JPS6246160B2 - - Google Patents
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- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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-
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の概要
外質もしくは細胞外の細菌蛋白質に対するポリ
ペプチドもしくはフアージ遺伝子を開裂させ、成
熟核細胞からのたとえばインシユリンのような選
定蛋白質またはその一部についての遺伝情報を伝
える二重鎖DNA配列を組替えDNA技術により開
裂遺伝子中に組み込み、これを使用して細菌を形
質転換させ、分泌された選定蛋白質を回収する。
ペプチドもしくはフアージ遺伝子を開裂させ、成
熟核細胞からのたとえばインシユリンのような選
定蛋白質またはその一部についての遺伝情報を伝
える二重鎖DNA配列を組替えDNA技術により開
裂遺伝子中に組み込み、これを使用して細菌を形
質転換させ、分泌された選定蛋白質を回収する。
この発明はアメリカ合衆国厚生および文部省の
認可補助の下に行なわれた研究の成果である。
認可補助の下に行なわれた研究の成果である。
この発明は、特定の蛋白質を細菌中に生成さ
せ、これを細菌細胞から分泌させる方法に関する
ものであり、さらに詳細には所望の非細菌性蛋白
質またはその一部を再現するDNAを組替え技術
により外質蛋白質もしくは細菌外蛋白質(以後、
「キヤリヤ蛋白質」と云う)に関するプラスミド
もしくはフアージ遺伝子中に組み込み、この組替
えた遺伝子により細菌宿主を形質転換させ、そし
て形質転換された宿主を培養して蛋白質を分泌さ
せる方法に関するものである。このようにして生
成された蛋白質は、キヤリヤ蛋白質遺伝子の選択
に応じて常法により培養基からまたは外質空間か
ら回収することができる。
せ、これを細菌細胞から分泌させる方法に関する
ものであり、さらに詳細には所望の非細菌性蛋白
質またはその一部を再現するDNAを組替え技術
により外質蛋白質もしくは細菌外蛋白質(以後、
「キヤリヤ蛋白質」と云う)に関するプラスミド
もしくはフアージ遺伝子中に組み込み、この組替
えた遺伝子により細菌宿主を形質転換させ、そし
て形質転換された宿主を培養して蛋白質を分泌さ
せる方法に関するものである。このようにして生
成された蛋白質は、キヤリヤ蛋白質遺伝子の選択
に応じて常法により培養基からまたは外質空間か
ら回収することができる。
特定蛋白質を再現するDNAを細胞内蛋白質に
関する遺伝子中に組み込むことは公知である〔イ
タクラ等、サイエンス、第198巻、第1056〜1063
頁(1977)〕。しかしながら、この場合の問題点
は、このようにして作られた蛋白質は他の細胞内
蛋白質と混ざり合い、したがつて細胞内の酵素に
より劣化され、その結果所望の蛋白質生成物を純
粋な形で得る際問題が生ずるということである。
関する遺伝子中に組み込むことは公知である〔イ
タクラ等、サイエンス、第198巻、第1056〜1063
頁(1977)〕。しかしながら、この場合の問題点
は、このようにして作られた蛋白質は他の細胞内
蛋白質と混ざり合い、したがつて細胞内の酵素に
より劣化され、その結果所望の蛋白質生成物を純
粋な形で得る際問題が生ずるということである。
前記の問題点を解消するため、本発明によれば
選定蛋白質またはその一部を再現するDNAを細
菌遺伝子中に組み込むことにより選定蛋白質また
はその一部を製造するに際し、細胞外もしくは外
質のキヤリヤ蛋白質に対する細菌遺伝子を開裂さ
せ、選定蛋白質またはその一部についての遺伝情
報を伝える非細菌性DNA断片を組替え手段によ
り開裂位置に組み込み、組替えられた遺伝子によ
り細菌宿主を形質転換させ、この形質転換された
細菌を培養して選定蛋白質またはその一部を分泌
させることを特徴とする選定蛋白質またはその一
部の製造方法が提供される。
選定蛋白質またはその一部を再現するDNAを細
菌遺伝子中に組み込むことにより選定蛋白質また
はその一部を製造するに際し、細胞外もしくは外
質のキヤリヤ蛋白質に対する細菌遺伝子を開裂さ
せ、選定蛋白質またはその一部についての遺伝情
報を伝える非細菌性DNA断片を組替え手段によ
り開裂位置に組み込み、組替えられた遺伝子によ
り細菌宿主を形質転換させ、この形質転換された
細菌を培養して選定蛋白質またはその一部を分泌
させることを特徴とする選定蛋白質またはその一
部の製造方法が提供される。
実例として、キヤリヤ蛋白質のアミノ酸末端に
疎水性アミノ酸のリーダー配列(leader
sequence)を有しかつ通常キヤリヤ蛋白質を生
成する細胞の膜を通して分泌され、しかもこの分
泌の際に疎水性リーダー配列の開裂を伴なうよう
なこのキヤリヤ蛋白質に関する遺伝子を使用して
選定蛋白質を生成させることができ、この生成蛋
白質をキヤリヤ蛋白質の選択に応じて外質空間
(periplasmic space)から或いは細菌を繁殖さ
せた培養基から回収することができる。このよう
にして、細菌内における他の蛋白質による汚染が
避けられると共に異質蛋白質を劣化させるような
細菌細胞内の酵素を避けることにより大きな安定
性が達成される。
疎水性アミノ酸のリーダー配列(leader
sequence)を有しかつ通常キヤリヤ蛋白質を生
成する細胞の膜を通して分泌され、しかもこの分
泌の際に疎水性リーダー配列の開裂を伴なうよう
なこのキヤリヤ蛋白質に関する遺伝子を使用して
選定蛋白質を生成させることができ、この生成蛋
白質をキヤリヤ蛋白質の選択に応じて外質空間
(periplasmic space)から或いは細菌を繁殖さ
せた培養基から回収することができる。このよう
にして、細菌内における他の蛋白質による汚染が
避けられると共に異質蛋白質を劣化させるような
細菌細胞内の酵素を避けることにより大きな安定
性が達成される。
本発明において使用しうるキヤリヤ蛋白質に関
する細菌切断としては抗性物質耐性に関する遺伝
子、たとえばペニシリン耐性に関する遺伝子すな
わちペニシリナーゼ、クロラムフエニコール耐性
に関する遺伝子、或いはテトラサイクリン耐性に
関する遺伝子ならびにアルカリフオスフアターゼ
に関する遺伝子およびバクテリアリボヌクレアー
ゼに関する遺伝子が挙げられる。
する細菌切断としては抗性物質耐性に関する遺伝
子、たとえばペニシリン耐性に関する遺伝子すな
わちペニシリナーゼ、クロラムフエニコール耐性
に関する遺伝子、或いはテトラサイクリン耐性に
関する遺伝子ならびにアルカリフオスフアターゼ
に関する遺伝子およびバクテリアリボヌクレアー
ゼに関する遺伝子が挙げられる。
各種の蛋白質もしくはその部分についての遺伝
情報を伝える遺伝子すなわちDNA断片を、本発
明の方法により細菌性キヤリヤ蛋白質遺伝子に組
み込むことができる。上記の各種の蛋白質には、
たとえば成熟核(真核)細胞蛋白質およびウイル
ス蛋白質のような各種の非細菌性蛋白質が包含さ
れる。特に重要なものは、たとえばインシユリ
ン、ヒト生育ホルモン、インターフエロンなど医
薬活性蛋白質のような成熟核細胞蛋白質である。
