CN116669558A - 用于害虫防治的mu-沙漠灌木蛛毒素-dc1a变体多肽 - Google Patents

用于害虫防治的mu-沙漠灌木蛛毒素-dc1a变体多肽 Download PDF

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Abstract

本发明公开了新的杀昆虫肽、多肽、蛋白质和核苷酸；它们在培养基和植物中的表达；生产这些肽、多肽、蛋白质和核苷酸的方法；新工艺；新的生产技术；新的制剂；和新的生物体。本发明还涉及一种命名为Dc1a‑变体多肽(DVP)的新型肽，其为非天然存在的、修饰形式的肽Mu‑沙漠灌木蛛毒素‑Dc1a，分离自美国沙漠蜘蛛(Diguetia canities)。此处，我们描述了：编码DVP的基因；基因和肽的各种制剂和组合；以及使用这些制剂和组合防治昆虫的方法。此外，本发明涉及具有胱氨酸结(CK)结构的新型重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)，这些CRP通过从具有四个或更多个二硫键的多肽中去除一个或多个二硫键产生。

Description

用于害虫防治的MU-沙漠灌木蛛毒素-DC1A变体多肽
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月28日提交的美国临时申请序列号63/084,339的权益和优先权。上述申请的全部内容均并入本文。
序列表
本申请全文以引用方式并入名称为“225312-497884_ST25.txt”(126千字节)的序列表，该序列表创建于2021年9月27日下午6:32，为126KB，并在此以电子方式提交。
技术领域
本公开提供了杀昆虫蛋白、核苷酸、肽、它们在植物中的表达、产生这些肽的方法、新的制剂，以及描述了用于防治昆虫的方法。
背景技术
有害昆虫对人类健康和粮食安全构成了全球性的威胁。昆虫对人类健康构成威胁，因为它们是疾病的媒介。蚊子是最臭名昭著的疾病媒介昆虫之一。按蚊属(Anopheles)的蚊子是寨卡病毒、基孔肯雅病毒和疟疾的主要媒介，疟疾是由锥虫属(Trypanosoma)的原生动物引起的疾病。另一种蚊子，埃及伊蚊(Aedes aegypti)是引起黄热病和登革热的病毒的主要媒介。并且伊蚊属(Aedes)物种的蚊子也是导致各种类型脑炎的病毒的媒介。班氏丝虫(Wuchereria bancrofti)和马来丝虫(Brugia malayi)是引起丝虫病的寄生蛔虫，通常由库蚊属(Culex)、曼蚊属(Mansonia)和按蚊属的蚊子传播。
与蚊子相似，双翅目(Diptera)中的其他成员自古以来同样也困扰着人类。除了产生疼痛的叮咬以外，马蝇和鹿蝇可传播兔热病(土拉巴斯德氏菌(Pasteurellatularensis))和炭疽(炭疽杆菌(Bacillus anthracis))的细菌性病原体，以及在热带非洲引起罗阿丝虫病的寄生蛔虫(罗阿丝虫)。
丽蝇(大头金蝇(Chrysomya megacephala))和家蝇(普通家蝇(Muscadomestica))将在一瞬间从腐肉和粪便中起飞，并在下一瞬间飞到我们的家中以及我们的食物上，从而在它们身后传播痢疾、伤寒、霍乱、脊髓灰质炎、雅司病、麻风病和结核病。
潜蝇属(Hippelates)的眼潜蝇可携带引起雅司病(雅司螺旋体(Treponemapertenue))的螺旋菌病原体，并且也可传播结膜炎(红眼病)。舌蝇属(Glossina)的采采蝇传播引起非洲昏睡病的原生动物病原体(冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)和罗得西亚锥虫(T.rhodesiense))。白蛉属(Phlebotomus)中的白蛉是在南美洲引起卡里翁氏病(奥罗亚热)的细菌(杆菌状巴通体(Bartonella bacilliformis))的媒介。在亚洲和北非的部分地区，它们传播引起白蛉热(三天热)的病毒因子以及引起利什曼病的原生动物病原体(利什曼原虫(Leishmania)属)。
人类食物安全也受到昆虫的威胁。昆虫害虫无差别地以专用于商业目的和个人用途的粮食作物为目标；实际上，由昆虫害虫造成的损害可涵盖广泛范围，从前者单纯的不便到经济破坏，再到后者营养不良或饥饿等极端情况。昆虫害虫也会对家养动物造成压力和疾病。并且，由于全球旅行和气候变化，曾经受制于地理和气候边界的昆虫害虫已经扩大了它们的范围。
发明内容
本公开描述了具有对一种或多种昆虫物种的杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)。此处，DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了由DVP、DVP杀昆虫蛋白或它们的组合和赋形剂组成的组合物。
本公开描述了用于编码DVP的多核苷酸，其中DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或它们的互补核苷酸序列。
此外，本公开描述了生产DVP的方法，该方法包括：制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含用于编码DVP的多核苷酸和/或其互补核苷酸序列，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；将载体引入酵母细胞；以及在用于能够使DVP表达和分泌到生长培养基中的条件下，在生长培养基中培养酵母细胞。
本公开描述了对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括将杀虫有效量的由DVP、DVP杀昆虫蛋白或它们的组合和赋形剂组成的组合物施用至害虫所在处，或施用至易受害虫侵袭的植物或动物。
此外，本公开描述了包含多核苷酸的载体，该多核苷酸用于编码DVP，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
本公开还描述了酵母菌株，该酵母菌株包含：第一表达盒，该第一表达盒包含用于编码DVP的多核苷酸，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T。
此外，本公开提供了重组CRP，该重组CRP包含根据以下式(II)的胱氨酸结(CK)结构、基本上由其组成或由其组成：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成该胱氨酸结基序的唯一二硫键；其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽亚基；其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在；其中所述重组CRP通过修饰具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP来产生，其中该一个或多个非CK二硫键不是该第一二硫键、该第二二硫键或该第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成该CK基序；其中通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰该可修饰CRP；其中从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP；并且其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
此外，本公开描述了制备重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的方法，该重组CRP包含根据以下式(II)的胱氨酸结(CK)结构：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成该胱氨酸结基序的唯一二硫键；其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽亚基；其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在；所述方法包括：(a)提供具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中该一个或多个非CK二硫键不是该第一二硫键、该第二二硫键或该第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成该CK基序；以及(b)通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰该可修饰CRP；其中从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP；并且其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
本公开还描述了增加重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的产量的方法，所述方法包括：(a)产生具有根据以下式(II)的胱氨酸结(CK)结构的重组CRP：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成该胱氨酸结基序的唯一二硫键；其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽亚基；其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在；其中根据下列方法来产生所述重组CRP：(b)提供具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中该一个或多个非CK二硫键不是该第一二硫键、该第二二硫键或该第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成该CK基序；(c)通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰该可修饰CRP；其中从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP；并且其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由以下项中任一项所示的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由以下项中任一项所示的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由以下项中任一项所示的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:213或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:213或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由以下项中任一项所示的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:213或217-219；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含SEQ ID NO:213所示的氨基酸序列；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由SEQ ID NO:213所示的氨基酸序列组成；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含SEQ ID NO:217所示的氨基酸序列；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由SEQ ID NO:217所示的氨基酸序列组成；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含SEQ ID NO:218所示的氨基酸序列；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由SEQ ID NO:218所示的氨基酸序列组成；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含SEQ ID NO:219所示的氨基酸序列；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由SEQ ID NO:219所示的氨基酸序列组成；或其药学上可接受的盐。
此外，本公开描述了包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP的融合蛋白；其中所述一种或多种DVP具有与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中DVP相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐。
附图说明
图1示出了野生型(WT)Dc1a的高效液相色谱(HPLC)标准曲线。
图2示出了纯WT Dc1a的HPLC色谱图。
图3描绘了显示出DVP C41T/C51A和C41T/C51A/W31F/Y32S/P36A的相对产量的图。DVP C41T/C51A/W31F/Y32S/P36A与C41T/C51A相比，在表达上具有69％的增加。
图4描绘了C41T/C51A的色谱图。表示背景、折叠和错误折叠变体的峰示于括号中。
图5描绘了C41T/C51A/D38A/L42V的色谱图。表示背景和折叠变体的峰由标记表示。
图6描绘了显示出DVP相对表达的总结的图，该图示出了表达增加而没有活性损失。此处，分析了WT-Dc1a和以下DVP：(1)C41T/C51A；(2)C41T/C51A/D38A；(3)C41T/C51A/D38A/L42V和(4)C41S/C51S/D38A/L42V。
图7示出了评价WT-Dc1a和以下DVP的影响的蝇击倒实验结果：(1)C41T/C51A；(2)C41T/C51A/D38A和(3)C41S/C51S/D38A/L42V。通过评估在24小时的蝇击倒(即，不能行走)百分比(在24小时的击倒％)来生成剂量-反应曲线。
图8描绘了显示出在24小时的野生型(三角形)和以下DVP的击倒百分比的图：(1)C41T/C51A/D38A(SEQ ID NO:29)(菱形)和C41S/C51S/D38A/L42V(SEQ ID NO:53)(正方形)。
图9描绘了DVP杀昆虫蛋白的示意图。此处，各组分定义如下：“ERSP”是指内质网信号肽；“UBI”是指泛素单体；“DVP”是指Mu-沙漠灌木蛛毒素变体多肽；“L”是指间插接头肽；并且“HIS”指组氨酸标签。
图10描绘了植物表达的WT Dc1a和DVP杀昆虫蛋白的His标签蛋白质印迹。每条泳道代表在变性蛋白质凝胶条件下运行，并使用标准蛋白质印迹技术进行可视化的粗植物提取物。在图像上方列出了在蛋白质印迹中测试的样品的简称以及表达的评级系统。符号(-)表示印迹上未检测到蛋白质，并且如果检测到蛋白质，则符号(+)至(+++)表示检测到的量。标示“梯”的泳道示出了分子量标记。泳道“植物阴性对照”示出了阴性对照(即，表达GFP的烟草蛋白提取物)。用“M#”标记的泳道表示所评价的DVP杀昆虫蛋白的简称。泳道“WT”示出了具有WT Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a蛋白质的杀昆虫蛋白。
图11示出了表明与背景DVP相比的高产量DVP的产量的图。此处，对具有以下突变的背景DVP进行点突变：D38A、C41S和C51S。背景DVP的突变包括：L42I、K2L、Y32S、K2L+Y32S、D38T、D38S和D38M。经由rpHPLC评估产量，并相对于背景DVP进行归一化。具有另外的突变L42I、K2L、Y32S、K2L+Y32S、D38T和D38S的DVP相对于C41S/C51S/D38ADVP背景(SEQ ID NO:47)对照，都具有相对提高的产量。
图12示出了显示出K2L、Y32S和L42I突变的结果的图。此处，以下DVP的产量：(1)K2L/Y32S/L42I(SEQ ID NO:217)和(2)K2L/Y32S/D38A/L42I/C41S/C51S(SEQ ID NO:218)与WT Dc1a(SEQ ID NO:2)的产量进行比较。组合突变K2L、Y32S和L42I导致表达水平显著增加。
图13描绘了显示出式(II)的示意图，该示意图描述了具有胱氨酸结(CK)结构的重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)。此处，CI至CVI是半胱氨酸残基；半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；(二硫键由连接半胱氨酸残基的线表示)。该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成胱氨酸结基序的唯一二硫键。NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是肽亚基，每个肽亚基包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列。在一些实施方案中，其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在。
图14示出了通过HPLC测定的WT ApsIII和ApsIII半胱氨酸缺失(dCys)的相对产量。(n＝8)。虚线表示中值；点划线表示四分位距的边界。
具体实施方式
定义
术语“5’末端”和“3’末端”是指方向性，即核苷酸聚合物(例如，DNA)的末端-末端取向。多核苷酸的5’末端是具有第五个碳的多核苷酸的末端。
“5’和3’同源臂”或“5’和3’臂”或“左臂和右臂”是指载体和/或靶向载体中的多核苷酸序列，这些多核苷酸序列与宿主生物体中的靶向基因组序列和/或感兴趣的内源基因同源重组，以便实现宿主生物体的染色体基因座的成功遗传修饰。
“ACTX”或“ACTX肽”或“atracotoxin”是指从属于毒疣蛛(Atracinae)科的蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽家族。一种这样的蜘蛛被称为澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛，其学名为澳大利亚漏斗网蜘蛛(Hadronyche versuta)。来自毒疣蛛科物种的ACTX肽的示例是Omega-ACTX、Kappa-ACTX和U-ACTX肽。
“ADN1启动子”是指由源自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)粘附缺陷蛋白质1基因的启动子序列组成的DNA片段。
“影响”是指某物如何影响另一事物，例如，肽、多肽、蛋白质、药物或化学品如何影响昆虫，例如害虫。
“比对”是指比较两个或更多个序列(例如，核苷酸、多核苷酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白质序列)以确定它们彼此之间的关系的方法。比对通常由应用各种算法的计算机程序执行，然而，也可手动执行比对。比对程序通常通过潜在的序列比对进行迭代，并使用置换表对比对进行评分，从而采用多种策略以达到潜在的最佳比对评分。常用的比对算法包括但不限于CLUSTALW(参见Thompson J.D.、Higgins D.G.、Gibson T.J.，“CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throughsequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice”，Nucleic Acids Research，第22卷：第4673-4680页，1994年)、CLUSTALV(参见Larkin M.A.等人，CLUSTALW2,ClustalW and ClustalX version 2，Bioinformatics，第23卷第21期：第2947-2948页，2007年)、Mafft、Kalign、ProbCons和T-Coffee(参见Notredame等人，“T-Coffee:A novel method for multiple sequence alignments”，Journal of MolecularBiology，第302卷：第205-217页，2000年)。实现前述算法中的一者或多者的示例性程序包括但不限于来自DNAStar的MegAlign(DNAStar,Inc.，3801Regent St.Madison，Wis.，53705)、MUSCLE、T-Coffee、CLUSTALX、CLUSTALV、JalView、Phylip和来自Accelrys的Discovery Studio(Accelrys,Inc.，10188Telesis Ct，Suite 100，San Diego，Calif.，92121)。在一些实施方案中，比对将“相移”和/或“空位”引入被比较的序列中的一者或两者中，以便最大化两个序列之间的相似性，并且评分是指定量表达所比对序列的相关性的过程。
“α交配因子(α-MF)肽”或“α-MF信号”或“α-MF”或“α交配因子分泌信号”或“αMF分泌信号”(均可互换使用)是指当α-MF肽可操作地连接到感兴趣的重组肽(例如，DVP)时，允许在重组表达系统中进行分泌性表达的信号肽。α-MF肽将新生重组多肽导向重组表达系统(例如，酵母重组表达系统)的分泌途径。
“试剂”是指一种或多种化学物质、分子、核苷酸、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、毒物、杀昆虫剂、杀虫剂、有机化合物、无机化合物、原核生物或真核生物，以及由其产生的试剂。
“农业上可接受的载体”涵盖通常用于杀虫剂配制技术中的所有佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些是杀虫剂配制领域技术人员熟知的。
“农杆菌感染”意指通过使用根癌农杆菌(A.tumefaciens)或发根农杆菌(A.rhizogenes)将DNA引入植物细胞的植物转化方法。
“BAAS”意指大麦α-淀粉酶信号肽，并且是ERSP的一个示例。BAAS的一个示例是具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的BAAS(NCBI登录号AAA32925.1)。
“生物量”是指任何测量的植物产物。
“二元载体”或“二元表达载体”意指在大肠杆菌(E.coli)菌株和农杆菌菌株中可复制自身的表达载体。此外，该载体包含由左和右边界序列括起的DNA区(通常称为t-DNA)，该区域被毒力基因识别，从而被农杆菌复制并递送到植物细胞中。
“bp”或“碱基对”是指包含两个彼此键合的化学碱基的分子。例如，DNA分子由两条缠绕链组成，其中每条链具有由交替的脱氧核糖和磷酸基团组成的主链。附着在每个脱氧核糖上的是四个碱基中的一者，即腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)，其中腺嘌呤与胸腺嘧啶形成碱基对，并且胞嘧啶与鸟嘌呤形成碱基对。
“C-末端”是指位于多肽末端的游离羧基(即，-COOH)。
“CE”是指具有可操作地连接到第六半胱氨酸残基的N-末端的肽亚基，该半胱氨酸残基参与根据式(II)的CK结构中的胱氨酸结基序(即，CVI)的二硫键形成。
如本文所用，带有上标罗马数字的字母“C”(即，“CI”、“CII”、“CIII”、“CIV”、“CV”和“CVI”)是指参与二硫键形成的半胱氨酸残基，其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；并且其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成胱氨酸结基序的唯一二硫键。因此，可修饰CRP可具有用于形成一个或多个非CK二硫键的一个或多个半胱氨酸残基，其中该一个或多个非CK二硫键不是第一二硫键、第二二硫键或第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成CK基序。因此，上标罗马数字I、II、III、IV、V和VI表示给定的半胱氨酸残基，即分别参与二硫键形成的第一、第二、第三、第四、第五和第六半胱氨酸残基，并且其中那些二硫键是形成胱氨酸结基序的上述第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键；标记为“CI”、“CII”、“CIII”、“CIV”、“CV”和“CVI”的半胱氨酸残基和/或上标罗马数字I、II、III、IV、V和VI既不意味着表示，也不应解释为氨基酸序列中的第一、第二、第三、第四、第五和第六半胱氨酸残基，因为其他半胱氨酸残基可存在于可修饰CRP中，无论那些其他半胱氨酸残基是否形成非CK二硫键。例如，可修饰CRP可具有存在于其氨基酸序列中的一个或多个半胱氨酸残基(从N-末端读到C-末端)，该一个或多个半胱氨酸残基在CI残基之前的氨基酸序列中出现。同样，一个或多个半胱氨酸残基可存在于肽亚基中，该一个或多个半胱氨酸残基可以或可以不形成非CK二硫键。
“cDNA”或“拷贝DNA”或“互补DNA”是指与RNA分子互补的分子。在一些实施方案中，cDNA可以是单链或双链的。在一些实施方案中，cDNA可以是在逆转录酶催化的反应中由单链RNA模板合成的双链DNA。在其他实施方案中，“cDNA”是指共享在天然成熟mRNA物种中发现的序列元件排列的所有核酸，其中序列元件是外显子和3’和5’非编码区。通常mRNA物种具有连续的外显子，其中间插内含子被核RNA剪接除去，以形成编码蛋白质的连续开放阅读框。在一些实施方案中，“cDNA”是指与mRNA模板互补并源自该mRNA模板的DNA。
“CEW”指玉米穗虫。
“CK结构”或“胱氨酸结结构”是指具有CK基序的肽、多肽或蛋白质之间共有的结构相似性，例如，包含三个二硫键，并且其中半胱氨酸CI和CIV、CII和CV以及CIII和CVI通过二硫键连接。在一些实施方案中，“共有的结构相似性”是指存在共有的结构特征，例如特定氨基酸在特定位置处存在和/或具有同一性。在其他实施方案中，术语“共有的结构相似性”是指结构元件(例如：环、片、螺旋、H键供体、H键受体、糖基化模式、盐桥和二硫键)存在和/或具有同一性。在一些实施方案中，术语“共有的结构相似性”是指原子或部分相对于彼此的三维排列和/或取向(例如：感兴趣的试剂和参考试剂之间的距离和/或它们之间的角度)。在一些实施方案中，CK结构包含以下支架、框架、结构和/或主链：NE–CI–L1–CII–L2–CIII–L3–CIV–L4–CV–L5–CVI–CE；其中CI至CVI是半胱氨酸残基；其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成该胱氨酸结基序的唯一二硫键；其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽亚基；并且其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在。
“可切割接头”参见接头。
“克隆”是指涉及插入来自一个源的DNA片段(例如，通常是感兴趣的基因，例如dvp)并将其与来自另一个源的DNA片段(例如，通常是载体，例如质粒)重组，并引导该重组DNA或“重组DNA”复制，通常通过将该重组DNA转化到细菌或酵母宿主中的过程和/或方法。
“编码序列”或“CDS”是指当置于适当的调节序列控制下并在必需的转录和/或翻译分子因子存在时可被转录(例如，在DNA的情况下)或翻译(例如，在mRNA的情况下)成肽、多肽或蛋白质的多核苷酸或核酸序列。编码序列的边界由5’(氨基)末端的翻译起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。转录终止序列通常位于编码序列的3’。在一些实施方案中，编码序列可在5’和/或3’末端侧翼有非翻译区。在一些实施方案中，编码序列可用于产生肽、多肽或蛋白质产物。在一些实施方案中，编码序列可以或可以不与另一编码序列或定位信号诸如核定位信号融合。在一些实施方案中，编码序列可克隆到载体或表达构建体中，可整合到基因组中，或可作为DNA片段存在。
“密码子优化”指产生其中一个或多个内源、天然和/或野生型密码子被最终仍编码相同氨基酸但在对应宿主中优选的密码子替换的基因。
“互补”是指本领域技术人员所理解的两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑兼容性或匹配在一起。因此，如果两个序列能够彼此杂交以形成稳定的反平行双链核酸结构，则它们是彼此“互补的”。如果第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列基本上相同，或者如果第一多核苷酸在严格的杂交条件下可与第二多核苷酸杂交，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。因此，序列为5’-TATAC-3’的多核苷酸与序列为5’-GTATA-3’的多核苷酸互补。
“条件培养基”意指已被细胞使用并富含细胞衍生物质但不含细胞的细胞培养基。
“拷贝数”是指载体、表达盒、扩增单位、基因或任何定义的核苷酸序列在任何时间存在于宿主细胞中的相同拷贝数。例如，在一些实施方案中，基因或另一定义的染色体核苷酸序列可以一个、两个或更多个拷贝存在于染色体上。自主复制载体可以每个宿主细胞一个或几百个拷贝存在。
“培养”或“细胞培养”是指在人工的体外环境中维持细胞。
“培养”是指在各种培养基上或其中繁殖生物体。例如，术语“培养”可以意指在合适的条件下在液体或固体培养基中使细胞群生长。在一些实施方案中，培养是指(通常在容器或反应器中)发酵重组生产感兴趣的异源多肽和/或其他期望的终产物。
“胱氨酸”是指氧化的半胱氨酸-二聚体。胱氨酸是经由氧化两个半胱氨酸分子获得的含硫氨基酸，并且通过二硫键连接。
“胱氨酸结基序”或“CK基序”是指包含3个二硫键的蛋白质结构基序。如本文所用的术语“胱氨酸结基序”是指含有以下3个二硫键的结构基序：第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键，其中在这些二硫键中的两个二硫键之间出现的肽区段形成环，第三二硫键通过该环，形成轮烷亚结构。第一二硫键在半胱氨酸残基CI和CIV之间出现；第二二硫键在半胱氨酸残基CII和CV之间出现；并且第三二硫键在半胱氨酸残基CIII和CVI之间出现；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构，并且其中该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键是形成胱氨酸结基序的唯一二硫键。在一些实施方案中，二硫键拓扑结构形成以下胱氨酸结基序中的一种胱氨酸结基序：抑制剂胱氨酸结(ICK)基序、生长因子胱氨酸结(GFCK)基序或环状胱氨酸结(CCK)基序。
“Dc1a”或“Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a”是指从美国沙漠蜘蛛(Diguetia canities，也称为“沙漠灌木蜘蛛”)中分离的多肽。野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a的一个示例是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽(NCBI登录号P49126.1)。
“确定成分培养基”是指由已知化学组分组成但不含粗蛋白质提取物或副产物诸如酵母提取物或蛋白胨的培养基。
“简并性”或“密码子简并性”是指一种氨基酸可由不同的核苷酸密码子编码的现象。因此，编码蛋白质或多肽的核酸分子的核酸序列可由于简并性而变化。由于遗传密码的简并性，许多核酸序列可编码具有特定活性的给定多肽；本文考虑的是此类功能相当的变体。
“二硫键”或“二硫桥”是指通过偶联它们侧链上的两个巯基而衍生的两个半胱氨酸之间的共价键。在一些实施方案中，二硫键经由氧化折叠多肽(例如，CRIP)中存在的两个不同的巯基(-SH)而产生。在一些实施方案中，多肽可包含至少六个不同的巯基(即，六个半胱氨酸残基，每个半胱氨酸残基包含一个巯基)。因此，在一些实施方案中，多肽可形成三个或更多个分子内二硫键。
“二硫键拓扑结构”或“二硫键连接模式”或“二硫键连接性”是指二硫键和半胱氨酸残基的连接模式。在一些实施方案中，具有式(II)的CK结构的CRIP包含六个保守的半胱氨酸残基(编号为I-VI)，这些半胱氨酸残基形成具有以下二硫键连接性的三个二硫键：CI和CIV、CII和CV以及CIII和CVI。在一些实施方案中，二硫键连接性在拓扑结构上是不变的，意味着二硫键仅可通过解除一个或多个二硫化物的连接来改变，诸如使用氧化还原条件。
“双表达盒”是指包含在同一载体上的两个DVP表达盒。
“双转基因肽表达载体”或“双转基因表达载体”意指包含两个拷贝的DVP表达盒的酵母表达载体。
“DNA”是指脱氧核糖核酸，包含一个或多个脱氧核糖核苷酸或核苷酸(即腺嘌呤[A]、鸟嘌呤[G]、胸腺嘧啶[T]或胞嘧啶[C])的聚合物，其可以单链或双链形式排列。例如，一个或多个核苷酸产生多核苷酸。
“dNTP”是指组成DNA和RNA的三磷酸核苷。
“dvp”或“Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多核苷酸”或“Dc1a变体多核苷酸”或“变体Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a多核苷酸”是指用于编码DVP的多核苷酸序列。术语“Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多核苷酸”当用于描述包含在DVP ORF中的Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多核苷酸序列时、其在载体中的内含物时，以及/或者当描述编码杀昆虫蛋白的多核苷酸时，被描述为“dvp”和/或“Dvp”。
“DVP”或“Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多肽”是指在某些方面与野生型成熟Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a(SEQ ID NO:2)不同的肽、多肽或蛋白突变体或变体。例如，在一些实施方案中，这种变异可以是氨基酸取代、氨基酸缺失/插入和/或用于编码野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a的多核苷酸的突变或变异。这种变异的结果是非天然存在的多肽和/或编码该多肽的多核苷酸序列相对于野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性。
“DVP表达盒”是指一个或多个调节元件，诸如启动子、增强子元件、mRNA稳定化聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、内含子、转录后调节元件和用于编码DVP的多核苷酸，例如DVP ORF。例如，DVP表达盒的一个示例是一个或多个DNA片段，该一个或多个DNA片段包含用于表达DVP的多核苷酸片段、ADH1启动子、LAC4终止子和α-MF分泌信号。DVP表达盒包含编码DVP或DVP杀昆虫蛋白所必需的所有核酸。
“DVP ORF”是指用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的多核苷酸。
“DVP ORF图表”是指一个或多个DVP ORF的组成，如以图或方程式形式写出的。例如，“DVP ORF图表”可写成使用首字母缩写词或简称来表示表达ORF内包含的DNA片段。因此，在一个示例中，“DVP ORF图表”可描述编码ERSP、LINKER、STA和DVP的多核苷酸片段，通过以方程形式分别将DNA片段图示为“ersp”(即，编码ERSP多肽的多核苷酸序列)；“linker”或“L”(即，编码LINKER多肽的多核苷酸序列)；“sta”(即，编码STA多肽的多核苷酸序列)和“dvp”(即，编码DVP的多核苷酸序列)。DVP ORF图表的示例是“ersp-sta-(linkeri-dvpj)N”或“ersp-(dvpj-linkeri)N-sta”和/或它们的DNA片段的任何组合。
“DVP杀昆虫蛋白”是指由以下组成的任何蛋白质、肽、多肽、氨基酸序列、构型或排列：(1)至少一种DVP，或两种或更多种DVP(其中所述两种或更多种DVP可相同或不同)；和(2)另外的非毒素肽、多肽或蛋白质，例如，在一些实施方案中，其中所述另外的非毒素肽、多肽或蛋白质具有进行下列操作中的一者或多者的能力：相对于单独的DVP，当昆虫暴露于DVP杀昆虫蛋白时，增加昆虫的死亡率以及/或者抑制昆虫的生长；增加所述DVP杀昆虫蛋白的表达，例如在宿主细胞或表达系统中；以及/或者影响DVP杀昆虫蛋白的翻译后加工(例如，允许DVP杀昆虫蛋白的分泌性表达)。在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可以是包含两种或更多种DVP的聚合物。在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可以是包含两种或更多种DVP的聚合物，其中这些DVP经由接头肽(例如，可切割和/或不可切割接头)可操作地连接。在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可指与一种或多种蛋白质(诸如稳定化结构域(STA)、内质网信号传导蛋白质(ERSP)、昆虫可切割或昆虫不可切割的接头(L)和/或它们的任何其他组合)可操作地连接的一种或多种DVP。在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可以是非天然存在的蛋白，包括(1)野生型Dc1a蛋白；和(2)另外的非毒素肽、多肽或蛋白质，例如ERSP、接头、STA、UBI或组氨酸标签或相似的标记。在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含：(1)DVP；和(2)α交配因子肽。例如，在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含：(1)DVP；和(2)α交配因子(α-MF)或α交配因子(α-MF)分泌结构域(用于分泌性表达)。在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含：(1)DVP；和(2)乳酸克鲁维酵母(K.lactis)α-交配因子(α-MF)分泌结构域(用于分泌性表达)。在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含：(1)两种或更多种DVP，其中这些DVP经由接头肽(例如，可切割和/或不可切割接头)可操作地连接；并且其中这些DVP相同或不同；和(2)α-MF(例如，乳酸克鲁维酵母α-交配因子(α-MF)分泌结构域(用于分泌性表达))。
“DVP构建体”是指肽、多肽和/或可操作地连接的多肽片段的基序(例如，DVP杀昆虫蛋白)的三维排列/取向。例如，DVP ORF可包括以下组分或基序中的一者或多者：DVP、内质网信号肽(ERSP)、接头肽(L)、翻译稳定蛋白质(STA)或它们的任何组合。并且，如本文所用，术语“DVP构建体”用于描述结构基序的名称和/或取向。换句话讲，DVP构建体描述了在给定的DVP ORF中包含的组分或基序的排列和取向。例如，在一些实施方案中，DVP构建体描述但不限于以下DVP杀昆虫蛋白中的一者的取向：ERSP-DVP、ERSP-(DVP)N、ERSP-DVP-L、ERSP-(DVP)N-L、ERSP-(DVP-L)N、ERSP-L-DVP、ERSP-L-(DVP)N、ERSP-(L-DVP)N、ERSP-STA-DVP、ERSP-STA-(DVP)N、ERSP-DVP-STA、ERSP-(DVP)N-STA、ERSP-(STA-DVP)N、ERSP-(DVP-STA)N、ERSP-L-DVP-STA、ERSP-L-STA-DVP、ERSP-L-(DVP-STA)N、ERSP-L-(STA-DVP)N、ERSP-L-(DVP)N-STA、ERSP-(L-DVP)N-STA、ERSP-(L-STA-DVP)N、ERSP-(L-DVP-STA)N、ERSP-(L-STA)N-DVP、ERSP-(L-DVP)N-STA、ERSP-STA-L-DVP、ERSP-STA-DVP-L、ERSP-STA-L-(DVP)N、ERSP-(STA-L)N-DVP、ERSP-STA-(L-DVP)N、ERSP-(STA-L-DVP)N、ERSP-STA-(DVP)N-L、ERSP-STA-(DVP-L)N、ERSP-(STA-DVP)N-L、ERSP-(STA-DVP-L)N、ERSP-DVP-L-STA、ERSP-DVP-STA-L、ERSP-(DVP)N-STA-L ERSP-(DVP-L)N-STA、ERSP-(DVP-STA)N-L、ERSP-(DVP-L-STA)N或ERSP-(DVP-STA-L)N；其中N是1至200的整数。
“ELISA”或“iELISA”意指将样品固定到板表面然后如下检测的测定方案：施用一抗，随后施用与酶缀合的二抗，该酶将无色底物转化为可在样品间被检测和定量的有色底物。在该方案期间，洗掉抗体，使得仅保留那些结合它们的表位的抗体用于检测。我们手中的样品主要是蛋白质，并且ELISA允许定量回收的蛋白质的量。
“内源的”是指多核苷酸、肽、多肽、蛋白质或生物体中天然发生和/或存在的过程，例如在特定遗传操作之前已经存在于宿主细胞中的分子或活性。
“增强子元件”是指可操作地连接到启动子的DNA序列，相对于不存在增强子元件时由启动子产生的转录活性，该DNA序列可对启动子发挥增强的转录活性。
“ER”或“内质网”是所有真核生物常见的亚细胞器，其中发生一些翻译后修饰过程。
“ERSP”或“内质网信号肽”是氨基酸的N-末端序列，在编码DVP的mRNA分子的蛋白质翻译过程期间，其被宿主细胞信号识别颗粒识别并结合，该宿主细胞信号识别颗粒将蛋白质翻译核糖体/mRNA复合物移动至细胞质中的ER。结果是蛋白质翻译暂停，直到其与ER对接，在那里继续翻译，并将所得蛋白质注入ER中。
“ersp”是指编码肽ERSP的多核苷酸。
“ER运输”是指将细胞表达的蛋白质运输到ER中进行翻译后修饰、分类和运输。
“表达盒”是指在重组表达系统中完成转基因或异源多核苷酸(例如，用于编码DVP的多核苷酸)所必需的所有DNA元件。因此，在一些实施方案中，“表达盒”是指(1)感兴趣的DNA序列，例如，用于编码DVP的异源多核苷酸；和以下中的一者或多者：(2)启动子、终止子和/或增强子元件；(3)合适的mRNA稳定化聚腺苷酸化信号；(4)内部核糖体进入位点(IRES)；(5)内含子；和/或(6)转录后调节元件。(1)与(2)至(6)中至少一者的组合称为“表达盒”。
例如，在一些实施方案中，表达盒可以是(1)用于编码DVP的异源多核苷酸；并且还包含以下一者或多者：(2)启动子、终止子和/或增强子元件；(3)合适的mRNA稳定化聚腺苷酸化信号；(4)内部核糖体进入位点(IRES)；(5)内含子；和/或(6)转录后调节元件。
在一些实施方案中，表达盒可以是(1)用于编码DVP的一种或多种异源多核苷酸；并且还包含以下一者或多者：(2)启动子、终止子和/或增强子元件；(3)合适的mRNA稳定化聚腺苷酸化信号；(4)内部核糖体进入位点(IRES)；(5)内含子；和/或(6)转录后调节元件；其中用于编码DVP的该一种或多种异源多核苷酸中的每一者还包含(2)至(6)中的一者或多者；其中DVP可相同或不同。
例如，在一些实施方案中，表达盒可指(1)用于编码DVP的第一异源多核苷酸，和用于编码DVP的一种或多种另外的异源多核苷酸；还包含以下中的一者或多者：(2)启动子、终止子和/或增强子元件；(3)合适的mRNA稳定化聚腺苷酸化信号；(4)内部核糖体进入位点(IRES)；(5)内含子；和/或(6)转录后调节元件；其中用于编码DVP的该第一异源多核苷酸和用于编码DVP的该一种或多种另外的异源多核苷酸还包含(2)至(6)中的一者或多者；或者其中用于编码DVP的该第一异源多核苷酸中的每一者，和用于编码DVP的该一种或多种另外的异源多核苷酸中的每一者各自单独还包含(2)至(6)中的一者或多者；其中DVP可相同或不同。
在另选的实施方案中，存在两个表达盒，每个表达盒包含用于编码DVP的异源多核苷酸(即，双表达盒)，其中DVP可相同或不同。
在其他实施方案中，存在三个表达盒，每个表达盒包含用于编码DVP的异源多核苷酸(即，三表达盒)；其中DVP可相同或不同。
在一些实施方案中，可通过将第二表达盒亚克隆到含有第一表达盒的载体中来产生双表达盒。在一些实施方案中，可通过将第三表达盒亚克隆到含有第一和第二表达盒的载体中来产生三表达盒。涉及表达盒和克隆技术的方法是本领域熟知的，并在本文中有所描述。
“FECT”意指使用消除了外壳蛋白基因和三基因框的狐尾花叶病毒的瞬时植物表达系统。
“GFP”意指水母(维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria))的绿色荧光蛋白质。
“生长培养基”是指用于体外培养细胞的营养培养基。
如本文所用的“肠道”可指任何器官、结构、组织、细胞、细胞外基质和/或包括肠道的空间，例如：前肠，例如口腔、咽、食道、嗉囊、前胃道或嗉囊；中肠，例如中肠盲肠、脑室；后肠，例如幽门、回肠、直肠或肛门；围食膜；微绒毛；基膜；肌肉层；马氏管；或直肠壶腹。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置均被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一者中的位置被腺嘌呤占据，那么这些分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。同源的是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一者中的位置被腺嘌呤占据，则这些分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性是两个序列共享的匹配或同源位置数的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个位置是匹配的或同源的，则这两个序列是60％同源的。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC共享50％同源性。
当与核酸相关使用时，术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性，或完全同源性，并因此是相同的。“序列同一性”是指两个或更多个核酸之间相关性的量度，并且以相对于总比较长度的百分比给出。同一性计算考虑了在它们各自的较大序列中相同的那些核苷酸残基和在相同相对位置的那些核苷酸残基。
“ICK基序”或“ICK基序蛋白”是指具有至少6个半胱氨酸核心氨基酸的16个至60个氨基酸的肽，这些半胱氨酸核心氨基酸具有三个二硫桥。在一些实施方案中，这三个二硫桥是共价键，并且在这六个半胱氨酸残基中，共价二硫键在从N-末端氨基酸开始的六个核心半胱氨酸氨基酸的第一和第四、第二和第五以及第三和第六半胱氨酸之间。在一些实施方案中，具有该基序的肽包含β-发夹二级结构，通常由位于该基序的第四和第六核心半胱氨酸之间的残基组成，其中该发夹通过由该基序的三个二硫键提供的结构交联而稳定。在一些实施方案中，在抑制剂胱氨酸结基序中可存在另外的半胱氨酸/胱氨酸或半胱氨酸氨基酸。
