JPH0755151B2 - 選定蛋白質およびそれをコードする組替えｄｎａ分子 - Google Patents

選定蛋白質およびそれをコードする組替えｄｎａ分子

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JPH0755151B2
JPH0755151B2 JP61066115A JP6611586A JPH0755151B2 JP H0755151 B2 JPH0755151 B2 JP H0755151B2 JP 61066115 A JP61066115 A JP 61066115A JP 6611586 A JP6611586 A JP 6611586A JP H0755151 B2 JPH0755151 B2 JP H0755151B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の概要 外質もしくは細胞外の細菌蛋白質に対するプラスミドも
しくはファージ遺伝子を開裂させ、成熟核細胞からのた
とえばインシュリンのような選定蛋白質またはその一部
についての遺伝情報を伝える二重鎖DNA配列を組替えDNA
技術により開裂遺伝子中に組み込み、これを使用して細
菌を形質転換させ、分泌された選定蛋白質を回収する。
この発明はアメリカ合衆国厚生および文部省の認可補助
の下に行なわれた研究の成果である。
この発明は、特定の蛋白質を細菌中に生成させ、これを
細菌細胞から分泌させる方法に関するものであり、さら
に詳細には所望の非細菌性蛋白質またはその一部を再現
するDNAを組替え技術により外質蛋白質もしくは細胞外
蛋白質（以後、「キャリヤ蛋白質」と云う）に関するプ
ラスミドもしくはファージ遺伝子中に組み込み、この組
替えた遺伝子により細菌宿主を形質転換させ、そして形
質転換された宿主を培養して蛋白質を分泌させる方法に
関するものである。このようにして生成された蛋白質
は、キャリヤ蛋白質遺伝子の選択に応じて常法により培
養基からまたは外質空間から回収することができる。
特定蛋白質を再現するDNAを細胞内蛋白質に関する遺伝
子中に組み込むことは公知である〔イタクラ等、サイエ
ンス、第198巻、第1056〜1063頁（1977）〕。しかしな
がら、この場合の問題点は、このようにして作られた蛋
白質は他の細胞内蛋白質と混ざり合い、したがって細胞
内の酵素により劣化され、その結果所望の蛋白質生成物
を純粋な形で得る際問題が生ずるということである。
前記の問題点を解消するため、本発明によればハイブリ
ッド遺伝子、前記ハイブリッド遺伝子は細胞外もしくは
外質のキャリヤ蛋白質および選定蛋白質またはポリペプ
チドをコードする非細菌性遺伝子とからなり、前記非細
菌性遺伝子は前記細胞外もしくは外質のキャリヤ蛋白質
をコード細菌遺伝子の一部に局在している、が提供され
る。
実例として、キャリヤ蛋白質のアミノ酸末端に疏水性ア
ミノ酸のリーダー配列（leader sequence）を有しか通
常キャリヤ蛋白質を生成する細胞の巻を通して分泌さ
れ、しかもこの分泌の際に疏水性リーダー配列の開列を
伴なうようなこのキャリヤ蛋白質に関する遺伝子を使用
して選定蛋白質を生成させることができ、この生成蛋白
質をキャリヤ蛋白質の選択に応じて外質空間（periplam
ic space）から或いは細菌を繁殖させた培養基から回
収することができる。このようにして、細菌内における
他の蛋白質による汚染が避けられると共に異質蛋白質を
劣化させるような細菌細胞内の酵素を避けることにより
大きな安定性が達成される。
本発明において使用しうるキャリヤ蛋白質に関する細菌
遺伝子としては、抗生物質耐性に関する遺伝子、たとえ
ばペニシリン耐性またはペニシリナーゼに関する遺伝
子、クロラムフェニコール耐性に関する遺伝子、或いは
テトラサイクリン耐性に関する遺伝子ならびにアルカリ
フォスファターゼに関する遺伝子およびバクテリアボヌ
クレアーゼに関する遺伝子が挙げられる。
各種の蛋白質もしくはその部分についての遺伝情報を伝
える遺伝子またはDNA断片を、本発明の方法により細菌