これらは、それぞれ各遺伝子によりアミノ酸末端
に一連の疎水性アミノ酸を有するプレ蛋白質(す
なわち先駆蛋白質)として合成される。この疎水
性リーダー配列は、細菌膜を通して分泌される細
菌蛋白質のリーダー配列と同一ではない。したが
つて、プレインシユリンなど高級細胞のプレ蛋白
質が疎水性リーダー配列を有するという事実があ
り、しかもそのようなプレ蛋白質がたとえば細菌
細胞内で合成され得たとしても、このプレ蛋白質
を細菌細胞内で発達完成させ得ると期待すること
はできない。さらに、本発明の方法は、細菌細胞
内における成熟核細胞の完成蛋白質(これらは有
用であることが知られている)の合成とその分泌
を与える他に、産業上興味のあるその他の細胞外
生成物を細菌細胞内で合成しかつそこから生成物
を分泌することをも可能にさせる。これら生成物
としては、融合蛋白質および上記したようなキヤ
リヤ蛋白質よりなる融合蛋白質が挙げられ、これ
らは特定の決定因子たとえばウイルス抗原(たと
えばコート蛋白質などウイルスの抗原蛋白質)担
持する。これら後者の融合蛋白質はワクチン製造
に有用であり、かつその抗原特性のためウイルス
に対して特異的な免疫反応の発生を誘起させるこ
とができる。この種のワクチンは、如何なる生ウ
イルスもまた不活性ウイルス材料も含有していな
いので、極めて安全である。さらに、この方法に
よれば、培養によつて繁殖させ得ないようなウイ
ルスに対してもワクチンを作ることが可能であ
る。
情報を伝える遺伝子すなわちDNA断片を、本発
明の方法により細菌性キヤリヤ蛋白質遺伝子に組
み込むことができる。上記の各種の蛋白質には、
たとえば成熟核(真核)細胞蛋白質およびウイル
ス蛋白質のような各種の非細菌性蛋白質が包含さ
れる。特に重要なものは、たとえばインシユリ
ン、ヒト生育ホルモン、インターフエロンなど医
薬活性蛋白質のような成熟核細胞蛋白質である。
これらは、それぞれ各遺伝子によりアミノ酸末端
に一連の疎水性アミノ酸を有するプレ蛋白質(す
なわち先駆蛋白質)として合成される。この疎水
性リーダー配列は、細菌膜を通して分泌される細
菌蛋白質のリーダー配列と同一ではない。したが
つて、プレインシユリンなど高級細胞のプレ蛋白
質が疎水性リーダー配列を有するという事実があ
り、しかもそのようなプレ蛋白質がたとえば細菌
細胞内で合成され得たとしても、このプレ蛋白質
を細菌細胞内で発達完成させ得ると期待すること
はできない。さらに、本発明の方法は、細菌細胞
内における成熟核細胞の完成蛋白質(これらは有
用であることが知られている)の合成とその分泌
を与える他に、産業上興味のあるその他の細胞外
生成物を細菌細胞内で合成しかつそこから生成物
を分泌することをも可能にさせる。これら生成物
としては、融合蛋白質および上記したようなキヤ
リヤ蛋白質よりなる融合蛋白質が挙げられ、これ
らは特定の決定因子たとえばウイルス抗原(たと
えばコート蛋白質などウイルスの抗原蛋白質)担
持する。これら後者の融合蛋白質はワクチン製造
に有用であり、かつその抗原特性のためウイルス
に対して特異的な免疫反応の発生を誘起させるこ
とができる。この種のワクチンは、如何なる生ウ
イルスもまた不活性ウイルス材料も含有していな
いので、極めて安全である。さらに、この方法に
よれば、培養によつて繁殖させ得ないようなウイ
ルスに対してもワクチンを作ることが可能であ
る。
以下、実施例により本発明を一層詳細に説明す
るが、これにより本発明は制限を受けるものでは
ない。
るが、これにより本発明は制限を受けるものでは
ない。
実施例
キヤリヤ蛋白質として、イー・コリ(E.coli、
大腸菌)・ペニシリナーゼを使用し、これに対す
る遺伝子を小さいプラスミドpBR322上に担持さ
せた。この遺伝子の制限酵素地図を図中に示す。
このプラスミドベクターは、ボリヴアール等によ
り記載されている〔Boliver et al.、Gene、2、
95〜113(1977)〕。宿主細菌としては、イ・コリ
〔E.coli×1776*〕を使用した〔カーチス等、イ
ン・レコンビナント・モレキユール:インパク
ト・オン・サイエンス・アンド・ソサイエテイ
ー、プロシーデイングス・オブ・テンス・マイル
ス・インターナシヨナルシンポジウム、ベール
ス・アンド・バセツト、45〜56(1977):
Curtiss et al.in Recombinant Molecules:
Impact on Science and Society、Proceedings
of the Tenth Mils International Symposium、
eds.Beers & Bassett、45〜56(1977)〕。
大腸菌)・ペニシリナーゼを使用し、これに対す
る遺伝子を小さいプラスミドpBR322上に担持さ
せた。この遺伝子の制限酵素地図を図中に示す。
このプラスミドベクターは、ボリヴアール等によ
り記載されている〔Boliver et al.、Gene、2、
95〜113(1977)〕。宿主細菌としては、イ・コリ
〔E.coli×1776*〕を使用した〔カーチス等、イ
ン・レコンビナント・モレキユール:インパク
ト・オン・サイエンス・アンド・ソサイエテイ
ー、プロシーデイングス・オブ・テンス・マイル
ス・インターナシヨナルシンポジウム、ベール
ス・アンド・バセツト、45〜56(1977):
Curtiss et al.in Recombinant Molecules:
Impact on Science and Society、Proceedings
of the Tenth Mils International Symposium、
eds.Beers & Bassett、45〜56(1977)〕。
*E.coli×1776はアメリカ合衆国、メリーランド
州、ロツクヴイルのアメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨンに寄託(ブタペスト条約
に基づく寄託)されて一般に使用しうる状態に
おかれており、ATCC No.31244が付与された
ものである。
州、ロツクヴイルのアメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨンに寄託(ブタペスト条約
に基づく寄託)されて一般に使用しうる状態に
おかれており、ATCC No.31244が付与された
ものである。
宿主−ベクターの組合せは確証されたEK2シス
テムであり、これはアメリカ合衆国ナシヨナル・
インスチチユート・オブ・ヘルス(NIH)により
1977年7月7日付で保証されたものである。
テムであり、これはアメリカ合衆国ナシヨナル・
インスチチユート・オブ・ヘルス(NIH)により
1977年7月7日付で保証されたものである。
プラスミドは、図中に示すように、アミノ酸
181および182の位置に対応してペニシリナーゼ遺
伝子のPst〔プロビデンシア・スチユアルテイ
イ・エンドヌクレアーゼ(providencia stuartii
endonuclease)〕制限位置を有する。二重鎖
cDNAを、X線誘発させた移植可能のラツテB−
細胞腫瘍から単離されたプレプロインシユリン
mRNA(PPI−mRNA)を含有するRNAから合成
した〔チツク等、プロシーデイング・ナシヨナ
ル・アカデミー・サイエンス・USA(P.N.A.S.