“同一性”是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较所述序列确定的。术语“同一性”还意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度，视情况而定，如通过此类序列的字符串之间的匹配确定的。“同一性”和“相似性”可容易地通过本领域普通技术人员已知的无数方法中的任一种来计算，包括但不限于以下描述的那些：Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.编辑，Oxford University Press，New York，1988年；Biocomputing:Informatics and Genome Projects，Smith,D.W.编辑，Academic Press，New York，1993年；Computer Analysis of Sequence Data，第1部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994年；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje,G.，Academic Press，1987年；以及Sequence Analysis Primer，Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，M Stockton Press，NewYork，1991年；以及Carillo,H.和Lipman,D.，SIAM J.Applied Math.，第48卷：第1073页，1988年，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。此外，确定同一性和相似性的方法被编码在公众可获得的计算机程序中。例如，在一些实施方案中，测定两个序列之间的同一性和相似性的方法包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research，第12卷第1期：第387页，1984年)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.，第215卷：第403-410页(1990年))。BLAST X程序可从NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual，Altschul,S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.，20894；Altschul,S.等人，J.Mol.Biol.，第215卷：第403-410页，1990年)，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
“体内”是指天然环境(例如，动物或细胞)和在天然环境中发生的过程或反应。
“失活”是指某物不处于使用状态的情况，例如处于休眠和/或不工作状态。例如，当用于基因的上下文中或当提及基因时，术语失活意指所述基因不再活跃地合成基因产物，使所述基因产物翻译成蛋白质，或以其他方式使基因执行其正常功能。例如，在一些实施方案中，术语失活可指基因转录RNA的失败、RNA加工(例如，前mRNA加工、RNA剪接、或其他转录后修饰)的失败；干扰非编码RNA成熟；干扰RNA输出(例如，从细胞核到细胞质)；干扰翻译；蛋白折叠；易位；蛋白质转运；以及/或者抑制和/或干扰分子多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、转录因子、调节剂、抑制剂或参与任何上述过程的其他因子中的任一者。
“增加”或“增加的”是指使某物(例如，肽、多肽或蛋白质的表达)在大小、量、强度或程度上更大。例如，在一些实施方案中，从不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键可导致产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP，其中具有根据式(II)的CK结构导致以下效果：相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP，重组CRP的表达水平增加，以及/或者重组CRP的产量增加。
因此，在一些实施方案中，在具有根据式(II)的CK结构的重组CRP中，术语“增加的表达水平”或“表达水平增加”或“增加的产量”或“产量增加”是指相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP中蛋白质的量、蛋白质的表达水平和/或蛋白质的产量，具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP中蛋白质的量、蛋白质的表达水平和/或蛋白质的产量增加至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.8％、至少约0.9％、至少约1％、至少约1.25％、至少约1.5％、至少约1.75％、至少约2％、至少约2.25％、至少约2.5％、至少约2.75％、至少约3％、至少约3.25％、至少约3.5％、至少约3.75％、至少约4％、至少约4.25％、至少约4.5％、至少约4.75％、至少约5％、至少约5.25％、至少约5.5％、至少约5.75％、至少约6％、至少约6.25％、至少约6.5％、至少约6.75％、至少约7％、至少约7.25％、至少约7.5％、至少约7.75％、至少约8％、至少约8.25％、至少约8.5％、至少约8.75％、至少约9％、至少约9.25％、至少约9.5％、至少约9.75％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％、至少约26％、至少约27％、至少约28％、至少约29％、至少约30％、至少约31％、至少约32％、至少约33％、至少约34％、至少约35％、至少约36％、至少约37％、至少约38％、至少约39％、至少约40％、至少约41％、至少约42％、至少约43％、至少约44％、至少约45％、至少约46％、至少约47％、至少约48％、至少约49％、至少约50％、至少约50％、至少约51％、至少约52％、至少约53％、至少约54％、至少约55％、至少约56％、至少约57％、至少约58％、至少约59％、至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％或大于100％。
“不可操作”是指某物不起作用、失灵或不再能够起作用的情况。例如，当用于基因的上下文中或当提及基因时，术语“不可操作”是指所述基因不再能够如其正常情况那样永久或暂时地操作。例如，在一些实施方案中，“不可操作”意指基因不再能够合成基因产物，将所述基因产物翻译成蛋白质，或以其他方式不能使基因执行其正常功能。例如，在一些实施方案中，术语不可操作可指基因转录RNA的失败、RNA加工(例如，前mRNA加工、RNA剪接、或其他转录后修饰)的失败；干扰非编码RNA成熟；干扰RNA输出(例如，从细胞核到细胞质)；干扰翻译；蛋白折叠；易位；蛋白质转运；以及/或者抑制和/或干扰分子多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、转录因子、调节剂、抑制剂或参与任何上述过程的其他因子中的任一者。
“昆虫”包括“昆虫纲(Insecta)”中的所有生物体。术语“成虫前”昆虫是指成虫阶段之前任何形式的生物体，包括例如卵、幼虫和若虫。如本文所用，术语“昆虫”是指任何节肢动物和线虫，包括螨虫，和已知侵染所有作物、蔬菜和树木的昆虫，并且包括在林业、园艺和农业领域中被视为害虫的昆虫。可用本文公开的方法保护的具体作物的示例是大豆、玉米、棉花、苜蓿和蔬菜作物。本文包括了具体作物和昆虫的列表。
“昆虫肠道环境”或“肠道环境”意指在昆虫或昆虫幼虫的前肠、中肠或后肠中发现的特定pH和蛋白酶条件。
“昆虫血淋巴环境”意指在昆虫或昆虫幼虫中发现的特定pH和蛋白酶条件。
如本文所用，术语“杀昆虫的”通常用于指本文所用的多肽或蛋白质增加昆虫死亡率或抑制昆虫生长速率的能力。如本文所用，术语“杀线虫的”是指本文所用的多肽或蛋白质增加线虫死亡率或抑制线虫生长速率的能力。通常，术语“线虫”包括所述生物体的卵、幼虫、幼体和成熟形式。
“杀昆虫活性”意指当昆虫暴露于化合物、试剂或肽时或之后，昆虫死亡、停止或减慢其移动；停止或减慢其进食；停止或减慢其生长；变得混淆(例如，关于导航、定位食物、睡眠行为和/或交配)；不能化蛹；干扰繁殖；以及/或者阻止该昆虫产生后代和/或阻止该昆虫产生可育后代。
“整合表达载体”或“整合载体”意指能够将其自身插入酵母细胞基因组的特定基因座并稳定地成为酵母基因组的一部分的酵母表达载体。
“间插接头”是指蛋白质中分离蛋白质不同部分的短肽序列，或置于ORF的阅读框中以分离上游和下游DNA序列的短DNA序列。例如，在一些实施方案中，可使用间插接头，从而允许蛋白质在翻译期间实现它们独立的二级和三级结构形成。在一些实施方案中，间插接头可在植物细胞环境中、在昆虫和/或鳞翅目肠道环境中、以及在昆虫血淋巴和鳞翅目血淋巴环境中具有抗性或易受切割。
“分离的”是指从其天然环境中分离物质和/或组分，例如，从给定属或物种中分离的毒素意指从其天然环境中分离毒素。
“Kappa-ACTX肽”或“κ-ACTX”(均可互换使用)是指属于杀昆虫抑制剂胱氨酸结(ICK)肽家族的肽，其从属于毒疣蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离。一种这样的蜘蛛是澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛，其学名为澳大利亚漏斗网蜘蛛。本文提供了示例性的野生型Kappa-ACTX肽，具有以下氨基酸序列：“AICTGADRPCAACCPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP”(SEQID NO:198)(UniProtKB/Swiss-Prot No.P82228.1)。
“kb”指千碱基，即1000个碱基。如本文所用，术语“kb”意指核酸分子的长度。例如，1kb是指1000个核苷酸长度的核酸分子。1kb长度的双链DNA长度包含两千个核苷酸(即每条链上有一千个)。另选地，1kb长度的单链RNA的长度包含一千个核苷酸。
“kDa”是指千道尔顿，等于1,000道尔顿的单位；“道尔顿”是分子量(MW)的单位。
“敲入”是指用外源或异源基因或它们的部分替换内源基因。例如，在一些实施方案中，术语“敲入”是指通过同源重组将编码所需蛋白质的核酸序列引入靶基因座，从而引起所需蛋白质的表达。在一些实施方案中，“敲入”突变可修饰基因序列以产生功能丧失或功能获得突变。术语“敲入”可指将外源或异源多核苷酸序列或其片段引入基因组(例如，“它们进行了敲入”或“它们敲入异源基因”)或所得细胞和/或生物体(例如，“细胞是敲入的“或“动物是敲入的”)的程序。
“敲除”是指部分或完全抑制细胞中由内源DNA序列编码的蛋白质的表达基因产物(例如，mRNA)。在一些实施方案中，“敲除”可通过靶向缺失编码肽、多肽或蛋白质的整个基因或基因的一部分来实现。结果，缺失可使基因失活、部分失活、不可操作、部分不可操作，或以其他方式降低基因或其产物在其正常表达的整个生物体的任何细胞中和/或细胞中的表达。术语“敲除”可指使内源基因(例如，“它们进行了敲除”或“它们敲除了内源基因”)或所得细胞和/或生物体(例如，“细胞是敲除的”或“动物是敲除的”)完全或部分失活或不可操作的程序。
“击倒剂量50”或“KD50”是指在50％的群体中，例如在家蝇(普通家蝇)和/或埃及伊蚊(蚊子)的群体中，引起瘫痪或停止移动所需的中值剂量。
“l”或“linker”是指编码间插接头肽的核苷酸。
“L1”是指位于第一半胱氨酸和第二半胱氨酸残基之间的肽亚基，这些半胱氨酸残基参与根据式(II)的CK结构中的胱氨酸结基序(即，CI和CII)的二硫键形成。
“L2”是指位于第二半胱氨酸和第三半胱氨酸残基之间的肽亚基，这些半胱氨酸残基参与根据式(II)的CK结构中的胱氨酸结基序(即，CII和CIII)的二硫键形成。
“L3”是指位于第三半胱氨酸和第四半胱氨酸残基之间的肽亚基，这些半胱氨酸残基参与根据式(II)的CK结构中的胱氨酸结基序(即，CIII和CIV)的二硫键形成。
“L4”是指位于第四半胱氨酸和第五半胱氨酸残基之间的肽亚基，这些半胱氨酸残基参与根据式(II)的CK结构中的胱氨酸结基序(即，CIV和CV)的二硫键形成。
“L5”是指位于第五半胱氨酸和第六半胱氨酸残基之间的肽亚基，这些半胱氨酸残基参与根据式(II)的CK结构中的胱氨酸结基序(即，CV和CVI)的二硫键形成。
“L”在适当的上下文中是指间插接头肽，该间插接头肽将翻译稳定蛋白(STA)与另外的多肽，例如DVP和/或多个DVP连接。当提及氨基酸时，“L”也可意指亮氨酸。
“LAC4启动子”或“Lac4启动子”或“pLac4”是指由源自乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶基因的启动子序列组成的DNA片段。LAC4启动子是强的且可诱导的报告基因，用于驱动转化到酵母中的外源基因的表达。
“LAC4终止子”或“Lac4终止子”是指由源自乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶基因的转录终止子序列组成的DNA片段。
“鳞翅目肠道环境”意指在鳞翅目昆虫或幼虫的前肠、中肠或后肠中发现的特定pH和蛋白酶条件。
“鳞翅目血淋巴环境”意指在鳞翅目昆虫或幼虫中发现的特定pH和蛋白酶条件。
“LD20”是指杀死20％群体所需的剂量。
“LD50”是指致死剂量50，意指杀死50％群体所需的剂量。
“接头”或“LINKER”或“肽接头”或“L”或“间插接头”是指用于将两个肽连接在一起的短肽序列。接头还可指置于ORF的阅读框中以分离上游和下游DNA序列的短DNA序列。在一些实施方案中，接头可被昆虫蛋白酶切割。在一些实施方案中，接头可允许蛋白质在翻译期间实现它们独立的二级和三级结构形成。在一些实施方案中，接头可在植物细胞环境中、在昆虫和/或鳞翅目肠道环境中、以及/或者在昆虫血淋巴和鳞翅目血淋巴环境中具有抗性或易受切割。在一些实施方案中，接头可被蛋白酶切割，例如，在一些实施方案中，接头可被植物蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、生姜蛋白酶和/或cardosin)、昆虫蛋白酶、真菌蛋白酶、脊椎动物蛋白酶、无脊椎动物蛋白酶、细菌蛋白酶、哺乳动物蛋白酶、爬行动物蛋白酶或禽类蛋白酶切割。在一些实施方案中，接头可以是可切割的或不可切割的。在一些实施方案中，接头包含二元或三元区，其中每个区可被至少两种类型的蛋白酶切割：其中一种是昆虫和/或线虫蛋白酶，并且另一种是人蛋白酶。在一些实施方案中，接头可具有(至少)三个作用中的一者：在昆虫肠道环境中切割，在植物细胞中切割，或设计成不是有意切割。
“培养基”是指用于在细胞培养中培养细胞的营养液。
“MOA”是指作用机制。
“可修饰CRP”是指除了具有第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键以外，还具有一个或多个非CK二硫键的富含半胱氨酸的蛋白质，第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构，其中该一个或多个非CK二硫键不是第一二硫键、第二二硫键或第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成CK基序。可修饰CRP的示例包括具有“CNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNCIGGGCSKTCGY”(SEQ ID NO:193；NCBI登录号P49268.1)的氨基酸序列的ApsIII蛋白；具有以下氨基酸序列的野生型Kappa-ACTX肽：“AICTGADRPCAACCPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP”(SEQ ID NO:198；UniProtKB/Swiss-ProtNo.P82228.1)；和/或以下项中任一项：SEQ ID NO:1-2或195。
“分子量(MW)”是指分子的质量或重量，并且通常以“道尔顿(Da)”或千道尔顿(kDa)测量。在一些实施方案中，可使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、分析超速离心或光散射来计算MW。在一些实施方案中，SDS-PAGE方法如下：在凝胶上用一组分子量标准分离感兴趣的样品。运行样品，然后用所需的染色剂处理凝胶，随后脱色约2小时至14小时。下一步骤是确定标准品和感兴趣的蛋白质的相对迁移距离(Rf)。迁移距离可使用以下等式来确定：
接下来，可基于针对标准中的条带获得的值来确定MW的对数；例如，在一些实施方案中，将SDS变性多肽的分子量的对数及其相对迁移距离(Rf)绘制成图。在绘制成图后，对得到的值进行插值将提供未知蛋白质条带的分子量。
“基序”是指涉及具有一些生物学意义和/或发挥一些作用或参与一些生物学过程的多核苷酸或多肽序列。
“多克隆位点”或“MCS”是指在载体上发现的DNA片段，其包含许多限制位点，其中可插入感兴趣的DNA序列。
“突变体”是指(例如，在DNA序列中)具有改变的生物体、DNA序列、肽序列或多肽序列，该改变导致所述生物体和/或序列不同于天然存在的或野生型生物体和/或序列。例如，野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a多肽可改变，产生非天然存在的DVP。
“NE”是指具有可操作地连接到第一半胱氨酸残基的C-末端的肽亚基，该半胱氨酸残基参与根据式(II)的CK结构中的胱氨酸结基序(即，CI)的二硫键形成。
“N-末端”是指位于多肽的起始或起点的游离胺基(即，-NH2)。
“NCBI”是指国家生物技术信息中心。
“nm”是指纳米。
“非极性氨基酸”是弱疏水性的氨基酸，并且包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。甘氨酸或Gly是本发明的二肽最优选的非极性氨基酸。
“标准化肽产量”意指条件培养基中的肽产量除以测量肽产量时的对应细胞密度。肽产量可用单位体积中产生的肽的质量表示，例如，mg/升或mg/L，或用HPLC色谱中产生的肽的UV吸收峰面积表示，例如，mAu.sec。细胞密度可用培养物在600nm波长(OD600)下的可见光吸收表示。
“OD”是指光密度。通常，OD是使用分光光度计测量的。
“OD660nm”或“OD660nm”是指660纳米(nm)下的光密度。
“单字母代码”意指以其单字母代码列出的肽序列，以区分蛋白质一级结构中的各种氨基酸：丙氨酸＝A，精氨酸＝R，天冬酰胺＝N，天冬氨酸＝D，天冬酰胺或天冬氨酸＝B，半胱氨酸＝C，谷氨酸＝E，谷氨酰胺＝Q，谷氨酰胺或谷氨酸＝Z，甘氨酸＝G，组氨酸＝H，异亮氨酸＝I，亮氨酸＝L，赖氨酸＝K，甲硫氨酸＝M，苯丙氨酸＝F，脯氨酸＝P，丝氨酸＝S，苏氨酸＝T，色氨酸＝W，酪氨酸＝Y，并且缬氨酸＝V。
“可操作”是指被使用的能力、做某事的能力和/或实现某种功能或结果的能力。例如，在一些实施方案中，“可操作”是指多核苷酸、DNA序列、RNA序列或其他核苷酸序列或基因编码肽、多肽和/或蛋白质的能力。例如，在一些实施方案中，多核苷酸可用于编码蛋白质，这意味着多核苷酸包含赋予其产生蛋白质的能力的信息(例如，通过转录mRNA，其继而又被翻译成蛋白质)。
“可操作地连接”是指并置，其中如此描述的组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。例如，在一些实施方案中，可操作地连接可指两个或更多个DNA、肽或多肽序列。在其他实施方案中，可操作地连接可指两个相邻的DNA序列放置在一起，使得一个DNA序列的转录激活可作用于另一个DNA序列。在其他实施方案中，术语“可操作地连接”可指两个或更多个肽和/或多肽，其中所述两个或更多个肽和/或多肽以产生单个多肽链的方式连接；另选地，术语可操作地连接可指两个或更多个肽以一个肽对另一个肽发挥一些作用的方式连接。在其他实施方案中，可操作地连接可指两个相邻的DNA序列放置在一起，使得一个序列的转录激活可作用于另一个序列。
“ORF”或“开放阅读框”是指在翻译起始信号(例如分别为AUG或ATG)和编码一个或多个多肽序列的已知终止密码子中的任一者或多者之间的RNA或DNA序列的长度。换句话说，ORF描述了从翻译RNA编码的核糖体的角度来看的参考框，因为核糖体由于没有遇到终止密码子而能够保持阅读(即，向新生蛋白质添加氨基酸)。因此，“开放阅读框”或“ORF”是指在编码序列的翻译起始和终止密码子之间编码的氨基酸序列。此处，术语“起始密码子”和“终止密码子”是指编码序列中分别指定蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链终止的三个相邻核苷酸的单元(即密码子)。
在一些实施方案中，ORF是密码子的连续延伸，该连续延伸以起始密码子(通常对于DNA为ATG，并且对于RNA为AUG)开始并在终止密码子(通常为UAA、UAG或UGA)处结束。在其他实施方案中，ORF可以是在翻译起始信号(例如，AUG或ATG)和已知终止密码子中的任一者或多者之间的RNA或DNA序列的长度，其中所述RNA或DNA序列的长度编码一个或多个多肽序列。在一些其他实施方案中，ORF可以是编码蛋白质的DNA序列，该序列以ATG起始密码子开始并以TGA、TAA或TAG终止密码子结束。ORF也可以意指DNA编码的翻译蛋白质。通常，本领域普通技术人员基于“开放阅读框”的最广义的定义简单地考虑了不包含终止密码子的一系列密码子的事实，将术语“开放阅读框”和“ORF”与术语“编码序列”区分开来。因此，尽管ORF可包含内含子，但编码序列通过参照那些可被分成密码子的核苷酸(例如，连接的外显子)来区分，这些密码子实际上通过核糖体翻译机制(即，编码序列不包含内含子)翻译成氨基酸；然而，如本文所用，术语“编码序列”、“CDS”、“开放阅读框”和“ORF”可互换使用。
“外重组的”或“外重组”是指在体内同源重组期间除去侧翼为两个位点特异性重组位点(例如，与靶载体的同源臂同源的靶基因的5’-和3’-核苷酸序列)的基因和/或多核苷酸序列(例如，内源基因)。参见“敲除”。
“肽表达载体”意指包含异源肽转基因的宿主生物体表达载体。
“肽表达酵母菌株”、“肽表达菌株”或“肽生产菌株”意指能够生产异源肽的酵母菌株。
“肽接头”参见接头。
“肽亚基”是指肽、多肽或蛋白质中的一个或多个半胱氨酸残基上游、下游和/或之间的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽亚基在具有根据式(II)的CK结构的重组CRP中的半胱氨酸残基的上游、下游和/或之间。在一些实施方案中，肽亚基可具有1个至13个氨基酸残基长度。在其他实施方案中，肽亚基可具有13个或更多个氨基酸残基长度。在一些实施方案中，包含根据式(II)的CK结构的重组CRP中的肽亚基命名为NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE。
“肽转基因”或“杀昆虫肽转基因”或“杀昆虫蛋白转基因”或“Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体转基因”是指编码DVP并可在生物表达系统中翻译的DNA序列。
“肽产量”意指在由肽表达酵母菌株的细胞产生的条件培养基中杀昆虫肽的浓度。它可用单位体积中产生的肽的质量表示，例如，mg/升或mg/L，或用HPLC色谱中产生的肽的UV吸收峰面积表示，例如，mAu.sec。
“害虫”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。
“杀虫有效量”是指能够使至少一种害虫死亡或显著减少害虫生长、进食或正常生理发育的杀虫剂的量。该量将根据以下因素而变化，例如待防治的特定靶标害虫，待处理的特定环境、位置、植物、作物或农业场所，环境条件，以及杀昆虫有效的多肽组合物的施用方法、比率、浓度、稳定性和量。制剂还可根据气候条件、环境考虑和/或施用频率和/或害虫侵袭的严重程度而变化。
“药学上可接受的盐”是指通过制备其酸或碱盐而修饰的化合物。
“植物”应意指完整的植物、植物组织、植物细胞、植物部分、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。
“植物转基因蛋白质”意指在将编码来自异源物种的蛋白质的DNA或RNA递送到植物细胞中的一者或多者后在植物中表达的该蛋白质。
“植物嵌入式保护剂”或“PIP”是指由转基因植物产生的杀昆虫蛋白，以及植物产生该蛋白质所必需的遗传物质。
“植物可切割接头”意指可切割接头肽或编码可切割接头肽的核苷酸，其包含植物蛋白酶识别位点，并且可在植物细胞中的蛋白质表达过程期间切割。
“植物再生培养基”意指含有植物生长所必需的元素和维生素以及促进细胞再生为胚所必需的植物激素的任何培养基，该胚可发芽并产生源自组织培养物的小植株。通常，培养基含有可选择的试剂，转基因细胞对其表达赋予对该试剂的抗性的可选择的基因。
“质粒”是指作为感兴趣的基因(例如，dvp)的载体的DNA片段，当转化或转染到生物体中时，可独立于宿主生物体复制和表达包含在质粒中的DNA序列。质粒是一种类型的载体，并且可以是“克隆载体”(即，用于克隆DNA片段和/或经由一些选择指示剂选择携带质粒的宿主群体的简单质粒)或“表达质粒”(即，用于产生大量多核苷酸和/或多肽的质粒)。
“极性氨基酸”是极性的氨基酸，并且包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸和酪氨酸；优选的极性氨基酸是丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；其中丝氨酸是最优选的。
“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸(例如，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或它们的类似物)的聚合形式；例如两个或更多个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的序列。如本文所用，术语“多核苷酸”包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA；它还包括修饰和未修饰形式的多核苷酸(对多核苷酸的修饰和作为多核苷酸的修饰例如可包括甲基化、磷酸化和/或加帽)。在一些实施方案中，多核苷酸可以是以下中的一者：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)；基因组DNA；基因组DNA片段；外显子；内含子；信使RNA(mRNA)；转移RNA；核糖体RNA；核酶；cDNA；重组多核苷酸；分支多核苷酸；质粒；载体；任何序列的分离的DNA；任何序列的分离的RNA；核酸探针；引物或前述中的任一者的扩增拷贝。
在其他实施方案中，多核苷酸可指用于编码基因的开放阅读框的聚合形式的核苷酸。
在一些实施方案中，多核苷酸可指cDNA。
在一些实施方案中，多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的结构也可通过其5’-或3’-末端来指代，这指示多核苷酸的方向性。在多核苷酸单链中相邻的核苷酸通常通过它们3’和5’碳之间的磷酸二酯键连接。然而，也可使用不同的核苷酸间键，诸如包括亚甲基、氨基磷酸酯键等的键。这意味着相应的5’和3’碳可暴露在多核苷酸的任一端，其可被称为5’和3’末端或端。5’和3’末端也可分别称为磷酰基(PO4)和羟基(OH)末端，因为化学基团连接到那些末端。术语多核苷酸还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则制备或使用多核苷酸的任何实施方案包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式中的每一者两者。
在一些实施方案中，多核苷酸可包括修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物(包括具有非天然碱基的核苷酸、具有修饰的天然碱基的核苷酸，诸如氮杂-或脱氮-嘌呤等)。如果存在，则可在多核苷酸组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。
在一些实施方案中，多核苷酸还可在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。另外，多核苷酸中的核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸的一个或多个末端可被保护或以其他方式修饰，以防止该末端以特定方式与其他多核苷酸相互作用(例如，形成共价键)。
在一些实施方案中，多核苷酸可由四种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)。也可存在尿嘧啶(U)，例如，当多核苷酸是RNA时，作为胸腺嘧啶的天然替代物。尿嘧啶也可用于DNA。因此，术语“序列”是指多核苷酸或任何核酸分子的字母表示，包括天然和非天然碱基。
术语“RNA分子”或核糖核酸分子是指具有核糖而不是脱氧核糖并且通常尿嘧啶而不是胸腺嘧啶作为嘧啶碱基中的一者的多核苷酸。本发明的RNA分子通常是单链的，但也可以是双链的。在RNA分子来自RNA样品的上下文中，RNA分子可包括从细胞核、线粒体或叶绿体中的DNA转录的单链分子，这些单链分子具有与转录它的DNA链互补的核苷酸碱基的线性序列。
在一些实施方案中，多核苷酸还可包含一个或多个异源调节元件。例如，在一些实施方案中，调节元件是一个或多个启动子、增强子、沉默子、操作子、剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止信号、RNA输出元件、内部核糖体进入位点(IRES)、聚-U序列或它们的组合。
“转录后调节元件”是在mRNA转录后影响其的DNA区段和/或机制。转录后机制包括剪接事件、加帽、剪接以及添加Poly(A)尾和本领域普通技术人员已知的其他机制。
“启动子”是指RNA聚合酶结合并启动基因转录的DNA区。
在本文中，“蛋白质”具有与“肽”和/或“多肽”相同的含义。
“比率”是指两个量之间或两个对象之间的定量关系，其示出了两个或更多个量之间或两个或更多对象之间的关系(以量或数量计)。因此，在一些实施方案中，比率示出了第一值包含或被包含在第二值内的次数。
“阅读框”是指双链DNA分子的六个可能的阅读框中的一个阅读框，每个方向三个阅读框。所用的阅读框决定了在DNA分子的编码序列中哪些密码子用于编码氨基酸。在一些实施方案中，阅读框是将多核苷酸和/或核酸(例如，DNA或RNA)中的核苷酸序列分成一组连续的非重叠的三联体的方式。
“重组CRP”是指包含根据式(II)的胱氨酸结(CK)结构的非天然存在的重组肽、多肽或蛋白质，其源自不具有根据式(II)的胱氨酸结(CK)结构的可修饰CRP。如本文所用，术语“重组”涵盖例如多肽，该多肽相对于其天然存在的对应物或相对于不具有根据式(II)的胱氨酸结(CK)结构的非天然存在的蛋白质(例如，非天然的可修饰CRP)包含一个或多个变化(包括添加、缺失和/或取代)，其中此类变化例如通过重组DNA技术引入。术语“重组”还涵盖肽、多肽或蛋白质，其包含以下项，基本上由以下项组成或由以下项组成：由人类产生的氨基酸序列；人工肽、多肽或蛋白质；融合蛋白；和/或嵌合多肽；由人类产生的核苷酸序列；人工核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA或基因；编码融合蛋白的多核苷酸；和/或编码嵌合多肽的多核苷酸。一旦表达，重组肽、多肽和/或蛋白质就可根据本领域普通技术人员已知的标准方法进行纯化，这些方法例如包括但不限于：硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、凝胶电泳等。在一些实施方案中，重组蛋白可通过任何方式产生，包括例如肽、多肽或蛋白合成。
“重组DNA”或“rDNA”是指由两个或更多个不同DNA片段组成的DNA。
“重组载体”意指插入了外源DNA的DNA质粒载体。
“调节元件”是指控制核酸序列表达和/或加工的一些方面的遗传元件。例如，在一些实施方案中，可在转录和转录后水平发现调节元件。调节元件可以是顺式调节元件(CRE)或反式调节元件(TRE)。在一些实施方案中，调节元件可以是一个或多个启动子、增强剂、沉默子、操作子、剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止信号、RNA输出元件、内部核糖体进入位点(IRES)、聚-U序列和/或例如以组织特异性方式、时间相关方式增加或减少表达以及/或者引起组成型表达来影响基因表达的其他元件。
“限制酶”或“限制性内切核酸酶”是指在特定限制位点切割DNA的酶。例如，限制酶可在EcoRI、SacII或BstXI限制位点切割质粒，从而使质粒线性化，并连接感兴趣的DNA。
“限制位点”是指DNA上包含4个至8个核苷酸的序列的位置，并且其序列被特定的限制酶识别。
“选择基因”意指赋予遗传修饰的生物体在选择压力下生长的优势的基因。
“血清变型”或“血清型”是指通过一组特征性抗原区分的一组密切相关的微生物。在一些实施方案中，血清变型是抗原性和血清学上不同的微生物变异种。
“sp.”是指物种。
“ssp.”或“subsp.”是指亚种。
“亚克隆”或“亚克隆的”是指将DNA从一个载体转移到另一个载体(通常是有利的载体)的过程。例如，在选择用pKLAC1质粒转化的酵母菌落后，编码突变体DVP的多核苷酸可亚克隆到pLB102质粒中。
“SSI”是上下文相关的首字母缩写词。在一些上下文中，它可指“位点特异性整合”，用于指将允许体内同源重组在宿主生物体的基因组内的特定位点发生的序列。因此，在一些实施方案中，术语“位点特异性整合”是指将转基因导向宿主生物体基因组中的靶位点的过程，从而允许将感兴趣的基因整合至宿主生物体的预选基因组位置。然而，在其他上下文中，SSI可指“室内表面喷洒”，这是将可变体积可喷洒量的杀昆虫剂施用到病媒所处的表面(诸如墙壁、窗户、地板和天花板上)上的技术。
“STA”或“翻译稳定蛋白质”或“稳定结构域”或“稳定蛋白质”(本文可互换使用)意指具有足够三级结构的肽或蛋白质，其可在细胞中积累而不被细胞的蛋白质降解过程靶向。该蛋白质的长度可在5个和50个氨基酸之间。翻译稳定蛋白质由蛋白质的在ORF中与编码杀昆虫蛋白或DVP的序列可操作地连接的DNA序列编码。可操作地连接的STA可以在DVP的上游或下游，并且在两个序列(STA和DVP)之间可具有任何间插序列，只要间插序列不导致任一个DNA序列的移码。翻译稳定蛋白质也可具有增加DVP穿过肠壁并进入昆虫血淋巴的递送的活性。STA的示例包括但不限于本文档所描述或教导的任何翻译稳定蛋白，包括GFP(绿色荧光蛋白质；SEQ ID NO:57；NCBI登录号P42212)；GNA(SEQ ID NO:58；NCBI登录号AAL07474.1)；或Jun a 3(阿什杜松(Juniperus ashei)；SEQ ID NO:59；NCBI登录号P81295.1)。
“sta”意指编码翻译稳定蛋白质的核苷酸。
“菌株”是指遗传变体、分离物、亚型、其群体或其培养物，表现出属于同一谱系的表型和/或基因型特征，不同于同一物种的其他成员的那些表型和/或基因型特征。例如，在一些实施方案中，术语“菌株”可指具有一个或多个特征的一种或多种酵母细胞，该一个或多个特征使它们在某些方面相对于它们物种的其他酵母细胞而言是不同的，其中所述其他酵母细胞不具有该一个或多个特征。
“结构基序”是指肽和/或多肽的三维排列，和/或可操作地连接的多肽区段的排列。例如，包含ERSP-STA-L-DVP的多肽具有ERSP基序、STA基序、LINKER基序和DVP多肽基序。
“毒素”是指毒液和/或毒物，尤其是由某些动物、高等植物和病原菌产生的蛋白质或结合蛋白质。通常，术语“毒素”是保留的天然产物，例如在蝎子、蜘蛛、蛇、有毒蘑菇等中发现的分子和肽，而术语“毒物”保留用于人造产物和/或人工产物，例如人造化学杀虫剂。然而，如本文所用，术语“毒素”和“毒物”同义使用。
“转染”和“转化”均是指将外源和/或异源DNA或RNA(例如，含有编码DVP的多核苷酸的载体)引导至宿主生物体(例如，原核生物或真核生物)的过程。通常，本领域普通技术人员有时保留术语“转化”来描述将外源和/或异源DNA或RNA引入细菌细胞的过程；并保留术语“转染”用于描述将外源和/或异源DNA或RNA引入真核细胞的过程。然而，如本文所用，术语“转化”和“转染”同义使用，无论过程是否描述将外源和/或异源DNA或RNA引入原核生物(例如，细菌)或真核生物(例如，酵母、植物或动物)中。
“转基因”意指编码被转化到植物中的蛋白质的异源和/或外源DNA序列。
“转基因宿主细胞”或“宿主细胞”意指用基因转化并经由另外的选择基因选择其转基因状态的细胞。
“转基因植物”意指源自用外源DNA转化的单个细胞的植物，使得植物中的每个细胞都包含该转基因。
“瞬时表达系统”意指基于根癌农杆菌的系统，该系统将编码卸甲植物病毒的DNA递送到植物细胞中，并在其中表达。植物病毒已被工程改造为以高达40％的TSP的高浓度表达感兴趣的蛋白质。
“三表达盒”是指包含在同一载体上的三个DVP表达盒。
“TRBO”意指使用烟草花叶病毒并除去病毒外壳蛋白基因的瞬时植物表达系统。
“胰蛋白酶切割”意指使用蛋白酶(胰蛋白酶，其识别暴露的赖氨酸和精氨酸氨基酸残基)在切割位点处分离可切割接头的体外测定。它还意指胰蛋白酶切割该位点的作用。
“TSP”或“总可溶性蛋白质”意指可从植物组织样品中提取并溶解到提取缓冲液中的蛋白质总量。
“UBI”是指泛素。例如，在一些实施方案中，UBI可指从玉蜀黍(Zea mays)中分离的泛素单体。
“var.”是指变种或变异种。术语“var.”用于表示排列在物种水平和/或亚种(当存在时)以下的分类学类别。在一些实施方案中，术语“var.”代表与相同亚种或物种的其他成员在次要但永久或可遗传特征上不同的成员。
“变体”或“变体序列”或“变体肽”是指具有一个或多个保守氨基酸取代或保守修饰的氨基酸序列。“变体”中的保守氨基酸取代相对于其非变体形式基本上不降低变体的活性。例如，在一些实施方案中，与具有公开的和/或要求保护的序列的肽相比，“变体”具有一个或多个保守氨基酸取代，如SEQ ID NO所示。
“载体”是指接受感兴趣的异源多核苷酸(例如，dvp)的DNA片段。感兴趣的异源多核苷酸称为“插入物”或“转基因”。
“野生型”或“WT”是指在其天然存在的状态或条件下发现和/或观察到的生物体、多核苷酸序列和/或多肽序列的表型和/或基因型(即，外观或序列)。
“酵母表达载体”或“表达载体”或“载体”意指可将异源基因和/或表达盒引入酵母细胞以进行转录和翻译的质粒。
“产量”是指肽的产量，并且产量增加可意指生产量增加、生产率增加和平均或中值产量增加以及更高产量的频率增加。术语“产量”当用于植物作物生长和/或生产时，如在“植物的产量”中，是指由植物产生的生物质的质量和/或数量。
在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文需要，否则提及单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组时，应涵盖那些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和多个(即，一者或多者)。
除非另有说明，否则本公开无需过多的实验，而是使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、固相和液体核酸合成、溶液中的肽合成、固相肽合成、免疫学、细胞培养和配制的常规技术。此类程序描述于例如Sambrook、Fritsch和Maniatis，MolecularCloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第二版，1989年，第一卷、第二卷和第三卷；DNA Cloning:A Practical Approach，第一卷和第二卷，D.N.Glover编辑，1985年，IRL Press，Oxford，全文；Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach，M.J.Gait编辑，1984年，IRL Press，Oxford，全文，特别是其中Gait的论文，第1-22页；Atkinson等人，第35-81页；Sproat等人，第83-115页；以及Wu等人，第135-151页；4.Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach，B.D.Hames和S.J.Higgins编辑，1985年，IRL Press，Oxford，全文；Immobilized Cells and Enzymes:APractical Approach，1986年，IRL Press，Oxford，全文；Perbal,B.，A Practical Guideto Molecular Cloning，1984年；Methods In Enzymology，S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press,Inc.，全系列；J.F.Ramalho Ortigao，“The Chemistry of PeptideSynthesis”，载于：访问虚拟实验室网站的知识数据库，Interactiva，Germany；Sakakibara,D.、Teichman,J.、Lien,E.L和Fenichel,R.L.，1976年，Biochem.Biophys.Res.Commun.，第73卷，第336-342页；Merrifield,R.B.，1963年，J.Am.Chem.Soc.，第85卷，第2149-2154页；Barany,G.和Merrifield,R.B.，1979年，ThePeptides(Gross,E.和Meienhofer,3编辑)，第2卷，第1-284页，Academic Press，New York，12.Wiinsch,E.编辑，1974年，Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden derOrganischen Chemie，Muler,E.编辑，第15卷，第4版，第1部分和第2部分，Thieme，Stuttgart；Bodanszky,M.，1984年，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky,M.和Bodanszky,A.，1984年，The Practice of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky,M.，1985年，Int.J.PeptideProtein Res.，第25卷，第449-474页；Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷，D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986年，Blackwell Scientific Publications；以及Animal Cell Culture:Practical Approach，第三版，John R.W.Masters编辑，2000年；这些文献中的每一者全文都以引用方式并入本文。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”或其变体诸如“包含”或“含有”将被理解为暗示包括所述步骤或元件或整数或者步骤或元件或整数的组，但不排除任何其他步骤或元件或整数或者元件或整数的组。
本文所提及的所有专利申请、专利和印刷出版物全文都以引用方式并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请全文都被明确地并且单独地指出以引用方式并入。并且，本文引用的所有专利申请、专利和印刷出版物全文都以引用方式并入本文，除了任何定义、主题免责声明或否认声明，并且除了并入的材料与本文明确的公开内容不一致的程度，在这种情况下，以本公开的语言为准。
野生型沙漠灌木蛛毒素和DVP
美国沙漠蜘蛛也称为“沙漠灌木蜘蛛”，是在美国沙漠和半沙漠栖息地发现的一种锥网蜘蛛。美国沙漠蜘蛛产生毒素，该毒素已被证明具有杀昆虫作用，而对哺乳动物没有作用。参见Bende等人，“A distinct sodium channel voltage-sensor locus determinesinsect selectivity of the spider toxin Dc1a”，Nat Commun.，2014年7月11日；第5卷：第4350页。
美国沙漠蜘蛛产生的毒素中的一种毒素是(尤其是)Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a(也称为μ-DGTX-Dc1a，或简称为“Dc1a”)。本文提供了来自美国沙漠蜘蛛的具有SEQ ID NO:1(NCBI登录号P49126.1)的氨基酸序列的示例性野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a多肽序列。
SEQ ID NO:1中例示的野生型Dc1a多肽包括信号肽区和前肽区。多肽加工后，成熟的野生型Dc1a多肽具有“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。Dc1a具有抑制剂胱氨酸结(ICK)基序，以及源自延伸的N-末端片段的三链β-折叠，和残基C25和C39之间的大的胱氨酸间环。Dc1a在C12和C25处、C19和C39处、C24和C53处以及C41和C51处的半胱氨酸之间具有二硫键连接性。
Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多肽(DVP)或其药学上可接受的盐是与野生型成熟Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a(SEQ ID NO:2)不同的突变体或变体。例如，在一些实施方案中，这种变异可以是氨基酸取代、氨基酸缺失/插入或编码野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a的多核苷酸的变化。这种变异的结果是非天然存在的多肽和/或编码该多肽的多核苷酸序列相对于野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性。
在一些实施方案中，DVP可包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:213或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP可以是两种或更多种DVP的均聚物或杂聚物，其中每种DVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，DVP可以是融合蛋白，该融合蛋白包含由可切割或不可切割接头分离的两种或更多种DVP，其中每种DVP的氨基酸序列可相同或不同。并且，在一些实施方案中，接头在昆虫的肠道或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，DVP可与一种或多种另外的肽和/或产物组合。例如，DVP可以是包含如本文所述的DVP和赋形剂的组合物的一部分。
在一些实施方案中，DVP可由多核苷酸编码。例如，多核苷酸用于编码DVP，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或它们的互补核苷酸序列。在其他实施方案中，如果多核苷酸编码DVP，其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
在其他实施方案中，多核苷酸编码DVP，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或它们的互补核苷酸序列。
在其他实施方案中，多核苷酸编码DVP，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或它们的互补核苷酸序列。
在其他实施方案中，多核苷酸编码DVP，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或它们的互补核苷酸序列。
在其他实施方案中，多核苷酸编码DVP，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:213或217-219；或它们的互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含本文所述的一种或多种DVP，或本文所述的编码DVP的多核苷酸。
在一些实施方案中，DVP可通过包括以下步骤的方法产生：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含用于表达DVP或其互补核苷酸序列的多核苷酸，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐；(b)将载体引入酵母细胞；以及(c)在用于能够使DVP表达和分泌到生长培养基中的条件下，在生长培养基中培养酵母细胞。在一些实施方案中，如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
在一些实施方案中，载体是包含α-MF信号的质粒。在其他实施方案中，将载体转化到酵母菌株中。例如，在一些实施方案中，酵母菌株选自酵母(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、汉逊酵母(Hansenula)属、耶氏酵母(Yarrowia)属或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属的任何物种。在一些实施方案中，酵母菌株选自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。例如，在一些实施方案中，酵母菌株是乳酸克鲁维酵母。
