活性化因子（
ｔＰＡ）およびそれらの活性誘導体等をコードするもの
であることもできる。生産遺伝子はまた酵素またはその
一部分の構造遺伝子をコードするものであることもでき
る。

本発明はさらに１前記定義された組み換えＤＮＡ分子に
より生物学的系中において発現された融合タンパク質を
開裂させる方法をも提供することである。

終りに１本発明は前記組み換えＤＮＡ分子を含有するプ
ラスミドベクターにも関する。本発明はまた前記定義さ
れた組み換えＤＮＡ分子を宿している細菌細胞にも関す
る。この分子は細菌細胞の染色体中に挿入されうるが、
プラスミドベクター中に包含されることもできる。

宿主細胞は例えばダラム陰性細菌でありそして特に大腸
菌（Ｌ　ｏｏｌｉ　）があげられる。

本発明を添付図面を参照して後記非限定的実施例により
さらに説明する。

第１図はストレプトコッカスタンパク質Ｇｉｌ伝子（Ｇ
）およびこの遺伝子の７ラグメントを含有する構成物の
概略図である。

第２図はプラスミドｐＥＧ　（第１図Ｂ）を含有する大
腸菌細胞の増殖培地をゲル電気泳動により分析した結果
を示す写真である。レーン１は清澄化した増殖培地から
の総タンパク質、レーン２はＩｇＧ−アフイニテイによ
り精製したタンパク質そしてレーン６はＨ８Ａ−アフイ
ニテイにより精製したタンノξり質を示す。

第３図は２種のサブクローンされたフラグメントから発
現されたフラグメントのＩｇＧ−結合およびＨ８Ａ−結
合をゲル電気泳動により分析した結果を示す写真である
。

異なる構成分を含有する大腸菌細胞からの増殖培地をＨ
８Ａ−またはＩｇＧ−セファロース上で精製した。溶離
されたタンパク質を凍結乾燥しそして５Ｄ８−ＰＡＧＥ
で分析した。

Ａ：ｐＢＩＢ２（第１図Ｄ）を含有する細胞。レーン１
はＩｇＧ−アフイニテイにより精製したタンパク質（注
：工ｇＧ１７）Ｌ−沼およびＨ−鎖）、レーン２はＨ８
Ａ−アフイニテイにより精製したタンパク質を示す。

Ｂ：　Ｉ）Ｃ２Ｃ！＋（第１図Ａ）を含有する細胞。レ
ーン１はＩｇＧ−アフイニテイにより精製したタンパク
質を、そしてレーン２はＨ８Ａ−アフイニテイにより精
製したタンパク質を示す。

第４図はプラスミドｐＺＺＢＩＢ２　（第１図Ｅ）を含
有する細胞の増殖培地からＨ８Ａ−アフイニテイにより
精製された物質をゲル電気泳動により分析した結果を示
す写真である。

第５図は大腸菌株ｐＡ８Ｐ　（レーン１）およびｐＮＰ
−１（レーン２）の浸透ショックにより得られ、それぞ
れイオン交換クロマトグラフィーおよびＨ８Ａ−アフイ
ニテイクロマトグラフイーにより精製された物質をケ゛
ル電気泳動により分析した結果を示す写真である。

第６図は還元条件下での１３チポリアクリルアミドゲル
上における融合タンパク質の８Ｄ８／ＰＡＧＥ分析を示
す写真である。レーン１はｐＢＩＢ２Ｍ１を宿す大腸菌
細胞の総ペリプラズム内容物、レーン２はＨ８Ａ−セフ
ァロースで７フイニテイ精製されたＢＢ−Ｍ　１タンツ
ク質、レーン３はｐｇＺＺＭｌを宿す大腸菌細胞のｍ−
：ｖゾラズム内容物、レーン４は工ｇＧ−セファ四−ス
でアフイテイ精製されたＺＺ　−Ｍ　１タンノ（り質を
示す。数字はおよその分子量（ｋＤａ　）を示す。

第７図はＨ８Ａで液域されたマイクロタイターウェルに
結合された融合タンパク質ＢＢ−Ｍ１のＥＬＩＳＡにお
ける力価を示す（旧印）。マイクロタイタープレートを
ＣＦＡ中の融合タンパク質ＺＺ−Ｍ１で免疫したウサギ
からの抗血清を１：２０００に希釈したものとインキュ
イージョンした。値はＢＢ−Ｍｌのタンツク質Ｇ由来部
分を含有する血清の反応性（ＯＤ１α０２２〜α０８８
）を差し引くことにより減少された。

第８図はＣＦＡ中（■印）またはアジュバントなしく・
印）の融合タン／ぐり質ＺＺ−Ｍ１で免疫したウサギか
らの抗血清の融合タンパク質ＢＢ−Ｍ１との反応性をＥ
ＬＩＳＡにおいて示す。値はＢＢ−Ｍｌのタンパク質Ｇ
由来部分を含有する血清の反応性（ＯＤ、　０．０１１
〜０．１５８）を差し引くことＫより低下された。吸光
度＞　０．１　＝ｍ性。

第９図はＣＦＡ中のＺＺ−Ｍｌで免疫したウサギからの
抗血清のＢＢ−Ｍｌでのアフイニテイ精製結果を示す。

適用されたＩｇＧフラクション（ＩＩｈ印）、フロース
ルーフラクション（ム印）モしてα２Ｍグリシン緩衝液
で溶離したフラクション（ｗＩ印）のＢＢ−Ｍｌとの反
応性をＥＩ、　Ｉ　ＳＡにより示す。フラクションは精
製工程により惹起される希釈に関し、はぼ等しい容量に
調聾された。