)、74、628−632(1977):Chick et al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA〕。凍結腫瘍スライス物の各
20gを乳鉢と乳棒により滅菌砂と共に磨砕し、
Mg2+での沈澱によりポスト−ヌクレア(post−
nuclear)上澄液から細胞質RNAを精製し〔パル
ミター、バイオケミストリー、13、3603〜3615
(1974):Palmiter、Biochemistry〕、次いでフエ
ノールとクロロホルムで抽出した。このRNAを
アリゴ−dT−セルロース・クロマトグラフイー
によりさらに精製し〔アヴイブ等、P.N.A.S.、
69、1408−1412(1972)〕、二重鎖cDNA合成に対
するひな型としてそのまま使用した〔エフストラ
チアデイス等、セル、7、279〜288(1976);
Efstratiadis et al.、Cell〕が、ただし特定のp
(dT)8dG−dCプライマー(共同研究)を用いて
逆転写させた。RNAとプライマーの濃度はそれ
ぞれ7mg/μおよび1mg/μであつた。全ての
4種のα−P32−dNTPsは1.25mMであつた(最
終比活性0.85Ci/mモル)。逆転写はRNAインプ
ツトの2%であり、その25%が二重鎖DNA生成
物中に最終的に回収された。
181および182の位置に対応してペニシリナーゼ遺
伝子のPst〔プロビデンシア・スチユアルテイ
イ・エンドヌクレアーゼ(providencia stuartii
endonuclease)〕制限位置を有する。二重鎖
cDNAを、X線誘発させた移植可能のラツテB−
細胞腫瘍から単離されたプレプロインシユリン
mRNA(PPI−mRNA)を含有するRNAから合成
した〔チツク等、プロシーデイング・ナシヨナ
ル・アカデミー・サイエンス・USA(P.N.A.S.
)、74、628−632(1977):Chick et al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA〕。凍結腫瘍スライス物の各
20gを乳鉢と乳棒により滅菌砂と共に磨砕し、
Mg2+での沈澱によりポスト−ヌクレア(post−
nuclear)上澄液から細胞質RNAを精製し〔パル
ミター、バイオケミストリー、13、3603〜3615
(1974):Palmiter、Biochemistry〕、次いでフエ
ノールとクロロホルムで抽出した。このRNAを
アリゴ−dT−セルロース・クロマトグラフイー
によりさらに精製し〔アヴイブ等、P.N.A.S.、
69、1408−1412(1972)〕、二重鎖cDNA合成に対
するひな型としてそのまま使用した〔エフストラ
チアデイス等、セル、7、279〜288(1976);
Efstratiadis et al.、Cell〕が、ただし特定のp
(dT)8dG−dCプライマー(共同研究)を用いて
逆転写させた。RNAとプライマーの濃度はそれ
ぞれ7mg/μおよび1mg/μであつた。全ての
4種のα−P32−dNTPsは1.25mMであつた(最
終比活性0.85Ci/mモル)。逆転写はRNAインプ
ツトの2%であり、その25%が二重鎖DNA生成
物中に最終的に回収された。
二重鎖cDANを次の手順によりプラスミド
pBR322のPst位置に組み込んだ。すなわち、
pBR322DNA(5.2μg)をPstで線状化し、約
15dG残基を1mMのCo2+〔ロイチヨウドハリー
等、核酸研究、3、101〜116(1976)〕およびオ
ートクレーブにかけた100μg/mlのゼラチンの存
在下に15℃で末端トランスフエラーゼにより3′末
端に対して付加した。同じ手順を用いてdC残基
を2.0μgの二重鎖cDNAに付加した。反応混合
物をフエノールで抽出し、エタノールで沈澱させ
た。dC末端の二重鎖cDNAを6%ポリアクリルア
ミドゲル中において自然条件下で電気泳動させ
た。放射線写真に従つて、300〜600塩基対の寸法
範囲の分子(0.5μg)をゲルから溶出させた
〔エフストラチアジス等、メソツド・イン・モレ
キユラー・バイオロジー、8、1〜124
(1976);Efstratiadis et al.、in Methods in
Molecular Biology〕。溶出された二重鎖cDNAを
エタノール沈澱により濃縮し、PH8のトリス緩衝
液10mM中に再溶解させ、dG未端のpBR322の5
μgと混合し、次いで0.1MのNaCl、10mMの
EDTA、PH8の10mMのトリスに対して透析し
た。次いで、混合物(4ml)を56゜の温度で2分
間加熱し、42゜の温度でアニールを2時間行なつ
た。このハイブリツドDNAを使用してイー・コ
リ×1776を形質転換させた。オリゴdC−dG結合
を用いて、後に組み込みを行ないうるようにPst
カツトを再生させる。イー・コリ×1776の形質転
換(pBR322を有するEK−2宿主、EK−2ベク
ター)を、フイーデラルレジスター(Federal
Register)中に1976年7月7日付で発行された組
替えDNA研究に関するN.I.H.ガイドラインに従
つて、P3物理的封鎖施設における生物学的安全
装置内で行なつた。
pBR322のPst位置に組み込んだ。すなわち、
pBR322DNA(5.2μg)をPstで線状化し、約
15dG残基を1mMのCo2+〔ロイチヨウドハリー
等、核酸研究、3、101〜116(1976)〕およびオ
ートクレーブにかけた100μg/mlのゼラチンの存
在下に15℃で末端トランスフエラーゼにより3′末
端に対して付加した。同じ手順を用いてdC残基
を2.0μgの二重鎖cDNAに付加した。反応混合
物をフエノールで抽出し、エタノールで沈澱させ
た。dC末端の二重鎖cDNAを6%ポリアクリルア
ミドゲル中において自然条件下で電気泳動させ
た。放射線写真に従つて、300〜600塩基対の寸法
範囲の分子(0.5μg)をゲルから溶出させた
〔エフストラチアジス等、メソツド・イン・モレ
キユラー・バイオロジー、8、1〜124
(1976);Efstratiadis et al.、in Methods in
Molecular Biology〕。溶出された二重鎖cDNAを
エタノール沈澱により濃縮し、PH8のトリス緩衝
液10mM中に再溶解させ、dG未端のpBR322の5
μgと混合し、次いで0.1MのNaCl、10mMの
EDTA、PH8の10mMのトリスに対して透析し
た。次いで、混合物(4ml)を56゜の温度で2分
間加熱し、42゜の温度でアニールを2時間行なつ
た。このハイブリツドDNAを使用してイー・コ
リ×1776を形質転換させた。オリゴdC−dG結合
を用いて、後に組み込みを行ないうるようにPst
カツトを再生させる。イー・コリ×1776の形質転
換(pBR322を有するEK−2宿主、EK−2ベク
ター)を、フイーデラルレジスター(Federal
Register)中に1976年7月7日付で発行された組
替えDNA研究に関するN.I.H.ガイドラインに従
つて、P3物理的封鎖施設における生物学的安全