在一些实施方案中，DVP的表达提供了：每升培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L、200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L、至少12,000mg/L、至少12,500mg/L、至少13,000mg/L、至少14,000mg/L、至少15,000mg/L、至少16,000mg/L、至少17,000mg/L、至少17,500mg/L、至少18,000mg/L、至少19,000mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L、至少60,000mg/L、至少70,000mg/L、至少80,000mg/L、至少90,000mg/L或至少100,000mg/L的DVP的产量。例如，在一些实施方案中，DVP的表达提供了每升培养基至少100mg/L的DVP的产量。
在一些实施方案中，DVP在培养基中的表达导致单个DVP在培养基中的表达。
在一些实施方案中，DVP在培养基中的表达导致包含两种或更多种DVP多肽的DVP聚合物在培养基中的表达。
在一些实施方案中，载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒用于编码第一表达盒的DVP。在一些实施方案中，载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒用于编码第一表达盒的DVP或另一表达盒的DVP。在一些实施方案中，表达盒用于编码以下项中任一项所示的DVP：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
本发明的示例性DVP提供于下表1。
表1.示例性Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多肽，包括简称、SEQ ID NO和完整的氨基酸序列表。Nucl.＝核苷酸。尽管此处提供了核苷酸序列，但是编码蛋白质或多肽(例如，DVP)的核酸分子的核酸序列可由于简并性而变化。
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在一些实施方案中，DVP可具有二硫键缺失。例如，在一些实施方案中，DVP可以在残基C41和C51处具有氨基酸取代，从而导致二硫键的缺失。在一些实施方案中，具有二硫键缺失的DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C51G、C51F和/或两者的氨基酸取代。在一些实施方案中，具有二硫键缺失的DVP可具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“二硫键缺失”是指相对于SEQ ID NO:2具有C51G、C51F和/或两者的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T和C51A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C51G、C51F和/或两者的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41A和C51A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41A/C51A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41A和C51A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41S和C51A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41S/C51A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41S和C51A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41V和C51A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41V/C51A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41V和C51A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41A和C51T的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41A/C51T”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41A和C51T的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41A和C51S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41A/C51S”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41A和C51S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41A和C51V的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41A/C51V”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41A和C51V的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T和C51S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51S”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T和C51S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41S和C51S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41S/C51S”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41S和C51S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和V17A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/V17A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和V17A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和D20A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D20A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和D20A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和S21A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/S21A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和S21A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和W31A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/W31A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和W31A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和Y32A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/Y32A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和Y32A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和P36A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/P36A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和P36A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和L42A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/L42A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和L42A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和V52A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/V52A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和V52A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和W31F的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/W31F”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和W31F的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和Y32S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/Y32S”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和Y32S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、W31F、Y32S和P36A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/W31F/Y32S/P36A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、W31F、Y32S和P36A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D20A和L42N的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D20A/L42N”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D20A和L42N的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D20A和L42V的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D20A/L42V”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D20A和L42V的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和D38K的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38K”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和D38K的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A和D38S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38S”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A和D38S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D38A和V52T的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A/V52T”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D38A和V52T的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D38A和V52A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A/V52A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D38A和V52A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D38A和V17E的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A/V17E”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D38A和V17E的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D38A和L42V的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A/L42V”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D38A和L42V的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D38A和L42S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A/L42S”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D38A和L42S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D38A和L42E的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A/L42E”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D38A和L42E的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D38A和L42Q的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A/L42Q”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D38A和L42Q的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D38A和D20A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A/D20A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D38A和D20A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D20A和Y32S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D20A/Y32S”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D20A和Y32S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D38A和Y32S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D38A/Y32S”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D38A和Y32S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D20A、D38A和Y32S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D20A/D38A/Y32S”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D20A、D38A和Y32S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51A、D20A、W31F、Y32S和P36A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51A/D20A/W31F/Y32S/P36A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51A、D20A、W31F、Y32S和P36A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41S、C51T和D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41S/C51T/D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41S、C51T和D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51T和D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51T/D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51T和D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41S、C51S和D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41S/C51S/D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41S、C51S和D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51S和D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51S/D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51S和D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41V、C51T和D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41V/C51T/D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41V、C51T和D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41T、C51V和D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41T/C51V/D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41T、C51V和D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41S、C51V和D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41S/C51V/D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41S、C51V和D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41V、C51S和D38A的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41V/C51S/D38A”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41V、C51S和D38A的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41S、C51S、D38A和L42V的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41S/C51S/D38A/L42V”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41S、C51S、D38A和L42V的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有C41S、C51S、D38A和L42V的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“C41S/C51S/D38A/L42V”是指相对于SEQ ID NO:2具有C41S、C51S、D38A和L42V的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有D38A、L42I、C41S和C51S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:210的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“D38A/L42I/C41S/C51S”是指相对于SEQ ID NO:2具有D38A、L42I、C41S和C51S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有K2L、D38A、C41S和C51S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:211的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“K2L/D38A/C41S/C51S”可指相对于SEQ ID NO:2具有K2L、D38A、C41S和C51S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有Y32S、D38A、C41S和C51S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:212的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“Y32S/D38A/C41S/C51S”可指相对于SEQ ID NO:2具有Y32S、D38A、C41S和C51S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有K2L、Y32S、D38A、C41S和C51S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:213的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“K2L/Y32S/D38A/C41S/C51S”可指相对于SEQ ID NO:2具有K2L、Y32S、D38A、C41S和C51S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有D38T、C41S和C51S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:214的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“D38T/C41S/C51S”可指相对于SEQ ID NO:2具有D38T、C41S和C51S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有D38S、C41S和C51S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:215的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“D38S/C41S/C51S”可指相对于SEQ ID NO:2具有D38S、C41S和C51S的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有K2L、Y32S和L42I的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:217的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“K2L/Y32S/L42I”可指相对于SEQ ID NO:2具有K2L、Y32S和L42I的氨基酸取代的那些实施方案。
在一些实施方案中，DVP相对于SEQ ID NO:2可具有K2L、Y32S、L42I、C41S和C51S的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，DVP可具有SEQ ID NO:217的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“K2L/Y32S/L42I/C41S/C51S”可指相对于SEQ ID NO:2具有K2L、Y32S、L42I、C41S和C51S的氨基酸取代的那些实施方案。
在各种实施方案中，编码DVP的多核苷酸可用于转化植物细胞、酵母细胞或细菌细胞。在一些实施方案中，杀昆虫DVP转基因蛋白质可被配制成组合物，这些组合物可以本领域技术人员已知的任何方式喷洒或以其他方式施用到植物或其部分的表面。因此，本文提供了DNA构建体，其用于在宿主细胞(例如，植物细胞)中在适当条件下编码一种或多种DVP。用于防治植物细胞的寄生昆虫的害虫感染的方法包括通过重组技术将编码如本文所述的DVP的多核苷酸施用或引入植物、植物组织或植物细胞，以及在暴露于害虫的田地中使所述重组改变的植物、植物组织或植物细胞生长。另选地，DVP可配制成由DVP和赋形剂组成的可喷洒组合物，并通过直接施用而直接施用于易感植物，使得传染性昆虫摄入DVP后产生有害作用。
在一些实施方案中，DVP可包含与以下项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP可包含与以下项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP可包含与以下项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP可包含与以下项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:213或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP可包含与以下项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:128或147；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，用于编码DVP的多核苷酸可具有以下项中任一项的核酸序列：SEQ ID NO:77-114、116-122、124、156、158、164、167-168、172、174-175、220-225或227-219。在一些实施方案中，用于编码DVP的多核苷酸可包含与以下项具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％核苷酸序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO:77-114、116-122、124、156、158、164、167-168、172、174-175、220-225或227-219。
在一些实施方案中，用于编码DVP的多核苷酸可包含与以下项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的核酸序列：SEQ ID NO:77-114、116-122、124、156、158、164、167-168、172、174-175、220-225或227-219。
在一些实施方案中，编码DVP的多核苷酸可编码具有与以下项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的DVP：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包括用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有与以下项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其互补序列。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包括用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有与以下项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其互补序列。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包括用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有与以下项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:213或217-219；或其互补序列。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包括用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其互补序列。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包括用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其互补序列。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包括用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其互补序列。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包括用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:213或217-218；或其互补序列。
DVP杀昆虫蛋白
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可以是任何蛋白质、肽、多肽、氨基酸序列、构型、构建体或排列，该DVP杀昆虫蛋白包含：(1)至少一种DVP，或两种或更多种DVP；和(2)另外的非毒素肽、多肽或蛋白质。例如，在一些实施方案中，相对于单独的DVP，这些另外的肽、多肽或蛋白质可具有以下能力：增加暴露于DVP杀昆虫蛋白的昆虫的死亡率以及/或者抑制昆虫的生长；增加DVP杀昆虫蛋白的表达，例如在宿主细胞中；以及/或者影响DVP杀昆虫蛋白的翻译后加工。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可以是包含两种或更多种DVP的聚合物。在其他实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可以是包含两种或更多种DVP的聚合物，其中这些DVP经由接头肽(例如，可切割和/或不可切割接头)可操作地连接。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可指与一种或多种蛋白质(诸如稳定化结构域(STA)、内质网信号传导蛋白质(ERSP)、昆虫可切割或昆虫不可切割的接头(L)和/或它们的任何其他组合)可操作地连接的一种或多种DVP。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可以是氨基酸的聚合物，当其适当地折叠时或者在其最天然的热力学状态下，对一种或多种昆虫发挥杀昆虫活性。例如，在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可以是包含两种或更多种不同的DVP的聚合物。在其他实施方案中，杀昆虫蛋白可以是两种或更多种相同的DVP的聚合物。
在其他实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含一种或多种DVP，以及一种或多种肽、多肽或蛋白质，该一种或多种肽、多肽或蛋白质可有助于DVP杀昆虫蛋白的折叠。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含一种或多种DVP，以及一种或多种肽、多肽或蛋白质，其中该一种或多种肽、多肽或蛋白质是有助于稳定性或溶解性的蛋白质标签。在其他实施方案中，这些肽、多肽或蛋白质可以是有助于亲和纯化的蛋白质标签。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可指与一种或多种蛋白质(诸如稳定化结构域(STA)、内质网信号传导蛋白质(ERSP)、昆虫可切割或昆虫不可切割的接头、一种或多种异源肽、一种或多种另外的多肽和/或它们的任何其他组合)可操作地连接的一种或多种DVP。在一些实施方案中，杀昆虫蛋白可包含本文公开的一种或多种DVP。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含DVP均聚物，例如，两个或更多个为相同DVP的DVP单体。在一些实施方案中，杀昆虫蛋白可包含DVP杂聚物，例如，两种或更多种DVP单体，其中DVP单体是不同的。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含DVP，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含一种或多种DVP，该一种或多种DVP具有以下项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含DVP，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含DVP，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含一种或多种DVP，该一种或多种DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含一种或多种DVP，该一种或多种DVP具有以下项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含一种或多种DVP，其中这些DVP相同或不同。
用于产生可切割和不可切割接头的示例性方法可见于美国专利申请号15/727,277和PCT申请号PCT/US2013/030042，这些申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可以是包含如本文所述的一种或多种DVP的融合蛋白，这些DVP可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽。
“α交配因子(α-MF)肽”或“α-MF信号”或“α-MF”或“α交配因子分泌信号”或“αMF分泌信号”(均可互换使用)是指当α-MF肽可操作地连接到感兴趣的重组肽(例如，DVP)时，允许在重组表达系统中进行分泌性表达的信号肽。α-MF肽将新生重组多肽导向重组表达系统(例如，酵母重组表达系统)的分泌途径。
α-MF肽是本领域所熟知的。本文提供了示例性α-MF肽，包括但不限于：pKLAC1载体的乳酸克鲁维酵母α交配因子前-原分泌前导序列(SEQ ID NO:246)；NCBI登录号XP_454814(SEQ ID NO:247)；Mf(α)1/Mf(α)2(SEQ ID NO:248；NCBI登录号QEU61411.1)；交配因子α前体N-末端(SEQ ID NO:249；NCBI登录号KAG0674310)等。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中所述一种或多种DVP具有与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中DVP相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中所述一种或多种DVP具有与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中DVP相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐，其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中该一种或多种DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中该一种或多种DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中该一种或多种DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；该一种或多种DVP是两种或更多种DVP的均聚物或杂聚物，其中每种DVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中该一种或多种DVP、该α-MF或它们的组合由可切割接头或不可切割接头分离。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中，该α-MF肽为源自酵母物种的α-MF肽。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中，该α-MF肽源自选自酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属或裂殖酵母属的任何物种的酵母物种。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中该α-MF肽源自选自乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母的酵母物种。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中，该α-MF肽源自乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母。
在一些实施方案中，α-MF肽可以是源自乳酸克鲁维酵母的α-MF肽。
在一些实施方案中，α-MF肽可以是乳酸克鲁维酵母α-交配因子(α-MF)分泌结构域(用于分泌性表达)。
例如，在一些实施方案中，α-MF肽可具有与SEQ ID NO:246-249中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，α-MF肽可具有与SEQ ID NO:246所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，α-MF肽可具有SEQ ID NO:246-249中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，α-MF肽可具有SEQ ID NO:246所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含一种或多种DVP，该一种或多种DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；其中该一种或多种DVP可操作地连接到α-MF肽，该α-MF肽具有与SEQ ID NO:246-249中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含一种或多种DVP，该一种或多种DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；其中该一种或多种DVP可操作地连接到α-MF肽，该α-MF肽具有与SEQ ID NO:246-249中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列；并且还包含另外的非毒素肽、多肽或蛋白质，例如，在一些实施方案中，其中所述另外的非毒素肽、多肽或蛋白质具有进行下列操作中的一者或多者的能力：相对于单独的DVP，当昆虫暴露于DVP杀昆虫蛋白时，增加昆虫的死亡率以及/或者抑制昆虫的生长；增加所述DVP杀昆虫蛋白的表达，例如在宿主细胞或表达系统中；以及/或者影响DVP杀昆虫蛋白的翻译后加工(例如，允许DVP杀昆虫蛋白的分泌性表达)。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中存在两种或更多种DVP。
在一些实施方案中，融合蛋白可包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中存在两种或更多种DVP，其中这些DVP和/或该α-MF肽经由接头肽(例如，可切割和/或不可切割接头)可操作地连接。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可以是融合蛋白，该融合蛋白包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；并且进一步与一种或多种蛋白质(诸如稳定化结构域(STA)、内质网信号传导蛋白质(ERSP)、昆虫可切割或昆虫不可切割的接头(L)和/或它们的任何其他组合)可操作地连接。
本文所述的DVP中的任何DVP可用于产生包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP的融合蛋白。例如，本文所述的DVP中的任何DVP可用于产生包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP的融合蛋白，例如，其中该一种或多种DVP具有与以下项中任一项具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219，其同样在本文有所描述。
示例性DVP和DVP杀昆虫蛋白
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:47)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:47)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSVKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:53)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSVKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:53)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKMVCRDV”(SEQ ID NO:136)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKMVCRDV”(SEQ ID NO:136)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRDVKSGFFSSKEVCRDV”(SEQ ID NO:139)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRDVKSGFFSSKEVCRDV”(SEQ ID NO:139)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACREVKSGFFSSKKVCRDV”(SEQ ID NO:140)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACREVKSGFFSSKKVCRDV”(SEQ ID NO:140)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECESGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV”(SEQ ID NO:144)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECESGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV”(SEQ ID NO:144)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECNSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV”(SEQ ID NO:146)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECNSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV”(SEQ ID NO:146)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECYSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV”(SEQ ID NO:147)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECYSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV”(SEQ ID NO:147)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:187)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:187)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWKKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:188)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWKKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:188)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWHKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:189)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWHKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:189)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLFSKWRPLDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:190)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLFSKWRPLDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:190)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLFSKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:191)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLFSKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:191)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:209)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:209)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:210)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:210)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:211)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:211)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:212)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:212)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:213)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:213)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLTCRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:214)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLTCRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:214)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLSCRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:215)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLSCRSLKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:215)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLDCRCIKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:217)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLDCRCIKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:217)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:218)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:218)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:219)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:219)，或其药学上可接受的盐，或基本上由其组成或由其组成。