性キャリヤ蛋白質遺伝子に組み込むことができる。上記
の各種の蛋白質には、たとえば成熟核（真核）細胞蛋白
質およびウイルス蛋白質のような各種の非細菌性蛋白質
が包含される。特に重要なものは、たとえばインシュリ
ン、ヒト生育ホルモン、インターフェロンおよび他の医
薬活性蛋白質のような成熟核細胞蛋白質である。これら
は、それぞれ各遺伝子によりアミノ酸末端に一連の疏水
性アミノ酸を有するプレ蛋白質または先駆蛋白質として
合成される。この疏水性リーダー配列は、細菌膜を通し
て分泌される細菌蛋白質のリーダー配列と同一ではな
い。したがってプレインシュリンなど高級細胞のプレ蛋
白質が疏水性リーダー配列を有するという事実があり、
しかもそのようなプレ蛋白質がたとえば細菌細胞内で合
成され得たとしても、このプレ蛋白質を細菌細胞内で発
達完成させ得ると期待することはできない。さらに、本
発明の方法は、細菌細胞内における成熟核細胞の完成蛋
白質（これらは有用であることが知られている）の合成
とその分泌を与える他に、産業上興味のあるその他の細
胞外生成物を細菌細胞内で合成しかつそこから生成物を
分泌することも可能にさせる。これら生成物としては、
融合蛋白質および上記したようなキャリヤ蛋白質よりな
る融合蛋白質が挙げられ、これらは特定の決定因子たと
えばウイルス抗原（たとえばコート蛋白質などウイルス
の抗原蛋白質）を担持する。これら後者の融合蛋白質は
ワクチン製造に有用であり、かつその抗原特性のためウ
イルスに対して特異的な免疫反応の発生を誘起させるこ
とができる。この種のワクチンは、如何なる生ウイルス
もまた不活性ウイルス材料も含有していないので、極め
て安全である。さらに、この方法によれば、培養によっ
て繁殖させ得ないようなウイルスに対してもワクチンを
作ることが可能である。
以下、実施例により本発明を一層詳細に説明するが、こ
れにより本発明は制限を受けるものではない。
実施例 キャリヤ蛋白質として、イー・コリ（E.coli、大腸菌）
・ペニシリナーゼを使用し、これに対する遺伝子を小さ
いプラスミドpBR322上に担持させた。この遺伝子の制限
酵素地図を図中に示す。このプラスミドベクターは、ボ
リヴァール等により記載されている〔Bolivar et al.,
Gene,2,95〜113（1977）〕。宿主細菌としては、イー・
コリ〔E.coli×1776＊〕を使用した〔カーチス等、イ・
レコンビナント・モレキュール：インパクト・オン・サ
イエンス・アンド・ソサイエティー，プロシーディング
ス・オブ・テンス・マイルス・インターナションナルシ
ンポジウム，ベールス・アンド・バセット、45〜56（19
77）:Curtiss et al.in Recombinant Molecules:Impact
on Science and Society,Proceedings of the Tenth M
iles International Symposium,eds.Beers ＆ Bassett,
45〜56（1977）〕。
＊ E.coli×1776はアメリカ合衆国、メリーランド州、
ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションに寄託されて一般に使用しうる状態におかれて
おり、ATCC No.31244が付与されたものである。
宿主−ベクターの組合せは確証されたEK2システムであ
り、これはアメリカ合衆国ナションナル・インスチチュ
ート・オブ・ヘルス（NIH）により1977年７月７日付で
保証されたものである。
プラスミドは、図中に示すように、アミノ酸181および1
82の位置に対応してペニシリナーゼ遺伝子のPst〔プロ
ビデンシア・スチュアルティイ・エンドヌクレアーゼ
（providencia stuartii endonuclease）〕制限位置を
有する。二重鎖cDNAを、Ｘ線誘発させた移植可能のラッ
テＢ−細胞腫瘍から単離されたプレプロインシュリンmR
NA（PPI−mRNAを含有するRNAから合成した〔チック等、
プロシーディング・ナッションナル・アカデミー・サイ