装置内で行なつた。
イ−・コリ×1776をトランスフエクシヨン法
〔エネア等、ジヤーナル・オブ・モレキユラー・
バイオロジー、96、495〜509(1975);Enea et
al.、J.Mol.Biol.〕により形質転換させたが、た
だしこの方法を次のように僅かに変えた。すなわ
ち、イ−・コリ×1776を、10μg/mlのジアミノ
ーピメリン酸と40μg/mlのチアミジン(シグ
マ)とをA590が0.5になるよう加えたL型培養基
〔トリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl5g
(デイフコ社)〕中で繁殖させた。200ml部の細胞
を300rpmにて沈降させ、MnCl270mMとPH5.6の
NaAc40mMとCaCl230mMとを含有する冷緩衝液
1/10容量中にスワールにより再懸濁させ、氷に20
分間保つた。これら細胞を再びペレツト化し、次
いで同じ緩衝液における元の容量の1/30中に再懸
濁させた。アニールされたDNA(2ml)をこれ
ら細胞に加えた。この混合物の一部(0.3ml)を
滅菌試験管内中に入れて氷上で60分間培養した。
次いでこの細胞を37゜の温度に2分間置いた。培
養基を各試験管に加え、(0.7ml)、この試験管を
温度37゜で15分間培養した。200μ部の細胞
を、テトラサイクリン15μg/mlを含有する寒天
板の上に置かれた滅菌ニトロセルロースフイルタ
ー(ミリポア社)の上に展延させた〔このフイル
ターは使用前に煮沸して洗剤を除去した〕。この
寒天板37゜で48時間培養した。フイルターのレプ
リカを作つた。形質転換を含有するニトロセルロ
ースフイルターを寒天から外し、滅菌ワツトマン
濾紙の層上に置いた。コロニーを含むフイルター
の上部に新たな無菌フイルターを置き、無菌ベル
ベツト布と二重ブロツクとを用いて圧力をかけ
た。無菌針を用いてフイルターを止めた。第二の
フイルターを新たな寒天板の上に置き、37゜で48
時間培養した。第一のフイルター上のコロニーを
グルンスタイン−ホグネス〔P.N.A.S.72、3961−
3965(1975)〕の技術によりスクリーニングし、
この場合試料としてはラツテのオリゴーdT結合
RNAから転写された高比活性cDNAのHae切断
により生成された80ヌクレオチツド長さの断片を
使用した。陽性コロニーを次のようにしてハルト
(HART)法〔パターソン等、P.N.A.S.74、4370
〜4374(1977)〕により再スクリーニングにかけ
た。プラスミドDNA(約3μg)をPstで切断さ
せ、エタノール沈澱させ、次いで20μのジオン
化ホルムアミド中に直接に溶解させた。95゜で1
分間加熱した後、各試料を氷上に置いた。1.5μ
gのオリゴ(dT)−セルロース結合RNAと10mM
までのPH6.4のパイプス(PIPES)と0.4Mまでの
NaClとを添加した後、混合物を50゜で2時間培
養した。次いで、これを水75μの添加により希
釈し、10μgの麦芽tRNAの存在下でエタノール
沈澱させ、70%エタノールで洗浄し、H2O中に溶
解させ、麦芽の無細胞翻約混合物に加えた〔ロバ
ート等、P.N.A.S.70、2330〜2334(1973)〕。23℃
で3時間の後、2μづつ2回取り出してトリク
ロル酢酸により沈澱させ、残余の反応混合物をリ
ボヌクレアーゼで処理し、免疫分析用緩衝液で希
釈し、そして二重抗体免疫沈澱〔ロメジコ等、核
酸研究、3、381〜391(1976);Lomedico et
al.、Nucleic Acids Res.〕により免疫反応性プ
レプロインシユリンの合成の分析を行なつた。洗
浄した免疫沈澱物を1mlのNCS(アメルシヤ
ム)中に溶解させ、液体シンチレーシヨンにより
10μのオムニフルオール(Omnifluor)(ニユ
ー・イングランド・ヌクレア)中で計数した。
〔エネア等、ジヤーナル・オブ・モレキユラー・
バイオロジー、96、495〜509(1975);Enea et
al.、J.Mol.Biol.〕により形質転換させたが、た
だしこの方法を次のように僅かに変えた。すなわ
ち、イ−・コリ×1776を、10μg/mlのジアミノ
ーピメリン酸と40μg/mlのチアミジン(シグ
マ)とをA590が0.5になるよう加えたL型培養基
〔トリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl5g
(デイフコ社)〕中で繁殖させた。200ml部の細胞
を300rpmにて沈降させ、MnCl270mMとPH5.6の
NaAc40mMとCaCl230mMとを含有する冷緩衝液
1/10容量中にスワールにより再懸濁させ、氷に20
分間保つた。これら細胞を再びペレツト化し、次
いで同じ緩衝液における元の容量の1/30中に再懸
濁させた。アニールされたDNA(2ml)をこれ
ら細胞に加えた。この混合物の一部(0.3ml)を
滅菌試験管内中に入れて氷上で60分間培養した。
次いでこの細胞を37゜の温度に2分間置いた。培
養基を各試験管に加え、(0.7ml)、この試験管を
温度37゜で15分間培養した。200μ部の細胞
を、テトラサイクリン15μg/mlを含有する寒天
板の上に置かれた滅菌ニトロセルロースフイルタ
ー(ミリポア社)の上に展延させた〔このフイル
ターは使用前に煮沸して洗剤を除去した〕。この
寒天板37゜で48時間培養した。フイルターのレプ
リカを作つた。形質転換を含有するニトロセルロ
ースフイルターを寒天から外し、滅菌ワツトマン
濾紙の層上に置いた。コロニーを含むフイルター
の上部に新たな無菌フイルターを置き、無菌ベル
ベツト布と二重ブロツクとを用いて圧力をかけ
た。無菌針を用いてフイルターを止めた。第二の
フイルターを新たな寒天板の上に置き、37゜で48
時間培養した。第一のフイルター上のコロニーを
グルンスタイン−ホグネス〔P.N.A.S.72、3961−
3965(1975)〕の技術によりスクリーニングし、
この場合試料としてはラツテのオリゴーdT結合
RNAから転写された高比活性cDNAのHae切断
により生成された80ヌクレオチツド長さの断片を
使用した。陽性コロニーを次のようにしてハルト
(HART)法〔パターソン等、P.N.A.S.74、4370
〜4374(1977)〕により再スクリーニングにかけ
た。プラスミドDNA(約3μg)をPstで切断さ
せ、エタノール沈澱させ、次いで20μのジオン
化ホルムアミド中に直接に溶解させた。95゜で1
分間加熱した後、各試料を氷上に置いた。1.5μ
gのオリゴ(dT)−セルロース結合RNAと10mM
までのPH6.4のパイプス(PIPES)と0.4Mまでの
NaClとを添加した後、混合物を50゜で2時間培
養した。次いで、これを水75μの添加により希
釈し、10μgの麦芽tRNAの存在下でエタノール
沈澱させ、70%エタノールで洗浄し、H2O中に溶
解させ、麦芽の無細胞翻約混合物に加えた〔ロバ
ート等、P.N.A.S.70、2330〜2334(1973)〕。23℃
で3時間の後、2μづつ2回取り出してトリク