生产DVP的方法
生产蛋白质的方法是本领域熟知的，并且存在多种技术可用。例如，在一些实施方案中，可使用重组方法或化学合成来生产蛋白质。
在一些实施方案中，本发明的DVP可使用任何已知的用于生产蛋白质的方法生产。例如，在一些实施方案中，并且没有限制，DVP可使用重组表达系统，诸如酵母表达系统或者细菌表达系统来产生。然而，本领域普通技术人员将认识到，可使用其他蛋白质生产方法。
在一些实施方案中，本发明提供了使用重组表达系统生产DVP的方法。
在一些实施方案中，本发明包括生产DVP的方法、基本上由其组成或由其组成，所述方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含用于编码DVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成；(b)将该载体引入宿主细胞，例如细菌或酵母，或昆虫，或植物细胞，或动物细胞；以及(c)在用于能够使DVP表达和分泌到生长培养基中的条件下，在生长培养基中培养酵母菌株。在一些相关的实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。
本发明在多种宿主细胞中都是可行的(参见下文的宿主细胞部分)。实际上，本发明的最终用户可在他或她选择的任何宿主细胞中实践其教导。因此，在一些实施方案中，宿主细胞可以是满足最终用户要求的任何宿主细胞；即，在一些实施方案中，DVP的表达可使用多种宿主细胞并依照本文的教导完成。例如，在一些实施方案中，用户可能期望使用一种特定类型的宿主细胞(例如，酵母细胞或细菌细胞)而不是另一种；给定宿主细胞的优选范围可从可用性到成本。
例如，在一些实施方案中，在一些实施方案中，本发明包括生产DVP的方法、基本上由其组成或由其组成，所述方法包括：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含用于编码DVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成；(b)将该载体引入宿主细胞，例如细菌或酵母，或昆虫，或植物细胞，或动物细胞；以及(c)在用于能够使DVP表达和分泌到生长培养基中的条件下，在生长培养基中培养酵母菌株。在一些相关的实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。
分离并突变野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a
在各种例示性实施方案中，DVP可通过以下方式获得：在野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a多核苷酸序列中产生突变；将该Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多核苷酸(dvp)序列插入到合适的载体中；以表达编码DVP的多核苷酸的方式转化宿主生物体；培养宿主生物体以产生所需量的DVP；然后从宿主生物体中和/或周围纯化DVP。
使用本领域普通技术人员已知的任何技术，野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a毒素可从毒液中分离，而毒液又可从蜘蛛(例如，美国沙漠蜘蛛)的毒腺中分离。例如，在一些实施方案中，可根据美国专利号5,688,764中所述的方法分离毒液，该专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
可通过使用针对Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a多核苷酸序列的引物探针筛选基因组文库来获得野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a多核苷酸序列。另选地，野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a多核苷酸序列和/或DVP多核苷酸序列可化学合成。例如，可使用寡核苷酸合成方法(诸如亚磷酰胺；三酯、亚磷酸酯或H-膦酸酯方法)产生野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a多核苷酸序列和/或DVP多核苷酸序列(参见Engels,J.W.和Uhlmann,E.(1989年)，“GeneSynthesis[New Synthetic Methods(77)]”，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，第28卷：第716-734页，其公开内容全文以引用方式并入本文)。
在野生型Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a多核苷酸序列中产生突变可通过本领域普通技术人员熟知的各种方法来实现。诱变方法包括昆克尔方法；盒式诱变；PCR定点诱变；“完美的谋杀”技术(“完美的犯罪”)；利用PCR和一个可循环标记进行直接基因缺失和定点诱变；利用PCR和一个使用长同源区的可循环标记进行直接基因缺失和定点诱变；移位“弹入弹出”方法；和CRISPR-Cas 9。定点诱变的示例性方法可见于Ruvkun和Ausubel，“A generalmethod for site-directed mutagenesis in prokaryotes”，Nature，1981年1月1日，第289卷第5793期：第85-88页；Wallace等人，“Oligonucleotide directed mutagenesis ofthe human beta-globin gene:a general method for producing specific pointmutations in cloned DNA”，Nucleic Acids Res.，1981年8月11日，第9卷第15期：第3647-3656页；Dalbadie-McFarland等人，“Oligonucleotide-directed mutagenesis asageneral and powerful method for studies of protein function”，Proc Natl AcadSci U S A，1982年11月，第79卷第21期：第6409-6413页，Bachman，“Site-directedmutagenesis.”Methods Enzymol.，2013年，第529卷：第241-248页；Carey等人，“PCR-mediated site-directed mutagenesis”，Cold Spring Harb Protoc.，2013年8月1日，2013年，第8卷：第738-742页；以及Cong等人，“Multiplex genome engineering usingCRISPR/Cas systems”，Science，2013年2月15日，第339卷第6121期：第819-823页；所有上述文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
化学合成DVP多核苷酸
在一些实施方案中，编码DVP的多核苷酸序列可使用商业上可获得的多核苷酸合成服务(诸如由(例如，TurboGENETM、PriorityGENE和FragmentGENE)或(例如，定制DNA和RNA寡聚物设计和定制DNA寡聚物)提供的那些)化学合成。用于产生DNA和/或定制化学合成的多核苷酸的示例性方法是本领域熟知的，并且例示性地提供于1995年2月13日提交的美国专利号5,736,135、序列号08/389,615中，这些申请的公开内容全文以引用方式并入本文。还参见Agarwal等人，“Chemical synthesis ofpolynucleotides”，Angew Chem Int Ed Engl.，1972年6月，第11卷第6期：第451-459页；Ohtsuka等人，“Recent developments in the chemical synthesis ofpolynucleotides”，Nucleic Acids Res.，1982年11月11日，第10卷第21期：第6553-6570页；Sondek和Shortle，“A general strategy for random insertion and substitutionmutagenesis:substoichiometric coupling of trinucleotide phosphoramidites”，Proc Natl Acad Sci U S A，1992年4月15日，第89卷第8期：第3581-3585页；BeaucageS.L.等人，“Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by thePhosphoramidite Approach”，Tetrahedron，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，NL，第48卷第12期，1992年，第2223-2311页；Agrawal，1993年，“Protocols forOligonucleotides and Analogs:Synthesis and Properties”，Methods in MolecularBiology，第20卷，其公开内容全文以引用方式并入本文。
化学合成的多核苷酸允许产生DNA序列，该序列基于所述序列内的核苷酸排列(即胞嘧啶[C]、鸟嘌呤[G]、腺嘌呤[A]或胸腺嘧啶[T]分子的排列)被定制以产生所需多肽；从化学合成的DNA多核苷酸转录的mRNA序列可翻译成氨基酸序列，每个氨基酸对应于mRNA序列中的密码子。因此，从mRNA序列翻译的多肽链的氨基酸组成可通过改变决定20种氨基酸中的哪一种将被添加到生长中的多肽中的基础密码子来改变；因此，DNA中的突变诸如插入、取代、缺失和移码可引起氨基酸插入、取代或缺失，这取决于基础密码子。
在一些实施方案中，可化学合成多核苷酸，其中所述多核苷酸含有一个或多个突变。在一些实施方案中，mRNA可从模板DNA序列中产生。在其他实施方案中，mRNA可克隆并转化到感受态细胞中。
载体和转化
本发明的载体是指用于将一种或多种异源多核苷酸引入宿主细胞(例如，酵母细胞)的工具。本领域普通技术人员已知多种可用的载体和克隆策略。
如本文所用，术语“载体”是指载体核酸分子，多核苷酸可插入其中用于引入细胞(例如，转化)，并且在该细胞中可复制该多核苷酸。在一些实施方案中，载体可包含“载体元件”，例如但不限于：复制起点(ORI)；允许选择的基因或核苷酸序列(例如，赋予抗生素抗性的基因或允许在确定成分培养基中生长的核苷酸序列)；多克隆位点；启动子区；引物结合位点；和/或它们的组合。
在一些实施方案中，插入载体的多核苷酸或核苷酸序列中的一些多核苷酸或核苷酸序列可以是“异源的”或“外源的”，这意味着其对于载体所引入的细胞是外源的，或者该序列与细胞中的序列同源，但是在宿主细胞核酸中通常没有发现该序列的位置。例如，在一些实施方案中，重组酵母细胞可用包含异源多核苷酸的载体进行转化，该异源多核苷酸包含内源核苷酸序列，但是在宿主细胞核酸中通常没有发现该内源核苷酸序列的位置。
载体既可用作制备本发明的异源多核苷酸的方法，又可用于最终转化用于产生重组酵母细胞的细胞，以及/或者用作增加异源多肽表达的方法。
在一些实施方案中，载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。例如，在一些实施方案中，载体可以是质粒，其可将异源多核苷酸和/或表达盒引入宿主细胞以进行转录和翻译。
本领域普通技术人员将很好地通过标准重组技术构建载体，这在Sambrook等人1989年和Ausubel等人1996年的文献中有所描述，这两篇文献全文均以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，除了编码异源多核苷酸之外，载体还可编码靶分子。靶分子是将所需多核苷酸引导至特定位置的分子。
在一些实施方案中，用于编码DVP的异源多核苷酸可插入到任何合适的载体(例如，质粒、噬菌体或病毒载体)中进行扩增，并因此可使用本领域已知的方法进行繁殖，诸如在Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，由Sambrook,Fritsch和Maniatis编辑(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989年)中描述的那些方法，其公开内容全文以引用方式并入本文。
从化学合成的DNA多核苷酸序列和/或经由诱变改变的野生型DNA多核苷酸序列获得DVP可通过将DNA序列克隆到合适的载体中来实现。本领域普通技术人员已知多种可用的表达载体、宿主生物体和克隆策略。例如，载体可以是质粒，其可将异源基因和/或表达盒引入酵母细胞中以进行转录和翻译。术语“载体”用于指载体核酸分子，核酸序列可插入其中以引入细胞，在该细胞中该核酸序列可复制。载体可包含“载体元件”，诸如复制起点(ORI)；赋予抗生素抗性以允许选择的基因；多克隆位点；启动子区；用于非细菌转染的选择标记；和引物结合位点。核酸序列可以是“外源的”，这意味着其对于载体所引入的细胞是外源的，或者该序列与细胞中的序列同源，但在宿主细胞核酸中通常没有发现该序列的位置。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员将很好地通过标准重组技术构建载体，这在Sambrook等人1989年和Ausubel等人1996年的文献中有所描述，这两篇文献均以引用方式并入本文。除了编码Dc1a变体多核苷酸之外，载体可编码靶分子。靶分子是将所需核酸引导至特定组织、细胞或其他位置的分子。
在一些实施方案中，可将用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的多核苷酸转化到宿主细胞中。
在一些实施方案中，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的多核苷酸可克隆到载体中，并转化到宿主细胞中。
在一些实施方案中，可将DVP ORF转化到宿主细胞中。
除了用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的多核苷酸序列(例如，DVP ORF)之外，称为调节元件的另外的DNA片段可克隆到允许外源DNA或转基因表达增强的载体中；此类另外的DNA片段的示例包括(1)启动子、终止子和/或增强子元件；(2)合适的mRNA稳定化聚腺苷酸化信号；(3)内部核糖体进入位点(IRES)；(4)内含子；和(5)转录后调节元件。感兴趣的DNA片段(例如，dvp)与前述顺式作用元件中的任一者的组合称为“表达盒”。
在一些实施方案中，表达盒或DVP表达盒可包含一种或多种DVP，和/或一种或多种DVP杀昆虫蛋白。
在一些实施方案中，表达盒或DVP表达盒可包含一种或多种DVP，和/或一种或多种DVP杀昆虫蛋白，和一种或多种另外的调节元件，诸如：(1)启动子、终止子和/或增强子元件；(2)合适的mRNA稳定化聚腺苷酸化信号；(3)内部核糖体进入位点(IRES)；(4)内含子；和(5)转录后调节元件。
在一些实施方案中，单个表达盒可包含上述调节元件中的一者或多者，和用于表达DVP的多核苷酸。例如，在一些实施方案中，DVP表达盒可包含用于表达DVP的多核苷酸，和α-MF信号；Kex2位点；LAC4终止子；ADN1启动子；和乙酰胺酶(amdS)选择标记—在5’末端和3’末端侧接LAC4启动子。
在一些实施方案中，可存在许多克隆到载体中的表达盒。例如，在一些实施方案中，可存在第一表达盒，该第一表达盒包含用于表达DVP的多核苷酸。在另选的实施方案中，存在两个用于编码DVP的表达盒(即，双表达盒)。在其他实施方案中，存在三个用于编码DVP的表达盒(即，三表达盒)。
在一些实施方案中，可通过将第二DVP表达盒亚克隆到含有第一DVP表达盒的载体中来产生双表达盒。
在一些实施方案中，可通过将第三DVP表达盒亚克隆到含有第一和第二DVP表达盒的载体中来产生三表达盒。
在一些实施方案中，DVP多核苷酸可使用各种克隆策略以及本领域普通技术人员容易获得的商业克隆试剂盒和材料克隆到载体中。例如，DVP多核苷酸可使用此类策略如SnapFast、Gateway、TOPO、Gibson、LIC、InFusionHD或Electra策略克隆到载体中。存在许多可用于生产DVP的商业上可获得的载体。例如，DVP多核苷酸可使用聚合酶链反应(PCR)产生，并与pCRTMII-TOPO载体或载体(作为/>TA/>试剂盒从Invitrogen商购获得)在室温下混合5分钟；然后可将/>反应物转化到感受态细胞中，随后可基于颜色变化选择这些感受态细胞(参见Janke等人，“A versatile toolboxfor PCR-based tagging of yeast genes:new fluorescent proteins,more markersand promoter substitution cassettes”，Yeast,2004年8月，第21卷第11期：第947-962页；还参见Adams等人，Methods in Yeast Genetics.，Cold Spring Harbor，NY，1997年，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，编码DVP的多核苷酸可克隆到载体(诸如质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和/或人工染色体(例如，YAC))中。
在一些实施方案中，编码DVP的多核苷酸可通过进行以下操作插入到载体(例如，使用大肠杆菌作为宿主的质粒载体)中：使用允许插入感兴趣的DNA片段所必需的限制酶消化约2μg至5μg载体DNA，随后过夜温育以完成完全消化(碱性磷酸酶可用于5’末端去磷酸化以便避免自连接/再环化)；凝胶纯化消化的载体。接下来，经由PCR扩增感兴趣的DNA片段，例如，编码DVP的多核苷酸，并使用本领域普通技术人员已知的技术(例如，通过使用PCR清除试剂盒)从PCR反应中除去任何过量的酶、引物、未掺入的dNTP、短时失败的PCR产物和/或盐。通过产生包含以下的混合物将感兴趣的DNA片段与载体连接：约20ng载体；约100ng至1,000ng或感兴趣的DNA片段；2μL 10×缓冲液(即，30mM Tris-HCl 4mM MgCl2，26μM NAD，1mMDTT，50μg/mL BSA，pH 8，在25℃下储存)；1μL T4DNA连接酶；通过加入H2O使总体积达到20μL。然后，可将连接反应混合物在室温下温育2小时，或在16℃下温育过夜。然后，连接反应物(即，约1μL)可转化到感受态细胞中，例如，通过使用电穿孔或化学方法，然后可进行菌落PCR以鉴定含有感兴趣的DNA片段的载体。
在一些实施方案中，编码DVP的多核苷酸(例如，DVP ORF)，连同一起组成DVP表达盒的其他DNA片段一起，可被设计用于从宿主酵母细胞分泌。设计DVP表达盒的例示性方法如下：表达盒可以信号肽序列开始，随后编码Kex2切割位点(赖氨酸-精氨酸)的DNA序列，并且接着随后是DVP多核苷酸转基因(DVP ORF)，其中在5’末端处添加甘氨酸-丝氨酸密码子，并且最后在3’末端处添加终止密码子。然后所有这些元件在酵母细胞中作为单个开放阅读框(ORF)表达为融合肽。α-交配因子(αMF)信号序列最常用于促进重组杀昆虫肽通过重组酵母的内源分泌途径的代谢加工，即表达的融合肽通常将进入内质网，其中α-交配因子信号序列通过信号肽酶活性被除去，然后将所得的前杀昆虫肽运输至高尔基体，其中上述赖氨酸-精氨酸二肽被Kex2内切蛋白酶完全去除，之后成熟的多肽(即，DVP)从细胞分泌出来。
在一些实施方案中，重组酵母细胞中的多肽表达水平可通过基于特定宿主酵母物种优化密码子来增强。在给定宿主生物体的内源开放阅读框中观察到的密码子的天然存在频率不一定需要被优化用于高效表达。此外，不同的酵母物种(例如，乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母等)具有不同的用于高效表达的最佳密码子。因此，应该考虑密码子优化用于DVP表达盒，包括编码信号序列的序列元件、Kex2切割位点和DVP，因为它们最初在重组酵母细胞中被翻译成一个融合肽。
在一些实施方案中，密码子优化的DVP表达盒可连接到酵母特异性表达载体中用于酵母表达。存在许多表达载体可用于酵母表达，包括附加型载体和整合型载体，并且它们通常是为特定酵母菌株设计的。应该根据将用于肽生产的特定酵母表达系统仔细选择合适的表达载体。在一些实施方案中，可使用整合载体，其整合到转化的酵母细胞的染色体中，并且在细胞分裂和增殖的循环中保持稳定。整合型DNA序列与转化的酵母物种中的靶向基因组DNA基因座同源，并且此类的整合型序列包括pLAC4、25SrDNA、pAOX1和TRP2等。杀昆虫肽转基因的位置可与整合型DNA序列(插入载体)相邻或在整合型DNA序列(置换载体)内。
在一些实施方案中，表达载体或克隆载体可包含用于在大肠杆菌中制备DNA的大肠杆菌元件，例如大肠杆菌复制起点、抗生素选择标记等。在一些实施方案中，载体可包含表达感兴趣的转基因所需的序列元件的阵列，例如转录启动子、终止子、酵母选择标记、与宿主酵母DNA同源的整合型DNA序列等。存在许多合适的酵母启动子可用，包括天然和工程改造启动子，例如，酵母启动子诸如pLAC4、pAOX1、pUPP、pADH1、pTEF、pGal1等，和其他可用于一些实施方案中的启动子。
在一些实施方案中，可使用选择方法诸如乙酰胺原养型选择；博莱霉素抗性选择；遗传霉素抗性选择；诺尔丝菌素抗性选择；尿嘧啶缺乏选择；和/或其他选择方法。例如，在一些实施方案中，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS基因可用作选择性标记。使用选择性标记的示例性方法可见于美国专利号6,548,285(1997年4月3日提交)；6,165,715(1998年6月22日提交)；6,110,707(1997年1月17日提交)，这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，编码DVP的多核苷酸可插入到pKLAC1载体中。pKLAC1可从NewEnglandInc.(NEB#E1000)商购获得。pKLAC1被设计为实现重组蛋白(例如，DVP)在酵母乳酸克鲁维酵母中的高水平表达。pKLAC1质粒可单独订购，或作为乳酸克鲁维酵母蛋白质表达试剂盒的一部分订购。pKLAC1质粒可使用SacII或BstXI限制酶线性化，并具有αMF分泌信号下游的MCS。αMF分泌信号指导重组蛋白质进入分泌途径，然后经由Kex2切割，从而产生感兴趣的肽，例如DVP。Kex2是钙依赖性丝氨酸蛋白酶，其参与激活分泌途径的蛋白原，并且是可商购获得的(/>项目号450-45)。
在一些实施方案中，编码DVP的多核苷酸可插入到pLB102质粒中，或在选择用与编码DVP的多核苷酸连接的pKLAC1质粒转化的酵母菌落后亚克隆到pLB102质粒中。可基于乙酰胺酶(amdS)选择用与编码DVP的多核苷酸连接的pKLAC1质粒转化的酵母(例如乳酸克鲁维酵母)，这允许转化的酵母细胞在含有乙酰胺作为其唯一氮源的YCB培养基中生长。一旦鉴定出用与编码DVP的多核苷酸连接的pKLAC1质粒转化的阳性酵母菌落。
在一些实施方案中，编码DVP的多核苷酸可插入到其他可商购获得的质粒和/或载体中，这些质粒和/或载体对于本领域技术人员是容易获得的，例如质粒可从Addgene(非盈利质粒库)、 和PromegaTM获得。
在一些实施方案中，用一个或多个DVP表达盒转化的酵母细胞可在酵母培养物中生产DVP，产量为：每升培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L、200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L、至少12,000mg/L、至少12,500mg/L、至少13,000mg/L、至少14,000mg/L、至少15,000mg/L、至少16,000mg/L、至少17,000mg/L、至少17,500mg/L、至少18,000mg/L、至少19,000mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L、至少60,000mg/L、至少70,000mg/L、至少80,000mg/L、至少90,000mg/L或至少100,000mg/L的DVP。
在一些实施方案中，用一个或多个DVP表达盒转化的乳酸克鲁维酵母的培养物可在酵母培养物中生产DVP，产量为：每升含有以下项的生长培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L、200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L、至少12,000mg/L、至少12,500mg/L、至少13,000mg/L、至少14,000mg/L、至少15,000mg/L、至少16,000mg/L、至少17,000mg/L、至少17,500mg/L、至少18,000mg/L、至少19,000mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L、至少60,000mg/L、至少70,000mg/L、至少80,000mg/L、至少90,000mg/L或至少100,000mg/L的DVP：(1)MSM培养基配方：2g/L柠檬酸钠二水合物；1g/L硫酸钙二水合物(0.79g/L无水硫酸钙)；42.9g/L磷酸二氢钾；5.17g/L硫酸铵；14.33g/L硫酸钾；11.7g/L硫酸镁七水合物；2mL/L PTM1微量盐溶液；0.4ppm生物素(来自500×，200ppm储备液)；1％至2％纯甘油或其他碳源。(2)PTM1微量盐溶液：硫酸铜-5H2O 6.0g；碘化钠0.08g；硫酸锰-H2O 3.0g；钼酸钠-2H2O 0.2g；硼酸0.02g；氯化钴0.5g；氯化锌20.0g；硫酸亚铁-7H2O 65.0g；生物素0.2g；硫酸5.0mL；加水至终体积为1升。乳酸克鲁维酵母确定成分培养基(DMSor)的例示性组成如下：11.83g/L KH2PO4、2.299g/L K2HPO4、20g/L可发酵糖(例如，半乳糖、麦芽糖、拉托三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖和/或糖醇，例如赤藓醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇和木糖醇)、1g/L MgSO4.7H2O、10g/L(NH4)SO4、0.33g/L CaCl2.2H2O、1g/L NaCl、1g/L KCl、5mg/L CuSO4.5H2O、30mg/L MnSO4.H2O、10mg/LZnCl2、1mg/L KI、2mg/L CoCl2.6H2O、8mg/L Na2MoO4.2H2O、0.4mg/L H3BO3、15mg/LFeCl3.6H2O、0.8mg/L生物素、20mg/L泛酸钙、15mg/L硫胺素、16mg/L肌醇、10mg/L烟酸和4mg/L吡哆醇；选择标记，以及在使得能够最佳表达的条件下进行培养。
在一些实施方案中，包含用于表达DVP的多核苷酸的一个或多个表达盒可插入到载体中，从而产生产量为约100mg/L的DVP(酵母发酵液上清液)。例如，在一些实施方案中，包含用于表达DVP的多核苷酸的两个表达盒可插入到载体(例如，pKS022质粒)中，从而产生产量为约2g/L的DVP(酵母发酵液上清液)。另选地，在一些实施方案中，包含用于表达DVP的多核苷酸的三个表达盒可插入到载体(例如，pLB103bT质粒)中。
在一些实施方案中，可将多个DVP表达盒转染到酵母中，以便能够将一个或多个拷贝的优化DVP转基因整合到乳酸克鲁维酵母基因组中。将多个DVP表达盒引入到乳酸克鲁维酵母基因组中的示例性方法如下：合成DVP表达盒DNA序列，其包含完整的LAC4启动子元件、密码子优化的DVP ORF元件和pLAC4终止子元件；将完整的表达盒连接到pLB10V5的pLAC4终止子下游的Sal I和Kpn I限制位点之间的pLB103b载体中，从而产生双转基因DVP表达载体pKS022；然后使用Sac II限制性内切核酸酶将双转基因载体pKS022线性化，并通过电穿孔转化到乳酸克鲁维酵母YCT306菌株中。然后使所得酵母菌落在补充有5mM乙酰胺的YCB琼脂板上生长，只有表达乙酰胺酶的细胞才能有效地使用乙酰胺作为氮的代谢源。为了评价酵母菌落，可从pKS022酵母板上挑取约100个至400个菌落。来自菌落的接种物各自在2.2mL的加入了2％糖醇作为碳源的确定的乳酸克鲁维酵母培养基中培养。培养物在23.5℃下温育，以280rpm振荡六天，此时培养物中的细胞密度将达到其最大水平，如600nm(OD600)处的吸光度所示。然后通过以4,000rpm离心10分钟从培养物中除去细胞，并将所得上清液(条件培养基)通过0.2μM膜过滤用于HPLC产量分析。
表达盒
除了用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸之外，称为调节元件的另外的DNA片段可克隆到允许异源多核苷酸表达增强的载体中。此类调节元件的示例包括(1)启动子、终止子和/或增强子元件；(2)合适的mRNA稳定化聚腺苷酸化信号；(3)内部核糖体进入位点(IRES)；(4)内含子；和(5)转录后调节元件。
如上所述，感兴趣的DNA片段(例如，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸)与前述顺式作用元件中的任一者的组合称为“表达盒”。
因此，在一些实施方案中，称为调节元件的这些另外的DNA片段可被可操作地连接，并相对于用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸处于任何取向。
例如，在一些实施方案中，载体可包含表达盒，其中该表达盒包含以下一者或多者：(1)启动子、终止子和/或增强子元件；(2)合适的mRNA稳定化聚腺苷酸化信号；(3)内部核糖体进入位点(IRES)；(4)内含子；和(5)转录后调节元件，它们允许用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸表达增强。
并且，在一些实施方案中，载体可包含用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的多种异源多核苷酸，其中用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的单独的异源多核苷酸中的每种异源多核苷酸都具有其自己的表达盒，该表达盒包含以下一者或多者：(1)启动子、终止子和/或增强子元件；(2)合适的mRNA稳定化聚腺苷酸化信号；(3)内部核糖体进入位点(IRES)；(4)内含子；和(5)转录后调节元件，它们分别允许用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸中的每种异源多核苷酸表达增强。
在一些实施方案中，异源多核苷酸可包含一个或多个表达盒。
在一些实施方案中，载体可包含一个或多个表达盒。
克隆策略
可通过多种方法将合适的多核苷酸插入到载体中。
通常，在用合适的限制性内切核酸酶消化插入物和载体后，将DNA序列连接到载体中的所需位置。另选地，可连接插入物和载体中的平端。各种克隆技术公开于Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,Inc.，1997年，以及Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989年)中；这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。此类方法和其他方法被认为在本领域技术人员的范围内。
在一些实施方案中，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸可插入到其他可商购获得的质粒和/或载体中，这些质粒和/或载体对于本领域技术人员是容易获得的，例如质粒可从Addgene(非盈利质粒库)、和PromegaTM获得。
在一些实施方案中，载体可以是例如质粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。在其他实施方案中，载体可包括染色体、非染色体和合成DNA序列、SV40的衍生物；细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA组合的载体、病毒DNA(诸如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病病毒)。
在一些实施方案中，可使用与真核细胞(诸如脊椎动物细胞)相容的载体。真核细胞载体是本领域熟知的，可从商业来源获得。所考虑的载体可包含原核序列(以促进载体在细菌中的增殖)和在非细菌细胞中起作用的一个或多个真核转录单元。通常，此类载体提供了用于插入所需重组DNA分子的方便的限制位点。pcDNAI、pSV2、pSVK、pMSG、pSVL、pPVV-1/PML2d和pTDT1(ATCC号31255)衍生的载体是适于转染非人细胞的哺乳动物载体的示例。在一些实施方案中，可用来自细菌质粒(诸如pBR322)的序列修饰前述载体中的一些载体，以促进原核和真核细胞中的复制和药物抗性选择。另选地，病毒的衍生物(诸如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或爱泼斯坦-巴尔病毒(pHEBo、pREP-衍生的和p205))可用于在猪细胞中表达蛋白质。用于制备质粒以及转化宿主细胞的各种方法是本领域熟知的。
在一些实施方案中，除了用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸之外，载体可包括用于靶向膜或分泌的信号序列或前导序列以及表达调节元件，诸如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号和/或增强子；并且可根据其目的以各种形式进行构建。起始密码子和终止密码子通常被认为是编码靶蛋白的核苷酸序列的一部分，是在已施用遗传构建体的受试者中发挥功能所必需的，并且必须与编码序列一起在框中。
在一些实施方案中，载体的启动子可以是组成型的或诱导型的。此外，表达载体可包括允许选择含有载体的宿主细胞的选择性标记，并且可复制的表达载体包括复制起点。载体可以是自我复制的，或者可整合到宿主DNA中。
如果构建体的设计导致标记由内源启动子指导转录，则在靶向转录活性基因的情况下可能不需要使用启动子。本文描述了用于进行这种靶向修饰的示例性构建体和载体。然而，可用于此类方法的其他载体是本领域已知的，并且可易于适用于本发明。
在一些实施方案中，可使用靶向载体。基本的靶向载体包含位点特异性整合(SSI)序列，例如，与靶向的内源DNA片段同源的序列的5’和3’同源臂。
在一些实施方案中，靶向载体还可任选地包括一个或多个阳性和/或阴性选择标记。在一些实施方案中，选择标记可用于破坏基因功能以及/或者鉴定转化后整合了靶向载体核苷酸序列的细胞。
在一些实施方案中，靶向载体的使用可利用包含一个或多个突变的异源多核苷酸，以便产生可与内源基因有区别的限制性模式(如果转基因和内源基因相似)。
同源臂
本领域普通技术人员将认识到，靶向基因修饰需要使用包含与靶向基因同源的区域(或其侧翼区)的核酸分子载体，使得可促进载体整合到基因组中。因此，靶向载体通常被设计为包含以下三个主要区域：(1)第一区域，该第一区域与待靶向的基因座同源；(2)第二区域，该第二区域是待插入所靶向基因座处以及/或者特异性替换所靶向基因座的一部分的异源多核苷酸序列(例如，包含用于编码感兴趣的蛋白质以及/或者编码选择性标记(诸如抗生素抗性蛋白质)的多核苷酸)；和(3)第三区域，该第三区域与第一区域一样，与所靶向基因座同源，但通常不与基因组的第一区域邻接。
靶向载体和所靶向的内源或野生型基因座之间的同源重组导致靶向载体中呈现的两个同源区之间的任何基因座序列的缺失，以及用异源序列和任选地一个或多个另外的调节元件替换该序列，或将异源序列和任选地一个或多个另外的调节元件插入该序列中，该异源序列例如编码感兴趣的多核苷酸。
为了促进同源重组，靶向载体的第一区域和第三区域(参见上文)包括与待靶向的基因(或侧翼区)具有基本同一性的序列。“基本上相同”意指具有与另一序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％以及甚至更优选100％同一性的序列。序列同一性通常使用(基于局部比对算法的搜索工具)或/>2以其中指定的默认参数来测量(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.，第215卷：第403-410页，1990年；Tatiana等人，FEMS Microbiol.Lett.，第174卷：第247-250页，1999年)。这些软件程序通过对将同源性程度分配给各种取代、缺失和其他修饰来匹配相似序列。因此，与所靶向的基因座具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％以及甚至更优选100％序列同一性的序列可用于本发明以促进同源重组。
两个同源区(即，上述第一区域和第三区域)的总大小可以是例如约1千碱基至25千碱基(kb)之间(例如，约2kb至20kb之间、约5kb至15kb之间或约6kb至10kb之间)，并且替换所靶向的基因座的一部分的第二区域的大小可以是例如约0.5kb至5kb之间(例如，约1kb至4kb之间、约1kb至3kb之间、约1kb至2kb或约3kb至4kb)。
在一些实施方案中，靶向载体通常可包含选择性标记和位点特异性整合(SSI)序列。SSI序列可包含感兴趣的转基因，例如，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸；其侧翼有称为“5’和3’同源臂”或“5’和3’臂”或“左臂和右臂”或“同源臂”的两个基因组DNA片段。这些同源臂与宿主生物体中的靶向基因组序列和/或感兴趣的内源基因重组，以实现宿主生物体的染色体基因座的成功遗传修饰。
当设计靶向载体的同源臂时，5’和3’臂都应与待靶向的内源序列具有足够的序列同源性，以产生序列的有效体内配对和交叉形成。并且，尽管同源臂长度是可变的，但是两条臂的同源性总长度为至少5kb至8kb(较短的臂具有不小于1kb的长度)，这是可遵循的一般准则，以有助于确保重组成功。
在一些实施方案中，5’和/或3’同源臂可变化。例如，在一些实施方案中，不同的基因座可由5’和/或3’同源臂靶向，例如，在本文所述的同源臂的上游和/或下游，以在不同的位置交换感兴趣的序列。
载体设计和体内同源重组的另外的示例性方法可见于：美国专利号5,464,764，名称为“Positive-negative selection methods and vectors”(1993年2月4日提交；受让人University of Utah Research Foundation，Salt Lake City，UT)；美国专利号5,733,761，名称为“Protein production and protein delivery”(1995年5月26日提交；受让人Transkaryotic Therapies,Inc.，Cambridge，MA)；美国专利号5,789,215，名称为“Genetargeting in animal cells using isogenic DNA constructs”(1997年8月7日提交；受让人GenPharm International，San Jose，CA)；美国专利号6,090,554，名称为“Efficientconstruction of gene targeting vectors”(1997年10月31日提交；受让人Amgen,Inc.，Thousand Oaks，CA)；美国专利号6,528,314，名称为“Procedure for specificreplacement of a copy of a gene present in the recipient genome by theintegration of a gene different from that where the integration is made”(1995年6月6日提交；受让人Institut,Pasteur)；美国专利号6,537,542，名称为“Targetedintroduction of DNA into primary or secondary cells and their use for genetherapy and protein production”(2000年4月14日提交；受让人TranskaryoticTherapies,Inc.，Cambridge，MA)；美国专利号8,048,645，名称为“Method of producingfunctional protein domains”(2001年8月1日提交；受让人Merck Serono SA)；以及美国专利号8,173,394，名称为“Systems and methods for protein production”(2009年4月6日提交；受让人Wyeth LLC，Madison，NJ)；这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
涉及选择性标记的示例性描述和方法提供于Wigler等人，Cell，第11卷：第223页(1977年)；Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第48卷：第202页(1992年)；Lowy等人，Cell，第22卷：第817页(1980年)；Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA，第77卷：第357页(1980年)；O'Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第78卷：第1527页(1981年)；Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第78卷：第2072页(1981年)；Wu和Wu，Biotherapy，第3卷：第87-95页(1991年)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，第32卷：第573-596页(1993年)；Mulligan，Science，第260卷：第926-932页(1993年)；Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.，第62卷：第191-217页(1993年)；Santerre等人，Gene，第30卷：第147页(1984年)；Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N Y(1993年)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，N Y(1990年)；在第12章和第13章中，Dracopoli等人(编辑)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，N Y(1994年)；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.，第150卷：第1页(1981年)；美国专利号6,548,285(1997年4月3日提交)；6,165,715(1998年6月22日提交)；和6,110,707(1997年1月17日提交)，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
示例性载体
在一些实施方案中，本发明包含载体，基本上由载体组成或由载体组成，该载体包含：(a)异源多核苷酸或其互补核苷酸序列，该异源多核苷酸或其互补核苷酸序列包含：(i)用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的核苷酸序列；(b)5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和所述3’同源臂分别位于异源多核苷酸的上游和下游；其中所述载体用于允许异源多核苷酸同源重组介导地整合到内源宿主细胞基因座中；并且其中所述同源重组介导的整合导致用异源多核苷酸替换内源宿主细胞DNA片段。
在一些实施方案中，异源多核苷酸或其互补核苷酸序列包含：(i)用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的核苷酸序列可克隆或插入载体(例如，质粒)中。在其他实施方案中，异源多核苷酸或其互补核苷酸序列的组分中的任何组分，即(i)用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的核苷酸序列，可克隆或插入到载体中。