エンス・USA（P.N.A.S.）,74,628−632（1977）:Chick
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA〕。凍結腫瘍スライス
物の各20gを乳鉢と乳棒により滅菌砂と共に磨砕し、Mg
2+での沈澱によりポスト−ヌクレア（post−nuclear）
上澄液から細胞質RNAを精製し〔パルミター，バイオケ
ミストリー、13,3603〜3615（1974）:Palmiter,Biochem
istry〕，次いでフェノールとクロロホルムで抽出し
た。このRNAをアリゴ−dT−セルロース・クロマトグラ
フィーによりさらに精製し〔アヴイブ等、P.N.A.S.,69,
1408−1412（172）〕、二重砂cDNA合成に対するひな型
としてそのまま使用した〔エフストラチアディス等、セ
ル,7,279〜288（1976）;Efstratiadis et al.,Cell〕
が、ただし特定のｐ（dT）8dG−dCプライマー（共同研
究）を用いて逆転写させた。RNAとプライマーの濃度は
それぞれ7mg/μであった。全ての４種のα−P32−dNT
Psは1.25mMであった（最終比活性0.85Ci/mモル）。逆転
写はRNAインプットの２％であり、その25％が二重鎖DNA
精製物中に最終的に回収された。
二重鎖cDNAを次に手順によりプラスミドpBR322のPst位
置に組み込んだ。すなわち、pBR32DNA（5.0μｇ）をPst
で線状化し、約15dG残基を1mMのCo2+〔ロイチヨウドハ
リー等、核酸研究,3,101〜116（1976）〕およびオート
クレーブにかけた100μg/mlのゼラチンの存在下に15℃
で末端トランスフェラーゼにより３′末端に対して付加
した。同じ手順を用いてdc残基を2.0μｇの二重鎖cDNA
に付加した。反応混合物をフェノールで抽出し、エタノ
ールで沈澱させた。dC末端の二重鎖cDNAを６％ポリアク
リルアミドゲル中において自然条件下で電気泳動させ
た。放射線写真に従って、300〜600塩基対の寸法範囲の
分子（0.5μｇ）をゲルから溶出させた〔エフストラチ
アジス等、メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジ
ー、8,1〜124（1976）;Efstratiadis et al.,in Method
s in Molecular Biology〕。溶出された二重鎖cDNAをエ
タノール沈澱により濃縮し、pH8のトリス緩衝液10mM中
に再溶解させ、dG末端のpBR322の５μｇと混合し、次い
で0.1MのNaCl、10mMのEDTA,pH8の10mMのトリスに対して
透析した。次いで、混合物（4ml）を56゜の温度で２分
間加熱し、42゜の温度でアニールを２時間行なった。こ
のハイブリッドDNAを使用してイー・コリ×1776を形質
転換させた。オリゴdC−dG結合を用いて、後に組み込み
を行ないうるようにPstカットを再生させる。イー・コ
リ×1776の形質転換（pBR322を有するEK−２宿主、EK−
２ベクター）を、フィーデラルレジスター（Federal Re
gister）中に1976年７月７日付で発行された組替えDNA
研究に関するN.I.H.ガイドラインに従って、P3物理的封
鎖施設における生物学的安全装置内で行なった。
イー・コリ×1776をトランスフェクション法〔エネア
等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,9
6,495〜509（1975）;Enea et al.,J.Mol.Biol.〕により
形質転換させたが、ただしこの方法を次のように僅かに
変えた。すなわち、イー・コリ×1776を、10μg/mlのジ
アミノ−ピメリン酸と40μg/mlのチアミジン（シグマ）
とをA590が0.5になるよう加えたＬ型培養基〔トリプト
ン10g、酵母エキス5g、NaCl5g（ディフコ社）〕中で繁
殖させた。200ml部の細胞を3000rpmにて沈降させ、MnCl
270mMとpH5.6のNaAc40mMとCaCl230mMとを含有する冷緩