ロル酢酸により沈澱させ、残余の反応混合物をリ
ボヌクレアーゼで処理し、免疫分析用緩衝液で希
釈し、そして二重抗体免疫沈澱〔ロメジコ等、核
酸研究、3、381〜391(1976);Lomedico et
al.、Nucleic Acids Res.〕により免疫反応性プ
レプロインシユリンの合成の分析を行なつた。洗
浄した免疫沈澱物を1mlのNCS(アメルシヤ
ム)中に溶解させ、液体シンチレーシヨンにより
10μのオムニフルオール(Omnifluor)(ニユ
ー・イングランド・ヌクレア)中で計数した。
1つのコロニーをハルト・スクリーニング法で
同定した。Pstに作用しうるインサートは、マキ
サムおよびギルバードの方法〔P.N.A.S.74、560
〜564(1977)〕により配列決定を行なつて、それ
がラツテのプレプロインシユリンの配列に相当
することを示した。ニツクトランスレーシヨン
(Nicktranslation)によりDNAポリメラーゼで
ラベルしたこのインサートを使用して、グルンス
タインーホグネス分析法により200種の形質転換
体をスクリーニングした。ラツテのプレプロイン
シユリンcDNAプローブにハイブリド化する48種
のクローンが同定された。
同定した。Pstに作用しうるインサートは、マキ
サムおよびギルバードの方法〔P.N.A.S.74、560
〜564(1977)〕により配列決定を行なつて、それ
がラツテのプレプロインシユリンの配列に相当
することを示した。ニツクトランスレーシヨン
(Nicktranslation)によりDNAポリメラーゼで
ラベルしたこのインサートを使用して、グルンス
タインーホグネス分析法により200種の形質転換
体をスクリーニングした。ラツテのプレプロイン
シユリンcDNAプローブにハイブリド化する48種
のクローンが同定された。
形質転換されたイー・コリ×1776のこれら48種
のクローンをその場で放射線免疫技術によりスク
リーニングして、これらクローンがインシユリン
抗原を生成しているかどうか、またこれらクロー
ンが融合ポリペプタイド鎖〔この一末端はインシ
ユリン抗原であり、他端はペニシリナーゼ(バク
テリアキヤリヤ蛋白質)抗原である〕を生成して
いるかどうかを決定した。融合ポリペプタイド鎖
が存在することは、これらクローンがペニシリナ
ーゼに関するバクテリヤ遺伝子とインシユリンに
関する成熟核細胞遺伝子との融合生成物である遺
伝子を含有することを示している。このような融
合ポリペプタイド鎖は、下記する技術により実際
に見出された。この技術は、探求されている融合
蛋白質が2種の免疫末端を含み、そのそれぞれが
それぞれ特定の抗体に結合するという事実を利用
する。特定抗体をプラスチツク円板の上に置き、
溶解バクテリヤ細胞からの免疫蛋白質をその円板
と接触させて載置し、次いでこの円板を洗い、放
射性抗体に曝した。蛋白質分子は一方の抗原決定
因子を有するプラスチツクに固定された抗体に結
合し、次いで第二の決定因子を有する放射性抗体
を結合するであろう。もし抗ペニシリナーゼが円
板上に存在しかつ抗インシユリンがラベルされる
ならば、「サンドイツチ」を洗浄した後、残存す
る放射性活性の点のみが融合蛋白質の存在を示す
であろう。さらに詳細には、この方法は次のよう
にして行なわれた。
のクローンをその場で放射線免疫技術によりスク
リーニングして、これらクローンがインシユリン
抗原を生成しているかどうか、またこれらクロー
ンが融合ポリペプタイド鎖〔この一末端はインシ
ユリン抗原であり、他端はペニシリナーゼ(バク
テリアキヤリヤ蛋白質)抗原である〕を生成して
いるかどうかを決定した。融合ポリペプタイド鎖
が存在することは、これらクローンがペニシリナ
ーゼに関するバクテリヤ遺伝子とインシユリンに
関する成熟核細胞遺伝子との融合生成物である遺
伝子を含有することを示している。このような融
合ポリペプタイド鎖は、下記する技術により実際
に見出された。この技術は、探求されている融合
蛋白質が2種の免疫末端を含み、そのそれぞれが
それぞれ特定の抗体に結合するという事実を利用
する。特定抗体をプラスチツク円板の上に置き、
溶解バクテリヤ細胞からの免疫蛋白質をその円板
と接触させて載置し、次いでこの円板を洗い、放
射性抗体に曝した。蛋白質分子は一方の抗原決定
因子を有するプラスチツクに固定された抗体に結
合し、次いで第二の決定因子を有する放射性抗体
を結合するであろう。もし抗ペニシリナーゼが円
板上に存在しかつ抗インシユリンがラベルされる
ならば、「サンドイツチ」を洗浄した後、残存す
る放射性活性の点のみが融合蛋白質の存在を示す
であろう。さらに詳細には、この方法は次のよう
にして行なわれた。
それぞれ直径8.25cm、厚さ8mmの透明ポリビニ
ル(PV)の円板(ドラ・メイ社、ニユーヨー
ク)を平滑な紙シートの間で平板にした。次いで
ガラス製ペトリ皿中において、この円板を60μ
g/mlのIgGを含有するPH9.2の0.2MのNaHCO310
mlを含む液体の表面上に載置した。室温に2分間
以上置いた後、円板を取出し、冷洗浄緩衝液
(WB)10mlで2回洗浄した。ここで用いた緩衝
液は燐酸緩衝塩水と0.5%正常モルモツト血清と
0.1%子牛血清アルブミンと0.3mg/ml硫酸ストレ
プトマイシンとからなるものである。各円板を、
洗浄後に直ちに使用した。
ル(PV)の円板(ドラ・メイ社、ニユーヨー
ク)を平滑な紙シートの間で平板にした。次いで
ガラス製ペトリ皿中において、この円板を60μ
g/mlのIgGを含有するPH9.2の0.2MのNaHCO310
mlを含む液体の表面上に載置した。室温に2分間
以上置いた後、円板を取出し、冷洗浄緩衝液
(WB)10mlで2回洗浄した。ここで用いた緩衝
液は燐酸緩衝塩水と0.5%正常モルモツト血清と
0.1%子牛血清アルブミンと0.3mg/ml硫酸ストレ
プトマイシンとからなるものである。各円板を、
洗浄後に直ちに使用した。
リゾチーム0.5mg/mlと30mMのトリス(PH
8)と10mMのEDTAとを含有する1.5%アガロー
ス上にコロニーを移すことにより、抗原を細菌細
胞から遊離させた。1gG被覆されたPV円板表面
をアガロースと細胞コロニーの面に向けて載置
し、4゜の温度で60分間放置した。次いで、各区
板を取外し、冷WB10mlで3回洗浄した。この段
階で、固体抗体層上への抗原の免疫吸着を完了し
た。
8)と10mMのEDTAとを含有する1.5%アガロー
ス上にコロニーを移すことにより、抗原を細菌細
胞から遊離させた。1gG被覆されたPV円板表面
をアガロースと細胞コロニーの面に向けて載置
し、4゜の温度で60分間放置した。次いで、各区
板を取外し、冷WB10mlで3回洗浄した。この段
階で、固体抗体層上への抗原の免疫吸着を完了し
た。
かくして円板に付着しているI125でラベルした
抗体と抗原との反応は、5×106cpm(γ放射)
のI125−IgGを含有する1.5mlのWBを、ペトリ皿
の底部に置かれた通常のナイロンメツシユからな
る直径8.25cmの平たい円板の中心部に固定するこ
とにより行なつた。ナイロンメツシユは離間材と