在一些实施方案中，重组宿主细胞用载体转化，该载体包含用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸或其互补核苷酸序列，或基本上由其组成或由其组成，可操作地连接且处于任何取向的所述异源多核苷酸包含以下核苷酸序列：(i)用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的至少一种核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸可使用各种克隆策略以及本领域普通技术人员容易获得的商业克隆试剂盒和材料克隆到载体中。
例如，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸和/或核苷酸序列可使用此类策略如SnapFast、Gateway、TOPO、Gibson、LIC、InFusionHD或Electra策略克隆到载体中。
存在许多可用于生产本发明的载体的商业上可获得的载体。例如，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸可使用聚合酶链反应(PCR)产生，并与pCRTMII-TOPO载体或载体(作为/>TA/>试剂盒从Invitrogen商购获得)在室温下混合5分钟；然后可将/>反应物转化到感受态细胞中，随后可基于颜色变化选择这些感受态细胞(参见Janke等人，“A versatile toolbox for PCR-based tagging ofyeast genes:new fluorescent proteins,more markers and promoter substitutioncassettes”，Yeast,2004年8月，第21卷第11期：第947-962页；还参见Adams等人，Methodsin Yeast Genetics.，Cold Spring Harbor，NY，1997年，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸可克隆到载体(诸如质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和/或人工染色体(例如，YAC))中。
在一些实施方案中，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸可通过进行以下操作插入到载体(例如，使用大肠杆菌作为宿主的质粒载体)中：使用允许插入感兴趣的DNA片段所必需的限制酶消化约2μg至5μg载体DNA，随后过夜温育以完成完全消化(碱性磷酸酶可用于5’末端去磷酸化以便避免自连接/再环化)；凝胶纯化消化的载体。接下来，经由PCR扩增感兴趣的DNA片段，例如，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸，并使用本领域普通技术人员已知的技术(例如，通过使用PCR清除试剂盒)从PCR反应中除去任何过量的酶、引物、未掺入的dNTP、短时失败的PCR产物和/或盐。通过产生包含以下的混合物将感兴趣的DNA片段与载体连接：约20ng载体；约100ng至1,000ng或感兴趣的DNA片段；2μL 10×缓冲液(即，30mM Tris-HCl 4mM MgCl2，26μMNAD，1mM DTT，50μg/mL BSA，pH 8，在25℃下储存)；1μL T4 DNA连接酶；通过加入H2O使总体积达到20μL。然后，可将连接反应混合物在室温下温育2小时，或在16℃下温育过夜。然后，连接反应物(即，约1μL)可转化到感受态细胞中，例如，通过使用电穿孔或化学方法，然后可进行菌落PCR以鉴定含有感兴趣的DNA片段的载体。
在一些实施方案中，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸，连同一起组成表达ORF的其他DNA片段一起，可被设计用于从宿主酵母细胞分泌。设计表达ORF的例示性方法如下：ORF可以信号肽序列开始，随后编码Kex2切割位点(赖氨酸-精氨酸)的DNA序列，并且接着随后是异源多核苷酸转基因，其中在5’末端处添加甘氨酸-丝氨酸密码子，并且最后在3’末端处添加终止密码子。然后所有这些元件在酵母细胞中作为单个开放阅读框(ORF)表达为融合肽。α-交配因子(αMF)信号序列最常用于促进重组杀昆虫肽通过重组酵母的内源分泌途径的代谢加工，即表达的融合肽通常将进入内质网，其中α-交配因子信号序列通过信号肽酶活性被除去，然后将所得的前杀昆虫肽运输至高尔基体，其中上述赖氨酸-精氨酸二肽被Kex2内切蛋白酶完全去除，之后成熟的DVP或DVP杀昆虫蛋白从细胞分泌出来。
在一些实施方案中，重组细胞中的多肽表达水平可通过基于特定宿主酵母物种优化密码子来增强。在给定宿主生物体的内源开放阅读框中观察到的密码子的天然存在频率不一定需要被优化用于高效表达。此外，不同的酵母物种(例如，乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母等)具有不同的用于高效表达的最佳密码子。因此，应该考虑密码子优化用于表达ORF，包括编码信号序列的序列元件、Kex2切割位点和异源多肽，因为它们最初在重组酵母细胞中被翻译成一个融合肽。
在一些实施方案中，密码子优化的表达ORF可连接到酵母特异性表达载体中用于酵母表达。存在许多表达载体可用于酵母表达，包括附加型载体和整合型载体，并且它们通常是为特定酵母细胞设计的。应该根据将用于肽生产的特定酵母表达系统仔细选择合适的表达载体。在一些实施方案中，可使用整合载体，其整合到转化的酵母细胞的染色体中，并且在细胞分裂和增殖的循环中保持稳定。整合型DNA序列与转化的酵母物种中的靶向基因组DNA基因座同源，并且此类的整合型序列包括pLAC4、25SrDNA、pAOX1和TRP2等。杀昆虫肽转基因的位置可与整合型DNA序列(插入载体)相邻或在整合型DNA序列(置换载体)内。
在一些实施方案中，表达载体可包含用于在大肠杆菌中制备DNA的大肠杆菌元件，例如大肠杆菌复制起点、抗生素选择标记等。在一些实施方案中，载体可包含表达感兴趣的转基因所需的序列元件的阵列，例如转录启动子、终止子、酵母选择标记、与宿主酵母DNA同源的整合型DNA序列等。存在许多合适的酵母启动子可用，包括天然和工程改造启动子，例如，酵母启动子诸如pLAC4、pAOX1、pUPP、pADH1、pTEF、pGal1等，和其他可用于一些实施方案中的启动子。
在一些实施方案中，用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸可插入到其他可商购获得的质粒和/或载体中，这些质粒和/或载体对于本领域技术人员是容易获得的，例如质粒可从Addgene(非盈利质粒库)、和PromegaTM获得。
在制备包含用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸的载体之后，将该载体转化到酵母细胞中以产生本发明的重组酵母细胞。
在一些实施方案中，本发明的载体包含：(a)异源多核苷酸或其互补核苷酸序列，该异源多核苷酸或其互补核苷酸序列包含：(i)用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸；(b)5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和所述3’同源臂分别位于异源多核苷酸的上游和下游；其中所述载体用于允许异源多核苷酸同源重组介导地整合到内源酵母宿主细胞基因座中；并且其中所述同源重组介导的整合导致用异源多核苷酸替换内源酵母宿主细胞基因DNA片段。
在一些实施方案中，载体可包含用于编码DVP的多核苷酸或其互补序列。
在一些实施方案中，载体可包含用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其互补序列。
在一些实施方案中，载体可包含用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其互补序列。
在一些实施方案中，载体可包含用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其互补序列。
在一些实施方案中，载体可包含用于编码DVP的多核苷酸，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:213或217-219；或其互补序列。
转化和细胞培养方法
术语“转化”和“转染”两者均描述了将外源和/或异源DNA或RNA引入宿主生物体的过程。通常，本领域普通技术人员有时保留术语“转化”来描述将外源和/或异源DNA或RNA引入细菌细胞的过程；并保留术语“转染”用于描述将外源和/或异源DNA或RNA引入真核细胞的过程。然而，如本文所用，术语“转化”和“转染”同义使用，无论过程是否描述将外源和/或异源DNA或RNA引入原核生物(例如，细菌)或真核生物(例如，酵母、植物或动物)中。
在一些实施方案中，宿主细胞可使用用于编码DVP的多核苷酸进行转化。
在一些实施方案中，包含DVP表达盒的载体可克隆到表达质粒中并转化到宿主细胞中。在一些实施方案中，酵母细胞可以是本文所述的那些酵母细胞中的任何酵母细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞可使用以下方法进行转化：电穿孔；细胞挤压；显微镜下注射；刺穿；使用液体静压力；声穿孔；光学转染；连续输液；脂质转染；通过使用病毒诸如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒；化学磷酸盐法；经由DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺(PEI)的内吞作用；原生质体融合；水动力递送；磁转染；核仁转染；和/或其他。关于转染和/或转化技术的示例性方法可见于：Makrides，2003年，“Gene Transferand Expression in Mammalian Cells”，Elvesier；Wong,TK和Neumann,E.，“Electricfield mediated gene transfer”，Biochem.Biophys.Res.Commun.，第107卷：第584-587页，1982年；Potter和Heller，“Transfection by Electroporation”，Curr Protoc MolBiol.，2003年5月，章节：第9.3单元；Kim和Eberwine，“Mammalian cell transfection:thepresent and the future”，Anal Bioanal Chem.，2010年8月，第397卷第8期：第3173-3178页，这些文献中的每一者的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，电穿孔可用于用一个或多个DVP表达盒转化细胞，该细胞可在酵母培养物中生产DVP，产量为：每升培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L、200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L、至少12,000mg/L、至少12,500mg/L、至少13,000mg/L、至少14,000mg/L、至少15,000mg/L、至少16,000mg/L、至少17,000mg/L、至少17,500mg/L、至少18,000mg/L、至少19,000mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L、至少60,000mg/L、至少70,000mg/L、至少80,000mg/L、至少90,000mg/L或至少100,000mg/L的DVP。
电穿孔是一种其中将电流施加到细胞上使细胞膜变得可渗透的技术；这继而又允许外源DNA被引入细胞。电穿孔是本领域普通技术人员熟知的，并且实现电穿孔所需的工具和装置是可商购获得的(例如，Gene Pulser XcellTM电穿孔系统，用于电穿孔的/>转染系统，Thermo-Fisher Scientific；和其他工具和/或装置)。电穿孔的示例性方法示于：Potter和Heller，“Transfection by Electroporation”，Curr Protoc MolBiol.，2003年5月，章节：第9.3单元；Saito，2015年，“Electroporation Methods inNeuroscience”，Springer press；Pakhomov等人，2017年，“Advanced ElectroporationTechniques in Biology and Medicine”，Taylor&Francis；这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，电穿孔可用于将包含编码DVP的多核苷酸的载体引入酵母中。例如，在一些实施方案中，DVP表达盒克隆到质粒中，并经由电穿孔转化到酵母细胞中。
在一些实施方案中，将DVP表达盒克隆到质粒中，并经由电穿孔转化到酵母细胞中，可通过以下步骤来实现电穿孔：用合适的酵母物种(例如，乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母等)接种约10mL至200mL酵母提取物蛋白胨右旋糖(YEPD)，并在30℃下在振荡器上温育直到酵母培养物的早期指数期(例如，约0.6至2×108个细胞/mL)；在无菌离心管中收获酵母，并在4℃下以3000rpm离心5分钟(注意：在该步骤期间保持细胞冷冻)，用40mL冰冷的无菌去离子水洗涤细胞，并以23,000rpm粒化细胞5分钟；重复洗涤步骤，并将细胞重悬于20mL的1M可发酵糖(例如，半乳糖、麦芽糖、拉托三糖(latotriose)、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如，赤藓醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇和木糖醇)中，随后以3,000rpm旋转5分钟；用适当体积的冰冷的1M可发酵糖(例如，半乳糖、麦芽糖、拉托三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如，赤藓醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇和木糖醇)重悬细胞至3×109个细胞/mL的最终细胞密度(1.5×109个细胞/mL至6×109个细胞/mL是可接受的细胞密度)；在预冷的0.2cm电穿孔比色皿中，将40μL酵母悬浮液与含有编码DVP的线性多核苷酸(约1μg)的约1μL至4μL载体(浓度为100ng/μL至300ng/μL)混合(注意：确保样品与铝比色皿的两侧接触)；提供2000V的单脉冲，RC回路的最佳时间常数为5ms，然后将细胞在0.5mLYED和0.5mL 1M可发酵糖(例如，半乳糖、麦芽糖、拉托三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如，赤藓醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽糖、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇和木糖醇混合物)中回收，然后涂布到选择性板上。
在一些实施方案中，电穿孔可用于将含有编码DVP的多核苷酸的载体引入酵母，例如将DVP克隆到质粒中，并经由电穿孔转化到乳酸克鲁维酵母细胞中，可通过以下步骤来实现电穿孔：接种约10mL至200mL酵母提取物蛋白胨右旋糖(YEPD)，在30℃下在振荡器上温育直到酵母培养物的早期指数期(例如，约0.6至2×108个细胞/mL)；在无菌离心管中收获酵母，并在4℃下以3000rpm离心5分钟(注意：在该步骤期间保持细胞冷冻)，用40mL冰冷的无菌去离子水洗涤细胞，并以23,000rpm粒化细胞5分钟；重复洗涤步骤，并将细胞重悬于20mL的1M可发酵糖(例如，半乳糖、麦芽糖、拉托三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如，赤藓醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇和木糖醇)中，随后以3,000rpm旋转5分钟；用适当体积的冰冷的1M可发酵糖(例如，半乳糖、麦芽糖、拉托三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如，赤藓醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇和木糖醇)重悬细胞至3×109个细胞/mL的最终细胞密度；在预冷的0.2cm电穿孔比色皿中，将40μL酵母悬浮液与含有编码DVP的线性多核苷酸(约1μg)的约1μL至4μL载体混合(注意：确保样品与铝比色皿的两侧接触)；提供2000V的单脉冲，RC回路的最佳时间常数为5ms，然后将细胞在0.5mL YED和0.5mL 1M可发酵糖(例如，半乳糖、麦芽糖、拉托三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖)和/或糖醇(例如，赤藓醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽糖、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇和木糖醇混合物)中回收，然后涂布到选择性板上。
在一些实施方案中，使用本文所述的例示性方法，即利用酵母的本发明的载体以及转化和发酵方法可导致生产DVP的量为：每升培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L、200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L、至少12,000mg/L、至少12,500mg/L、至少13,000mg/L、至少14,000mg/L、至少15,000mg/L、至少16,000mg/L、至少17,000mg/L、至少17,500mg/L、至少18,000mg/L、至少19,000mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L、至少60,000mg/L、至少70,000mg/L、至少80,000mg/L、至少90,000mg/L或至少100,000mg/L的DVP。
在一些实施方案中，电穿孔可用于通过如下步骤将含有编码DVP的多核苷酸的载体引入植物原生质体中：在原生质体溶液(例如，大约8mL的10mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)，pH 5.5；0.01％(w/v)果胶酶(pectylase)；1％(w/v)离析酶；40mM CaCl2；和0.4M甘露醇)中温育无菌植物材料，并在30℃下将混合物加入到旋转振荡器中约3小时至6小时以生产原生质体；经由80μm目尼龙筛过滤除去碎片；用约4mL植物电穿孔缓冲液(例如，5mMCaCl2；0.4M甘露醇；和PBS)冲洗该筛；将原生质体合并在无菌的15mL锥形离心管中，然后以约300×g离心约5分钟；离心后，弃去上清液，并用5mL植物电穿孔缓冲液洗涤；将原生质体以每mL液体约1.5×106至2×106个原生质体重悬于植物电穿孔缓冲液中；将约0.5mL原生质体悬浮液转移到置于冰上的一个或多个电穿孔比色皿中，并加入载体(注意：为了稳定转化，应使用上述限制性方法中的任一者将载体线性化，并可使用约1μg至10μg载体；为了瞬时表达，可将载体保持在其超螺旋状态，并可使用约10μg至40μg载体)；将载体与原生质体悬浮液混合；将比色皿放入电穿孔设备中，并在约1kV至2kV(最初可使用3μF至25μF电容，同时优化反应)下电击一次或多次；将比色皿放回冰中；在完全培养基中将转化细胞稀释20倍；并在约48小时后收获原生质体。
异源多核苷酸掺入分析
通过本领域已知的方法可分析用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸的掺入。例如，在一些实施方案中，定量PCR(qPCR)和旁系同源比检验(PRT)可用于确定异源多核苷酸是否已掺入。在一些实施方案中，qPCR用于证实用于编码DVP或DVP杀昆虫蛋白的异源多核苷酸整合到重组宿主细胞中。
定量PCR(qPCR)已用于通过实时PCR来分析基因表达并定量拷贝数变异。qPCR涉及具有未知拷贝数的测试基因座和具有已知拷贝数的参考基因座的扩增。存在两种方法用于测定：荧光染料和嵌入染料。在任一方法中，荧光在每个PCR循环中加倍，并且起始模板的量可由达到指定的荧光阈值水平所需的循环数来确定。实际的qPCR实验在样品制备后需要半天时间。通常使用的qPCR数据分析方法是通过将PCR信号与标准曲线相关联进行绝对定量，以及将一组中的靶向转录物的PCR信号与另一组相关联进行相对定量。
为了测量DNA拷贝数，扩增子应该位于具有该基因独特序列的外显子或内含子内。还应包括具有两个拷贝的对照基因。制备含有所有组分的主混合物并将其分配在96孔板或384孔板中。针对每个反应加入模板和/或引物。在qPCR仪器上进行测定，并实时收集数据。
化学合成DVP
肽合成或化学合成或肽和/或多肽可用于产生DVP：这些方法可由本领域普通技术人员和/或通过使用商业供应商(例如，Piscataway，New Jersey)进行。例如，在一些实施方案中，化学肽合成可使用液相肽合成(LPPS)或固相肽合成(SPPS)来实现。
在一些实施方案中，肽合成通常可通过使用一种策略来实现，其中将随后的氨基酸的羧基偶联到在前氨基酸的N-末端产生新生多肽链—这过程与自然界中发生的多肽合成类型相反。
肽去保护是多肽化学合成中重要的第一步。肽去保护是其中通过使用化学品封闭氨基酸的反应性基团以便防止所述氨基酸的官能团参与不希望的或非特异性反应或副反应的过程；换句话讲，氨基酸被“保护”以免参与这些不希望的反应。
在合成肽链之前，必须将氨基酸“去保护”以允许链形成(即，氨基酸结合)。用于保护N-末端的化学品包括9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和叔丁氧基羰基(Boc)，它们中的每一者可分别经由使用弱碱(例如，哌啶)和中强酸(例如，三氟乙酸(TFA))除去。
所需的C-末端保护剂取决于所用的化学肽合成策略的类型：例如，LPPS需要保护C-末端氨基酸，而SPPS不需要，因为固体载体充当保护基团。侧链氨基酸需要使用几种不同的保护基团，这些保护基团基于各个肽序列和N-末端保护策略而变化；然而，用于侧链氨基酸的保护基团通常基于叔丁基(tBu)或苄基(Bzl)保护基团。
氨基酸偶联是肽合成程序中的下一步骤。为了实现氨基酸偶联，必须活化引入的氨基酸的C-末端羧酸：这可使用碳二亚胺诸如二异丙基碳二亚胺(DIC)或二环己基碳二亚胺(DCC)来完成，这些碳二亚胺与引入的氨基酸的羧基反应形成O-酰基异脲中间体。随后经由增长的肽链N末端上的伯氨基的亲核攻击置换O-酰基异脲中间体。由碳二亚胺产生的反应性中间体可导致氨基酸的外消旋化。为了避免氨基酸的外消旋化，加入试剂诸如1-羟基苯并三唑(HOBt)以便与O-酰基异脲中间体反应。可使用的其他偶联剂包括2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)，以及另外的活化碱。最后，在氨基酸去保护和偶联后，
在合成过程结束时，必须从多肽中除去保护基团—通常通过酸解发生的过程。确定肽切割所需的试剂取决于所使用保护方案和总体合成方法。例如，在一些实施方案中，溴化氢(HBr)；氟化氢(HF)；或三氟甲磺酸(TFMSA)可用于切割Bzl和Boc基团。另选地，在其他实施方案中，较弱的酸诸如TFA可实现tBut和Fmoc基团的酸解。最后，可基于肽的生理化学特性(例如，电荷、大小、疏水性等)纯化肽。可用于纯化肽的技术包括纯化技术，包括反相色谱法(RPC)；大小排阻色谱法；分配色谱法；高效液相色谱法(HPLC)；和离子交换色谱法(IEC)。
肽合成的示例性方法可见于：Anderson G.W.和McGregor A.C.，1957年，“T-butyloxycarbonylamino acids and their use in peptide synthesis”，Journal ofthe American Chemical Society.第79卷：第6180-6183页；Carpino L.A.，1957年，“Oxidative reactions of hydrazines.Iv.Elimination of nitrogen from 1,1-disubstituted-2-arenesulfonhydrazides1-4”，Journal of the American ChemicalSociety.第79卷：第4427-4431页；McKay F.C.和Albertson N.F.，1957年，“New amine-masking groups for peptide synthesis”，Journal of the American ChemicalSociety.第79卷：第4686-4690页；Merrifield R.B.，1963年，“Solid phase peptidesynthesis.I.The synthesis of a tetrapeptide”，Journal of the American ChemicalSociety.第85卷：第2149-2154页；Carpino L.A.和Han G.Y.，1972年，“9-fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group”，The Journal of OrganicChemistry，第37卷：第3404-3409页；以及A Lloyd-Williams P.等人，1997年，“Chemicalapproaches to the synthesis of peptides and proteins”，Boca Raton:CRC Press，第278页；美国专利号：3,714,140(1971年3月16日提交)；4,411,994(1978年6月8日提交)；7,785,832(2006年1月20日提交)；8,314,208(2006年2月10日提交)；10,442,834(2015年10月2日提交)；以及美国专利申请2005/0165215(2004年12月23日提交)，这些文献和专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
细胞培养和发酵技术
细胞培养技术是本领域熟知的。在一些实施方案中，培养方法和/或材料将必然需要基于所选择的宿主细胞进行调整(例如，改变pH、温度、培养基含量等)。在一些实施方案中，培养基含有唯一碳源(例如，山梨糖醇)。在一些实施方案中，可使用任何已知的培养技术来产生本发明的重组酵母细胞。
示例性培养方法提供于美国专利号3,933,590；3,946,780；4,988,623；5,153,131；5,153,133；5,155,034；5,316,905；5,330,908；6,159,724；7,419,801；9,320,816；9,714,408；和10,563,169；这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
宿主细胞
本发明的方法、组合物、DVP和DVP杀昆虫蛋白可在任何细胞类型(例如真核或原核细胞)中实施。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞是原核生物。例如，在一些实施方案中，宿主细胞可以是古细菌或真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用的细菌的示例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如，枯草杆菌(B.subtilis))、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如，绿脓杆菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌属(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷菌属(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是单细胞的细胞。例如，在一些实施方案中，宿主细胞可以是细菌细胞，诸如革兰氏阳性细菌。
在一些实施方案中，宿主细胞可以是选自以下属的细菌：CandidatusChloracidobacterium、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、弗兰克氏菌属(Frankia)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、产水菌属(Aquifex)、拟杆菌属(Bacteroides)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、拟杆菌属、卟啉单胞菌属、黄杆菌属(Flavobacterium)、衣原体属(Chlamydia)、突柄杆菌属(Prosthecobacter)、疣微菌属(Verrucomicrobium)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、色球藻属(Chroococcus)、平裂藻属(Merismopedia)、聚球藻菌属(Synechococcus)、鱼腥藻属(Anabaena)、念珠藻属(Nostoc)、螺旋藻属(Spirulina)、束毛藻属(Trichodesmium)、宽球藻属(Pleurocapsa)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿蓝细菌属(Prochloron)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特氏菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、除卤素杆菌属(Dehalobacter)、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、支原体(Mycoplasma)、钩端螺菌属(Leptospirillum)、硝化螺菌属(Nitrospira)、热脱硫杆菌属(Thermodesulfobacterium)、出芽菌属(Gemmata)、小梨形菌属(Pirellula)、浮霉状菌属(Planctomyces)、柄杆菌属(Caulobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、突柄微菌属(Prosthecomicrobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、红细菌属(Rhodobacter)、玫瑰杆菌属(Roseobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)、红螺菌属(Rhodospirillum)、立克次氏体(Rickettsia)、康氏立克次体(Rickettsia conorii)、线粒体(Mitochondria)、沃尔巴克氏体属(Wolbachia)、赤细菌属(Erythrobacter)、赤微菌属(Erythromicrobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、产碱菌属(Alcaligenes)、伯克氏菌属(Burkholderia)、纤发菌属(Leptothrix)、球衣菌属(Sphaerotilus)、硫杆状菌属(Thiobacillus)、奈瑟菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、嘉利翁氏菌属(Gallionella)、螺菌属(Spirillum)、固氮弧菌属(Azoarcus)、气单胞菌属(Aeromonas)、Succinomonas、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、瘤胃杆菌属(Ruminobacter)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)、荚硫菌属(Thiocapsa)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、威格尔斯沃思氏菌属(Wigglesworthia)、耶尔森菌属(Yersinia)、柯克斯体属(Coxiella)、军团菌属(Legionella)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、巴斯德菌属(Pasteurella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、贝氏硫细菌属(Beggiatoa)、华丽硫珠菌(Thiomargarita)、弧菌属(Vibrio)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、粘球菌属(Myxococcus)、脱硫八叠球菌属(Desulfosarcina)、地杆菌属(Geobacter)、除硫单胞菌属(Desulfuromonas)、疏螺旋体属(Borrelia)、细螺旋体属(Leptospira)、密螺旋体属(Treponema)、石袍菌属(Petrotoga)、热袍菌属(Thermotoga)、异常球菌属(Deinococcus)或栖热菌属(Thermus)。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可选自以下细菌物种中的一者：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、白色链霉菌(Streptomyces albicans)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、Streptomyces plicatosporus、艾伯特埃希氏菌(Escherichiaalbertii)、蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)、大肠杆菌、费氏埃希氏菌(Escherichiafergusonii)、赫氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)、塞内加尔埃希氏菌(Escherichiasenegalensis)、伤口埃希氏菌(Escherichia vulneris)、冷杉假单胞菌(Pseudomonasabietaniphila)、伞菌假单胞菌(Pseudomonas agarici)、Pseudomonas agarolyticus、嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila)、Pseudomonas alginovora、Pseudomonasandersonii、南极假单胞菌(Pseudomonas antarctica)、铁角蕨假单胞菌(Pseudomonasasplenii)、壬二酸假单胞菌(Pseudomonas azelaica)、Pseudomonas batumici、波扎诺假单胞菌(Pseudomonas borealis)、油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)、裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)、乳脂色假单胞菌(Pseudomonascremoricolorata)、Pseudomonas diterpeniphila、Pseudomonas filiscindens、弗雷德里克斯堡假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)、姜黄色假单胞菌(Pseudomonasgingeri)、Pseudomonas graminis、格氏假单胞菌(Pseudomonas grimontii)、脱氮假单孢杆菌(Pseudomonas halodenitrificans)、Pseudomonas halophila、栖木假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)、Pseudomonas hydrogenovora、印度假单胞菌(Pseudomonasindica)、日本假单胞菌(Pseudomonas japonica)、杰氏假单胞菌(Pseudomonasjessenii)、基尔假单胞菌(Pseudomonas kilonensis)、韩国假单胞菌(Pseudomonaskoreensis)、亚麻假单胞菌(Pseudomonas lini)、浅黄色假单胞菌(Pseudomonas lurida)、Pseudomonas lutea、划界假单胞菌(Pseudomonas marginata)、子午线假单胞菌(Pseudomonas meridiana)、嗜中酸假单胞菌(Pseudomonas mesoacidophila)、海绵假单胞菌(Pseudomonas pachastrellae)、帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)、副黄假单胞菌(Pseudomonas parafulva)、Pseudomonas pavonanceae、Pseudomonasproteolyica、嗜冷假单胞菌(Pseudomonas psychrophila)、耐冷假单胞菌(Pseudomonaspsychrotolerans)、Pseudomonas pudica、Pseudomonas rathonis、Pseudomonasreactans、根际假单胞菌(Pseudomonas rhizosphaerae)、Pseudomonas salmononii、高温假单胞菌(Pseudomonas thermaerum)、Pseudomonas thermocarboxydovorans、耐热假单胞菌(Pseudomonas thermotolerans)、赛维瓦尔假单胞菌(Pseudomonas thivervalensis)、阴城假单胞菌(Pseudomonas umsongensis)、温哥华假单胞菌(Pseudomonasvancouverensis)、威斯康星假单胞菌(Pseudomonas wisconsinensis)、黄色海假单胞菌(Pseudomonas xanthomarina)、厦门假单胞菌(Pseudomonas xiamenensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、病鳝假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)、香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)、变黄假单胞菌(Pseudomonas flavescens)、晋州假单胞菌(Pseudomonas jinjuensis)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、假产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)、食树脂假单孢菌(Pseudomonas resinovorans)、Pseudomonasstraminae、桔黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)、绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、隆德假单胞菌(Pseudomonaslundensis)、腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)、产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)、布氏假单胞菌(Pseudomonas brenneri)、雪松假单胞菌(Pseudomonascedrina)、结冰假单胞菌(Pseudomonas congelans)、皱纹假单胞菌(Pseudomonascorrugata)、康氏假单胞菌(Pseudomonas costantinii)、极端东方化假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、Pseudomonas fulgida、盖氏假单胞菌(Pseudomonas gessardii)、黎巴嫩假单胞菌(Pseudomonas libanensis)、孟氏假单胞菌(Pseudomonas mandelii)、边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)、地中海假单胞菌(Pseudomonas mediterranea)、米氏假单胞菌(Pseudomonas migulae)、霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)、东方假单胞菌(Pseudomonas orientalis)、草假单胞菌(Pseudomonas poae)、罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)、产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、托拉氏假单孢菌(Pseudomonas tolaasii)、平凡假单胞菌(Pseudomonas trivialis)、威隆假单胞菌(Pseudomonas veronii)、脱氮假单孢杆菌(Pseudomonas denitrificans)、穿孔假单胞菌(Pseudomonas pertucinogena)、黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)、栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)、橙黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)或施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。榛黄假单胞菌(Pseudomonas avellanae)、大麻假单胞菌(Pseudomonas cannabina)、番木瓜假单胞菌(Pseudomonas caricapapyae)、菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)、晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)、褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)、山黄麻假单胞菌(Pseudomonas tremae)或黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是真核生物。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是属于分化枝的细胞：后鞭毛生物；绿色植物(例如，藻类和植物)；Amebozoa；丝足虫门；囊泡虫门；海洋鞭毛虫门；不等鞭毛门；盘嵴总门或古虫界。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用宿主细胞完成，该宿主细胞是例如后生动物(Metazoan)、领鞭目(Choanoflagellata)或真菌(fungi)。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用宿主细胞完成，该宿主细胞是真菌。例如，在一些实施方案中，宿主细胞可以是属于真核生物门的细胞：子囊菌门、担子菌门、壶菌门、小孢子虫目或接合菌门。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用宿主细胞完成，该宿主细胞是属于以下属中的一者的真菌：曲霉属(Aspergillus)、枝孢属(Cladosporium)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、羊肚菌属(Morchella)、脉孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)或黑粉菌属(Ustilago)。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用宿主细胞完成，该宿主细胞是属于以下物种中的一者的真菌：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、布拉酵母菌(Saccharomyces boulardi)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；黄曲霉(Aspergillusflavus)、土曲霉(A.terreus)、泡盛曲霉(A.awamori)；隆起支孢霉(Cladosporiumelatum)、多主枝孢霉(Cladosporium Herbarum)、球孢枝孢菌(CladosporiumSphaerospermum)、枝状枝孢菌(Cladosporium Cladosporioides)；稻热病菌(Magnaporthegrise)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、Magnaporthe rhizophila；小羊肚菌(Morchelladeliciosa)、羊肚菌(Morchella esculenta)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、间型脉胞菌(Neurospora intermedia)、四孢脉孢菌(Neurosporatetrasperma)；点青霉(Penicillium notatum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、娄地青霉(Penicillium roquefortii)或简青霉(Penicillium simplicissimum)。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可使用宿主细胞完成，该宿主细胞是乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是属于以下属中的一者的真菌：曲霉属、枝孢属、稻瘟病菌属、羊肚菌属、脉孢霉属、青霉属、酵母菌属、隐球菌属或黑粉菌属。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是酵母(Saccharomycetaceae)科的成员。例如，在一些实施方案中，宿主细胞可以是酵母科内的以下属中的一者：酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、固囊酵母属(Citeromyces)、兔粪酵母属(Cyniclomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、驹形氏酵母属(Komagataella)、柯达酵母属(Kuraishia)、拉钱斯氏酵母属(Lachancea)、娄德酵母属(Lodderomyces)、Nakaseomyces、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、Spathaspora、Tetrapisispora、Vanderwaltozyma、孢圆酵母属(Torulaspora)、威尔酵母属(Williopsis)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)或Zygotorulaspora。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是以下真菌中的一者：黄曲霉、土曲霉、泡盛曲霉、隆起支孢霉、多主枝孢霉、球孢枝孢菌、枝状枝孢菌、稻热病菌、稻瘟病菌、Magnaporthe rhizophila、小羊肚菌、羊肚菌、尖顶羊肚菌、粗糙脉孢菌、间型脉胞菌、四孢脉孢菌；点青霉、产黄青霉、娄地青霉或简青霉。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是假丝酵母属中的物种。例如，宿主细胞可以是以下中的一者：白假丝酵母(Candida albicans)、艾斯卡乐菲假丝酵母(Candida ascalaphidarum)、暗牧菲克假丝酵母(Candida amphixiae)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、耐银假丝酵母(Candida argentea)、大西洋假丝酵母(Candida atlantica)、大气假丝酵母(Candida atmosphaerica)、耳念珠菌(Candidaauris)、布兰克假丝酵母(Candida blankii)、布拉特假丝酵母(Candida blattae)、Candida bracarensis、凤梨假丝酵母(Candida bromeliacearum)、果生假丝酵母(Candidacarpophila)、卡瓦哈尔假丝酵母(Candida carvajalis)、天牛假丝酵母(Candidacerambycidarum)、Candida chauliodes、Candida corydalis、多西假丝酵母(Candidadosseyi)、都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)、Candida ergatensis、果实假丝酵母(Candida fructus)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、发酵假丝酵母(Candidafermentati)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、希木龙假丝酵母(Candidahaemulonii)、小假丝酵母(Candida humilis)、平常假丝酵母(Candida insectamens)、昆虫假丝酵母(Candida insectorum)、中间假丝酵母(Candida intermedia)、Candidajeffresii或乳酒假丝酵母(Candida kefyr)。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是克鲁维酵母属中的物种。例如，宿主细胞可以是以下中的一者：海泥克鲁维酵母(Kluyveromycesaestuarii)、多布克鲁维酵母(Kluyveromyces dobzhanskii)、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、非发酵克鲁维酵母(Kluyveromyces nonfermentans)或柳叶克鲁维酵母(Kluyveromyces wickerhamii)。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是毕赤酵母属中的物种。例如，宿主细胞可以是以下中的一者：粉状毕赤酵母(Pichia farinose)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、Pichia heedii、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)、挪威毕赤酵母(Pichia norvegensis)、奥默毕赤酵母(Pichia ohmeri)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)或亚膜毕赤酵母(Pichiasubpelliculosa)。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是酵母属中的物种。例如，宿主细胞可以是以下中的一者：树生酵母(Saccharomyces arboricolus)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、博伊丁酵母(Saccharomyces bulderi)、加勒比酵母(Saccharomyces cariocanus)、Saccharomyces cariocus、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、布拉迪酵母(Saccharomyces cerevisiae var boulardii)、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、Saccharomyces dairenensis、葡萄酒酵母(Saccharomycesellipsoideus)、真贝酵母(Saccharomyces eubayanus)、少孢酵母(Saccharomycesexiguous)、弗罗棱酵母菌(Saccharomyces florentinus)、脆壁酵母(Saccharomycesfragilis)、库德里阿兹威酵母(Saccharomyces kudriavzevii)、Saccharomycesmartiniae、米卡酵母(Saccharomyces mikatae)、摩拿酵母(Saccharomyces monacensis)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、Saccharomyces spencerorum、图列茨酵母(Saccharomyces turicensis)、单孢酵母(Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)或Saccharomyces zonatus。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是以下真菌中的一者：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或异常汉逊酵母(Hansenula anomala)。