第１０図は二発現系の基本的概念を示すダイヤグラムで
ある。ｚｚは８ｐＡに由来するＩｇＧ結合性領域、ＢＢ
はストレプトコッカスタンパク質Ｇからの血清アルブミ
ン結合性ドメイン、Ｐは免疫原性ペプチド、モしてＨ８
Ａはヒト血清アルブミンを示す。

本発明の詳しい態様を以下に述べる。

出発物質 Ｅ、　ｏｏｌｉ　ＲＲＩ　ｄｅｌ　Ｍｌ５　（Ｌａｎｇ
ｅｙ他、Ｐｒｏｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｏａｄ、　８ｃｉ
、、　ＵＳＡ　、　７２．１２５４〜１２５７（１９７
５））が実施例で用いられた。用いられたクローニング
ベクターはｐＵＣ８（ＶｉｅｒａおよびＭｅｓｓｉｇ、
　Ｇｏｎｏ、　１９．２５９〜２６Ｂ　（１９８２）　
）、ｐＥＺＺ　８（Ｌｏｗｅｎａｄｌｅｒ他、Ｇｏｎｅ
５８．８７〜９７（１９８７））、ｐＥＭＢＬ８−　（
Ｄｅｎｔｓ他、Ｎｕｏｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１
１．１６４５〜５３、（１９８５））、ｐＡｓＰ　［Ａ
ｂｒａｈｍｓｅｎ他、ＥＭＢＯＪ、　４．３９０１〜３
９０６（１９８５））、ｐＣＨ３９（Ｈｏｆｆｍａｎお
よびｆｒｉｇｈｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｏｉ、　。

ＵＳＡ、８２．５１０７〜５１１１（１９８５））およ
びＭｌ　５ｍｐ　１８　（Ｐｈａｒｍａｏｉａ社から市
販、Ｕｐｐｓａｌａ　ｓスウェーデン）である。すべて
の菌株およびベクターはスウェーデン国、ストックホル
ムのＲｏｙａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈ
ｎ、ｏｌｏｇｙ　、生化学部門で入手できる。プラスミ
ドベクターｐＮＰ　−１は西ドイツ微生物収集機関（Ｄ
ＳＭ）に寄託番号Ｄ８Ｍ−４３８６の下１９８８年２月
３日に寄託されている。

緩衝液および培地 ＰＢＳＴ　：　８．０９　ＮａＣｚＳＯ，２９ＫＴ１２
ＰＯａ、２．９９　Ｎａ２ＨＦＯａＸ　１０Ｈ２Ｏ％　
０．２りＫＣＬｓ　０．２ｄ　Ｔｗｅｅｎ■２０および
α２りＮａＮ　ｓに蒸留水を加えて１ｔとなした（ｐＨ
７，４）。

ＴＳＢ：３［１のトリプシン大豆プロスを１ｔとなしそ
してオートクレーブした。

ＴＳＴ：ＴＲＩＳ（２５ｍＭ）およびこれにＨＣ’ｔを
加えてｐＨ７，４となし、２００ｍＭ　ＮａＣｔ、　０
．０５％Ｔｗｅｅｎ■２０を加えたもの。

ルーチン法 分子生物学にルーチンに用いられる方法は記載されない
（例えば市販の制限酵素、ＤＮＡ連結、Ｂａｔ３１　エ
キソヌクレアーゼ、ＳＩヌクレアーゼおよびフレノウポ
リメラーゼ、大腸菌の形質転換およびプラスミドＤＮＡ
の単離）。

Ｎｏ５ｓａｌおよびＨｅｐｐｅｌのＪ、　ｏｆ　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｗ、。

２４４巻（／１１３）％　３０５５〜３０６２頁（１９
６６）Ｋ記載される浸透ショック法とは、細胞を０．１
ｍＭＥＤＴＡを含有する２０％スクロースに露出させ、
次に冷５・１０　　Ｍ　ＭｇＣｌ２中に分散させるとば
りプラズム内容吻が放出されるものである。

ＰＨＡ８’Ｉ’システム（Ｐｈａｒｍａｏｉａ社、Ｕｐ
ｐｓａｌａ　。

スウェーデン）を用いる８Ｄ８−ＰＡＧＥによりタンパ
ク質フラクションを分析するために、試料を負荷緩［ｒ
／＆［：２．５チＳＤＳ、　５　％ジチオトレイトール
（ＤＴＴ）オヨヒα０１％ブロムフェノールブルー〕中
に溶解させた。５％ＳＤＳ含有グラジェント（８〜２５
チ）ポリアクリルアミドゲルを１０ｍＡで３０分間操作
しそして次にクマシープルーで染色した。

実施例　１ ストレプトコッカスタンパク質Ｇのアルブミン結合性フ
ラグメントのクローニングおよび発現０１ｓｓｏｎ他（
Ｅｔｔｒ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６８　
：　３１９−３２４（１９８７））　　Ｋよシ記載され
るストレプトコッカス株０１４８からのタンパク質Ｇを
コードする遺伝子の概略を第１図Ｃに示す。遺伝子の一
部分ずつをコードする異なる遺伝子７ラグメントが第１
図Ａ、ＢおよびＤＫ概略が示される３種の構成物を組み
立てるのに用いられた。これら構成物の作製を以下に記
載する。