衝液1/10容量中にスワールにより再懸濁させ、氷上に20
分間保った。これら細胞を再ペレット化し、次いで同じ
緩衝液における元の容量の1/30中に再懸濁させた。アニ
ールされたDNA（2ml）をこれら細胞に加えた。この混合
物の一部（0.3ml）を滅菌試験管中に入れて氷上で60分
間培養した。次いでこの細胞を37゜の温度に２分間置い
た。培養基を角試験管に加え（0.7ml）、この試験管を
温度37゜で15分間培養した。200μ部の細胞を、テト
ラサイクリン15μg/mlを含有する寒天板の上に置かれた
滅菌ニトロセルロースフイルター（ミリポア社）の上に
展延させた〔このフイルターは使用前に煮沸して洗剤を
除去した〕。この寒天板を37゜で48時間培養した。フイ
ルターのレプリカを作った。形質転換体を含有するニト
ロセルロースフイルターを寒天から外し、滅菌ワットマ
ン濾紙の層上に置いた。コロニーを含むフイルターの上
部に新たな無菌フイルターを置き、無菌ベルベット布と
二重ブロックとを用いて圧力をかけた。無菌針を用いて
フイルターを止めた。第二のフイルターを新たな寒天板
の上に置き、37゜で48時間培養した第一のフイルター上
のコロニーをグルンスタイン−ホグネス〔P.N.A.S.72,3
961−3965（1975）〕の技術によりスクリーニングし、
この場合試料としてはラッテのオリゴ−dT結合RNAから
転写された高比活性cDNAのHae III切断により生成され
た80ヌクレオチッド長さの断片を使用した。陽性コロニ
ーを次のようにしてハルト（HART）法〔パターソン等、
P.N.A.S.74,4370〜4374（1977）〕により再スクリーニ
ングにかけた。プラスミドDNA（約３μｇ）をPstで切断
させ、エタノール沈澱させ、次いで20μのジオン化ホ
ルムアミド中に直接に溶解させた。95゜で１分間加熱し
た後、各試料を氷上に置いた。1.5μｇのオリゴ（dT）
−セルロース結合RNAと1mMまでのpH6.4のパイプス（PIP
ES）と0.4MまでのNaClとを添加した後、混合物を50゜で
２時間培養した。次いで、これを水75μの添加により
希釈し、10μｇの麦芽tRNAの存在下でエタノール沈澱さ
せ、70％エタノールで洗浄し、H2O中に溶解させ、麦芽
の無細胞翻訳混合物に加えた〔ロバート等、P.N.A.S.7
0,2330〜2334（1973）〕。23℃で３時間の後、２μづ
つ２回取り出してトリクロル酢酸により沈澱させ、残余
の反応混合物をリボヌクレアーゼで処理し、免疫分析用
緩衝液で希釈し、そして二重抗体免疫沈澱〔ロメジコ
等、核酸研究、3,381〜391（1976）;Lomedico et al.,N
ucleic Acids Res.〕により免疫反応性プレプロインシ
ュリンの合成の分析を行なった。洗浄した免疫沈澱を1m
lのNCS（アメルシャム）中に溶解させ、液体シンチレー
ションにより10μのオムニフルオール（Omnifluor）
（ニュー・イングランド・ヌクレア）中で計数した。
１つのコロニーをハルト・スクリーニング法で同定し
た。Pstに作用しうるインサートは、マキサムおよびギ
ルバートの方法〔P.N.A.S.74,560〜564（1977）〕によ
り配列決定を行なって、それがラッテのプレプロインシ
ュリンＩの配列に相当することを示した。ニックトラン
スレーション（Nicktranslation）によりDNAポリメラー
ゼＩでラベルしたこのインサートを使用して、グルンス
タイン−ホグネス分析法により200種の形質転換体をス
クリーニングした。ラッテのプレプロインシュリンcDNA
プローブにハイブリド化する48種のクローンが同定され
た。
形質転換されたイー・コリ×1776のこれら48種のクロー
ンをその場で放射線免疫技術によりスクリーニングし
て、これらクローンがインシュリン抗原を生成している
かどうか、またこれらクローン融合ポリペプタイド鎖
〔この一末端はインシュリン抗原であり、他端はペニシ
リナーゼ（バクテリヤキャリヤ蛋白質）抗原である〕を
生成しているかどうかを決定した。融合ポリペプタイド