使用酵母细胞作为宿主生物体来产生重组DVP是本领域普通技术人员熟知的一种特殊方法。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用任何酵母物种进行，包括但不限于酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属或裂殖酵母属的任何物种，并且酵母菌属的物种包括酵母属的任何物种，例如选自以下菌株的酿酒酵母物种：INVSc1、YNN27、S150-2B、W303-1B、CG25、W3124、JRY188、BJ5464、AH22、GRF18、W303-1A和BJ3505。在一些实施方案中，毕赤酵母属物种的成员包括毕赤酵母属的任何物种，例如毕赤酵母属物种、巴斯德毕赤酵母，例如，巴斯德毕赤酵母选自以下菌株：Bg08、Y-11430、X-33、GS115、GS190、JC220、JC254、GS200、JC227、JC300、JC301、JC302、JC303、JC304、JC305、JC306、JC307、JC308、YJN165、KM71、MC100-3、SMD1163、SMD1165、SMD1168、GS241、MS105、任何pep4敲除菌株和任何prb1敲除菌株，以及从以下菌株中选择的巴斯德毕赤酵母：Bg08、X-33、SMD1168和KM71。在一些实施方案中，任何克鲁维酵母属的物种可用于完成本文所述的方法，包括克鲁维酵母属的任何物种，例如乳酸克鲁维酵母，并且我们教导了乳酸克鲁维酵母的菌株可以但不是必须选自以下菌株：GG799、YCT306、YCT284、YCT389、YCT390、YCT569、YCT598、NRRL Y-1140、MW98-8C、MS1、CBS293.91、Y721、MD2/1、PM6-7A、WM37、K6、K7、22AR1、22A295-1、SD11、MG1/2、MSK110、JA6、CMK5、HP101、HP108和PM6-3C，除了乳酸克鲁维酵母物种之外，还选自GG799、YCT306和NRRL Y-1140。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是米曲霉(Aspergillus oryzae)。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是日本曲霉(Aspergillus japonicas)。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是黑曲霉(Aspergillus niger)。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是枯草芽孢杆菌。
在一些实施方案中，用于生产DVP或DVP杀昆虫蛋白的宿主细胞可以是里氏木霉(Trichoderma reesei)。
在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可用酵母的任何物种完成，包括但不限于汉逊酵母属物种的任何物种，包括汉逊酵母属的任何物种，并且优选多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可用酵母的任何物种完成，包括但不限于耶氏酵母属物种的任何物种，例如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。在一些实施方案中，本文所述的程序和方法可用酵母的任何物种完成，包括但不限于裂殖酵母属物种的任何物种，包括裂殖酵母属的任何物种，并且优选粟酒裂殖酵母。
在一些实施方案中，酵母物种诸如乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母等可用作宿主生物体。酵母细胞培养技术是本领域普通技术人员熟知的。酵母细胞培养的示例性方法可见于Evans，Yeast Protocols，Springer，1996年；Bill，Recombinant ProteinProduction in Yeast，Springer，2012年；Hagan等人，Fission Yeast:A LaboratoryManual，CSH Press，2016年；Konishi等人，“Improvement of the transformationefficiency of Saccharomyces cerevisiae by altering carbon sources in pre-culture”，Biosci Biotechnol Biochem.，2014年，第78卷第6期：第1090-1093页；Dymond，“Saccharomyces cerevisiae growth media”，Methods Enzymol.，2013年，第533卷：第191-204页；Looke等人，“Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-basedapplications”，Biotechniques，2011年5月，第50卷第5期：第325-328页；以及Romanos等人，“Culture of yeast for the production of heterologous proteins”，Curr ProtocCell Biol.，2014年9月2日，第64卷第20.9期：第1-16页，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
酵母细胞发酵培养基和原种的配方如下所述：(1)MSM培养基配方：2g/L柠檬酸钠二水合物；1g/L硫酸钙二水合物(0.79g/L无水硫酸钙)；42.9g/L磷酸二氢钾；5.17g/L硫酸铵；14.33g/L硫酸钾；11.7g/L硫酸镁七水合物；2mL/L PTM1微量盐溶液；0.4ppm生物素(来自500×，200ppm储备液)；1％至2％纯甘油或其他碳源。(2)PTM1微量盐溶液：硫酸铜-5H2O6.0g；碘化钠0.08g；硫酸锰-H2O 3.0g；钼酸钠-2H2O 0.2g；硼酸0.02g；氯化钴0.5g；氯化锌20.0g；硫酸亚铁-7H2O 65.0g；生物素0.2g；硫酸5.0ml；加水至终体积为1升。乳酸克鲁维酵母确定成分培养基(DMSor)的例示性组成如下：11.83g/L KH2PO4、2.299g/L K2HPO4、20g/L可发酵糖(例如半乳糖、麦芽糖、拉托三糖、蔗糖、果糖或葡萄糖和/或糖醇，例如赤藓醇、氢化淀粉水解产物、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇和木糖醇)、1g/L MgSO4.7H2O、10g/L(NH4)SO4、0.33g/L CaCl2.2H2O、1g/L NaCl、1g/L KCl、5mg/L CuSO4.5H2O、30mg/LMnSO4.H2O、10mg/L ZnCl2、1mg/L KI、2mg/L CoCl2.6H2O、8mg/LNa2MoO4.2H2O、0.4mg/LH3BO3、15mg/L FeCl3.6H2O、0.8mg/L生物素、20mg/L泛酸钙、15mg/L硫胺素、16mg/L肌醇、10mg/L烟酸和4mg/L吡哆醇。
酵母细胞可在48孔深孔板中培养，接种后用无菌透气盖密封。可挑取在板上培养的酵母菌落，例如乳酸克鲁维酵母菌落，并用每孔2.2mL由DMSor组成的培养基接种深孔板。接种的深孔板可在23.5℃下在冷藏的培养箱振荡器中以280rpm振荡生长6天。在接种后第6天，应通过以4000rpm离心10分钟，随后使用具有0.22μM膜的滤板过滤来收获条件培养基，其中将过滤的培养基进行HPLC分析。
在一些实施方案中，酵母细胞可通过以下步骤产生：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含用于表达DVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐；(b)将载体引入酵母细胞；以及(c)在用于能够使DVP表达和分泌到生长培养基中的条件下，在生长培养基中培养酵母细胞。
在一些实施方案中，酵母细胞可通过以下步骤产生：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含用于表达DVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐；(b)将载体引入酵母细胞；以及(c)在用于能够使DVP表达和分泌到生长培养基中的条件下，在生长培养基中培养酵母细胞；其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
在一些实施方案中，酵母细胞可通过以下步骤产生：(a)制备包含第一表达盒的载体，该第一表达盒包含用于表达DVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐；(b)将载体引入酵母细胞；以及(c)在用于能够使DVP表达和分泌到生长培养基中的条件下，在生长培养基中培养酵母细胞；其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:213或217-219。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:213或217-219。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP是两个或更多个DVP的均聚物或杂聚物，其中每个DVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP是包含由可切割或不可切割的接头分开的两个或更多个DVP的融合蛋白，并且其中每个DVP的氨基酸序列可以相同或不同。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中接头在昆虫的肠道或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中载体是包含α-MF信号的质粒。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中载体被转化到酵母细胞中。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该酵母细胞选自酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属或裂殖酵母属的任何物种。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该酵母细胞选自乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该酵母细胞是乳酸克鲁维酵母。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP的表达提供至少以下的产量：每升培养基中70mg/L、80mg/L、90mg/L、100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L、140mg/L、150mg/L、160mg/L、170mg/L、180mg/L、190mg/L、200mg/L、500mg/L、750mg/L、1,000mg/L、1,250mg/L、1,500mg/L、1,750mg/L或至少20,000mg/L的DVP。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP的表达提供至少以下的产量：每升培养基100mg/L的DVP。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP在培养基中的表达导致单一DVP在培养基中的表达。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中该DVP在培养基中的表达导致包含两种或更多种DVP多肽的DVP聚合物在培养基中的表达。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒用于编码第一表达盒的DVP。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒用于编码第一表达盒的DVP或另一表达盒的DVP。
在一些实施方案中，酵母细胞可用于表达DVP或DVP杀昆虫蛋白，其中表达盒用于编码DVP，该DVP的氨基酸序列与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
任何上述方法和/或本文所述的任何方法可用于生产一种或多种如本文所述的DVP或DVP杀昆虫蛋白。例如，本文所述的任何方法可用于生产一种或多种本公开所述的DVP，例如，氨基酸序列与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的DVP：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219，其同样在本文有所描述。
酵母转化、DVP纯化和分析
酵母转化的示例性方法如下：将携带DVP ORF的表达载体转化到酵母细胞中。首先，表达载体通常通过特异性限制酶切割而线性化，以促进经由同源重组的染色体整合。然后通过化学或电穿孔转化方法将线性表达载体转化到酵母细胞中，并通过同源重组整合到酵母基因组的靶位点中。整合可在相同染色体基因座发生多次；因此，转化的酵母细胞的基因组可包含多拷贝的DVP表达盒。成功转化的酵母细胞可使用有利于选择标记的生长条件来鉴定，该选择标记被工程改造到表达载体中并与DVP ORF共整合到酵母染色体中；此类标记的示例包括但不限于乙酰胺原养型、博来霉素抗性、遗传霉素抗性、诺尔丝菌素抗性和尿嘧啶原养型。
由于不可预知且可变的因素的影响—诸如基因和基因网络的表观遗传修饰，以及在经历转化程序的群体中的单个细胞中发生的整合事件的数量的变化—给定转化过程的单个酵母菌落将在它们生产DVP ORF的能力上不同。因此，应该从携带DVP转基因的转基因酵母菌落中筛选高产量菌株。用于这种筛选的两种有效方法—每种方法依赖于转基因酵母的小规模培养物的生长以提供用于随后分析的条件培养基样品—使用反相HPLC或家蝇注射程序来分析来自阳性转基因酵母菌落的条件培养基样品。
转基因酵母培养可使用14mL圆底聚丙烯培养管进行，其中向每个管中加入5mL至10mL确定成分培养基，或者在48孔深孔培养板中进行，其中向每个孔中加入2.2mL确定成分培养基。将不含粗蛋白质提取物或副产物诸如酵母提取物或蛋白胨的成分确定培养基用于培养以降低收获用于随后筛选步骤的条件培养基中的蛋白质背景。培养在最佳温度下进行，例如，对于乳酸克鲁维酵母为23.5℃，培养约5天至6天，直到达到最大细胞密度。DVP现在将由转化的酵母细胞生产并从细胞分泌至生长培养基中。为了制备用于筛选的样品，通过离心从培养物中除去细胞，并收集上清液作为条件培养基，然后通过0.22μm滤膜过滤来清洗，然后准备用于菌株筛选。
在一些实施方案中，用DVP转化的阳性酵母菌落可经由推定的酵母菌落的反相HPLC(rpHPLC)筛选来筛选。在该筛选方法中，可使用具有C18键合相的HPLC分析柱。以乙腈和水为流动相溶剂，并且用设定在220nm的UV吸光度检测器进行肽检测。将适量的条件培养基样品加载到rpHPLC系统中，并用线性梯度的流动相溶剂洗脱。在HPLC色谱中杀昆虫肽的对应峰面积被用于定量条件培养基中DVP的浓度。已知量的纯DVP通过相同的rpHPLC柱用相同的HPLC方案运行，以确认肽的保留时间，并产生用于定量的标准肽HPLC曲线。
阳性乳酸克鲁维酵母细胞的示例性反相HPLC筛选过程如下：DVP ORF可插入到表达载体pKLAC1中，并转化到来自New England Biolabs(Ipswich，MA，USA)的乳酸克鲁维酵母菌株YCT306中。pKLAC1载体是整合型表达载体。一旦DVP转基因克隆到pKLAC1中并转化到YCT306中，它们的表达就由LAC4启动子控制。所得转化菌落生产前原肽，其包含α-交配因子信号肽、Kex2切割位点和成熟DVP。α-交配因子信号肽引导前原肽进入内源分泌途径，并且成熟DVP被释放到生长培养基中。
在一些实施方案中，用于DVP表达的密码子优化可在两轮中进行，例如，在第一轮中，基于高表达DNA序列的一些共同特征，设计表达α-交配因子信号肽、Kex2切割位点和DVP的DVP ORF的多个变体，并在乳酸克鲁维酵母YCT306菌株中评价它们的表达水平，从而产生初始乳酸克鲁维酵母表达算法；在第二轮优化中，可基于初始乳酸克鲁维酵母表达算法设计另外的变体DVP ORF，以进一步微调乳酸克鲁维酵母表达算法，并鉴定在乳酸克鲁维酵母中DVP表达的最佳ORF。在一些实施方案中，由上述优化所得的DNA序列可具有编码α-MF信号肽、Kex2切割位点和DVP的开放阅读框，可使用Hind III和Not I限制位点将其克隆到pKLAC1载体中，从而产生DVP表达载体。
在一些实施方案中，可用DVP表达盒转化酵母巴斯德毕赤酵母。转化巴斯德毕赤酵母的示例性方法如下：酵母载体可用于将DVP表达盒转化到巴斯德毕赤酵母中。载体可从本领域普通技术人员已知的商业供应商处获得。在一些实施方案中，载体可以是整合型载体，并且可使用尿嘧啶核酸核糖基转移酶启动子(pUPP)来增强异源转基因表达。在一些实施方案中，载体可提供不同的选择策略；例如，在一些实施方案中，载体之间的唯一差异可以是一个载体可向宿主酵母提供G418抗性，而另一个载体可提供Zeocin抗性。在一些实施方案中，可设计和合成编码DVP的互补寡核苷酸对以用于亚克隆到两个酵母表达载体中。可通过将对应的互补寡核苷酸在30mM NaCl、10mM Tris-Cl(所有终浓度)、pH 8中混合至最终浓度20μM，然后在95℃下温育20分钟，随后在92℃下开始温育9小时，并在17℃结束温育，其中每20分钟降3℃，来进行杂交反应。杂交反应将产生编码DVP的DNA片段。可用BsaI-HF限制酶消化这两个巴斯德毕赤酵母载体，然后使用标准程序将反应的双链DNA产物亚克隆到线性化的巴斯德毕赤酵母载体中。在证实亚克隆的序列后，可通过电穿孔将质粒等份转染到巴斯德毕赤酵母菌株(例如，Bg08)中。可基于由工程化到载体中的元件赋予的抗性(例如，在该实施例中，对Zeocin或G418的抗性)来选择所得转化酵母。
肽产量的筛选和评价
在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白产量可使用配备有Onyx整体式4.5×100mm C18反相分析HPLC柱和自动注射器的Agilent 1100HPLC系统来评价。配备有Onyx整体式4.5×100mm C18反相分析HPLC柱和自动注射器的Agilent 1100HPLC系统的例示性用法如下：通过分析HPLC级水和含有0.1％三氟乙酸的乙腈(构成用于HPLC分析的两种流动相溶剂)，使用配备有Onyx整体式4.5×100mm C18反相分析HPLC柱和自动注射器的Agilent1100HPLC系统分析来自转化的乳酸克鲁维酵母细胞的过滤的条件培养基样品；使用HPLC色谱分析DVP或DVP杀昆虫蛋白两者的峰面积，然后用来计算条件培养基中的肽浓度，该肽浓度可进一步相对于对应的最终细胞密度(如通过OD600测量确定的)归一化，作为归一化的肽产量。
在一些实施方案中，可使用家蝇注射测定筛选用DVP或DVP杀昆虫蛋白转化的阳性酵母菌落。当通过背侧胸腔的体壁注射测量剂量时，DVP或DVP杀昆虫蛋白可麻痹/杀死家蝇。DVP或DVP杀昆虫蛋白的效力可用肽的平均麻痹/致死剂量(PD50/LD50)定义，其分别引起注射的家蝇50％的敲减比率或死亡率。纯DVP或DVP杀昆虫蛋白通常用于家蝇注射测定中以产生标准剂量-反应曲线，从该曲线可测定PD50/LD50值。使用来自纯DVP或DVP杀昆虫蛋白的标准剂量-反应曲线分析的PD50/LD50值，使用用对应条件培养基的连续稀释物进行的家蝇注射测定，可实现通过转化酵母产生的DVP或DVP杀昆虫蛋白的定量。
示例性家蝇注射生物测定如下：条件培养基被连续稀释以产生来自家蝇注射生物测定的全剂量-反应曲线。在注射前，用CO2固定成年家蝇(普通家蝇)，并选用12mg至18mg家蝇用于注射。使用装有1cc注射器和30号针头的微量施用器，通过家蝇背侧胸腔的体壁，将每只苍蝇0.5μL剂量的连续稀释的条件培养基样品注射到家蝇体内。将已注射的家蝇置于有潮湿滤纸并且盖上有呼吸孔的密闭容器中，并通过敲减比率或通过注射后24小时的死亡率评分来检查它们。计算标准化产量。肽产量意指条件培养基中肽的浓度，单位为mg/L。然而，肽产量并不总是足以准确地比较菌株生产率。单个菌株可具有不同的生长率，因此当收获培养物时，不同的培养物的细胞密度可能不同。具有高细胞密度的培养物可在培养基中生产更高浓度的肽，即使该菌株的肽生产率低于具有更高产生率的另一菌株。因此，术语“标准化产量”通过将肽产量除以对应培养物中的细胞密度来产生，并且这允许菌株之间肽生产率的更好比较。细胞密度由600nm处的吸光度表示，单位为“A”(吸光度单位)。
筛选已经经历了DVP或DVP杀昆虫蛋白转化的酵母菌落可从数百个潜在的菌落中鉴定高产量酵母菌株。当使用本文所述的优化的发酵培养基和发酵条件时，这些菌株可在生物反应器中发酵以实现至少高达4g/L或至少高达3g/L或至少高达2g/L的DVP或DVP杀昆虫蛋白产量。较高的生产率(以mg/L表示)可以是约100mg/L至约100,000mg/L；或约100mg/L至约90,000mg/L；或约100mg/L至约80,000mg/L；或约100mg/L至约70,000mg/L；或约100mg/L至约60,000mg/L；或约100mg/L至约50,000mg/L；或约100mg/L至约40,000mg/L；或约100mg/L至约30,000mg/L；或约100mg/L至约20,000mg/L；或约100mg/L至约17,500mg/L；或约100mg/L至约15,000mg/L；或约100mg/L至约12,500mg/L；或约100mg/L至约10,000mg/L；或约100mg/L至约9,000mg/L；或约100mg/L至约8,000mg/L；或约100mg/L至约7,000mg/L；或约100mg/L至约6,000mg/L；或约100mg/L至约5,000mg/L；或约100mg/L至约3,000mg/L；或约100mg/L至2,000mg/L；或约100mg/L至1,500mg/L；或约100mg/L至1,000mg/L；或约100mg/L至750mg/L；或约100mg/L至500mg/L；或约150mg/L至100,000mg/L；或约200mg/L至100,000mg/L；或约300mg/L至100,000mg/L；或约400mg/L至100,000mg/L；或约500mg/L至100,000mg/L；或约750mg/L至100,000mg/L；或约1,000mg/L至100,000mg/L；或约1,250mg/L至100,000mg/L；或约1,500mg/L至100,000mg/L；或约2,000mg/L至100,000mg/L；或约2,500mg/L至100,000mg/L；或约3,000mg/L至100,000mg/L；或约3,500mg/L至100,000mg/L；或约4,000mg/L至100,000mg/L；或约4,500mg/L至100,000mg/L；或约5,000mg/L至100,000mg/L；或约6,000mg/L至100,000mg/L；或约7,000mg/L至100,000mg/L；或约8,000mg/L至100,000mg/L；或约9,000mg/L至100,000mg/L；或约10,000mg/L至100,000mg/L；或约12,500mg/L至100,000mg/L；或约15,000mg/L至100,000mg/L；或约17,500mg/L至100,000mg/L；或约20,000mg/L至100,000mg/L；或约30,000mg/L至100,000mg/L；或约40,000mg/L至100,000mg/L；或约50,000mg/L至100,000mg/L；或约60,000mg/L至100,000mg/L；或约70,000mg/L至100,000mg/L；或约80,000mg/L至100,000mg/L；或约90,000mg/L至100,000mg/L；或者使用与转化前生产肽所用的相同或相似的生产方法提供的任何值的任何范围，或甚至比用转化前的肽可达到的产量更高。
药学上可接受的盐
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”和“农业上可接受的盐”是同义词。在一些实施方案中，可使用本文所述的DVP的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、晶体形式和单独的异构体、对映异构体、互变异构体、非对映异构体和前药。
在一些实施方案中，本发明的药学上可接受的盐具有母体化合物的所需药理活性。此类盐包括：与无机酸形成的酸加成盐；与有机酸形成的酸加成盐；或当存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、铝离子取代或与有机碱诸如乙醇胺等配位时形成的盐。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐包括常规的有毒或无毒盐。例如，在一些实施方案中，常规的无毒盐包括诸如富马酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、氯酸盐等的那些无毒盐。在一些实施方案中，本发明的药学上可接受的盐可通过常规化学方法从母体化合物合成。在一些实施方案中，可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备此类盐。在一些实施方案中，非水性介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表可见于Remington'sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.，1985年，第1418页，其公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐可以是以下之一：盐酸盐；钠；硫酸盐；醋酸盐；磷酸盐或二磷酸盐；氯化物；钾；马来酸盐；钙；柠檬酸盐；甲磺酸酯；硝酸盐；酒石酸盐；铝；或葡萄糖酸盐。
在一些实施方案中，可用于形成盐的药学上可接受的酸的列表可以是：乙醇酸；马尿酸；氢溴酸；盐酸；异丁酸；乳酸(DL)；乳糖酸；月桂酸；马来酸；苹果酸(-L)；丙二酸；扁桃酸(DL)；甲磺酸；萘-1,5-二磺酸；萘-2-磺酸；烟酸；硝酸；油酸；草酸；棕榈酸；帕莫酸；磷酸；丙酸；焦谷氨酸(-L)；水杨酸；癸二酸；硬脂酸；琥珀酸；硫酸；酒石酸(+L)；硫氰酸；甲苯磺酸(p)；十一碳烯酸；1-羟基-2-萘甲酸；2,2-二氯乙酸；2-羟基乙磺酸；2-酮戊二酸；4-乙酰氨基苯甲酸；4-氨基水杨酸；乙酸；己二酸；抗坏血酸(L)；天冬氨酸(L)；苯磺酸；苯甲酸；樟脑酸(+)；樟脑-10-磺酸(+)；癸酸(十酸)；己酸(六酸)；辛酸(八酸)；碳酸；肉桂酸；柠檬酸；环拉酸；十二烷基硫酸；1,2-乙二磺酸；乙磺酸；甲酸；富马酸；半乳糖二酸；龙胆酸；葡庚糖酸(D)；葡糖酸(D)；葡糖醛酸(D)；谷氨酸；戊二酸；或甘油磷酸。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐可以是任何有机或无机加成盐。
在一些实施方案中，盐可使用无机酸和有机酸作为游离酸。无机酸可以是盐酸、溴酸、硝酸、硫酸、高氯酸、磷酸等。有机酸可以是柠檬酸、醋酸、乳酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、甲磺酸、葡糖酸、琥珀酸、酒石酸、半乳糖醛酸、亚甲基双羟萘酸、谷氨酸、天冬氨酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、4-甲苯磺酸、水杨酸、柠檬酸、苯甲酸、丙二酸等。
在一些实施方案中，盐包括碱金属盐(钠盐、钾盐等)和碱土金属盐(钙盐、镁盐等)。例如，酸加成盐可包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘二甲酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、蔗糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐、铝、精氨酸、苄星、钙、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、乙醇胺、钾、钠、氨丁三醇、锌盐等，并且其中可使用盐酸盐或三氟乙酸盐。
在其他实施方案中，药学上可接受的盐可以是与酸形成的盐，该酸诸如乙酸、丙酸、丁酸、甲酸、三氟乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、硬脂酸、琥珀酸、乙基琥珀酸、乳糖酸、葡糖酸、葡庚糖酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、十二烷基硫酸、苹果酸、天冬氨酸、谷氨酸、己二酸、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、氢碘酸、烟酸、草酸、苦味酸、硫氰酸、十一烷酸、聚丙烯酸盐或羧乙烯基聚合物。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐可由无机碱或有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、亚铁盐、锌盐、铜盐、亚锰盐、铝盐、铁盐、锰盐等。优选的无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺，取代胺(包括天然存在的取代胺)，以及环胺(包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶等)的盐。优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、哌啶、氨丁三醇和胆碱。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和低等动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的效益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences，第66卷：第1-19页(1977年)中详细描述了药学上可接受的盐，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，本发明的盐可在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使游离碱官能团与合适的有机酸反应而单独制备。药学上可接受的无毒酸加成盐的示例是氨基与无机酸或有机酸形成的盐，该无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，该有机酸诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，或者通过使用本领域使用的其他方法诸如离子交换形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。其他药学上可接受的盐包括，当合适时，无毒的铵、季铵和使用抗衡离子形成的胺阳离子，抗衡离子诸如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐。
药学上可接受的盐的示例性描述在P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编辑)，Handbookof Pharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use，John Wiley&Sons，8月23日(2002年)中提供，该文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
DVP掺入植物或其部分
本文所述的DVP和/或包含至少一种如本文所述的DVP的杀昆虫蛋白，可掺入植物、植物组织、植物细胞、植物种子和/或其植物部分，用于DVP或DVP杀昆虫蛋白和/或编码它们的多核苷酸序列的稳定或瞬时表达。
在一些实施方案中，可使用本领域已知的重组技术将DVP或DVP杀昆虫蛋白掺入到植物中。在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白可以是包含一种或多种DVP单体的杀昆虫蛋白的形式。
如本文所用，关于转基因植物、植物组织、植物细胞和植物种子，术语“DVP”还涵盖DVP杀昆虫蛋白，并且“DVP多核苷酸”类似地还用于涵盖用于表达和/或编码包含一种或多种DVP的杀昆虫蛋白的多核苷酸或多核苷酸组。
将DVP掺入植物的目的是通过昆虫对转基因DVP的消耗将DVP和/或DVP杀昆虫蛋白传递给害虫，该转基因DVP在昆虫消耗的植物组织中表达。当昆虫从其食物(例如，以用DVP转化的转基因植物为食的昆虫)中消耗DVP时，消耗的DVP可具有抑制昆虫生长、削弱其移动或甚至杀死昆虫的能力。因此，表达DVP多核苷酸和/或DVP多肽的转基因植物可在多种植物组织中表达所述DVP多核苷酸/多肽，包括但不限于表皮(例如叶肉)；周皮；韧皮部；木质部；薄壁组织；厚角组织；厚壁组织；和初生和次生分生组织。例如，在一些实施方案中，编码DVP的多核苷酸序列能够可操作地连接到含有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶启动子的调节区，从而导致DVP在植物叶肉组织中的表达。
表达DVP和/或用于表达DVP的多核苷酸的转基因植物可通过本领域普通技术人员熟知的各种方法和方案中的任一者产生；本发明的此类方法不需要使用将核苷酸构建体引入植物的特定方法，只要核苷酸构建体能够进入植物的至少一个细胞的内部。将核苷酸构建体引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已将外源核酸序列或DNA片段掺入或整合入植物细胞的植物。这些核酸序列包括外源的或不存在于未转化的植物细胞中的那些，以及可以是内源的或存在于未转化的植物细胞中的那些。“异源的”通常是指对于细胞或它们所存在的天然基因组的部分不是内源的，并且已通过感染、转染、显微镜下注射、电穿孔、显微投影等加入到细胞中的核酸序列。
植物细胞的转化可通过本领域已知的几种技术中的一种技术完成。通常，表达外源或异源感兴趣的肽或多肽(例如DVP)的构建体将包含驱动基因转录的启动子，以及允许转录终止和聚腺苷酸化的3’非翻译区。此类构建体的设计和组织是本领域熟知的。在一些实施方案中，基因可被工程改造，使得所得肽被分泌，或在植物细胞内以其他方式靶向特定区和/或细胞器。例如，基因可被工程改造以包含信号肽，以促进肽向内质网的转移。还优选将植物表达盒工程化以包含内含子，使得内含子的mRNA加工是表达所需的。
通常，植物表达盒可插入到植物转化载体中。该植物转化载体可由实现植物转化所需的一种或多种DNA载体组成。例如，本领域的常规实践是利用由一个以上连续DNA片段组成的植物转化载体。这些载体在本领域中通常称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA片段的大小和复杂性相当大，并且将功能分离到单独的DNA分子上是有利的。二元载体通常包含质粒载体，该质粒载体包含T-DNA转移所需的顺式作用序列(诸如左边界和右边界)、经工程改造以能够在植物细胞中表达的选择性标记和“感兴趣的基因”(经工程改造以能够在期望产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。细菌复制所需的序列也存在于该质粒载体上。顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞中并在其中表达的方式排列。例如，选择标记基因和DVP位于左边界和右边界之间。通常第二质粒载体包含介导T-DNA从农杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。该质粒通常包含毒力功能(Vir基因)，其允许农杆菌感染植物细胞，以及通过在边界序列切割和vir介导的DNA转移来转移DNA，如本领域所理解的(Hellens和Mullineux，2000年，Trends in Plant Science，第5卷：第446-451页)。几种类型的农杆菌菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。第二质粒载体对于通过其他方法诸如显微投影、显微镜下注射、电穿孔、聚乙二醇等转化植物不是必需的。
通常，植物转化方法包括将异源DNA转移到靶植物细胞(例如未成熟或成熟胚、悬浮培养物、未分化愈伤组织、原生质体等)中，随后应用最大阈值水平的适当选择(取决于选择标记基因)以从一组未转化的细胞团中回收转化的植物细胞。外植体通常被转移到新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。随后，在置于补充有最大阈值水平的选择剂的再生培养基后，转化的细胞分化成芽。然后将芽转移到选择性生根培养基中以回收生根的芽或小植株。然后转基因小植株生长成成熟的植物并产生可育种子(例如Hiei等人，1994年，ThePlant Journal，第6卷：第271-282页；Ishida等人，1996年，Nature Biotechnology，第14卷：第745-750页)。外植体通常被转移到新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。产生转基因植物的技术和方法的一般描述见于：Ayres和Park，1994年，Critical Reviews inPlant Science，第13卷：第219-239；以及Bommineni和Jauhar，1997年，Maydica，第42卷：第107-120页。因为转化的材料包含许多细胞，所以转化的和未转化的细胞两者均存在于任一块受试的靶愈伤组织或组织或细胞组中。杀死非转化的细胞并使转化的细胞增殖的能力产生了转化的植物培养物。通常，除去未转化的细胞的能力受限于快速回收转化的植物细胞和成功产生转基因植物。
转化方案以及将核苷酸序列引入植物的方案可取决于靶向用于转化的植物或植物细胞的类型，即单子叶植物或双子叶植物而变化。转基因植物的产生可通过几种方法中的一者进行，包括但不限于显微镜下注射、电穿孔、直接基因转移、通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞(农杆菌介导的转化)、用粘附于颗粒的异源外源DNA轰击植物细胞、弹道颗粒加速、气溶胶束转化、Lec1转化和各种其他非颗粒直接介导的转移DNA的方法。示例性转化方案公开于美国公开申请号20010026941；美国专利号4,945,050；国际公开号WO 91/00915；和美国公开申请号2002015066，这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
叶绿体也可容易地转化，并且关于叶绿体转化的方法是本领域已知的。例如，参见Svab等人，1990年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第87卷：第8526-8530页；Svab和Maliga，1993年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷：第913-917页；Svab和Maliga，1993年，EMBO J.，第12卷：第601-606页，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。叶绿体转化的方法依赖于颗粒枪递送含有选择标记的DNA和通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，质体转化可通过组织优选表达核编码的和质体指导的RNA聚合酶而反式激活沉默质体携带的转基因来实现。该系统已报告于McBride等人，1994年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第91卷：第7301-7305页。
异源外源DNA整合到植物细胞中后，本领域普通技术人员可在培养基中应用最大阈值水平的适当选择化学品/试剂(例如抗生素)以杀死未转化的细胞，并通过将所述存活细胞有规律地转移到新鲜培养基中来使从该选择处理存活的推定转化的细胞分离和生长。通过连续传代和用适当选择进行攻击，技术人员鉴定和增殖用质粒载体转化的细胞。然后可使用分子和生物化学方法来确认整合到转基因植物基因组中的感兴趣的异源基因的存在。
可根据本领域普通技术人员已知的常规方法使已经转化的细胞生长成植物。例如，参见McCormick等人，1986年，Plant Cell Reports，第5卷：第81-84页，其公开内容全文以引用方式并入本文。然后可使这些植物生长，并且用相同的转化菌株或不同的菌株授粉，并且鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得杂种。可培育两代或多代以确保稳定地维持和遗传所需表型特征的表达，然后收获种子以确保已实现所需表型特征的表达。以这种方式，本公开提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，其具有稳定地掺入其基因组中的本发明的核苷酸构建体，例如本发明的表达盒。
在各种实施方案中，本公开提供了DVP杀昆虫蛋白，其作为如上所述的昆虫蛋白酶、蛋白酶和肽酶(本文统称为“蛋白酶”)的底物。
在一些实施方案中，可接受DVP表达的转基因植物或其部分，可包括：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、小米、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草皮草、西瓜和小麦植物。
在一些实施方案中，转基因植物可从最初用本文所述的DNA构建体转化的细胞生长。在其他实施方案中，转基因植物可在特定的组织或植物部分，例如叶、茎、花、萼片、果实、根、种子或它们的组合中表达所编码的DVP。
在一些实施方案中，植物、植物组织、植物细胞或植物种子可用DVP或编码该DVP的多核苷酸转化，其中该DVP具有本发明的任何DVP(例如，本文所述的一种或多种DVP)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，植物、植物组织、植物细胞或植物种子可用DVP或编码该DVP的多核苷酸转化，该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:187-191。
在一些实施方案中，植物、植物组织、植物细胞或植物种子可用DVP或编码该DVP的多核苷酸转化，其中该DVP是两种或更多种DVP多肽的均聚物或杂聚物，其中每种DVP的氨基酸序列相同或不同。
多核苷酸向植物中的掺入，由其表达的蛋白质
关于异源多肽在转基因植物中表达的挑战是在宿主生物体中表达时维持所引入多肽的期望效果(例如杀昆虫活性)；维持这种作用的一种方式是通过使用可操作地连接的内质网信号肽(ERSP)来增加正确的蛋白质折叠的机会。另一种维持转基因蛋白质作用的方法是掺入翻译稳定蛋白质(STA)。