して作用した。前記段階におけるように処理した
円板を、次いでメツシユと溶液との面に向けて載
置し、4゜で一晩培養した。次いで各円板を10ml
の冷WBで2回および水で2回洗浄し、室温にて
乾燥させた。この時点で、融合蛋白質はIgGの通
常の層と放射線ラベルした層の両者に結合されて
いる。次いで、これら蛋白質を通常の放射線写真
技術により検出した。この放射線写真技術として
は、たとえばラスキー等〔Lasky et al.、FEBS
Lett.、82、314〜316(1977)〕により記載されて
いるような、コダツクNo.スクリーンフイルムまた
はコダツクX−OMATRフイルムとデユポン・ク
ロネツクス照射および増強スクリーンとを用い
た。抗インシユリンと抗ペニシリナーゼの両IgG
部分が上記の方法に必要とされた。抗インシユリ
ン抗血清はモルモツトから得られる市販品とし
た。兎抗ペニシリナーゼ抗血清はImgの純ペニシ
リナーゼ(完全フロインドアジユバンド(デイフ
コ社)中のもの)をニユージーランド産の白兎に
注射して生成させた。最初の注射後2、3週間で
ブースター注射を不完全フロインドアジユバンド
(デイフコ社)において施こし、1週間後に兎を
出血させた。
抗体と抗原との反応は、5×106cpm(γ放射)
のI125−IgGを含有する1.5mlのWBを、ペトリ皿
の底部に置かれた通常のナイロンメツシユからな
る直径8.25cmの平たい円板の中心部に固定するこ
とにより行なつた。ナイロンメツシユは離間材と
して作用した。前記段階におけるように処理した
円板を、次いでメツシユと溶液との面に向けて載
置し、4゜で一晩培養した。次いで各円板を10ml
の冷WBで2回および水で2回洗浄し、室温にて
乾燥させた。この時点で、融合蛋白質はIgGの通
常の層と放射線ラベルした層の両者に結合されて
いる。次いで、これら蛋白質を通常の放射線写真
技術により検出した。この放射線写真技術として
は、たとえばラスキー等〔Lasky et al.、FEBS
Lett.、82、314〜316(1977)〕により記載されて
いるような、コダツクNo.スクリーンフイルムまた
はコダツクX−OMATRフイルムとデユポン・ク
ロネツクス照射および増強スクリーンとを用い
た。抗インシユリンと抗ペニシリナーゼの両IgG
部分が上記の方法に必要とされた。抗インシユリ
ン抗血清はモルモツトから得られる市販品とし
た。兎抗ペニシリナーゼ抗血清はImgの純ペニシ
リナーゼ(完全フロインドアジユバンド(デイフ
コ社)中のもの)をニユージーランド産の白兎に
注射して生成させた。最初の注射後2、3週間で
ブースター注射を不完全フロインドアジユバンド
(デイフコ社)において施こし、1週間後に兎を
出血させた。
硫酸アンモニウムによる沈澱および続いて
0.025Mの燐酸カリウム(PH7.3)、1%グリセリ
ンにおけるDEAE−セルロース(ワツトマンDE
−52)のクロマトグラフイーにより各免疫血清か
ら1gG部分を調製した。大部分の溶出物質を含有
する画分を集め、硫酸アンモニウムを40%飽和ま
で加えて蛋白質を沈澱させた。得られたペレツト
を元の血清容量の1/3の0.025M燐酸カリウム(PH
7.3)、0.1MNaCl、1%グリセリンに再懸濁さ
せ、同じ緩衝液に対して透析した。透析後、遠心
分離により全ての残留沈澱物を除去し、IgG部分
を−70゜に貯蔵した。
0.025Mの燐酸カリウム(PH7.3)、1%グリセリ
ンにおけるDEAE−セルロース(ワツトマンDE
−52)のクロマトグラフイーにより各免疫血清か
ら1gG部分を調製した。大部分の溶出物質を含有
する画分を集め、硫酸アンモニウムを40%飽和ま
で加えて蛋白質を沈澱させた。得られたペレツト
を元の血清容量の1/3の0.025M燐酸カリウム(PH
7.3)、0.1MNaCl、1%グリセリンに再懸濁さ
せ、同じ緩衝液に対して透析した。透析後、遠心
分離により全ての残留沈澱物を除去し、IgG部分
を−70゜に貯蔵した。
各IgG部分をハンター等〔Hunter et al.、
Biochem.J.、91、43〜46(1964)〕の常法により
沃素放射能分析にかけた。25μの反応混合物は
0.5Mの燐酸カリウム(PH7.5)と、2mCiのキヤリ
ヤフリーのNaI125と、150μgのIgGと2μgのク
ロラミンTとを含有した。室温にて3分間の後、
PBS25μ中のメタ重亜硫酸ナトリウム8μgを
加え、次いで2%正常モルモツト血清を含有する
PBS200μを加えた。I125でラベルしたIgGを、
2%正常モルモツト血清を含有するPBSで平衡状
態にしたセフアデツクスG−50のカラムにおける
クロマトグラフイーにより精製した。I125−IgG
溶出画分を、10%正常モルモツト血清を含有する
PBSで5mlに希釈し、滅菌ミリポアVCフイルタ
ー(0.1μm孔径)を通して濾過し、幾つかの部
分に分けて−70゜で貯蔵した。比活性は1.5×107
cpm/μgであつた。
Biochem.J.、91、43〜46(1964)〕の常法により
沃素放射能分析にかけた。25μの反応混合物は
0.5Mの燐酸カリウム(PH7.5)と、2mCiのキヤリ
ヤフリーのNaI125と、150μgのIgGと2μgのク
ロラミンTとを含有した。室温にて3分間の後、
PBS25μ中のメタ重亜硫酸ナトリウム8μgを
加え、次いで2%正常モルモツト血清を含有する
PBS200μを加えた。I125でラベルしたIgGを、
2%正常モルモツト血清を含有するPBSで平衡状
態にしたセフアデツクスG−50のカラムにおける
クロマトグラフイーにより精製した。I125−IgG
溶出画分を、10%正常モルモツト血清を含有する
PBSで5mlに希釈し、滅菌ミリポアVCフイルタ
ー(0.1μm孔径)を通して濾過し、幾つかの部
分に分けて−70゜で貯蔵した。比活性は1.5×107
cpm/μgであつた。
このスクリーニングにより、ペニシリナーゼお
よびインシユリン抗原決定因子を示す融合蛋白質
を合成かつ分泌する1種類のイー・コリ×1776の
クローンが検出された。外質系から回収されたこ
の蛋白質は放射線免疫分析においてインシユリン
に似ている。DNA配列が示すところでは、この
蛋白質はペニシリナーゼとプロインシユリンとの
間で融合体であり、この2種類の蛋白質はペニシ
リナーゼのアミノ酸182(アラニン)とプロイン
シユリンのアミノ酸4(グルタミン)との間で6
つのグリシンにより結合されている。かくして、
より高度の細胞ホルモンが細菌中において抗原活
性型として合成された。
よびインシユリン抗原決定因子を示す融合蛋白質
を合成かつ分泌する1種類のイー・コリ×1776の
クローンが検出された。外質系から回収されたこ
の蛋白質は放射線免疫分析においてインシユリン
に似ている。DNA配列が示すところでは、この
蛋白質はペニシリナーゼとプロインシユリンとの
間で融合体であり、この2種類の蛋白質はペニシ
リナーゼのアミノ酸182(アラニン)とプロイン
シユリンのアミノ酸4(グルタミン)との間で6
つのグリシンにより結合されている。かくして、