鎖が存在することは、これらクローンがペニシリナーゼ
に関するバクテリヤ遺伝子とインシュリンに関する成熟
核細胞遺伝子との融合生成物である遺伝子を含有するこ
とを示している。このような融合ポリペプタイド鎖は、
下記する技術により実際に見出された。この技術は、探
求されている融合蛋白質が２種の抗原末端を含み、その
それぞれがそれぞれ特定の抗体に結合するという事実を
利用する。特定抗体をプラスチック円板の上に置き、溶
解バクテリア細胞からの抗原蛋白質をこの円板と接触さ
せて載置し、次いでこの円板を洗い、放射性抗体に曝し
た。蛋白質分子は一方の抗原決定因子を有するプラスチ
ックに固定された抗体に結合し、次いで第二の決定因子
を有する放射性抗体を係合するであろう。もし抗ペニシ
リナーゼが円板上に存在しかつ抗インシュリンがラベル
されるならば、「サンドイッチ」を洗浄した後、残存す
る放射活性の点のみが融合蛋白質の存在を示すであろ
う。さらに詳細には、この方法は次のようにして行なわ
れた。
それぞれ直径8.25cm、厚さ8mmの透明ポリビニル（PV）
の円板（ドラ・メイ社、ニューヨーク）を平滑な紙シー
トの間で平板にした。次いでガラス製ペトリ皿中におい
て、この円板を60μg/mlのIgGを含有するpH9.2の0.2Mの
NaHCO310mlを含む液体の表面上に載置した、室温に２分
間以上置いた後、円板を取出し、冷洗浄緩衝液（WB）10
mlで２回洗浄した。ここで用いた緩衝液は燐酸緩衝塩水
と0.5％正常モルモット血清と0.1％子牛血清アルブミン
と0.3mg/ml硫酸ストレプトマイシンとからなるものであ
る。各円板を、洗浄後に直ちに使用した。
リゾチーム0.5mg/mlと30mMのトリス（pH8）と10mMのEDT
Aとを含有する1.5％アガロース上にコロニーを移すこと
により、抗原を最近細胞から遊離させた。IgG被覆され
たPV円板表面をアガロースと細菌コロニーの面に向けて
載置し、４゜の温度で60分間放置した。次いで、各円板
を取外し、冷WB10mlで３回洗浄した。この段階で、固相
抗体層上への抗原の免疫吸着を完了した。
かくして円板に付着しているI125でラベルした抗体と抗
原との反応は、５×106cpm（γ放射）のI125−IgGを含
有する1.5mlのWBを、ペトリ皿の底部に置かれた通常の
ナイロンメッシュからなる直径8.25cmの平たい円板の中
心部に固定することにより行なった。ナイロンメッシュ
は離間材として作用した。前期段階におけるように処理
した円板を、次いでメッシュと溶液との面に向けて載置
し、４゜で一晩培養した。次いで各円板を10mlの冷WBで
２回および水で２回洗浄し、室温にて乾燥させた。この
時点で、融合蛋白質はIgGの通常の層と放射線ラベルし
た層の両者に結合されている。次いで、これら蛋白質を
通常の放射線写真技術によりこの放射線写真技術として
は、たとえばラスキー等〔Lasky et al.,FEBS Lett.,8
2,314〜316（1977）〕により記載されているような、コ
ダックNo.スクリーンフイルムまたはコダックＸ−OMATR
フイルムとデュポン・クロネックス照射および増強スク
リーンとを用いた。抗インシュリンと抗ペニシリナーゼ
両IgG部分が上記の方法に必要とされた。抗インシュリ
ン抗血清はモルモットから得られる市販品とした。兎抗
ペニシリナーゼ抗血清は1mgの純ペニシリナーゼ（完全
フロインドアジュバント（デイフコ社）中のもの）をニ
ュージーランド産の白兎に注射して生成させた。最初の
注射後2,3週間でブースター注射を不完全フロインドア
ジュバント（デイフコ社）において施こし、１週間後に
兎を出血させた。
硫酸アンモニウムによる沈澱および続いて0.025Mの燐酸
カリウム（pH7.3）、１％グリセリンにおけるDEAE−セ
ルロース（ワットマンDE−52）のクロマトグラフィーに
より各免疫血清からIgG部分を調製した。大部分の溶出
物質を含有する画分を集め、硫酸アンモニウムを40％飽
和まで加えて蛋白質を沈澱させた。得られたペレットを
元の血清容量の1/3の0.025M燐酸カリウム（pH7.3）、0.