可使用上述任何转染方法，用编码DVP或包含一种或多种DVP的DVP杀昆虫蛋白的DNA序列瞬时或稳定转染植物。另选地，可用编码DVP的多核苷酸转染植物，其中所述DVP可操作地连接到用于编码内质网信号肽(ERSP)的多核苷酸；接头、翻译稳定蛋白(STA)；或它们的组合。例如，在一些实施方案中，转基因植物或植物基因组可用编码内质网信号肽(ERSP)、DVP和/或间插接头肽(LINKER或L)的多核苷酸序列转化，从而使从异源DNA转录的mRNA在转化植物中表达，随后所述mRNA被翻译成肽。
内质网信号肽(ERSP)
重组蛋白质对ER的亚细胞靶向可通过使用与所述重组蛋白质可操作地连接的ERSP来实现；这允许此类蛋白质的正确组装和/或折叠，以及这些重组蛋白质在植物中的高水平积累。关于将宿主蛋白质区室化到细胞内贮藏的示例性方法公开于McCormick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第96卷第2期：第703-708页，1999年；Staub等人，NatureBiotechnology，第18卷：第333-338页，2000年；Conrad等人，Plant Mol.Biol.，第38卷：第101-109页，1998年；以及Stoger等人，Plant Mol.Biol.，第42卷：第583-590页，2000年，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。因此，实现重组蛋白质的正确组装和/或折叠的一种方式是将内质网信号肽(ERSP)可操作地连接到感兴趣的重组蛋白质。
在一些实施方案中，包含内质网信号肽(ERSP)的肽可与DVP(命名为ERSP-DVP)可操作地连接，其中所述ERSP是所述肽的N-末端。在一些实施方案中，ERSP肽的长度在3至60个氨基酸之间，长度在5至50个氨基酸之间，长度在20至30个氨基酸之间。
在一些实施方案中，DVP ORF从它的5’-末端的ersp开始。当从转基因植物中表达时，为了使DVP正确折叠并发挥功能，它必须具有与编码DVP的多核苷酸框内融合的ersp核苷酸。在细胞翻译过程期间，翻译的ERSP可通过与被称为信号识别颗粒的细胞组分结合来指导被翻译的DVP插入到植物细胞的内质网(ER)中。在ER内，ERSP肽被信号肽酶切割，并且DVP被释放进入ER，在那里DVP在翻译后修饰过程期间正确折叠，例如，形成二硫键。没有任何另外的滞留蛋白质信号，蛋白质通过ER转运到高尔基体，在那里它最终分泌到质膜外并进入质外体空间。DVP可以有效地在质外体空间积累以达到在植物中的杀昆虫剂量。
ERSP肽位于植物翻译的DVP复合物的N-末端区，并且ERSP部分由约3个至60个氨基酸组成。在一些实施方案中，它是5个至50个氨基酸。在一些实施方案中，它是10个至40个氨基酸，但最经常由15个至20个；20个至25个；或25个至30个氨基酸组成。ERSP是信号肽，如此命名是因为它指导蛋白质的运输。信号肽还可称为靶向信号、信号序列、转运肽或定位信号。用于ER运输的信号肽通常长度为15个至30个氨基酸残基，并且具有三重组织，由疏水性残基的核心组成，侧接带正电荷的氨基末端和极性但不带电荷的羧基末端区。(Zimmermann等人，“Protein translocation across the ER membrane”，Biochimica et BiohysicaActa，2011年，第1808卷：第912-924页)。
许多ERSP是已知的。ERSP不是必须源自植物ERSP，非植物ERSP将使用本文所述的程序。然而，许多植物ERSP是熟知的，并且我们在此处描述了一些植物来源的ERSP。例如，在一些实施方案中，ERSP可以是大麦α-淀粉酶信号肽(BAAS)，其源自植物大麦(Hordeumvulgare)，并且具有如下氨基酸序列：“MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG”(SEQ ID NO:60)。
植物ERSP选自已知被表达并释放到植物质外体空间的蛋白质的基因组序列，包括示例诸如BAAS、胡萝卜伸展蛋白和烟草PR1。以下参考文献提供了进一步的描述，并且全文以引用方式并入本文：De Loose,M.等人，“The extensin signal peptide allowssecretion of a heterologous protein from protoplasts”，Gene，1991年，第99卷：第95-100页；De Loose,M.等人描述了来自皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)的延伸编码基因的结构分析，其序列包含用于蛋白质向内质网易位的典型信号肽；Chen,M.H.等人，“Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargoproteins to plastids and extracellular compartments of plant cells”，PlantPhysiology，2004年7月，第135卷：第3期：第1367-1377页。Epub，2004年7月2日。Chen,M.H.等人通过分析α-淀粉酶在转基因烟草中的表达，有或没有其信号肽，研究了α-淀粉酶在植物细胞中的亚细胞定位。这些参考文献和其他文献教导和公开了可用于本文所述的方法、程序和肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的信号肽。
在一些实施方案中，ERSP可包括但不限于以下之一：BAAS；烟草伸展蛋白信号肽；修饰的烟草伸展蛋白信号肽；或来自阿什杜松(Juniperus ashei)的Jun a 3信号肽。例如，在一些实施方案中，可用编码本文所述为内质网信号肽(ERSP)和DVP的肽中的任一者的核苷酸转化植物。
烟草伸展蛋白信号肽基序是ERSP的另一种示例性类型。参见Memelink等人，thePlant Journal,，1993年，第4卷：第1011-1022页；Pogue GP等人，Plant BiotechnologyJournal，2010年，第8卷：第638-654页，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，DVP ORF可具有用于编码烟草伸展蛋白信号肽基序的核苷酸序列。在一个实施方案中，DVP ORF可编码根据SEQ ID NO:61的伸展蛋白基序。在另一个实施方案中，DVP ORF可编码根据SEQ ID NO:62的伸展蛋白基序。
如何产生具有扩展信号基序的实施方案的例示性示例如下：使用具有四种合成DNA引物的寡聚延伸PCR设计编码伸展蛋白基序的DNA序列(例如，SEQ ID NO:63或SEQ IDNO:64所示的DNA序列)；末端位点诸如限制位点，例如5’末端的Pac I限制位点，和3’末端GFP序列的5’末端，可使用PCR以延伸蛋白DNA序列作为模板加入，并产生片段；该片段用作正向PCR引物以扩增编码DVP ORF的DNA序列，例如包含在pFECT载体中的“gfp-l-dvp”，因此产生编码(从N’到C’末端)“ERSP-GFP-L-DVP”的DVP ORF，其中ERSP是伸展蛋白。然后将所得DNA序列克隆到FECT载体的Pac I和Avr II限制位点中，以产生用于GFP融合DVP的瞬时植物表达的pFECT-DVP载体。
在一些实施方案中，例示性表达系统可包括将含有DVP ORF的FECT表达载体转化到农杆菌GV3101，并将转化的GV3101注射到烟草叶片中用于瞬时表达DVP ORF。
翻译稳定蛋白质(STA)
翻译稳定蛋白质(STA)可增加植物组织中DVP的量。DVP ORF、ERSP-DVP中的一者足以在转染的植物中表达正确折叠的DVP，但是在一些实施方案中，有效保护植物免受害虫损害可能需要植物表达的DVP积累。转染正确构建的DVP ORF，转基因植物可表达和积累更大量的正确折叠的DVP。当植物积累了更大量的正确折叠的DVP时，它可以更容易地抵抗、抑制和/或杀死侵袭和吃掉植物的害虫。增加多肽在转基因组织中的积累的一种方法是通过使用翻译稳定蛋白质(STA)。翻译稳定蛋白质可用于显著增加DVP在植物组织中的积累，并因此增加用DVP转染的植物关于害虫抗性的效力。翻译稳定蛋白质是具有足够三级结构的蛋白质，其可在细胞中积累而不被细胞的蛋白质降解过程靶向。
在一些实施方案中，翻译稳定蛋白质可以是另一个蛋白的结构域，或者其可以包含完整的蛋白质序列。在一些实施方案中，翻译稳定蛋白质可以是5个和50个之间的氨基酸，50个至250个氨基酸(例如，GNA)，250个至750个氨基酸(例如，几丁质酶)和750个至1500个氨基酸(例如，增效蛋白)。
翻译稳定蛋白质的一个实施方案可以是包含至少一种DVP的融合蛋白质的聚合物。此处提供了翻译稳定蛋白质的具体示例，以说明翻译稳定蛋白质的用途。该示例不旨在以任何方式限制本公开或权利要求。有用的翻译稳定蛋白质是本领域熟知的，并且如本文所公开的，可使用任何这种类型的蛋白质。评价和测试肽的生产的程序在本领域中是已知的并且在本文中有所描述。一种翻译稳定蛋白质的一个示例是绿色荧光蛋白质(GFP)(SEQID NO:57；NCBI登录号P42212.1)。
在一些实施方案中，包含内质网信号肽(ERSP)的蛋白质能够可操作地连接到DVP，该DVP继而又可操作地连接到翻译稳定蛋白质(STA)。此处，这种构型称为ERSP-STA-DVP或ERSP-DVP-STA，其中所述ERSP是所述蛋白质的N-末端，所述STA可在DVP的N-末端侧(上游)，或在DVP的C-末端侧(下游)。在一些实施方案中，称为ERSP-STA-DVP或ERSP-DVP-STA的包括本文所述的ERSP或DVP中的任一者的蛋白质能够可操作地连接到STA，例如本文所述或本文档教导的任何翻译稳定蛋白质，包括GFP(绿色荧光蛋白质；SEQ ID NO:57；NCBI登录号P42212)或Jun a 3(阿什杜松；SEQ ID NO:59；NCBI登录号P81295.1)。
翻译稳定蛋白质的另外示例可见于以下参考文献，这些参考文献的公开内容全文以引用方式并入本文：Kramer,K.J.等人，“Sequence of acDNA and expression of thegene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta”，InsectBiochemistry and Molecular Biology，第23卷第6期，1993年9月，第691-701页。Kramer,K.J.等人从烟草天蛾(Manduca sexta)中分离了编码几丁质酶的cDNA并对其进行了测序。Hashimoto,Y.等人，“Location and nucleotide sequence of the gene encoding theviral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virus”，Journal ofGeneral Virology，1991年，第72卷：第2645-2651页。这些参考文献和其他文献教导和公开了可用于本文所述的方法、程序和肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定蛋白质。
在一些实施方案中，DVP ORF可使用包含STA的DVP ORF转化到植物中，例如烟草植物本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中。例如，在一些实施方案中，STA可以是Jun a 3。成熟的Jun a 3是一种约30kDa的植物防御蛋白，其也是一些人的过敏原。Jun a 3由阿什杜松树产生，并且在一些实施方案中可用作翻译稳定蛋白质(STA)。在一些实施方案中，Jun a 3氨基酸序列可以是SEQ ID NO:65中所示的序列。在其他实施方案中，Jun a 3氨基酸序列可以是SEQ ID NO:59中所示的序列。
接头
接头蛋白质有助于组成DVP ORF的不同基序的正确折叠。如果表达ORF涉及多个DVP结构域表达，则本发明描述的DVP ORF也包括编码间插接头肽的多核苷酸序列，这些间插接头肽位于编码DVP(dvp)和翻译稳定蛋白质(sta)的多核苷酸序列之间，或位于编码多个编码DVP的多核苷酸序列，即(l-dvp)N或(dvp-l)N的多核苷酸序列之间。间插接头肽(LINKER或L)分离表达的DVP构建体的不同部分，并在表达过程期间帮助复合物的不同部分正确折叠。在表达的DVP构建体中，不同的间插接头肽可参与分离不同的功能结构域。在一些实施方案中，LINKER附接到DVP上，并且这个二价基团可重复多达10次(N＝1-10)，并且可能甚至超过10次(例如，N＝200)，以便促进在要保护的植物中正确折叠的DVP的积累。
在一些实施方案中，间插接头肽的长度可在1个和30个氨基酸之间。然而，它不是植物中表达的DVP中必需的组分。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白包含至少一种与可切割肽可操作连接的DVP。在其他实施方案中，DVP杀昆虫蛋白包含至少一种与不可切割肽可操作连接的DVP。
可为DVP ORF设计可切割接头肽，以从转化的植物中表达的DVP复合物中释放正确DVP，以改善DVP给予植物关于害虫损害的保护。一种类型的间插接头肽是植物可切割接头肽。在植物翻译后修饰期间，可从表达的DVP ORF复合物中完全除去这种类型的接头肽。因此，在一些实施方案中，在植物中翻译后修饰期间，由这种类型的间插接头肽连接的正确折叠的DVP可在植物细胞中从表达的DVP ORF复合物中释放。
另一种类型的可切割间插接头肽在植物中的表达过程中是不可切割的。然而，它具有对丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶特异的蛋白酶切割位点。该类型的可切割接头肽可被在昆虫和鳞翅目肠道环境和/或昆虫血淋巴和鳞翅目血淋巴环境中发现的蛋白酶消化，以在昆虫肠道或血淋巴中释放DVP。使用本公开所教导的信息，本领域技术人员应当常规地制造或找到将在本发明中有用的LINKER的其他示例。
在一些实施方案中，DVP ORF可包含可切割类型的间插接头，例如，SEQ ID NO:54中列出的类型，具有氨基酸代码“IGER”(SEQ ID NO:54)。该间插接头或LINKER的分子量为473.53道尔顿。在其他实施方案中，间插接头肽(LINKER)也可以是没有任何类型蛋白酶切割位点的间插接头肽，即不可切割间插接头肽，例如接头“ETMFKHGL”(SEQ ID NO:56)。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可具有两个或更多个可切割肽，其中该杀昆虫蛋白包含昆虫可切割接头(L)，该昆虫可切割接头与包含(DVP-L)n的构建体框内融合，其中“n”是1至200、或1至100、或1至10的整数。在另一个实施方案中，DVP杀昆虫蛋白，并且如本文所述，包含与DVP可操作地连接的内质网信号肽(ERSP)，该ERSP与昆虫可切割接头(L)和/或重复构建体(L-DVP)n或(DVP-L)n可操作地连接，其中n是1至200、或1至100、或1至10的整数。
在一些实施方案中，包含内质网信号肽(ERSP)的蛋白质可与DVP和间插接头肽(L或接头)可操作地连接，此类构建体称为ERSP-L-DVP或ERSP-DVP-L，其中所述ERSP是所述蛋白质的N-末端，并且所述L或接头可以在DVP的N-末端侧(上游)或DVP的C-末端侧(下游)。称为ERSP-L-DVP或ERSP-DVP-L的蛋白质，包含本文所述的ERSP或DVP中的任一者，可具有接头“L”，其可以是不可切割接头肽或可切割接头肽，并且其可在蛋白质表达过程期间在植物细胞中是可切割的或可在昆虫肠道环境和/或血淋巴环境中是可切割的。
在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含本文所述的或本文档教导的任何间插接头肽(LINKER或L)，包括但不限于以下序列：IGER(SEQ ID NO:54)、EEKKN(SEQ ID NO:55)和ETMFKHGL(SEQ ID NO:56)或它们的组合。
在各种实施方案中，示例性杀昆虫蛋白可包括蛋白质构建体，该蛋白质构建体包含：(ERSP)-(DVP-L)n；(ERSP)-(L)-(DVP-L)n；(ERSP)-(L-DVP)n；(ERSP)-(L-DVP)n-(L)；其中n是1至200、或1至100、或1至10的整数。在上述各种相关实施方案中，DVP是前述的Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多肽，L是不可切割或可切割肽，并且n是1至200的整数，优选1至100的整数，更优选1至10的整数。在一些实施方案中，DVP杀昆虫蛋白可包含相同或不同的DVP肽和相同或不同的昆虫可切割肽。在一些实施方案中，C-末端DVP在其C-末端与可切割肽可操作地连接，该可切割肽用于在昆虫的肠道环境中被切割。在一些实施方案中，N-末端DVP在其N-末端与可切割肽可操作地连接，该可切割肽用于在昆虫的肠道环境中被切割。
在昆虫肠道环境中发现的一些可用的蛋白酶和肽酶依赖于昆虫的生命阶段，因为这些酶通常在空间和时间上表达。昆虫的消化系统由消化道和相关腺体组成。食物进入口腔并与可含有或不含消化蛋白酶和肽酶的分泌物混合。前肠和后肠起源于外胚层。前肠通常用作生食的贮藏库。离散的食物团从前肠进入中肠(肠系膜或胃)。中肠是食物营养的消化和吸收部位。通常，中肠中某些蛋白酶和肽酶的存在遵循肠的pH。人胃肠系统中的某些蛋白酶和肽酶可包括：胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和二肽酶。
昆虫的肠道环境包括食草动物物种的消化系统区，在消化期间肽和蛋白质在该消化系统区降解。在昆虫肠道环境中发现的一些可用蛋白酶和肽酶可包括：(1)丝氨酸蛋白酶；(2)半胱氨酸蛋白酶；(3)天冬氨酸蛋白酶，和(4)金属蛋白酶。
植食性昆虫的消化系统中两种主要的蛋白酶类型是丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。Murdock等人(1987年)对属于鞘翅目(Coleopteran)的多种害虫的中肠酶进行了详细研究，而Srinivasan等人(2008年)已报告了属于鳞翅目的多种害虫的中肠酶。已知丝氨酸蛋白酶在幼虫肠道环境中占主导地位，并且在鳞翅目中占总消化活性的约95％，而鞘翅目物种具有更宽范围的主导肠道蛋白酶，包括半胱氨酸蛋白酶。
木瓜蛋白酶家族包含具有多种活性的肽酶，包括具有广泛特异性的内肽酶(诸如木瓜蛋白酶)、具有非常窄特异性的内肽酶(诸如甘氨酰内肽酶)、氨肽酶、二肽基肽酶，以及具有内肽酶和外肽酶活性的肽酶(诸如组织蛋白酶B和H)。在各种昆虫的中肠中发现的其他示例性蛋白酶包括胰蛋白酶样酶，例如胰蛋白酶和糜蛋白酶、胃蛋白酶、羧肽酶-B和氨基三肽酶。
丝氨酸蛋白酶广泛分布于几乎所有动物和微生物中(Joanitti等人，2006年)。在高等生物体中，近2％的基因编码这些酶(Barrette-Ng等人，2003年)。丝氨酸蛋白酶对于其宿主生物体的维持和存活是基本上不可缺少的，其在许多生物过程中起关键作用。丝氨酸蛋白酶通常根据它们的底物特异性分类，特别是根据P1处的残基是否为：胰蛋白酶样(Lys/Arg，优选在P1处)、糜蛋白酶样(大的疏水残基，诸如在P1处的Phe/Tyr/Leu)或弹性蛋白酶样(小的疏水残基，诸如在P1处的Ala/Val)(由Tyndall等人2005年修订)。丝氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶，其中心催化机制由三个不变的残基组成，即天冬氨酸、组氨酸和独特反应性丝氨酸，后者使其得名“催化三联体”。Asp-His-Ser三联体可见于至少四种不同的结构背景(Hedstrom，2002年)。丝氨酸蛋白酶的这四个族以糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶Y和Clp蛋白酶为代表。已经最详细研究的糜蛋白酶样族的三种丝氨酸蛋白酶是糜蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶。最近，已发现了具有新型催化三联体和二联体的丝氨酸蛋白酶在消化中的作用，包括Ser-His-Glu、Ser-Lys/His、His-Ser-His和N-末端Ser。
在昆虫的肠道环境中发现的一类充分研究的消化酶是半胱氨酸蛋白酶类。术语“半胱氨酸蛋白酶”旨在描述在酶催化位点具有半胱氨酸残基的高反应性巯基的蛋白酶。证据表明，许多植食性昆虫和植物寄生线虫至少部分依赖中肠半胱氨酸蛋白酶用于蛋白质消化。这些包括但不限于半翅目，尤其是南瓜蝽(南瓜缘蝽(Anasa tristis))；绿椿象(拟绿蝽(Acrosternum hilare))；点蜂缘椿象(Riptortus clavatus)；以及迄今为止所检查的几乎所有鞘翅目，尤其是科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯甲虫)；三线马铃薯甲虫(Lematrilineata)；天门冬甲虫(芦笋甲虫(Crioceris asparagi))；墨西哥豆甲虫(墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis))；赤拟榖盗甲虫(赤拟谷盗(Triolium castaneum))；糊涂粉甲虫(杂拟谷盗(Tribolium confusum))；跳蚤甲虫(凹胫跳甲属(Chaetocnema)物种、Haltica物种和毛跳甲属(Epitrix)物种)；玉米根虫(叶甲属(Diabrotica)物种)；四纹豆象(Callosobruchus aculatue)；象鼻虫(苜蓿叶象甲(Antonomus grandis))；稻象虫(米象(Sitophilus oryza))；玉米象(Sitophilus zeamais)；蚰子(谷象(Sitophilusgranarius))；埃及苜蓿叶象虫(苜蓿叶象虫(Hypera postica))；大豆象(菜豆象(Acanthoseelides obtectus))；谷蠹(Rhyzopertha dominica)；黄粉虫(大黄粉虫(Tenebrio molitor))；缨翅目(Thysanoptera)，尤其是西方花蓟马(西花蓟马(Frankliniella occidentalis))；双翅目，尤其是潜叶蝇物种(三叶斑潜蝇(Liriomyza trifolii))；植物寄生线虫，尤其是马铃薯白线虫(Globodera物种)、甜菜孢囊线虫(Heteroderaschachtii)和根瘤线虫(根结线虫(Meloidogyne)物种)。
另一类消化酶是天冬氨酸蛋白酶。术语“天冬氨酸蛋白酶”旨在描述在酶催化位点具有两个高度反应性的天冬氨酸残基的蛋白酶，并且其最通常的特征是对胃蛋白酶抑制剂的特异性抑制，该胃蛋白酶抑制剂是几乎所有已知天冬氨酸蛋白酶的低分子量抑制剂。证据表明，许多植食性昆虫部分依赖中肠天冬氨酸蛋白酶进行蛋白质消化，最常见的是与半胱氨酸蛋白酶结合。这些植食性昆虫包括但不限于半翅目(Hemiptera)，尤其是(长红锥蝽(Rhodnius prolixus)和床虱(臭虫(Cimex)物种)，以及瘤蝽科(Phymatidae)、蝽科(Pentatomidae)、长蝽科(Lygaeidae)和负子蝽科(Belostomatidae)的成员；鞘翅目，在芫菁科(Meloidae)、叶甲科(Chrysomelidae)、食蚜瓢虫(Coccinelidae)和豆象科(Bruchidae)中都属于扁虫下目(Cucujiformia)系列，尤其是科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata))、三线马铃薯甲虫(Lematri lineata)；南方和西方玉米根虫(玉米根虫、黄瓜条叶甲(undecimpunctata)和西方玉米根虫(D.virgifera)、象鼻虫(苜蓿叶象甲)、南瓜蝽(南瓜缘蝽)；跳甲(萝卜菜跳甲(Phyllotreta crucifera))、豆像甲虫(四纹豆象(Callosobruchus maculatus))、墨西哥豆甲虫(墨西哥豆瓢虫)、蚕豆日潜蝇(大豆潜叶虫(Odontota horni))、具缘芫菁(原野豆芫菁(Epicauta pestifera))和赤拟榖盗甲虫(赤拟谷盗)；双翅目，尤其是家蝇(普通家蝇)。参见Terra和Ferreira，1994年，Comn.Biochem.Physiol.，109B:第1-62页；Wolfson和Murdock，1990年，J.Chem.Ecol.，第16卷：第1089-1102页。
间插接头肽的其他示例可在以下参考文献中找到，其全文以引用方式并入本文：发现植物表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂前体包含被六个相同的接头肽分离的五个同质蛋白质抑制剂，如下文所公开的：Heath等人，“Characterization of the proteaseprocessing sites in a multidomain proteinase inhibitor precursor fromNicotiana alata”，European Journal of Biochemistry，1995年，第230卷：第250-257页。Chang,H.C.等人对绿色荧光蛋白质通过六种不同接头的折叠行为进行了比较，“De novofolding of GFP fusion proteins:high efficiency in eukaryotes but not inbacteria”，Journal of Molecular Biology，2005年10月21日，第353卷第2期：第397-409页。Daskalova,S.M.等人的研究表明，人GalNAc-Ts家族的同种型GalNAc-T2在本氏烟草植物中表达后保留了其定位和功能，“Engineering of N.benthamiana L.plants forproduction of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins”，BMC Biotechnology，2010年8月24日，第10卷：第62页。Kwok,E.Y.等人示出了内源质体蛋白质穿过基质的能力，“GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastidstromules and traffic between plastids”，Journal of Experimental Botany，2004年3月，第55卷第397期：第595-604页。Epub，2004年1月30日。Borovsky,D.等人报告了用蚊子十肽激素、胰蛋白酶调节的抑制因子(TMOF)对烟草花叶病毒(TMV)病毒体的表面进行工程改造，“Expression of Aedes trypsin-modulating oostatic factor on the virion ofTMV:A potential larvicide”，Proc Natl Acad Sci，2006年12月12日，第103卷第50期：第18963-18968页。这些参考文献和其他文献教导和公开了可用于本文所述的方法、程序和肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的间插接头。
DVP ORF和DVP构建体
“DVP ORF”是指编码DVP和/或一个或多个稳定蛋白质、分泌信号或靶向指导信号，例如ERSP或STA的核苷酸，并定义为ORF中具有翻译能力的核苷酸。因此，“DVP ORF图表”是指一个或多个DVP ORF的组成，如以图或方程式形式写出的。例如，“DVP ORF图表”可写成使用首字母缩写词或简称来表示表达ORF内包含的DNA片段。因此，在一个示例中，“DVP ORF图表”可描述编码ERSP、LINKER、STA和DVP的多核苷酸片段，通过以方程形式分别将DNA片段图示为“ersp”(即，编码ERSP多肽的多核苷酸序列)；“linker”或“L”(即，编码LINKER多肽的多核苷酸序列)；“sta”(即，编码STA多肽的多核苷酸序列)和“dvp”(即，编码DVP的多核苷酸序列)。DVP ORF图表的示例是“ersp-sta-(linkeri-dvpj)N”或“ersp-(dvpj-linkeri)N-sta”和/或它们的DNA片段的任何组合。
下文的方程描述了编码ERSP、STA、接头和DVP的DVP ORF的两个示例：
ersp-sta-l-dvp或ersp-dvp-l-sta
在一些实施方案中，本文所述的DVP表达开放阅读框(ORF)是多核苷酸序列，该多核苷酸序列将使植物能够表达mRNA，该mRNA继而又将被翻译成肽，这些肽被正确表达、折叠和/或积累到这样的程度，以致所述蛋白质提供足以抑制和/或杀死一种或多种害虫的剂量。在一个实施方案中，蛋白质DVP ORF的示例可以是Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多核苷酸(dvp)、“ersp”(即编码ERSP多肽的多核苷酸序列)、“linker”(即编码LINKER多肽的多核苷酸序列)、“sta”(即编码STA多肽的多核苷酸序列)或它们的任何组合，并且可以下文的方程形式描述：
ersp-sta-(linkeri-dvpj)n或ersp-(dvpj-linkeri)n-sta
多核苷酸方程的前述例示性实施方案将导致表达以下蛋白质复合物：ERSP-STA-(LINKERI-DVPJ)N，含有四种可能肽组分，用破折号分离每种组分。ersp的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽(ERSP)的多核苷酸片段。sta的组分是编码翻译稳定蛋白质(STA)的多核苷酸片段，该STA有助于在植物中表达的DVP的积累，然而，在一些实施方案中，在DVPORF中可能不需要包括sta。linkeri的组分是编码间插接头肽(L或LINKER)的多核苷酸片段，以将DVP与ORF中包含的其他组分以及翻译稳定蛋白质分离。下标字母“i”表示在一些实施方案中，不同类型的接头肽可用于DVP ORF中。组分“dvp”表示编码DVP的多核苷酸片段(也称为Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多核苷酸序列)。下标“j”表示不同的Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多核苷酸可包括在DVP ORF中。例如，在一些实施方案中，Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多核苷酸序列可编码具有氨基酸取代或氨基酸缺失的DVP。如“(linkeri-dvpj)n”中所示的下标“n”表示编码间插接头肽和DVP的核苷酸的结构可在相同DVP ORF中的相同开放阅读框中重复“n”次，其中“n”可以是1至10的任何整数；“n”可以是1至10，具体地“n”可以是1、2、3、4或5，并且在一些实施方案中“n”是6、7、8、9或10。重复序列可包含编码不同间插接头(LINKER)和不同DVP的多核苷酸片段。包括相同DVP ORF中的重复序列的不同多核苷酸片段都在相同的翻译框中。在一些实施方案中，在DVP ORF中包含sta多核苷酸可能不是必需的。例如，ersp多核苷酸序列可直接与编码DVP变体多核苷酸的多核苷酸连接而无需接头。
在前述的示例性方程中，编码多肽“DVP”的多核苷酸“dvp”可以是编码本文所述的任何DVP的多核苷酸序列。
在前述的示例性方程中，编码多肽“DVP”的多核苷酸“dvp”可以是编码如本文所述的任何DVP的多核苷酸序列，例如，包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列的DVP：SEQ ID NO:187-191。
上述方法中的任一者和/或本文所述的方法中的任一者可用于将一种或多种多核苷酸掺入植物或其植物部分，该一种或多种多核苷酸用于表达如本文所述的DVP或DVP杀昆虫蛋白中的任一者或多者。
在一些实施方案中，多核苷酸用于编码具有下列DVP构建体取向和/或排列的DVP杀昆虫蛋白：ERSP-DVP、ERSP-(DVP)N、ERSP-DVP-L、ERSP-(DVP)N-L、ERSP-(DVP-L)N、ERSP-L-DVP、ERSP-L-(DVP)N、ERSP-(L-DVP)N、ERSP-STA-DVP、ERSP-STA-(DVP)N、ERSP-DVP-STA、ERSP-(DVP)N-STA、ERSP-(STA-DVP)N、ERSP-(DVP-STA)N、ERSP-L-DVP-STA、ERSP-L-STA-DVP、ERSP-L-(DVP-STA)N、ERSP-L-(STA-DVP)N、ERSP-L-(DVP)N-STA、ERSP-(L-DVP)N-STA、ERSP-(L-STA-DVP)N、ERSP-(L-DVP-STA)N、ERSP-(L-STA)N-DVP、ERSP-(L-DVP)N-STA、ERSP-STA-L-DVP、ERSP-STA-DVP-L、ERSP-STA-L-(DVP)N、ERSP-(STA-L)N-DVP、ERSP-STA-(L-DVP)N、ERSP-(STA-L-DVP)N、ERSP-STA-(DVP)N-L、ERSP-STA-(DVP-L)N、ERSP-(STA-DVP)N-L、ERSP-(STA-DVP-L)N、ERSP-DVP-L-STA、ERSP-DVP-STA-L、ERSP-(DVP)N-STA-L ERSP-(DVP-L)N-STA、ERSP-(DVP-STA)N-L、ERSP-(DVP-L-STA)N或ERSP-(DVP-STA-L)N；其中N是1至200的整数。
本公开可用于任何植物物种的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。转基因方法或PEP将是特别有用的方法的作物包括但不限于：苜蓿、棉花、番茄、玉蜀黍、小麦、玉米、甜玉米、紫花苜蓿、大豆、高粱、红豌豆、亚麻籽、红花、油菜籽、油菜、稻、大豆、大麦、向日葵、树(包括针叶树和落叶树)、花(包括商业上和温室中生长的那些)、羽扇豆、柳枝稷、甘蔗、马铃薯、番茄、烟草、十字花科植物、胡椒、甜菜、大麦和油菜、芸苔属物种、黑麦、小米、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
用多核苷酸转化植物
在一些实施方案中，上文和本文描述的DVP ORF和DVP构建体可被克隆到任何植物表达载体中，以便DVP在植物中瞬时或稳定地表达。
瞬时植物表达系统可用于迅速地优化植物中某些特定DVP表达的DVP ORF结构，包括一些组分的必要性，一些组分的密码子优化，每种组分的顺序的优化等。瞬时植物表达载体通常源自植物病毒基因组。植物病毒载体由于植物病毒的感染特性而在植物中提供快速和高水平的外源基因表达的优势。植物病毒基因组的全长可用作载体，但通常缺失病毒组分，例如外壳蛋白质，并将转基因ORF亚克隆在该位置。DVP ORF可被亚克隆到这样的位点以产生病毒载体。这些病毒载体可以机械方式引入植物，因为它们本身是感染性的，例如通过植物创伤、喷雾等。它们也可经由农杆菌感染通过将病毒载体克隆到冠瘿病细菌根癌农杆菌或发根细菌毛根农杆菌的T-DNA中而转染到植物中。DVP在这个载体中的表达由RNA病毒的复制控制，并且病毒翻译成mRNA进行复制由强病毒启动子控制，例如，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。具有DVP ORF的病毒载体通常克隆到二元载体的T-DNA区中，该二元载体可在大肠杆菌菌株和农杆菌菌株中自身复制。植物的瞬时转染可通过用包含用于DVP表达的病毒载体的农杆菌细胞浸润植物叶来完成。在瞬时转化的植物中，由于转录后基因沉默(PTGS)，外源蛋白质表达通常在短时间内停止。有时PTGS抑制蛋白质基因必须与驱动DVPORF表达的相同类型的病毒载体瞬时共转化到植物中。这改善和扩展了植物中DVP的表达。最常用的PTGS抑制蛋白质是从番茄丛矮病毒(TBSV)中发现的P19蛋白。
在一些实施方案中，植物的瞬时转染可通过将编码DVP的多核苷酸与容易获得的载体(参见上文并如本文所述)中的任一者重组来实现，并且使用标记或信号(例如GFP发射)来确认。在一些实施方案中，瞬时转染的植物可通过在载体中将编码DVP的多核苷酸与编码GFP-杂种融合蛋白质的DNA重组，并使用设计用于靶向表达的不同FECT载体将所述载体转染到植物(例如，烟草)中而产生。在一些实施方案中，编码DVP的多核苷酸可与用于APO(质外体定位)积累的pFECT载体重组；与用于CYTO(细胞质定位)积累的pFECT载体重组；或与用于ER(内质网定位)积累的pFECT-ersp载体重组。
示例性瞬时植物转化策略是使用植物病毒载体的农杆菌感染，这是由于其高效、简便和低成本。在一些实施方案中，烟草花叶病毒过表达系统可用于用DVP瞬时转化植物。参见TRBO，Lindbo JA，Plant Physiology，2007年，第145卷：第1232-1240页，其公开内容全文以引用方式并入本文。
TRBO DNA载体具有用于农杆菌感染的T-DNA区，该区包含驱动没有编码病毒包膜蛋白质的基因的烟草花叶病毒RNA表达的CaMV 35S启动子。此外，该系统使用“卸甲”病毒基因组，因此可有效地防止病毒植物至植物的传播。
在另一个实施方案中，FECT病毒瞬时植物表达系统可用于用DVP瞬时转化植物。参见Liu Z&Kearney CM，BMC Biotechnology，2010年，第10卷：第88页，其公开内容全文以引用方式并入本文。FECT载体包含用于农杆菌感染的T-DNA区，该区包含驱动没有编码病毒包膜蛋白质和三基因框的基因的狐尾花叶病毒RNA表达的CaMV 35S启动子。此外，该系统使用“卸甲”病毒基因组，因此可有效地防止病毒植物至植物的传播。为了有效地表达引入的异源基因，FECT表达系统还需要共表达P19，一种来自番茄丛矮病毒的RNA沉默抑制蛋白质，以防止引入的T-DNA的转录后基因沉默(PTGS)(TRBO表达系统不需要共表达P19)。
在一些实施方案中，DVP ORF可被设计为编码一系列翻译融合的结构基序，其可描述如下：N’-ERSP-STA-L-DVP-C’，其中“N’”和“C’”分别表示N-末端和C-末端氨基酸，并且ERSP基序可以是大麦α-淀粉酶信号肽(BAAS)(SEQ ID NO:60)；稳定蛋白质(STA)可以是GFP(SEQ ID NO:57)；接头肽“L”可以是IGER(SEQ ID NO:54)。在一些实施方案中，ersp-sta-l-dvp ORF可化学合成以包括限制位点，例如在其5’末端的Pac I限制位点，和在其3’末端的Avr II限制位点。在一些实施方案中，DVP ORF可克隆到FECT表达载体(pFECT)的Pac I和Avr II限制位点中，以产生用于FECT瞬时植物表达系统(pFECT-DVP)的Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体表达载体。为了使FECT表达系统中的表达最大化，一些实施方案可具有表达为共转化产生的RNA沉默抑制蛋白质P19的FECT载体(pFECT-P19)。
在一些实施方案中，例如，通过进行常规PCR程序并将Not I限制位点加入到上述DVP ORF的3’-末端，然后将DVP ORF克隆到TRBO表达载体(pTRBO-DVP)的Pac I和Not I限制位点，可重组Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体表达载体以用于TRBO瞬时植物表达系统。
在一些实施方案中，使用一种或多种瞬时表达系统(例如，FECT和TRBO表达系统)，根癌农杆菌菌株(例如，可商购获得的GV3101细胞)可用于在植物组织(例如，烟叶)中瞬时表达DVP ORF。这种瞬时转染方案的示例性说明包括如下：GV3101的过夜培养物可用于接种200mL Luria-Bertani(LB)培养基；可使细胞生长至OD600在0.5和0.8之间的对数期；然后通过在4℃下以5000rpm离心10分钟沉淀细胞；然后用10mL预冷的TE缓冲液(Tris-HCl10mM，EDTA 1mM，pH8.0)洗涤细胞一次，然后重悬于20mL LB培养基中；GV3101细胞重悬浮液然后可以250μL级分等分到1.5mL微管中；然后将等分试样在液氮中速冻并储存在-80℃冰箱中以备进一步转化。然后可使用如下冻融方法将pFECT-DVP和pTRBO-DVP载体转化到感受态GV3101细胞中：将储存的感受态GV3101细胞在冰上解冻，并与1μg至5μg纯DNA(pFECT-DVP或pTRBO-DVP载体)混合。将细胞-DNA混合物在冰上保持5分钟，转移到-80℃下5分钟，并在37℃水浴中温育5分钟。然后将冻融处理的细胞稀释到1mL LB培养基中，并在室温下在摇床上振荡2小时至4小时。然后将200μL等份试样的细胞-DNA混合物涂布在含有适当抗生素(10μg/mL利福平、25μg/mL庆大霉素和50μg/mL卡那霉素可用于pFECT-DVP转化和pTRBO-DVP转化两者)的LB琼脂板上，并在28℃下温育两天。然后挑取所得转化的菌落，并在6mL等分的LB培养基中培养，该培养基含有用于转化的DNA分析的适当抗生素，并制备转化的GV3101细胞的甘油储备物。
在一些实施方案中，植物组织(例如烟叶)的瞬时转化可使用3mL无针头注射器进行叶注射来进行。在一个例示性示例中，将转化的GV3101细胞划线接种到具有适当抗生素(如上所述)的LB平板上，并在28℃孵育两天。将转化的GV3101细胞的集落接种到5ml LB-MESA培养基(补充有10mM MES和20μM乙酰丁香酮的LB培养基)和上述相同的抗生素中，并在28℃下生长过夜。通过以5000rpm离心10分钟收集过夜培养物的细胞，并以1.0的最终OD600重悬于诱导培养基(10mM MES、10mM MgCl2、100μM乙酰丁香酮)中。然后将细胞在诱导培养基中于室温下孵育2小时至过夜，然后准备好进行烟叶的瞬时转化。可使用不带针头的3mL注射器通过注射将处理过的细胞浸润到本氏烟草植物附着叶的下侧。
在一些实施方案中，瞬时转化可通过如下方式完成：用pFECT-DVP或pTRBO-DVP转染GV3101细胞的一个群体并用pFECT-P19转染另一个群体，然后将两个细胞群体等量混合在一起用于通过用3mL注射器注射来浸润烟叶。
用于编码DVP的多核苷酸的稳定整合在本公开中也是可能的，例如，DVP ORF也可使用稳定植物转化技术整合到植物基因组中，因此DVP可在植物中稳定表达并保护转化的植物代代相传。为了植物的稳定转化，DVP表达载体可以是环状的或线性的。DVP ORF、DVP表达盒和/或具有编码用于稳定植物转化的DVP的多核苷酸的载体应基于本领域普通技术人员已知的内容，和/或通过使用预测性载体设计工具诸如Gene Designer 2.0(Atum Bio)、VectorBuilder(Cyagen)、查看器、GeneArtTM质粒构建服务(Thermo-FisherScientific)和/或其他商业上可获得的质粒设计服务来进行仔细设计，以便优化植物中的表达。参见Tolmachov，“Designing plasmid vectors.”Methods Mol Biol.，2009年，第542卷：第117-129页。DVP的表达通常由在转基因植物的一些或所有细胞中促进转录的启动子控制。启动子可以是强植物病毒启动子，例如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的组成型35S启动子；它还可以是强植物启动子，例如，来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的氢过氧化物裂解酶启动子(pHPL)；来自大豆的大豆多聚泛素(Gmubi)启动子；来自不同植物物种(稻、玉米、马铃薯等)的泛素启动子等。植物转录终止子通常出现在ORF的终止密码子之后，以终止RNA聚合酶和mRNA的转录。为了评价DVP的表达，可在DVP表达载体中包含报告基因，例如，用于GUS染色测定的β-葡糖醛酸酶基因(GUS)、用于在UV光下进行绿色荧光检测的绿色荧光蛋白(GFP)基因等。为了选择转化的植物，选择标记基因通常包含在DVP表达载体中。在一些实施方案中，标记基因表达产物可为转化植物提供对特定抗生素(例如，卡那霉素、潮霉素等)或特定除草剂(例如，草甘膦等)的抗性。如果采用农杆菌感染技术进行植物转化，则T-DNA左边界和右边界序列也包含在DVP表达载体中，以将T-DNA部分转运到植物中。
构建的DVP表达载体可使用多种转染技术转染到植物细胞或者组织中。农杆菌感染是使用根癌农杆菌菌株或毛根农杆菌菌株转化植物的一种非常普遍的方法。粒子轰击(也称为基因枪或生物射弹)技术也是非常常见的植物转染方法。其他较不常见的转染方法包括组织电穿孔、碳化硅晶须、直接注射DNA等。转染后，将转染的植物细胞或组织置于植物再生培养基上，以将成功转染的植物细胞或组织再生为转基因植物。
转化植物的评价可在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平上完成。稳定转化的植物可在所有这些水平上进行评价，而瞬时转化的植物通常仅在蛋白质水平上进行评价。为了确保DVP ORF整合到稳定转化的植物的基因组中，可从稳定转化的植物组织中提取基因组DNA，并使用PCR或DNA印迹进行分析。DVP在稳定转化的植物中的表达可在RNA水平上进行评价，例如，通过使用RNA印迹或RT-PCR分析从转化的植物组织中提取的总mRNA。DVP在转化植物中的表达也可直接在蛋白质水平上进行评价。有许多方法来评价DVP在转化植物中的表达。如果报告基因包含在DVP ORF中，则可进行报告基因测定，例如，在一些实施方案中，可使用用于GUS报告基因表达的GUS应变测定、用于GFP报告基因表达的绿色荧光检测测定、用于荧光素酶报告基因表达的荧光素酶测定和/或其他报告技术。
在一些实施方案中，可从转化的植物组织中提取总蛋白，用于使用Bradford测定评价样品中的总蛋白水平，以直接评价DVP的表达。
在一些实施方案中，可采用分析型HPLC层析技术、蛋白质印迹技术或iELISA测定来定性或定量地评价从转化的植物组织中提取的总蛋白质样品中的DVP。DVP表达也可通过在昆虫生物测定中使用从转化的植物组织中提取的总蛋白样品来评价，例如，在一些实施方案中，转化的植物组织或整个转化的植物本身可用于昆虫生物测定中以评价DVP表达及其为植物提供保护的能力。
在一些实施方案中，本发明的植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分可包含一种或多种DVP，或编码该一种或多种DVP的多核苷酸，所述DVP包含至少是氨基酸序列
确认转化成功
在将异源外源DNA引入到植物细胞中以后，异源基因在植物基因组中的转化或整合通过各种方法如与整合基因有关的核酸、蛋白质和代谢物的分析来证实。
PCR分析是移种到土壤之前筛选早期转化细胞、组织或苗中掺入基因存在的快速方法(Sambrook和Russell，2001年，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual.”，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。使用对感兴趣的基因或农杆菌属载体背景等特异的寡核苷酸引物进行PCR。
植物转化可通过基因组DNA的DNA印迹分析来证实(Sambrook和Russell，2001年，(出处同上))。一般而言，从转化的植物提取总DNA，用适当的限制性酶消化，在琼脂糖凝胶中进行分级分离并且转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然后根据标准技术(Sambrook和Russell，2001年，出处同上)，可用例如放射性标记的32P靶DNA片段探测该膜或“印迹”，以证实被引入的基因在植物基因组中的整合。
在RNA印迹分析中，根据本领域常规使用的标准程序(Sambrook和Russell，2001年，出处同上)，从转化的植物的特定组织分离RNA，该RNA在甲醛琼脂糖凝胶中进行分级分离，并且印迹到尼龙滤膜上。然后通过本领域内已知的方法(Sambrook和Russell，2001年，出处同上)，使所述滤膜与源自DVP的放射性探针杂交，来检测由编码DVP的多核苷酸编码的RNA的表达。
根据标准程序(Sambrook和Russell，2001年，出处同上)，使用与存在于DVP上的一个或多个表位结合的抗体，可对转基因植物进行蛋白质印迹和生化测定等，以证实由DVP基因编码的蛋白质的存在。
已经开发了许多标记来确定植物转化的成功，例如对氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等的抗性。编码参与叶绿体代谢的产物的其他基因也可用作选择标记。例如，提供对植物除草剂诸如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮的抗性的基因可能特别有用。此类基因已被报道(Stalker等人，1985年，J.Biol.Chem.，第263卷，第6310-6314页(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；和Sathasivan等人，1990年，Nucl.Acids Res.，第18卷，第2188页(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。此外，本文公开的基因可用作评估细菌、酵母或植物细胞转化的标记。用于检测转基因在植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或其子代中的存在的方法是本领域众所周知的。在一个实施方案中，通过测试杀虫活性来检测转基因的存在。