より高度の細胞ホルモンが細菌中において抗原活
性型として合成された。
所望の成熟核細胞蛋白質に対するDNA配列
を、このpBR322プラスミドが情報伝達する蛋白
質のアミノ酸101と102との間の位置に相当する
Hindカツト中に、或いはアミノ酸45に相当す
る位置のTaqカツト中に組み込むことができるこ
とが判るであろう。全ての場合、もし成熟核細胞
DNAを末端のランダム付加によりまたは他の方
法により相の中に配列するならば、これはキヤリ
ヤ蛋白質の融合部分として表現され、その蛋白質
は細胞から分泌されるであろう。さらに、このプ
ラスミド中にまたはその他の中に存在するペニシ
リナーゼ遺伝子の配列は、突然変異により或いは
たとえは接合に便利な新規の制限カツトを組み込
むような方法で遺伝子の特点個所にDNA断片を
組み込む直接組替えDNA技術により改変させる
ことができる。たとえば、プラスミドpBR322上
のR1カツトは突然変異により除去することがで
き、またR1配列を結合(Ligation)によりペニシ
リナーゼ遺伝子中に組み込むことができる。これ
は恐らく遺伝子を不活性化させるであろうが、
DNAのこの領域をキヤリヤ蛋白質の合成のため
に使用することを妨げないであろう。
を、このpBR322プラスミドが情報伝達する蛋白
質のアミノ酸101と102との間の位置に相当する
Hindカツト中に、或いはアミノ酸45に相当す
る位置のTaqカツト中に組み込むことができるこ
とが判るであろう。全ての場合、もし成熟核細胞
DNAを末端のランダム付加によりまたは他の方
法により相の中に配列するならば、これはキヤリ
ヤ蛋白質の融合部分として表現され、その蛋白質
は細胞から分泌されるであろう。さらに、このプ
ラスミド中にまたはその他の中に存在するペニシ
リナーゼ遺伝子の配列は、突然変異により或いは
たとえは接合に便利な新規の制限カツトを組み込
むような方法で遺伝子の特点個所にDNA断片を
組み込む直接組替えDNA技術により改変させる
ことができる。たとえば、プラスミドpBR322上
のR1カツトは突然変異により除去することがで
き、またR1配列を結合(Ligation)によりペニシ
リナーゼ遺伝子中に組み込むことができる。これ
は恐らく遺伝子を不活性化させるであろうが、
DNAのこの領域をキヤリヤ蛋白質の合成のため
に使用することを妨げないであろう。
疎水性リーダーの末端に位置するアミノ酸23に
対するコード(Code)と、たとえばTaqカツト
に位置するアミノ酸45に対するコードとの間に存
在するペニシリナーゼ遺伝子DNAの断片は、適
当な酵素の混合物によるDNAの切断により除去
することができる。この種の1つの混合物はラム
ダエキソヌクレアーゼであり、これは酵素S1と
共同して5′末端からDNA鎖を切断し、一本鎖オ
ーバーハングを除去する。この種の他の混合物と
してはT4DNAポリメラーゼがあり、これはS1と
共に1本のDNA鎖の3′末端を切断し、同様に一
本鎖オーバーハングを除去する。調節切断によ
り、プラスミドDNA分子を適当に短縮して、R1
カツトからアミノ酸23に符号する点まで或いは疎
水性リーダー配列上の他の点まで延在する断片に
することができ、このような断片を融合させてイ
ンシユリン配列を有する同様に発生された断片に
し、これを便利な初期点、すなわち成熟インシユ
リン分子が始まる点まで酵素的に切断することが
できる。これら2つの断片を、たとえばT4DNA
リガーゼによる末端結合により融合させ、この融
合体をプラスミド中に組み込むことができる。こ
の融合体は、キヤリヤ遺伝子がイ−・コリの疎水
性リーダー配列にのみ符号しかつ成熟核細胞遺伝
子が残余の構造情報を与えるような形質転換体の
キヤリヤ蛋白質をもたらす。このような構成は原
則的には正確に行なうこともできるが、実用的に
は恐らくランダムに行なわれ、興未ある領域に末
端部を有する各種の遺伝子断片を接合させる操作
を含み、また融合断片により形質転換されたバク
テリヤクローンを囲む培地を検査して、たとえば
上記したようなRIAにより抗原活性を蛋白合成の
証拠として検出する。
対するコード(Code)と、たとえばTaqカツト
に位置するアミノ酸45に対するコードとの間に存
在するペニシリナーゼ遺伝子DNAの断片は、適
当な酵素の混合物によるDNAの切断により除去
することができる。この種の1つの混合物はラム
ダエキソヌクレアーゼであり、これは酵素S1と
共同して5′末端からDNA鎖を切断し、一本鎖オ
ーバーハングを除去する。この種の他の混合物と
してはT4DNAポリメラーゼがあり、これはS1と
共に1本のDNA鎖の3′末端を切断し、同様に一
本鎖オーバーハングを除去する。調節切断によ
り、プラスミドDNA分子を適当に短縮して、R1
カツトからアミノ酸23に符号する点まで或いは疎
水性リーダー配列上の他の点まで延在する断片に
することができ、このような断片を融合させてイ
ンシユリン配列を有する同様に発生された断片に
し、これを便利な初期点、すなわち成熟インシユ
リン分子が始まる点まで酵素的に切断することが
できる。これら2つの断片を、たとえばT4DNA
リガーゼによる末端結合により融合させ、この融
合体をプラスミド中に組み込むことができる。こ
の融合体は、キヤリヤ遺伝子がイ−・コリの疎水
性リーダー配列にのみ符号しかつ成熟核細胞遺伝
子が残余の構造情報を与えるような形質転換体の
キヤリヤ蛋白質をもたらす。このような構成は原
則的には正確に行なうこともできるが、実用的に
は恐らくランダムに行なわれ、興未ある領域に末
端部を有する各種の遺伝子断片を接合させる操作
を含み、また融合断片により形質転換されたバク
テリヤクローンを囲む培地を検査して、たとえば
上記したようなRIAにより抗原活性を蛋白合成の
証拠として検出する。
本発明の方法はイー・コリ・ペニシリナーゼ遺
伝子を使用することのみに限定されるものではな
く、多重転写プラスミド上またはフアージ上に担
持された任意の分泌蛋白質に対する遺伝子にも応
用することができる。また本発明の方法はインシ
ユリンのみに限定されるものではなく、相中に翻
訳された場合ウイルス蛋白質中または成熟核細胞
蛋白質中の抗原決定因子に符号するコード領域を
有するようなウイルスまたは成熟核細胞の任意の
DNA断片の融合蛋白質を発現させるためにも使
用することができる。たとえば、もし動物ウイル
スDNAの断片をペニシリナーゼ遺伝子のPstもし
くはHindの位置に組み込むならば、或る感受
性バクテリヤは融合蛋白質を合成し、この蛋白質
はウイルス抗原に対して特異的な抗体を用いRIA
技術により確認することができる。この融合蛋白
質を次いで精製しかつ使用して動物または人間に
おける抗体反応を刺戟し、ウイルス蛋白質上の特
定位置に向けられた抗体を生産させるかまたはウ
イルス抗原に対するワクチン接種として利用する
ことができる。融合蛋白質はこの種のワクチン接
種に際し補助決定因子を与えて免疫反応を促進さ
せるが、恐らく集合状態の融合蛋白質をワクチン
中に使用しなければならないであろう。使用しう