1M NaCl、１％グリセリンに再懸濁させ、同じ緩衝液に
対して透析した。透析後、遠心分離により全ての残留沈
澱物を除去し、IgG部分を−70゜に貯蔵した。
各IgG部分をハンター等〔Hunter et al.,Biochem.J.,
91,43〜46（1964）〕の常法により沃素放射能分析にか
けた。25μの反応混合物は0.5Mの燐酸カリウム（pH7.
5）と、2mCiのキャリヤフリーのNaI125と、150μｇのIg
Gと２μｇのクロラミンＴとを含有した。室温にて３分
間の後、PBS25μ中のメタ重亜硫酸ナトリウム８μｇ
を加え、次いで２％正常モルモット血清を含有するPBS2
00μを加えた。I125でラベルしたIgGを、２％正常モ
ルモット血清を含有するPBSで平衡状態にしたセファデ
ックスＧ−500のカラムにおけるクロマトグラフィーに
より精製した。I125−IgG溶出画分を、10％正常モルモ
ット血清を含有するPBSで5ml希釈し、滅菌ミリポアVCフ
イルター（0.1μｍ孔径）を通して濾過し、幾つかの部
分に分けて−70゜で貯蔵した。比活性は1.5×107cpm/μ
ｇであった。
このスクリーニングにより、ペニシリナーゼおよびイン
シュリン抗原決定因子を示す融合蛋白質を合成かつ分泌
する１種類のイー・コリ×1776のクローンが検出され
た。外質系から回収されたこの蛋白質は放射線免疫分析
においてインシュリンに似ている。DNA配列が示すとこ
ろでは、この蛋白質はペニシリナーゼとプロインシュリ
ンとの間の融合体であり、この２種類の蛋白質はペニシ
リナーゼのアミノ酸182（アラニン）とプロインシュリ
ンのアミノ酸４（グルタミン）との間で６つのグリシン
により結合されている。かくして、より高度の細胞ホル
モンが細菌中において抗原活性型として合成された。
所望の成熟核細胞蛋白質に対するDNA配列を、このpBR32
2プラスミドが情報伝達する蛋白質のアミノ酸101と102
との間の位置に相当するHind IIカット中に、或いはア
ミノ酸45に相当する一のTaqカット中に組み込むことが
できることが判るであろう。全ての場合、もし成熟核細
胞DNAを末端のランダム付加によりまたは他の方法によ
り相の中に配列するならば、これはキャリヤ蛋白質の融
合部分として表現され、その蛋白質は細胞から分泌され
るであろう。さらに、このプラスミド中にまたはその他
の中に存在するペニシリナーゼ遺伝子の配列は、突然変
異により或いはたとえば接合に便利な新規の制限カット
を組み込むような方法で遺伝子の特点個所にDNA断片を
組み込む直接組替えDNA技術により改変させることがで
きる。たとえば、プラスミドpBR322上のR1カットは突然
変異により除去することができ、またR1配列を結合（li
gation）によりペニシリナーゼ遺伝子中に組み込むこと
ができる。これは恐らく遺伝子を不活性化させるであろ
うが、DNAのこの領域をキャリヤ蛋白質の合成のために
使用することを妨げないであろう。
疏水性リーダーの末端に位置するアミノ酸23に対するコ
ード（code）と、たとえばTaqカットに位置するアミノ
酸45に対するコードとの間に存在するペニシリナーゼ遺
伝子DNAの断片は、適当な酵素の混合物によりDNAの切除
により除去することができる。この種の１つの混合物は
ラムダエキソヌクレアーゼであり、これは酵素S1と共同
して５′末端からDNA鎖を切断し、一本鎖オーバーハン
グを除去する。この種の他の混合物としてはT4DNAポリ
メラーゼがあり、これはS1と共に１本のDNA鎖の３′末
端を切断し、同様に一本鎖オーバーハングを除去する。
調節切断により、プラスミドDNA分子を適当に短縮し
て、R1カットからアミノ酸23に符号する点まで或いは疏
水性リーダー配列上の他の点まで延在する断片にするこ
とができ、このような断片を融合させてインシュリン配
列を有する同様に発生された断片にし、これを便利な初
期点、すなわち成熟インシュリン分子が始まる点まで酵
素的に切断することができる。これら２つの断片を、た
とえばT4DNAリガーゼによる末端結合により融合させ、
この融合体をプラスミド中に組み込むことができる。こ