タンパク質Ｇからの３種の１ｇＧ結合性領域のコーディ
ング配列は遺伝子のＴｈａＩ−ＢｓｔＮＩ　７ラグメン
ト内のヌクレオチド１．０２１と１．８５２の間に含有
される（Ｏ１ｓｓｏｎ他、（１９８７）　Ｅｕｒ、　Ｊ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１６８：１１９−３２４）ｏこのＴｈａＩ部位を合成オ
リゴヌクレオチドＢａｍＨＩ−リンカ−（５’−ＣＧＧ
ＡＴＣＣＧ−３′）を連結することによＦ＞　ＢａｍＨ
１部位に変換しそしてＢｓ　ｔＮＩ切断面は付着末端を
充填するためにクレノウボリメラーゼを用いてプラント
末端となした。次にこの７ラグメントをｐＴＺｌ　８Ｒ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）　　のマルチリ
ンカ−中にクローンした。このベクターをはじめＫＸｂ
ａＩ　　で開裂させ次にクレノウボリメラーゼ処理して
付着末端を充填し続いてＢａｍＨＩで消化した。生成す
るプラスミドはｐＵＧ２６と呼ばれる。β−ガラクトシ
ダー七遺伝子中への読み進みを阻止するために翻訳停止
を付与する合成オリゴヌクレオチドをＰｓｔＩ部位中に
クローンした。タンパク質Ｇ遺伝子は２個のＰｓｔ工部
位を含有するので、下記概要で操作が行われた。プラス
ミドｐＴＺ１８ＲをＰｓｔＩで開裂させ、Ｔ４ポリメラ
ーゼで処理してプラント末端を生成させそして普遍翻訳
リンカ−ＵＴＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　スウェーデン
）に連結させた。この構成物をＥｃ　ｏ　ＲＩおよびＳ
ａｌ工で消化し、そしてｐＵＧ２（Ｓから＊＃された８
６０塩基対Ｅｃ　ｏ　ＲＩ−８ａｌＩフラグメントに連
結させてプラスミドｐＵＧ２７を生成させた。ｐＵＧ２
７からのＢａｍＨＩ−Ｈ１ｎｄ■７ラグメントをｐＥＺ
Ｚ８に挿入してタンパク質Ａに基づく２個の合成ＩｇＧ
結合性ドメインへの読み枠内融合を有するプラスミドｐ
ｌＺＧを生成させた。この２個のＺＺ７ラグメントをＡ
ｃｃＩ　　での開裂および再連結によシ除去した。得ら
れたプラスミドを分析すると０１およびｃ２領域の間で
相同組み換えが起ったことが判った。これによりタンパ
ク質Ｇ遺伝子の工ｇＧ結合性ドメインＣ１およびＣ６に
読み枠内で融合されたタン、Ｊり質Ａシグナルペプチド
を有するプラスミドｐＥ（）が得られた。この先端が欠
けたレセプターを第１図Ｂに略示する。

プラスミドｐＵＧ２７をＨｉｎｄＩＩＩおよび部分的に
Ｃ１ａ工で消化して領域Ｃ２およびＣ３をコードする遺
伝子７ラグメントをアガロースゲルで精製した。この７
−）グメントをプラスミドｐＵＣ８中Ａｃｃ　ＩとＨｉ
ｎｄｌｌＪとの間にサブクローンした。

ｐＵＣ８のｍｐ８マルチリンカ−中のＡｃｃＩ部位に近
接したＥｃｏＲＩ部位、およびＨ１ｎｄｍ部位を用いる
ことによシ、同じフラグメントな切シ出した。

これをｐＥＧの予めＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｍで消化
し精製したベクター７２グメント中に挿入して第１図Ａ
に示されるベクターｐｃ２ｃ３を生成させた。

ＡＢ領領域サブクローンするには、プラスミドｐｓＰＧ
２　（Ｇｕｓｓ他、１９８（Ｓ）をＥｃ　ｏ　ＲＩで消
化し、次にクレノウポリメラー七で処理して付着末端を
充填した。合成且江ニーリンカ−（ＧＧＴＣ（）ＡＣＣ
。

Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を連結によシ付
加した。

８ａｌＩおよびＰｓｔＩで消化すると６４０ｂｐフラグ
メントが放出され、これをアガロースゲルから単離しそ
して正の選択ベクターｐＫＭＢＬ８−中の同じ部位間に
挿入した。このプラスミドから両方の挿入部位に近接し
た。Ｅｃ　ｏ　ＲＩ部位およびＨｉｎｄｍ部位を用いて
タン／ξり質（）Ｊ伝子７ラグメントを切シ出し、そし
て前記のようにしてｐＥＧのベクター７ラグメント中に
挿入した。得られるベクターｐＢＩＢ２　（第１図Ｄ）
はＳＰＡの制御配列が先にあシ、領域Ｅの最後の６残基
から領域Ｃ１の初めの２４残基までのタンパク質Ｇの一
部分をコードする。

アフイニテイクロマトグラフイーには、■ｇＧ−セファ
ロースはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ＊　Ｓｗ
ｅｄｅｎ）から得られそしてｌ５Ａ−セファロースは精
製Ｈ８Ａ（Ｋａｂｉ−’Ｖｉｔｒｕｍ、　Ｓｔｏｃｋｈ
ｏ１ｍ＊　Ｓｗｅｄｅｎ）をＡｘｅｎ他の（１９６７）
　Ｎａｔｕｒｅ　２１４，１３０２−１３０４　　に記
載されるようにしてＣＮＢｒによシ活性化されたセファ
ロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ＊Ｓｗｅ
ｄｅｎ）　　Ｋ結合させることによ、ｂａｌ！１ｍされ
た。Ｈ８Ａ−およびＩｇＧ−セファロースはゲル約４−
ずつでカラムに押し込まれた。この方ラムをＰＢＳＴ−
ｍ　衝液で平衡化した。