ると思われる特定のキヤリヤ蛋白質は細菌蛋白質
自体であるか或いはさらに細菌蛋白質とキヤリヤ
蛋白質中に有用な補助決定因子を与えるような他
の便利な配列との間の融合体である。
伝子を使用することのみに限定されるものではな
く、多重転写プラスミド上またはフアージ上に担
持された任意の分泌蛋白質に対する遺伝子にも応
用することができる。また本発明の方法はインシ
ユリンのみに限定されるものではなく、相中に翻
訳された場合ウイルス蛋白質中または成熟核細胞
蛋白質中の抗原決定因子に符号するコード領域を
有するようなウイルスまたは成熟核細胞の任意の
DNA断片の融合蛋白質を発現させるためにも使
用することができる。たとえば、もし動物ウイル
スDNAの断片をペニシリナーゼ遺伝子のPstもし
くはHindの位置に組み込むならば、或る感受
性バクテリヤは融合蛋白質を合成し、この蛋白質
はウイルス抗原に対して特異的な抗体を用いRIA
技術により確認することができる。この融合蛋白
質を次いで精製しかつ使用して動物または人間に
おける抗体反応を刺戟し、ウイルス蛋白質上の特
定位置に向けられた抗体を生産させるかまたはウ
イルス抗原に対するワクチン接種として利用する
ことができる。融合蛋白質はこの種のワクチン接
種に際し補助決定因子を与えて免疫反応を促進さ
せるが、恐らく集合状態の融合蛋白質をワクチン
中に使用しなければならないであろう。使用しう
ると思われる特定のキヤリヤ蛋白質は細菌蛋白質
自体であるか或いはさらに細菌蛋白質とキヤリヤ
蛋白質中に有用な補助決定因子を与えるような他
の便利な配列との間の融合体である。
第1図、第2図および第3図はプラスミド
pBR322上に担持されたイー・コリ(大腸菌)の
ペニシリナーゼ遺伝子に関する完全な基本配列な
らびに遺伝情報となる蛋白質の対応アミノ酸配列
を示す説明図である。
pBR322上に担持されたイー・コリ(大腸菌)の
ペニシリナーゼ遺伝子に関する完全な基本配列な
らびに遺伝情報となる蛋白質の対応アミノ酸配列
を示す説明図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 選定蛋白質もしくはポリペプチドを細菌宿主
内で産生させてこれを宿主細胞の膜を通して分泌
させるに際し、プラスミドまたはフアージ遺伝子
よりなる群から選択されるクローン化ベヒクル内
において細胞外もしくは外質のキヤリヤ蛋白質に
対する細菌遺伝子を切断し、この切断部位に選定
蛋白質もしくはポリペプチドをコードする非細菌
性DNA断片を挿入することによりハイブリツド
遺伝子を形成し、このハイブリツド遺伝子により
前記細菌宿主を形質転換させ、かつ形質転換され
た細菌を培養してハイブリツド遺伝子を発現させ
ると共に、選定蛋白質もしくはポリペプチドを分
泌させることを特徴とする選定蛋白質もしくはポ
リペプチドの産生および分泌方法。 2 選定蛋白質が疎水性リーダーを有する真核細
胞蛋白質であり、前記疎水性リーダーは真核細胞
からの分泌の際に切断される特許請求の範囲第1
項記載の方法。 3 キヤリヤ蛋白質がイー・コリペニシリナーゼ
である特許請求の範囲第1項または第2項記載の
方法。 4 選定蛋白質がインシユリンである特許請求の
範囲第1項乃至第3項のいずれかに記載の方法。 5 キヤリヤ蛋白質がイー・コリペニシリナーゼ
でありかつ細菌遺伝子がPst制限部位にて切断さ
れる特許請求の範囲第1項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US05/913,533 US4411994A (en) | 1978-06-08 | 1978-06-08 | Protein synthesis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5519092A JPS5519092A (en) | 1980-02-09 |
JPS6246160B2 true JPS6246160B2 (ja) | 1987-09-30 |
Family
ID=25433372
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6901879A Granted JPS5519092A (en) | 1978-06-08 | 1979-06-04 | Selected protein producing method |
JP61066115A Expired - Lifetime JPH0755151B2 (ja) | 1978-06-08 | 1986-03-26 | 選定蛋白質およびそれをコードする組替えdna分子 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61066115A Expired - Lifetime JPH0755151B2 (ja) | 1978-06-08 | 1986-03-26 | 選定蛋白質およびそれをコードする組替えdna分子 |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP0006694B2 (ja) |
JP (2) | JPS5519092A (ja) |
AT (1) | ATE5001T1 (ja) |
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BG (1) | BG60444B2 (ja) |
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DD (1) | DD148235A5 (ja) |
DE (1) | DE2966291D1 (ja) |
DK (1) | DK237979A (ja) |
ES (1) | ES481362A1 (ja) |
FI (1) | FI791841A (ja) |
GR (1) | GR72953B (ja) |
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PT (1) | PT69737A (ja) |
WO (1) | WO1980000030A1 (ja) |
ZA (1) | ZA792486B (ja) |
Families Citing this family (109)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US6270955B1 (en) | 1978-12-22 | 2001-08-07 | Biogen, Inc. | Pharmaceutical compositions and methods for producing antibodies to hepatitis b virus and kits and methods for detecting antibodies to hepatitis b virus |
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