の融合体は、キャリヤ遺伝子がイー・コリの疏水性リー
ダー配列にのみ符合しかつ成熟核細胞遺伝子が残余の構
造情報を与えるような形質転換体のキャリヤ蛋白質をも
たらす。このような構成は原則的には正確に行なうこと
もできるが、実用的には恐らくランダムに行なわれ、興
味ある領域に末端部を有する各種の遺伝子断片を接合さ
せる操作を含み、また融合断片により形質転換されにバ
クテリヤクローンを囲む培地を検査して、たとえば上記
したようなRIAにより抗原活性を蛋白合成の証拠として
検出する。
本発明の方法はイー・コリ・ペニシリナーゼ遺伝子を使
用することのみに限定されるものではなく、多重転写プ
ラスミド上またファージ上に担持された任意の分泌蛋白
質に対する遺伝子にも応用することができる。また本発
明方法はインシュリンのみに限定されるものではなく、
相中に翻訳された場合ウイルス蛋白質中または成熟核細
胞蛋白質中の抗原決定因子に符合するコード領域を有す
るようなウイルスまたは成熟核細胞の任意のDNA断片の
融合蛋白質を発現させるためにも使用することができ
る。たとえば、もし動物ウイルスDNAの断片をペニシリ
ナーゼ遺伝子のPstもしくはHind IIの位置に組み込むな
らば、或る感受性バクテリヤは融合蛋白質を合成し、こ
の蛋白質はウイルス抗原に対して特異的な抗体を用いRI
A技術により確認することができる。この融合蛋白質を
次いで精製しかつ使用して動物または人間における抗体
反応を刺戟し、ウイルス蛋白質上の特定位置に向けられ
た抗体を生産させるかまたはウイルス抗原に対するワク
チン接種として利用することができる。融合蛋白質はこ
の種のワクチン接種に再し補助決定因子を与えて免疫反
応を促進させるが、恐らく集合状態の融合蛋白質をワク
チン中に使用しなければならないであろう。使用しうる
と思われる特定のキャリヤ蛋白質は細菌蛋白質自体であ
るか或いはさらに細菌蛋白質キャリヤ蛋白質中に有用な
補助決定因子を与えるような他の便利な配列との間の融
合体である。
【図面の簡単な説明】
第１図，第２図および第３図はプラスミドpBR322上に担
持されたイー・コリ（大腸菌）のペニシリナーゼ遺伝子
に関する完全な基本配列ならびに遺伝情報となる蛋白質
の対応アミノ酸配列を示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リデイア ジエー ヴイラーコマロフ アメリカ合衆国、マサチユーセツツ州 02130、ボストン、ポンド サークル 15 番 (72)発明者 アルギリス エー エフストラチアデイス アメリカ合衆国、マサチユーセツツ州 02138、ケンブリツジ、トラウブリツジ ストリート 16番 (56)参考文献 Ｇｅｎｅ Ｖｏｌ．２ Ｐ．95〜113 （1977)

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ハイブリッド遺伝子からなる組替えDNA分
    子であって、前記ハイブリッド遺伝子は細胞外もしくは
    外質のキャリヤ蛋白質に対する細菌遺伝子と、選定蛋白
    質もしくはポリペプチドをコードする非細菌性遺伝子と
    からなり、前記非細菌性遺伝子が前記細胞外もしくは外
    質のキャリヤ蛋白質をコードする前記細菌遺伝子の部分
    内に局在にすることを特徴とする組替えDNA分子。
  2. 【請求項２】非細菌性遺伝子が細菌遺伝子内でその中の
    制限エンドヌクレアーゼ部位に局在する特許請求の範囲
    第１項記載の組替えDNA分子。
  3. 【請求項３】制限エンドヌクレアーゼ部位がPst部位で
    ある特許請求の範囲第２項記載の組替えDNA分子。
  4. 【請求項４】細菌遺伝子がイー・コリペニシリナーゼに
    対する遺伝子である特許請求の範囲第１項記載の組替え
    DNA分子。
JP61066115A 1978-06-08 1986-03-26 選定蛋白質およびそれをコードする組替えｄｎａ分子 Expired - Lifetime JPH0755151B2 (ja)

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