プラスミドｐＥＧ　、　ｐＣ２Ｃ３およびｐＢＩ　Ｂ２
をそれぞれ含有する大腸菌株をＴ８Ｂ２００ｄ＋アンピ
シリン（７０１９／Ｉｔ）中６７℃で一夜二通シすつ培
養した。

細胞を６０００Ｘ、９で１０分間遠心分離することによ
り　ｏレッドとなしそして２通シの上清をそれぞれＩｇ
Ｇ−およびＨ８Ａ−カラムに直接負荷した。

次にカラムをカラム客層の１０倍のＰＢＳＴ緩衝液およ
び１容緻の５ｍＭ　ＮＨ４ＡＣ（ＰＨ５，５）で洗った
。

この後者は緩衝液容はを低下させて効率的な溶離を行え
るようにするためである。０．５Ｍ　ＨＡｃ（ｐｉ４２
．８）を用いて溶離し、１−ずつの７ラクシヨンを集め
た。２８０　ｎｍでのＯＤを測定し、そして関連する７
ラクシヨン（６および４）を集め、プールしそして凍結
乾燥した。

凍結乾燥後、種々の７ラクシヨンを負荷緩衝液（２，５
％ＳＤＳ、　　５％ジテオトレイトール〔ＤＴＴ、１お
よび０．０１％ブロムフェノールブルー）中に溶解させ
そして提供者によシ記載されるようにして５％ドデシル
硫酸ナトリウムを含有するグラジェント（８〜２５％）
ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）での７ア
スト（ｐｈａｓｔ）電気泳動（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＊Ｕ
ｐｐｓａｌａ、スウェーデン）により分析した。

ｐＥＧを含有する大腸菌株に関しては、タンパク質を精
製する前後にＳＤＳ　−ＰＡＧＥによシ分析した。

第２図に示されるように、組み候えＳＰＧは細胞外タン
パク質の５０％以上を構成する（レーン１）ｏ　工ｇＧ
−セファロース（レーン２）またはＨ８Ａ−セファロー
ス（レーン３）でのアフイニテイクロマトグラフイーに
よシ分解が１０％未満の純粋な組み換えタンパク質が高
収量で得られた。先端が欠けた８ＰＧは異常な移動率を
示して見かけの寸法的５３　ｋＤａを生ずることに留意
すべきであシ、これは塩基配列から予測される２　２　
ｋＤａよシかなシ大きい。これは早期の観察によるもの
である（Ｇｕｓｓ他、１９８６）。

ｐＣ２Ｃ５およびｐＢＩ　Ｂ２を含有する大Ｍ菌株に関
しては、アフイニテイにより精製された物質の電気泳動
の結果を第３図に示す。＠６図ＡはｐＢ１Ｂ２によシコ
ードされる５　０．５　ｋＤａタンパク質がＩｇＧ−セ
ファロース（レーン１）には結合しないが、Ｈ８Ａ（レ
ーン２）には効果的に結合されることを示している。こ
れと対照的に、ｐＣ２Ｃ３によシコードされる１７．２
ｋＤａタンパク質はＩｇＧ−セ７アロースには結合する
がＨ８Ａ−セファロースには結合しない（第６図Ｂ１　
レーン１および２）。

これらの結果はタンパク質Ｇの２つのレセプター活性が
異なる一次構造部分と関連しておシそして機能的に独立
していることを例証している。アルブミン結合活性を受
は持つ部分は２回反復する相同領域Ｂの両側に領域Ａが
配置されたもの、すなわちＡ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ　（第１
図Ｃ）から成っている。この部分の最後の６４アミノ酸
は構成物の一つｐＥＧによりコードされるアルブミン結
合性タンパク質に包含される、すなわち最後のＢ領域の
大部分および最後のＡ領域の全部である。それゆえ、天
然のタンパク質Ｇの比較的小さな７ラグメントでＨ８Ａ
−結合に充分である。

実施例　２ アルブミン結合活性を用いる融合タンパク質の精製 発現ベクターｐＨ１ＸｚＺＴ３０８はベクターｐＥＺＺ
８　　のＨｌｎｄＩＩＩおよびＣ１ａ工の間にｔｒｐＴ
に基づく合成的な翻訳および転写停止リンカ−（５’　
−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＴＡＡＧＴＡＡＧＣＣＧＣＣＡＧ
ＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣ）Ａ
ＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴ−３’　ｌ　ＫａｂｉＧｅｎ　Ａ
Ｂｔ　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を挿入する
ことによシ作製された。ｐＺＺＢＩ　Ｂ２を得るには、
ｐＢＩＢ２からのＥｃ　ＯＲＩ　−Ｈｉ　ｎｄ　ｍ　７
ラグメントを同じ酵素で予め消化されたこのベクター中
に挿入した。このプラスミドは第１図ＥＩＣａｌ１５示
されるようにＳＰＡプロモーターおよびシグナルｏ、ｐ
チドが上流にあるスタフィロコッカスタンパク質Ａ　（
Ｎｉｌｓｓｏｎ他、１９８７　ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ、１０７−１１５　）に由来する２２と
ＳＰＧのＡＢ領領域の融合タンパク質をコードする。

ｐＺＺＢＩ　Ｂ２を含有する大腸菌株なＴ８Ｂ２００ｍ
＋アンピシリン（７０１Ｒ９／／）中３７°Ｃで一夜培
養し、培養物を収穫しそして細胞を６０００ｇで１０分
間遠心分離することによシ清澄化した。

この清澄化された培地を前記のようにしてＨ８Ａ−セフ
ァロースによシアフイニテイ精製しそして溶離された物
質をＰＨＡ８Ｔ電気泳動によシ分析した。第４図に示さ
れるように、３８．７ｋＤａの融合タンパク質はどちら
のカラムからも結合および溶離することかできた。

これらの結果は、異種構造タンパク質（２２）はタンパ
ク質Ｇのアルブミン結合性部分ＢＩ　Ｂ２に融合された
場合にアルブミンに結合しそしてＨ８Ａ−７フイニテイ
クロマトグラフイーによシ精製されうることを証明して
いる。

実施例　６ アルブミン結合活性を用いる融合タンパク質の固定およ
び精製 プラスミドｐＢＩ　Ｂ２を制限酵Ｘ　ＥＣ０ＲＩおよび
５ａｌＩで消化し、フレノウポリメラーゼで処理しそし
て再連結してｐＢＩＢ２　ＦＶＳを生成させた。予めＰ
ｓｔＩおよびＨｌｎｄ　ｍで開裂させた１）ＢＩＢ２　
Ｒ／Ｓ中に合成オリゴヌクレオチド（ＴＧＣＡＡＧＡＴ
ＣＴＴＴＣＡＡＴＴＴＣＣＣＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＡＡ
ＴＴＣＴＡＡＧＣＴＴおよびその相補性配列）を挿入し
てＰｓｔＩ抵抗性プラスミドｐＢＩ　Ｂ２ＨＩＶを生成
させた。Ｍｌ　３ｍｐ１８に由来する多目的クローニン
グリンカ−をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ［１制限部位間
にクローン化すると、すぐ下流に位置するＬａｃＺ’７
伝子が発現された。生成するプラスミドはｐＢＩ　Ｂ２
ＨＩＶｍｐ１８と呼ばれた。

アルカリホスファターゼをツートスる遺伝子をアルブミ
ン結合性タンパク質をコードする配列に融合させるには
、プラスミドｐＣＨ３９を遺伝子源として用いた。Ｐｓ
ｔｌで開裂させると、予めＰｓｔｒで消化されたｐ　Ｂ
Ｉ　Ｂ２ＨＩＶｍｐ１８　ヘの読み枠内融合に適合する
、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を含有す
る３　ｋｂｐ　７９グメントが放出された。連結期間中
にｐｃＨ３９の残余もトリプル連結で組み込まれて所望
の融合の他に、アンピシリンに対するのみならずテトラ
サイクリンに対する抵抗性をもコードするプラスミドが
得られた。ｐＮＰ−１で示されるこの構成物を含有する
大腸菌細胞のサンプルはＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ−４３
８６の下に寄託されている。

分泌されるアルカリホスファターゼをコードするプラス
ミドｐＡｓＰを含有する大腸菌が対照として用いられた
。それぞれｐＮＰ−１およびｐＡｓＰを含有する大腸菌
株を、染色体アルカリホスファターゼ遺伝子を抑制する
ためにアンピシリン（７０＃／Ｊ）および０．９％ＫＨ
２ＰＯ４を補添シタＴＳＢ　２００蛇中で別々に培養し
た。細胞周辺腔に局在するタンパク質を知られた技法に
よる浸透ショック法を用いて放出させた。

この操作によシ放出されたアルカリホスファターゼ活性
を提供イにより記載されるようにしてｐ−二トロフェニ
ルホスフエート（Ｓ　１　ｇｍａ１０４−０）とインキ
ュベートすることによシ２種のサンプルについて測定し
た。酵素活性によシ基質が加水分解されてｐ−ニトロフ
ェノールが放出されそれが４１０ｎｍでの吸光度変化と
して測定されつる。活性の単位は一夜培養物１−に相当
するサンプル世に関する１分当シの４１０ｎｍでの吸光
度変化％として定義された。

融合タンパク質がＨ８Ａ含有マトリックスに選択的に固
定されうるか否かを判定するために以下のテストが行わ
れた。２棟の菌株の浸透ショック法によシ得られた物質
３４ずつをＴＳＴ　０．５−およびＨ８Ａ−七７アロー
ス５０μノと室温で３０分間別々に混合した。ｉｏ、ｏ
ｏｏｇで１分間遠心分離したのち、上清中のホスヘート
活性を測定した。ゲルをＴＳＴ　１　ｍｊで２回洗いそ
してゲルに結合された活性を前記のようにして測定した
。

その結果を下記第１表に示す。

ｐＡｓＰ　　　　　２．７４　　　１００　　　　　＜
０．１ｐＮＰ−１１，１４６４３に の表において「合計」とは浸透ショック法により放出さ
れた活性を示す。この結果は、ｐＡＳＰ　（対照）を含
有する細胞からのアルカリホス７アターセはＨ８Ａ−セ
ファロースに結合しないことを示している。反対に、ｐ
ＮＰ−１によυコードされるアルカリホスファターセ融
合タンパク質の大きな部分がＨ８Ａ−マトリックスに結
合する。このことはアルブミン結合性ドメインが完全無
欠な酵素活性を保有したまま異イ、！ｌ！構造のタンパ
ク質を固定するのに使用されうることを示している。

２種の大腸菌株から浸透ショック法によシ得られた物質
を実施例１に記載されるようにしてＨ８Ａ−セファロー
スクロマトグラフィーによシ別々にアフイニテイ精製し
た。ｐＡｓＦ　（対照）を含有する大腸菌株からの前記
０１Ｊプラズム７ラクシヨンを用い、溶離された物質を
２８０　ｎｍでの吸光度によシ測定しても何らのタンパ
ク物質もカラムに結合されなかった。これと反対にｐＮ
Ｐ−１株から生成されたタンパク質は結合され、このも
のは低−で溶離できた。この物質の玉■電気泳動による
分析を第５図レーン２に示す。

それＫよれば、予想される寸法（７１ｋＤａ　）を有す
る主要な結合が、標準操作に記載されるようにしてイオ
ン交換およびゲルー過によシ精製された天然のアルカリ
ホス７アターセ（レーン１）よシわずかに大きいことが
示された。

これらの結果により、タンパク質ＧからのＢＩ　Ｂ２ア
ル゛プミン結合性７ラグメントに融合された活性酵素か
らなるタンパク質がＨ３Ａ−セファロースによシ固定お
よび精製されうろことが証明される。

実施例　４ プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原Ｐｆ１５５／　ＲＥＳＡ
ｌの反復配列に対する抗体の生成、分析およびｌＲ裂に
関する二発現系 プラスモジウム・７アルシパルムメロゾイト抗原Ｐｆ１
５５／　ＲＥＳＡのＣ−末端オクタはプチド反僕ＥＥＮ
ＶＥＨＤＡの四慮体をコードする合成遺伝子フラグメン
トを発現ベクターｐＡＴＨ１１（ＡｓｌｕｎｄＬ、ｔ　
　８ｊ５１ａｎｄｅｒ　Ａ、、Ｗａｈｌｇｒｅｎ　Ｍ、
、Ｗａｈｌｉｎ　Ｂ、ＩＲｕａｎｇｊｉｒａｃｈｕｐｏ
ｒｎ　Ｗ、、　Ｂｅｒｚｉｎｓ　Ｋ、＋　Ｗｉｇｚｅｌ
ｌＨ，ｐ　Ｐｅｒｌｍａｎｎ　Ｐ、　ａｎｄ　Ｐｅｔｔ
ｅｒｓ　ｓｏｎ　Ｕ、　１９８７　）中に構成物から誘
導した。合成遺伝子構成物はプラスモジウム・ファルシ
パルム抗原Ｐｆ１５５の反復した高度に免疫原性を有す
るエピトープを発現する（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　８ｃｉ、　ＵＳＡ　８４：１３９９）。

この遺伝子７ラグメントを制限酵素ＸｍａＩおよびＨｉ
ｎｄｌｌＩで切シ出し、そして同じ酵素で予め消化した
プラスミドｐＥＺＺＴ３０ｓ　（実施例２記載）中に連
結した。この発現ベクターｐＥＺＺＴ３０８はＳｐＡオ
ペロンの転写、翻訳および分泌シグナルのあとに位置す
る、ＳｐＡ由来の二価合成ｒｇ（）結合性ドメインｔコ
ードする。生成するベクターｐｇＺＺＭＩは二価ＩｇＧ
結合性ドメインおよびオクタペプチド反復からなる融合
タンパク質をコードする。この融合タンパク寅はＺＺ−
Ｍｌと呼ばれた。

ＥＥＮＶＢＨＤＡ反復をコードする遺伝子フラグメント
な制限酵素Ｅｃ　ｏ　Ｒ１およびＨｌｎｄＩＩＩを用い
てプラスミドｐｇＺＺＭＩから切シ出した。同じ酵素を
用いてプラスミドｐＢＩ　Ｂ２ＨＩＶｍｐ１８　（実施
例３記載）を切断し、この中に前記フラグメントを連結
した。

生成するベクターｐＢＩ　Ｂ２Ｍ１はストレプトコッカ
スタンパク質Ｇからのアルブミン結合性領域およびオク
タペプチド反復からなる、ＢＢ−Ｍｌで示される融合タ
ンパク質をコードする。

異なる構成物を宿す大腸菌細胞をアンピシリン（７０Ｆ
＃９／ｌ）を補添したトリプシン大豆プロス（３［１／
Ａ’）５００ゴ中３７°Ｃで一夜増殖させた。

細胞を６０００Ｊｉ’ではレットとなしそしてはリプラ
ズムタンパク質を浸透ショックによシ放出させた。２種
の培養物からの調製物をＩｇＧ−セファロース（Ｐｈａ
ｒｍａｃ　ｉ　ａ　、スウェーデン）またはＨ８Ａ　−
−１＝フアロース（実施例１参照）５ゴのカラムにば接
加えた。

全ペリプラズム含磁を５ＤＳ−ＰＡ（）Ｅにより分析す
ると組み換え生成物が２種の発現系において産生された
主要タンパク質であることが示された（第６図、レーン
１および６）。

ニュージ−２ンド白ウサギをＣＦＡ中のまたはアジュバ
ントなしの融合タンパク質ＺＺ−Ｍ１１００μＩを用い
筋肉免疫した。４１Ｎ１および３０週後に行われるブー
スター注射にはＣＦＡの代ｆｉ　Ｋ　ＩＦＡが用いられ
た。ウサギから第１回の注射３週間後および各ブースタ
ーの１週間後に採血した。第３１Ｍでの採血から得られ
た抗血清が用いられり。工ｇＧヲタンパク質Ａ−セファ
ロースカラム（Ｐｈａｒｍａ、ｃｉａ）で単離した。

ＢＢ−Ｍｌが特異的な抗体を結合する容量をＩＩＬＩ弦
で測定した。ポリスチレンマイクロタイタープレート（
Ｄｙｎａｔｅｃｈ　、　Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ　、　Ｔ
ｈ、米国）をＨ３Ａ　（１０μｍ１７ａｔ）で被覆しそ
してＢＢ−ＭｌをＨ８Ａに３７°Ｃで６時間結合せしめ
た。対照プレートはＢＢ−Ｍｌのタンパク質Ｇ由来部分
で被覆した。

ＰＢＳ中ノ０．５％Ｂ８Ａを用い３７°Ｃで３時間遮断
したのち、この被覆されたプレートを、免疫されたウサ
ギから得られたウサギ抗血清の櫨々の希釈物と３７℃で
１時間インキュベートした。

アルカリホスファターゼと接合された羊抗−クサキＩｇ
Ｇと６７“Ｃで１時間、そしてｐ−二）ロフェニルホス
ヘートと室温で５０分間インキュベートしたのち、生ず
る発色を４０５　ｎｍで記録した。

ＢＢ−Ｍｌの濃度は抗原の抗体結合能力を低下させるこ
となく２００ｎｇ／−まで減少でき、そして反応性の抗
体を検出するにはＢＢ−Ｍｌ　　８　ｎｌ／ｍｅで充分
であった（第７図参照）。

ウサギ抗血清とＥＥＮＶＥＨＤＡ反復との反応性は被覆
抗原としてｔｏｏｏｎｙ−濃度の融合タンパク質ＢＢ−
Ｍ１を用い、ＥＬＩ８Ａで分析した。第８図に示される
ように、ＣＦＡ中またはアジュバントなしのＺＺ−Ｍｌ
で免疫したウサギはこのアッセイにおいてＥＥＮＶＥＨ
ＤＡ　尺復と反応する抗体を産生じた。

固定されたＨ８Ａへの融合タンパク質ＢＢ−Ｍ１の結合
によυハプチド特異的抗体をアフイニテイ精製するため
の効果的なシステムが得られよう。固定されたＨ８Ａは
スは−サーとして機能でき、セしてＢＢ−Ｍｌのタンパ
ク質Ｇ由来する部分に仲介された融合タンパク質の結合
はｍＡ反復の抗体結合能力を冒すべきでない。この前提
を試験するために、精製されたＢＢ−Ｍｌを、ＣＮＢｒ
によシ活性化されたセファロース（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉ
ａ）に結合したＨ３Ａには合させＢＢ−Ｍｌ　　３．に
／１５■アルブミンそしてグルタルアルデヒドによりＨ
８Ａに架橋させた（最終濃度０．５％）。この反応を１
％グリシンの添加によシ停止させた。

ゲルをＰＢＳ　、　０．２Ｍ酢酸（ｐＨ３，３）　、お
よび０．２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２，８）を用い逐次
的に充分に洗った。この操作を用いて、共有結合された
ＢＢ−Ｍｌが高収率で得られた。低−１でよく洗っても
マトリックスからは適用された田−Ｍ１０１５％未満し
か溶離され得なかった。アフイニテイクロマトグラフイ
ーするには、ウサギ血清から単離されたＩｇＧ　７ラク
シヨン２ダをカラムに適用されたパックされたビーズ１
−とインキュベートした。ＰＢＳで充分に洗ったのち、
結合された抗体を０．２Ｍグリシン緩（ｔｉ　Ｗ続いて
３Ｍ　ＫＳＣ’Ｎで溶離した。溶出液の緩衝液を製造者
の教示に従い、ＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
上で０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳに交換した。

ウサギ抗血清からの合計ＩｇＧ、フロースルー７ラクシ
ヨンおよび０．２Ｍグリシン緩衝液で溶離したフラクシ
ョンをＢＢ−Ｍｌとの反応性に関してＥＬＩＳＡで試験
した。第９図には、ＣＦＡ中のＺＺ−Ｍｌで免疫したウ
サギからの血清をアフイニテイ精裂に使用した実験結果
を示す。フロースルー７ラクシヨンには何らＢＢ−Ｍｌ
との抗体反応性は検出されなかった。適用されたＩｇＧ
の０．１％未満しか０．２Ｍグリシン緩衝液で溶離され
なかった（データは示さず）。第６図に示されるように
、ＢＢ−Ｍ１反応性に関する高い収率はグリシンフラク
ション中に回収された。

これらの結果は、ＳＰＧのアルブミン結合性ドメインか
組み換えペプチドを包含する融合タンパク質なＨ８Ａを
含有する固形支持体く特異的に固定するのに用いられう
ることを示している。

この固定されたペプチドはさらにそのペプチドに対する
抗体の分・析および精製にも使用されうる。この実施例
の概念をダイヤグラムで示したものが第１０図である。

【図面の簡単な説明】

第１図はストレプトフッカスタンバク質Ｇ遺伝子（Ｃ）
）およびこの遺伝子の７ラグメントを含有する構成物の
概略図である。 第２図はプラスミドｐＥＧ　（第１図Ｂ）を含有する大
腸菌細胞の増殖培地のゲル電気泳動分析の結果を示す写
真である。レーン１は清澄化した増殖培地からの総タン
パク質、レーン２はＩｇＧ−アフイニテイにより精製し
たタンパク質そしてレーン３はＨ８Ａ−アフイニテイに
よシ精製したタンパク質を示す。 第３図は２棟のサブクローンされたフラグメントから発
現された７ラグメントのＩｇＧ−結合およびＨ８Ａ−結
合のゲル電気泳動による分析を示す写真である。 第４図はシラスミドｐＺＺＢＩＢ２　（第１図Ｅ）を含
有する′ａ胞の増殖培地からの、Ｈ８Ａ−アフイニテイ
によυ精製された物質のゲル電気泳動分析の結果を示す
写真である。 第５図は大腸菌株１）ＡＳＰ　（レーン１）およびｐＮ
Ｐ−１（レーン２）の浸透ショックによシ得られ、それ
ぞれイオン交換クロマトグラフィーおよびＩＳＡ−アフ
イニテイクロマトグラフイーによシ精製された物質のゲ
ル電気泳動分析の結果を示す写真である。 第６図は還元条件下での１３％ポリアクリルアミドゲル
上における融合タンパク質のＳＤＳ　／ＰＡＧＥ分析の
結果を示す写真である。レーン１はｐＢＩ　Ｂ２Ｍ１を
宿す大腸菌細胞の総はリプラズム含量、レーン２はｌ５
Ａ−セファロース上でアフイニテイ精製されたＢＢ−Ｍ
１タンパク質、レーン３はｐＥＺ　ＺＭｌを宿す大腸菌
細胞の総ペリプラズム含鼠、レーン４はＩｇＧ−セファ
ロースでアフイニテイ精製されたＺＺ−Ｍ１タンパク質
を示す。数字はおよその分子量（ｋＤａ　）を示す。 第７図はＩＳＡで被僅されたマイクロタイターウェルに
結合された融合タンパク質ＢＢ−Ｍ１のＥＬＩＳＡにお
ける力価を示す（口部）。 第８図はＣＡ中（■印）またはアジュバントなしく閣印
）の融合タンパク質ＺＺ−Ｍ１で免疫したウサギからの
抗血清の融合タンパク質ＢＢ−Ｍ１との反応性をＥｉ、
ＩＳＡにおいて示す。 第９図はＣＦＡ中のＺＺ−Ｍｌで免疫されたウサギから
の抗血清のＢＢ−Ｍｌでの７フイニテイ精裂結来を示す
。適用されたＩｇＧ　７ラクシヨン（噛印）、フロース
ルー７ラクシヨン（ム印）そして０．２Ｍグリシン緩衝
液で溶離したフラクション（間部）のＥＬＩＳＡにおけ
るＢＢ−Ｍｌとの反応性を示す。 第１０図は二発現系の基本的概念を示すダイヤグラムで
ある。ｚｚはＳｐＡに由来するＩｇＧ結合領域、ＢＢは
ストレプトフッカスタンバク質Ｇからの血清アルブミン
結合性ドメイン、Ｐは免疫原性ペプチド、ＩＳＡはヒト
血清アルブミンを示す。 ４−閤−・ 一自転 ＦＩ（，２ ＩＧ−４ ３Ｑｈ ＩＧ−３ ＦＩ（，５ ２Ｍ３４ ＩＧ−６ ＦＩ（，８ ＦＩ（，７ １：１ １：５ １：２５ １：１２５ 希釈度 ＦＩ（，９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）血清アルブミンに選択的に結合しうる融合タンパク
   質またはポリペプチドを生産させるにあたり、下記工程
   ： ａ）所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする
   第２のＤＮＡ配列に操作的に連結されておりかつ血清ア
   ルブミン結合性ポリペプチドフラグメントをコードする
   第１のＤＮＡ配列を含有する組み換えベクターを作製し
   、 ｂ）前記融合タンパク質またはポリペプチドをコードす
   る合一されたＤＮＡ配列が宿主により発現されうるよう
   な様式で適合しうる宿主を前記組み換えベクターを用い
   て形質転換しそしてこの形質転換された宿主を適当な増
   殖培地中に培養して前記融合タンパク質またはポリペプ
   チドを産生させ、そして ｃ）前記融合タンパク質またはポリペプチドを単離する
   、 ことを特徴とする方法。 ２）工程ｃ）における単離が血清アルブミン結合能力を
   利用することにより行われることを特徴とする請求項１
   記載の方法。 ３）前記タンパク質またはポリペプチドの単離が血清ア
   ルブミンを含有する担体物質への吸着および場合により
   該担体物質からのこのタンパク質またはポリペプチドの
   脱着により行われることを特徴とする請求項２記載の方
   法。 ４）前記第１のＤＮＡ配列がタンパク質Ｇをコードする
   遺伝子に起源するＤＮＡ配列により構成されることを特
   徴とする請求項１、２または３記載の方法。 ５）前記第１のＤＮＡ配列が第１図に示されるセグメン
   トＡｌ、Ｂ１、Ａ２、Ｂ２およびＡ３の少なくとも１つ
   を含有することを特徴とする請求項４記載の方法。 ６）前記第１のＤＮＡ配列が第１図に示されるセグメン
   トＢ２およびＡ３を含有することを特徴とする請求項５
   記載の方法。 ７）担体物質からの融合タンパク質またはポリペプチド
   の脱着がｐＨを例えば約３以下に低下させることにより
   行われることを特徴とする請求項３〜６のいずれかに記
   載の方法。８）所望のタンパク質またはポリペプチドを
   コードする第２のＤＮＡ配列に操作的に連結されており
   かつ血清アルブミン結合性ポリペプチドフラグメントを
   コードする第１のＤＮＡ配列を含有する組み換えベクタ
   ーからなることを特徴とする、微生物中において複製可
   能な組み換えベクター。 ９）前記ＤＮＡ配列の一方が前記融合タンパク質または
   ポリペプチドをコードする結合されたＤＮＡ配列の５′
   −末端から伸びており、前記融合タンパク質をコーディ
   ングする結合配列が好ましくは構造タンパク質Ａをコー
   ドする遺伝子のプロモーターおよびシグナル配列を含有
   することを特徴とする請求項８記載の組み換えベクター
   。 １０）請求項８または９記載の組み換えベクターにより
   形質転換された宿主細菌。 １１）細菌宿主例えばエシエリヒア、バチルスまたはス
   タフイロコツカスの菌株である請求項１０記載の宿主細
   菌。 １２）請求項１〜７のいずれかにより生産された融合タ
   ンパク質またはポリペプチド。