可测试表达DVP和/或Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多核苷酸的可育植物的杀虫活性，并选择显示最佳活性的植物用于进一步育种。可获得本领域用于测定害虫活性的方法。通常，将蛋白质混合并用于取食测定。例如，参见Marrone等人，1985年，J.of EconomicEntomology，第78卷，第290-293页。
在一些实施方案中，评价瞬时转染程序的成功可基于报告基因(例如，GFP)的表达来确定。在一些实施方案中，GFP可在UV光下在用FECT和/或TRBO载体转化的烟叶中检测。
在一些实施方案中，可定量地评价植物(例如，烟草)中的DVP表达。说明烟草植物中DVP定量的示例性程序如下：通过用1000μL移液管吸头的大开口对叶子打孔，收集100mg转化的叶组织的圆片。将收集的叶组织置于具有5/32英寸直径不锈钢研磨球的2mL微管中，并在-80℃冷冻1小时，然后使用Troemner-Talboys高通量均质器均质化。接着，将750μL冰冷的TSP-SE1提取溶液(磷酸钠溶液50mM，1:100稀释的蛋白酶抑制剂混合物，EDTA 1mM，DIECA 10mM，PVPP 8％，pH 7.0)加入到管中并涡旋。然后将微管在室温下静置15分钟，然后在4℃下以16,000g离心15分钟；取100μL所得上清液并装入0.45μm MilliporeMultiScreen过滤微量滴定板中的Pre-Sephadex G-50填充柱中，在底部具有空的接收Costar微量滴定板。然后将微量滴定板在4℃下以800g离心2分钟。然后将所得滤液溶液(本文中称为烟叶的总可溶性蛋白提取物(TSP提取物))准备用于定量分析。
在一些实施方案中，TSP提取物的总可溶性蛋白浓度可使用Pierce考马斯Plus蛋白测定来估计。已知浓度的BSA蛋白质标准品可用于生成蛋白质定量标准曲线。例如，可将2μL的每种TSP提取物混合到200μL的考马斯Plus蛋白测定试剂盒的显色试剂(CPPA试剂)中，并孵育10分钟。然后可通过使用SoftMax Pro作为控制软件的SpectroMax-M2读板机读取OD595来评价显色反应。在得自通过FECT和TRBO转化的植物的TSP提取物中总可溶性蛋白的浓度可分别为约0.788±0.20μg/μL或约0.533±0.03μg/μL，并且该结果可用于计算用于iELISA测定的TSP中表达的Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体肽的百分比(％TSP)。
在一些实施方案中，间接ELISA(iELISA)测定可用于定量地评价用FECT和/或TRBO表达系统瞬时转化的烟叶中的DVP含量。使用iELISA定量DVP的一个例示性示例如下：将5μL叶TSP提取物在Immulon 2HD 96孔板的孔中用95μL CB2溶液(ImmunochemistryTechnologies)稀释，必要时进行连续稀释；然后将从提取物样品获得的叶蛋白在黑暗、室温下包被孔壁3小时，然后除去CB2溶液；每个孔用200μL PBS(Gibco)洗涤两次；将150μL封闭液(含5％脱脂奶粉的PBS中的封闭BSA)加入每个孔中，并在黑暗、室温下孵育1小时；除去封闭液后，用PBS洗涤孔，加入100μL针对DVP的一抗(定制抗体可从ProMabBiotechnologies,Inc.商购获得；或使用本领域普通技术人员容易获得的知识制备)；将以1:250的稀释度在封闭溶液中稀释的抗体加入每个孔中，并在黑暗、室温下孵育1小时；除去一抗，并用PBS洗涤每个孔4次；将100μL HRP偶联的二抗(即，针对用于产生一抗的宿主物种的抗体，以在封闭溶液中1:1000的稀释度使用)加入每个孔中，并在黑暗、室温下孵育1小时；除去二抗，并用100μL PBS洗涤孔；将底物溶液(ABTS过氧化物酶底物溶液A和溶液B的1:1混合物，KPL)加入每个孔中，并且显色反应进行直到显色足够明显；将100μL过氧化物酶终止液加入每个孔中以终止反应；使用SpectroMax-M2读板机在405nm下读取板中每种反应混合物的吸光度，SoftMax Pro用作控制软件；连续稀释的已知浓度的纯DVP样品可按照上述在iELISA测定中所述的相同方式进行处理，以生成用于定量分析的质量吸光度标准曲线。可通过iELISA检测表达的DVP，在来自FECT转化的烟草的叶TSP提取物中为约3.09±1.83ng/μL；并且在来自TRBO转化的烟草的叶TSP提取物中为约3.56±0.74ng/μL。或者，对于FECT转化的植物，表达的DVP可以是约0.40％的总可溶性蛋白(％TSP)，并且在TRBO转化的植物中，表达的DVP可以是约0.67％的TSP。
混合物、组合物和制剂
如本文所用，术语“组合物”和“制剂”可互换使用。
如本文所用，“v/v”或“％v/v”或“体积/体积”是指溶液的体积浓度(“v/v”代表体积/体积)。此处，当溶液的两种组分都是液体时，可使用v/v。例如，当用50mL水稀释50mL成分X时，在100mL的总体积中将有50mL成分X；因此，这可表示为“成分X 50％v/v”。如下计算体积/体积百分比(％v/v)：(溶质体积(mL)/溶液体积(100mL))；例如，％v/v＝溶质mL/100mL溶液。
如本文所用，“w/w”或“％w/w”或“重量/重量”是指溶液的重量浓度，即重量/重量百分比(“w/w”表示重量/重量)。此处，w/w表示100g溶液或混合物中成分的克数(g)。例如，由30g成分X和70g水组成的混合物将表示为“成分X 30％w/w”。重量/重量百分比(％w/w)如下计算：(溶质重量(g)/溶液重量(g))×100；或(溶质质量(g)/溶液质量(g))×100。
如本文所用，“w/v”或“％w/v”或“重量/体积”是指溶液的质量浓度，即重量/体积百分比(“w/v”表示重量/体积)。此处，w/v表示100mL溶液中成分的克数(g)。例如，如果使用1g成分X来组成100mL的总体积，则制备了“成分X的1％w/v溶液”。重量/体积百分比(％w/v)如下计算：(溶质质量(g)/溶液体积(mL))×100。
本文所述的任何DVP或DVP杀昆虫蛋白(例如，具有SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219所示的氨基酸序列的DVP或其药学上可接受的盐)可用于产生混合物和/或组合物，其中所述混合物和/或组合物由至少一种DVP组成。
用本文所述的且用于表达DVP的多核苷酸转化的任何组合物、产品、多肽和/或植物可用于防治害虫、它们的生长和/或由它们的作用引起的损害，尤其是它们对植物的损害。
包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐的组合物(例如，农用化学组合物)可包括但不限于：气溶胶和/或气溶胶化的产品，例如喷雾剂、熏蒸剂、粉末、粉剂和/或气体；拌种剂；口服制剂(例如，昆虫食物等)；(瞬时和/或稳定地)表达和/或产生DVP、DVP杀昆虫蛋白和/或DVP ORF的转基因生物体，例如植物或动物。
可将组合物配制成粉末、粉剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂、溶液剂等，并且可通过常规方法，例如包含该多肽的细胞培养物的干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备该组合物。在包含至少一种此类杀虫多肽的所有这些组合物中，该多肽可以约1重量％至约99重量％的浓度存在。
在一些实施方案中，本文所述的杀虫剂组合物可通过将DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐与期望的农业上可接受的载体一起配制来制备。在施用前，可以合适的方法例如冻干、冷冻干燥、干燥，或者在水性载体、介质或合适稀释剂例如盐水和/或其他的缓冲液中配制该组合物。在一些实施方案中，配制的组合物可以为粉尘或颗粒材料的形式，或者在油(植物或矿物油)中的悬浮液的形式，或者水或油/水乳剂的形式，或者作为可湿性粉剂，或者与适合于农业应用的任何其他载体材料相组合。合适的农业载体可以是固体或液体，并且是本领域熟知的。在一些实施方案中，该制剂可与一种或多种固体或液体助剂相混合，并且可通过多种方法来制备，例如通过使用常规配制技术将杀虫组合物与合适的助剂一起均匀地混合、掺合和/或研磨。合适的配制和施用方法描述于美国专利号6,468,523中，其公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，组合物可包含以下物质，基本上由以下物质组成，或由以下物质组成：DVP和赋形剂。
在一些实施方案中，组合物可包含以下物质，基本上由以下物质组成，或由以下物质组成：DVP杀昆虫蛋白和赋形剂。
在一些实施方案中，组合物可包含以下物质，基本上由以下物质组成，或由以下物质组成：DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂。
可喷雾组合物
本发明的喷雾产品的示例可包括用于农业用途的田间可喷雾制剂和用于住宅或商业空间的内部空间的室内喷雾剂。在一些实施方案中，包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐的滞留喷雾剂或空间喷雾剂可用于减少或消除内部空间中的昆虫害虫。
室内表面喷雾(SSI)是将可变体积可喷雾量的杀昆虫剂施用到病媒停留的室内表面(例如墙壁、窗户、地板和天花板)上的技术。可变体积可喷雾量的主要目的是缩短昆虫害虫(例如，蝇、蚤、蜱或蚊子媒介)的寿命，并由此减少或中断疾病传播。其次的影响是降低处理区域内昆虫害虫的密度。SSI可用作防治昆虫害虫媒介疾病的方法，诸如莱姆病、沙门氏菌、基孔肯雅病毒、寨卡病毒和疟疾，也可用于处理昆虫媒介携带的寄生虫，诸如利什曼病和恰加斯病。许多携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和疟疾的蚊子媒介包括家栖蚊媒介，它们在吸食血液后在房屋内休息。这些蚊子特别容易通过用包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的可喷雾组合物进行室内表面喷雾(SSI)来防治。顾名思义，SSI涉及将组合物与残留杀虫剂一起施用到墙壁和房屋的其他表面。
在一个实施方案中，包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的组合物将击倒与这些表面接触的昆虫害虫。SSI并不能直接防止人们被蚊子叮咬。相反，如果昆虫害虫停留在经喷雾的表面上，则SSI通常在它们吸血后对它们进行防治。因此，SSI防止感染被传播给其他人。为了有效，SSI必须应用于区域中非常高比例的住户(通常大于40％-80％)。因此，根据本发明的具有良好残留效力和可接受气味的喷雾剂特别适合作为综合的昆虫害虫媒介处理或防治解决方案的组分。
与要求活性DVP、DVP杀昆虫蛋白(例如用油漆)结合到住宅表面(诸如墙壁或天花板)的SSI相反，本发明的空间喷雾产品依赖于产生大量的小杀昆虫剂液滴，旨在在给定的时间段内通过一定体积的空气分布。当这些液滴碰到目标害虫时，它们会释放有效击倒剂量的DVP或DVP杀昆虫蛋白，以有效防治昆虫害虫。产生空间喷雾的传统方法包括热雾化(由此产生包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐的组合物的浓雾，从而产生浓雾外观)和超低体积(ULV)，由此通过冷的机械气溶胶发生器产生液滴。也可使用即用型气溶胶，诸如气溶胶罐。
因为大面积可在任何时间处理，所以前述方法是快速减少特定区域中飞行昆虫害虫数量的非常有效的方法。并且，由于施用后残留活性非常有限，因此必须以5-7天的间隔重复以便完全有效。该方法在需要快速减少昆虫害虫数量的流行情况下特别有效。因此，它可用于城市登革热防治活动。
有效的空间喷雾通常取决于以下具体原则。目标昆虫通常飞过喷雾云(或者有时停留在暴露的表面上时被碰到)。因此，喷雾液滴与目标昆虫之间的接触效率是至关重要的。这是通过确保喷雾液滴在最佳时间段内保持空气传播并且它们含有正确剂量的杀昆虫剂来实现的。这两个问题在很大程度上通过优化液滴尺寸来解决。如果液滴太大，它们就会太快地落到地面上，并且不会穿透植被或在施用过程中遇到的其他障碍物(限制了施用的有效面积)。如果这些大液滴中的一个大液滴碰到单独昆虫，那么它也“过量杀伤”，因为将对每只单独昆虫释放高剂量。如果液滴太小，那么它们可能由于空气动力学的原因而不会沉积在目标昆虫上(没有碰撞)，或者它们可能被对流气流向上带入大气。对于空间喷雾应用，液滴的最佳尺寸是体积中值直径(VMD)为10微米-25微米的液滴。
在一些实施方案中，可喷雾组合物可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，可喷雾组合物可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
泡沫
本发明的包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的活性组合物可制成基于气溶胶的应用(包括气溶胶化泡沫应用)的喷雾产品形式。加压罐是用于形成气溶胶的典型容器。一种与使用的DVP和DVP杀昆虫蛋白相容的气溶胶推进剂。优选地，使用液化气型推进剂。
合适的推进剂包括压缩空气、二氧化碳、丁烷和氮气。活性化合物组合物中推进剂的浓度为吡啶组合物的约5重量％至约40重量％，优选约15重量％至约30重量％，该吡啶组合物包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂。
在一个实施方案中，由DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐组成的制剂还可包括一种或多种发泡剂。可使用的发泡剂包括月桂醇聚醚硫酸钠、椰油酰胺DEA和椰油酰胺丙基甜菜碱。优选地，月桂醇聚醚硫酸钠、椰油酰胺DEA和椰油酰胺丙基组合使用。发泡剂在活性化合物组合物中的浓度为组合物的约10重量％至约25重量％，更优选15重量％至20重量％。
当这种制剂用于不含发泡剂的气溶胶应用时，本发明的活性组合物可在使用前无需混合即直接使用。然而，含有发泡剂的气溶胶制剂确实需要在使用前立即混合(即，摇动)。此外，如果含有发泡剂的制剂使用时间较长，则它们可能需要在使用过程中定期进行额外的混合。
在一些实施方案中，气溶胶化泡沫可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，气溶胶化泡沫可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
燃烧制剂
在一些实施方案中，还可用活性DVP或DVP杀昆虫蛋白组合物来处理居住区，方法是使用燃烧制剂，例如含有该组合物的蜡烛、烟卷或一柱熏香。例如，该组合物可被配制成家用产品，诸如“加热的”空气清新剂，其中杀昆虫剂组合物在加热(例如，电加热或燃烧)时释放。本发明的包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的活性组合物可制成喷雾产品形式，诸如气溶胶、蚊香和/或汽化器或喷雾器。
在一些实施方案中，燃烧制剂可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，燃烧制剂可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
织物处理
在一些实施方案中，可制备含有杀昆虫有效组合物的织物和服装，该杀昆虫有效组合物包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂。在一些实施方案中，本文所述的聚合物材料、纤维、纱线、织物、网或基材中的DVP或DVP杀昆虫蛋白的浓度可在相对宽的浓度范围内变化，例如，0.05重量％至15重量％，优选0.2重量％至10重量％，更优选0.4重量％至8重量％，尤其是0.5重量％至5重量％，诸如1重量％至3重量％。
类似地，包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的组合物(无论是用于处理表面还是用于涂覆纤维、纱线、网、织物)的浓度可在相对宽的浓度范围内变化，例如，0.1重量％至70重量％，诸如0.5重量％至50重量％，优选1重量％至40重量％，更优选5重量％至30重量％，尤其是10重量％至20重量％。
DVP或DVP杀昆虫蛋白的浓度可根据应用领域选择，以满足关于击倒效力、持久性和毒性的要求。也可实现材料性质的调整，因此可通过这种方式获得定制的纺织织物。
因此，DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐的有效量可取决于具体的使用模式、最希望防治的昆虫害虫和使用DVP或DVP杀昆虫蛋白的环境。因此，DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐的有效量足以实现对昆虫害虫的防治。
在一些实施方案中，织物处理剂可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，织物处理剂可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
表面处理组合物
在一些实施方案中，本公开提供了用于涂覆建筑物内部的墙壁、地板和天花板，以及用于涂覆基材或非生物材料的组合物或制剂，该组合物或制剂包含DVP和赋形剂，或包含DVP杀昆虫蛋白和赋形剂。包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的本发明组合物可使用已知的技术来制备以用于预期目的。包含DVP杀昆虫蛋白和赋形剂的组合物的制剂可被配制成还包含粘合剂以促进化合物与表面或其他基材的结合。用于结合的试剂是本领域已知的，并且往往是聚合形式。与纤维、纱线、织物或网相比，适用于待施加到具有特定孔隙率和/或粘合特性的壁表面的组合物的粘合剂的类型将是不同的—因此，基于已知的教导内容，技术人员将基于期望的表面和/或基材选择合适的粘合剂。
典型的粘合剂是聚乙烯醇、改性淀粉、聚乙烯丙烯酸酯、聚丙烯酸、聚乙酸乙烯酯共聚物、聚氨酯和改性植物油。合适的粘合剂可包括衍生自各种聚合物和共聚物以及它们的组合的胶乳分散体。在本发明组合物中用作粘合剂的合适胶乳包括苯乙烯、烷基苯乙烯、异戊二烯、丁二烯、丙烯腈、低级烷基丙烯酸酯、氯乙烯、偏二氯乙烯、低级羧酸和α,β-烯键式不饱和羧酸的乙烯基酯的聚合物和共聚物，包括其中共聚的含有三种或更多种不同单体种类的聚合物，以及硅酮或聚氨酯的后分散悬浮液。同样合适的可以是用于将活性成分粘合到其他表面的聚四氟乙烯(PTFE)聚合物。
在一些实施方案中，表面处理组合物可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，表面处理组合物可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
分散剂
在一些示例性实施方案中，根据本公开的杀昆虫制剂可由DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，以及赋形剂、稀释剂或载体(例如，水)、聚合物粘合剂，和/或附加组分诸如分散剂、聚合剂、乳化剂、增稠剂、醇、香料，或本领域已知的用于制备可喷雾杀昆虫剂的任何其他惰性赋形剂组成。
在一些实施方案中，包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的组合物可被制备成多种不同形式或制剂类型，诸如混悬剂或胶囊混悬剂。并且本领域技术人员可根据特定DVP或DVP杀昆虫蛋白的性质、其用途以及其应用类型来制备相关组合物。例如，在本公开的方法、实施方案和其他方面中使用的DVP或DVP杀昆虫蛋白可被包封在混悬剂或胶囊混悬剂制剂中。包封的DVP或DVP杀昆虫蛋白可提供改善的耐洗牢度，以及更长的活性期。制剂可以是有机基的或水基的，优选水基的。
在一些实施方案中，分散剂可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，分散剂可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
微胶囊化
适用于根据本公开的组合物和方法的微胶囊化DVP或DVP杀昆虫蛋白可用本领域已知的任何合适的技术制备。例如，先前已经开发了用于使材料微囊化的各种方法。这些方法可分为三类：物理方法、相分离和界面反应。在物理方法类别中，微胶囊壁材料和芯颗粒物理地结合在一起，并且壁材料围绕芯颗粒流动以形成微胶囊。在相分离类别中，微胶囊通过将芯材料乳化或分散在不混溶的连续相中而形成，其中壁材料溶解在该连续相中，并且通过例如凝聚作用使壁材料与连续相物理分离，并且沉积在芯颗粒周围。在界面反应类别中，微胶囊通过将芯材料乳化或分散在不混溶的连续相中，然后在芯颗粒的表面引起界面聚合反应而形成。存在于微胶囊中的DVP或DVP杀昆虫蛋白的浓度可在微胶囊重量的0.1％至60％之间变化。
在一些实施方案中，微胶囊化可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，微胶囊化可含有约0.005重量％至约99重量％的量的DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐。
试剂盒、制剂、分散剂及其成分
用于根据本公开的组合物(包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂)、方法、实施方案和其他方面的制剂可通过将所有成分与水混合在一起，并任选地使用合适的混合和/或分散聚集体而形成。通常，此类制剂在10℃至70℃，优选15℃至50℃，更优选20℃至40℃的温度下形成。通常，包含(A)、(B)、(C)和/或(D)中的一者或多者的制剂是可能的，其中可以使用：DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐(作为杀虫剂)(A)；固体聚合物(B)；任选的另外的添加剂(D)；并将它们分散在含水组分(C)中。如果粘合剂存在于本发明的组合物(包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂)中，优选使用聚合物粘合剂(B)在水中的分散体以及以前分别制备的DVP或DVP杀昆虫蛋白(A)在水中的含水制剂。此类单独的制剂可含有用于稳定各制剂中的(A)和/或(B)的额外添加剂，并且是可商购获得的。在第二方法步骤中，加入此类粗制制剂和任选的额外的水(组分(C))。同样，基于前述方案的上述成分的组合也是可能的，例如使用(A)和/或(B)的预形成分散体并将其与固体(A)和/或(B)混合。聚合物粘合剂(B)的分散体可以是化学品制造商已经制造的预制分散体。
此外，使用“手工制备的”分散体，即由最终使用者小规模制备的分散体也在本发明的范围内。这种分散体可通过提供约20％的粘合剂(B)在水中的混合物、将该混合物加热到90℃至100℃的温度并将该混合物强力搅拌数小时来制备。可以将制剂制成最终产品，以便最终使用者可以容易地将其用于根据本发明的方法。并且，当然可以类似地制备浓缩物，其可由最终使用者用额外的水(C)稀释至所需的使用浓度。
在一个实施方案中，适用于SSI应用的组合物(包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂)或涂覆制剂(包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂)含有活性成分和载体诸如水，并且还可含有一种或多种选自分散剂、润湿剂、防冻剂、增稠剂、防腐剂、乳化剂和粘合剂或粘着剂的共配制剂。
在一些实施方案中，DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐的示例性固体制剂通常被研磨至期望的粒度，例如粒度分布d(0.5)通常为3μm至20μm，优选5μm至15μm，尤其是7μm至12μm。
此外，可以将该制剂作为试剂盒运送给最终用户，该试剂盒包含至少第一组分，该第一组分包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐(A)；和包含至少一种聚合物粘合剂(B)的第二组分。其他添加剂(D)可以是试剂盒的第三单独组分，或者可以已经与组分(A)和/或(B)混合。最终使用者可仅通过向试剂盒的组分中加入水(C)并混合来制备供使用的制剂。试剂盒的组分也可以是水中的制剂。当然，可以将一种组分的含水制剂与另一种组分的干燥制剂混合。作为一个示例，该试剂盒可由以下制剂组成：DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐(A)和任选的水(C)的一种制剂；和至少一种聚合物粘合剂(B)、作为组分(C)的水和任选的组分(D)的第二单独制剂。
组分(A)、(B)、(C)和任选的(D)的浓度将由技术人员根据用于涂覆/处理的技术来选择。通常，DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐(A)的量可为基于组合物的重量计至多50重量％，优选1重量％至50重量％，诸如10重量％至40重量％，特别是15重量％至30重量％。聚合物粘合剂(B)的量可为基于组合物的重量计0.01重量％至30重量％，优选0.5重量％至15重量％，更优选1重量％至10重量％，尤其是1重量％至5重量％。如果存在，附加组分(D)的量通常为基于组合物的重量计0.1重量％至20重量％，优选0.5重量％至15重量％。如果存在，颜料和/或染料和/或香料的合适量通常为基于组合物的重量计0.01重量％至5重量％，优选0.1重量％至3重量％，更优选0.2重量％至2重量％。典型的即用型制剂包含0.1重量％至40重量％，优选1重量％至30重量％的组分(A)、(B)和任选的(D)，余量为水(C)。待由最终使用者稀释的浓缩物的典型浓度可包含5重量％至70重量％、优选10重量％至60重量％的组分(A)、(B)和任选的(D)，余量为水(C)。
例示性混合物、组合物、产品和转基因生物体
本公开考虑了含有一种或多种DVP或一种或多种DVP杀昆虫蛋白，或者在转基因生物的情况下表达或以其他方式产生一种或多种DVP或一种或多种DVP杀昆虫蛋白的混合物、组合物、产品和转基因生物体。
在一些实施方案中，该例示性混合物由以下物质组成：(1)DVP或DVP杀昆虫蛋白；或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂(例如，本文所述的赋形剂中的任一种)。
在一些实施方案中，本发明的混合物由以下物质组成：(1)一种或多种DVP，或一种或多种DVP杀昆虫蛋白，或其药学上可接受的盐；和(2)一种或多种赋形剂(例如，本文所述的赋形剂中的任一种)。
在一些实施方案中，本发明的混合物由以下物质组成：(1)一种或多种DVP，或一种或多种DVP杀昆虫蛋白，或其药学上可接受的盐；和(2)一种或多种赋形剂(例如，本文所述的赋形剂中的任一种)；其中上述(1)或(2)中的任一者可同时使用，或顺序使用。
利用DVP或DVP杀昆虫蛋白(如本文所述)的任何组合、混合物、产品、多肽和/或植物可用于防治害虫、它们的生长和/或由它们的作用引起的损害，尤其是它们对植物的损害。
包含DVP或DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的组合物可包括农用化学组合物。例如，在一些实施方案中，农用化学组合物可包括但不限于气溶胶和/或气溶胶化的产品(例如，喷雾剂、熏蒸剂、粉末、粉剂和/或气体)；拌种剂；口服制剂(例如，昆虫食物等)；或(瞬时和/或稳定地)表达和/或产生DVP或DVP杀昆虫蛋白的转基因生物体(例如，细胞、植物或动物)。
在一些实施方案中，本公开的活性成分可以组合物的形式施用，并且可以同时或相继地与其他非活性化合物一起施用于待处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、皂、休眠油、聚合物和/或定时释放或可生物降解的载体制剂，其允许在单次施用该制剂后对靶区域进行长期给药。如果需要，可制备这些非活性化合物中的一种或多种，以及制剂领域常用的其他农业上可接受的载体、表面活性剂或施用促进助剂。合适的载体和助剂可以是固体或者液体，并对应于通常用于配制技术的物质，例如天然或者再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或者肥料。同样，可将这些制剂制备成可食用的“诱饵”或塑造成害虫“陷阱”，以允许靶标害虫摄食或摄取该杀虫制剂。
施用本公开的活性成分或本公开的农用化学组合物的方法包括叶施用、种子包衣和土壤施用，该农用化学组合物由DVP或DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂组成，如通过本公开的本文所述的方法产生的。在一些实施方案中，施用次数和施用速度取决于相应害虫侵扰的强度。
可将包含DVP或DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的组合物配制成粉末、粉剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂、溶液剂等，并且可通过常规方法，例如包含该多肽的细胞培养物的干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备该组合物。在包含至少一种此类杀虫多肽的所有这些组合物中，该多肽可以约1重量％至约99重量％的浓度存在。
在一些实施方案中，可将含有DVP或DVP杀昆虫蛋白(或其药学上可接受的盐)的组合物预防性地施用于环境区域以防止易感害虫(例如，鳞翅目和/或鞘翅目害虫)的侵染，可通过本发明的方法在给定区域杀死这些害虫或减少其数量。在一些实施方案中，害虫摄取或接触杀虫有效量的多肽。
在一些实施方案中，可通过将DVP或DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐转化的细菌、酵母或其他细胞、晶体和/或孢子悬液或分离的蛋白质组分与所需的农业上可接受的载体配制在一起来制备本文所述的杀虫剂组合物。在施用前，可以合适的方法例如冻干、冷冻干燥、干燥，或者在水性载体、介质或合适稀释剂例如盐水和/或其他的缓冲液中配制该组合物。在一些实施方案中，配制的组合物可以为粉尘或颗粒材料的形式，或者在油(植物或矿物油)中的悬浮液的形式，或者水或油/水乳剂的形式，或者作为可湿性粉剂，或者与适合于农业应用的任何其他载体材料相组合。合适的农业载体可以是固体或液体，并且是本领域熟知的。在一些实施方案中，该制剂可与一种或多种固体或液体助剂相混合，并且可通过多种方法来制备，例如通过使用常规配制技术将杀虫组合物与合适的助剂一起均匀地混合、掺合和/或研磨。合适的配制和施用方法描述于美国专利号6,468,523，其公开内容全文以引用方式并入本文。
使用本发明的方法
保护植物、植物部分和种子的方法
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，包括提供表达DVP或编码该DVP的多核苷酸的植物。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，包括提供表达DVP或编码该DVP的多核苷酸的植物，其中所述DVP是如本文所述的DVP。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，该方法包括提供表达DVP或编码DVP的多核苷酸的植物，其中该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:187-191。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，包括提供表达DVP或编码该DVP的多核苷酸的植物，其中该DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:187-191。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，包括提供表达DVP或编码该DVP的多核苷酸的植物，其中该DVP还包含两种或更多种DVP的均聚物或杂聚物，其中每种DVP的氨基酸序列相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，包括提供表达DVP或编码该DVP的多核苷酸的植物，其中该DVP是包含由可切割或不可切割接头分开的两种或更多种DVP的融合蛋白，并且其中每种DVP的氨基酸序列可相同或不同。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，包括提供表达DVP或编码该DVP的多核苷酸的植物，其中该接头在昆虫的肠道或血淋巴内是可切割的。
在一些实施方案中，本发明提供了用于防治昆虫的方法，包括向所述昆虫提供在其基因组中包含稳定掺入的表达盒的转基因植物，其中所述稳定掺入的表达盒包含用于编码DVP的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供了在农艺和/或非农艺应用中防治无脊椎害虫的方法，包括使无脊椎害虫或其环境、固体表面(包括植物表面或其部分)与生物学有效量的一种或多种本发明的DVP，或与DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐接触。
在一些实施方案中，本公开提供了在农艺和/或非农艺应用中防治无脊椎害虫的方法，包括使无脊椎害虫或其环境、固体表面(包括植物表面或其部分)与生物学有效量的包含至少一种本发明的DVP和赋形剂的组合物接触。
防治无脊椎害虫的方法
在一些实施方案中，本公开提供了在农艺和/或非农艺应用中防治无脊椎害虫的方法，包括使无脊椎害虫或其环境、固体表面(包括植物表面或其部分)与生物学有效量的包含至少一种本发明的DVP杀昆虫蛋白和赋形剂的组合物接触。
合适的组合物的示例包括：(1)至少一种本发明的DVP；两种或更多种本发明的DVP；DVP杀昆虫蛋白；两种或更多种DVP杀昆虫蛋白；或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；包括与非活性成分一起配制成以如下形式递送的所述组合物：液体溶液、乳液、粉末、颗粒、纳米颗粒、微粒或它们的组合。
在一些实施方案中，为了实现与本发明的化合物、混合物或组合物接触以保护大田作物免受无脊椎害虫的侵害，通常在种植前将该化合物或组合物施用于作物的种子，施用于作物植物的叶子(例如，叶、茎、花、果实)，或者在种植作物之前或之后施用于土壤或其他生长介质。
接触方法的一个实施方案是通过喷涂。另选地，可将包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的颗粒组合物施用于植物叶子或土壤。本发明的化合物还可通过植物吸收有效地递送，方法是通过使植物与包含本发明化合物的组合物接触，该组合物作为浸壤液体制剂、对土壤的颗粒制剂、育苗箱处理剂或移栽浸渍剂施用。值得注意的是本公开组合物的形式为浸壤液体制剂。还值得注意的是用于防治无脊椎害虫的方法，该方法包括使该无脊椎害虫或其环境与生物有效量的DVP或DVP杀昆虫蛋白接触。还值得注意的是，在一些例示性实施方案中，该例示性方法考虑土壤环境，其中该组合物作为浸壤制剂施用至该土壤。还值得注意的是，DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐也通过局部施用到侵染场所而有效。其他接触方法包括通过以下方式施用本发明的化合物或组合物：直接喷施和滞留喷施、空气喷施、凝胶、种子包衣、微胶囊化、全身摄入、诱饵、耳标、大丸剂、喷雾器、熏剂、气溶胶、粉剂，以及许多其他方式。接触方法的一个实施方案是包含本发明的化合物或组合物、尺寸上稳定的肥料颗粒、棒或片剂。本发明的化合物也可浸渍到用于制造无脊椎动物防治装置的材料中(例如，昆虫网、施用到衣服上、施用到蜡烛制剂中等)。
在一些实施方案中，DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐也可用于种子处理以保护种子免受无脊椎害虫的侵害。在本公开内容和权利要求的上下文中，处理种子是指用生物学有效量的DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐接触种子，其通常被配制为本发明的组合物。这种种子处理保护种子免受土壤无脊椎害虫的侵害，并且通常还可保护从发芽的种子发育而来的幼苗的根和与土壤接触的其他植物部分。种子处理也可通过DVP或DVP杀昆虫蛋白在发育中的植物中的迁移提供叶子的保护。种子处理可应用于所有类型的种子，包括那些通过遗传转化表达特殊性状的植物将发芽的种子。此外，在一些实施方案中，DVP或DVP杀昆虫蛋白可转化入植物或其部分，例如植物细胞或植物种子，其已经用表达除草剂抗性的蛋白质诸如提供对草甘膦的抗性的草甘膦乙酰转移酶转化。
一种种子处理方法是在播种种子之前，用DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐(即，作为包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和赋形剂的配制的组合物或混合物)喷洒或撒粉种子。配制用于种子处理的组合物通常由DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和成膜剂或粘合剂组成。因此，本发明的种子包衣组合物通常由生物学有效量的DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐和成膜剂或粘合剂组成。种子可通过以下方式来包衣：将可流动的混悬浓缩剂直接喷施到种子的滚床中，然后干燥该种子。另选地，可将诸如润湿的散剂、溶液剂、悬乳剂、水中的可乳化浓缩剂和乳剂的其他制剂类型喷施到种子上。这种工艺尤其可用于将膜包衣施加到种子。各种包衣机器和工艺是可供本领域的技术人员使用的。合适的工艺包括在P.Kosters等人，Seed Treatment:Progress andProspects，1994BCPC Monograph No.57，以及其中列出的参考文献中列出的那些工艺，其公开内容全文以引用方式并入本文。
经处理的种子通常包含DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，其量的范围为每100kg种子约0.01g至1kg(即，处理前种子的约0.00001重量％至1重量％)。配制用于种子处理的可流动的混悬剂通常包含约0.5％至约70％的活性成分、约0.5％至约30％的成膜粘合剂、约0.5％至约20％的分散剂、0％至约5％的增稠剂、0％至约5％的颜料和/或染料、0％至约2％的消泡剂、0％至约1％的防腐剂以及0％至约75％的挥发性液体稀释剂。
使用组合物的方法
在一些实施方案中，本发明提供了使用混合物的方法，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；以防治昆虫，其中该DVP选自本文所述的DVP中的一种或任何组合，例如，针对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的DVP，所述DVP包含与根据式(I)的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐；其中所述方法包括制备混合物，然后将所述混合物施用于昆虫所在处。
在一些实施方案中，本发明提供了使用混合物防治昆虫的方法，所述混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐，和(2)赋形剂；其中所述昆虫选自：AchemaSphinx Moth(天蛾幼虫)(Eumorpha achemon)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶(Coliaseurytheme))；粉斑螟蛾(Caudra cautella)；Amorbia Moth(Amorbia humerosana)；粘虫(灰翅夜蛾属(Spodoptera)物种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、棉贪夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactyla)；杜鹃花毛虫(Datana major)；结草虫(常绿树蓑蛾(Thyridopteryx ephemeraeformis))；香蕉蛾(木豹蛾(Hypercompe scribonia))；香蕉弄蝶(Erionota thrax)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana))；加州槲蛾(Phryganidia californica)；春尺蠖(Paleacrita merriccata)；Cherry Fruitworm(樱小食心虫(Grapholita packardi))；China Mark Moth(圹水螟(Nymphula stagnata))；柑橘地老虎(柑橘夜蛾(Xylomyges curialis))；苹果蠹蛾(苹果小卷蛾(Cydia pomonella))；蔓越莓果虫(越橘蜂斑螟(Acrobasis vaccinii))；十字条纹菜青虫(卷心菜薄翅野螟(Evergestis rimosalis))；地老虎(夜蛾科(Noctuid)物种、小地老虎(Agrotisipsilon))；道格拉斯冷杉毒蛾(枞树毒蛾(Orgyia pseudotsugata))；Ello Moth(天蛾幼虫)(木薯天蛾(Erinnyis ello))；榆树尺蠖(榆秋黄尺蛾(Ennomos subsignaria))；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana))；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(Thymelicuslineola)；Essex Skipper；秋幕毛虫(Melissopus latiferreanus)；Filbert Leafroller(蔷薇黄卷蛾(Archips rosanus))；果树卷叶蛾(果树黄卷蛾(Archips argyrospilia))；葡萄浆果蛾(Paralobesia viteana)；荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)；葡萄叶雕叶虫(葡萄烟翅蛾(Harrisina americana))(仅地栽)；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)；Greenstriped Mapleworm(玫瑰栎蚕蛾(Dryocampa rubicunda))；Gummosos-Batrachedracomosae(Hodges)；舞毒蛾(Lymantria dispar)；铁杉尺蠖(东方铁杉尺蠖(Lambdinafiscellaria))；天蛾幼虫(烟草天蛾属(Manduca)物种)；菜粉蝶(Pieris rapae)；玉米天蚕蛾(玉米尺蚕蛾(Automeris io))；贾克松色卷蛾(Choristoneura pinus)；苹果浅褐卷叶蛾(苹淡褐卷蛾(Epiphyas postvittana))；瓜虫(甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata))；合欢巢蛾(含羞草雕蛾(Homadaula anisocentra))；斜纹卷叶虫(蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana))；夹竹桃蛾(夹竹桃蛾幼虫(Syntomeida epilais))；杂食性卷叶蛾(Playnota stultana)；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata)；柑桔凤蝶(大黄带凤蝶(Papilio cresphontes))；桔卷叶蛾(桔带卷蛾(Argyrotaenia citrana))；梨小食心虫(东方果蛾(Grapholita molesta))；桃条麦蛾(桃枝麦蛾(Anarsia lineatella))；松蝴蝶(娆粉蝶(Neophasia menapia))；豆荚虫；红带卷叶蛾(红带卷蛾(Argyrotaeniavelutinana))；红疣天社蛾(Schizura concinna)；Rindworm Complex；鞍背刺蛾毛虫(鞍背毛虫(Sibine stimulea))；鞍突毛虫(鞍背天社蛾(Heterocampa guttivitta))；盐沼毛虫(盐泽灯蛾(Estigmene acrea))；草地螟(草螟属(Crambus)物种)；尺蠖(榆秋黄尺蠖(Ennomos subsignaria))；秋星尺蠖(秋尺蠖(Alsophila pometaria))；云杉卷叶蛾(云杉色卷蛾(Choristoneura fumiferana))；天幕毛虫(各种枯叶蛾(Lasiocampidae))；萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶(Thecla basilides))；烟草天蛾(Manduca sexta)；烟草灰绿斑蛾(烟草粉螟(Ephestia elutella))；Tufted Apple Budmoth(簇生苹果芽蛾(Platynotaidaeusalis))；桃条麦蛾(桃枝麦蛾(Anarsia lineatella))；豆杂色夜蛾(疆夜蛾(Peridroma saucia))；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana)；黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)；胡桃毛虫(Datana integerrima)；结网毛虫(美国白蛾(Hyphantriacunea))；西部栎柳毒蛾(老古毒蛾(Orgyia vetusta))；南方玉米螟(Diatraeacrambidoides)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；桔根象甲；草莓根象甲；美核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘蔗犀金龟；咖啡果小蠹；一年生蓝草象鼻虫(Listronotus maculicollis)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟(Maladera castanea))；欧洲金龟子(Rhizotroqus majalis)；绿花金龟(绿六月花金龟(Cotinis nitida))；日本金龟子(日本弧丽金龟(Popillia japonica))；五月或六月甲虫(六月鳃角金龟属(Phyllophaga)物种)；圆头犀金龟(北方圆头犀金龟(Cyclocephalaborealis))；东方丽金龟(Anomala orientalis)；南方蒙面金龟子(南方圆头犀金龟(Cyclocephala lurida))；谷象(象甲总科(Curculionoidea))；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)；水稻二化螟(Chilo suppressalis)；尖音库蚊(Culex pipiens)；致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)；小蔗螟(Diatraeasaccharalis)；棉铃虫(Helicoverpa armigera)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)；绿棉铃虫(Heliothis virescens)；马铃薯甲虫；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)；玉米螟(Ostrinia nubilalis)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)；印度谷螟(Plodiainterpunctella)；吊丝虫(Plutella xylostella)；大豆尺夜蛾(Pseudoplusiaincludens)；玉米夜蛾(Spodoptera exigua)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；和/或榆叶甲(Xanthogaleruca luteola)。
在一些实施方案中，本发明提供了保护植物免受昆虫侵害的方法，包括提供表达一种或多种DVP或编码该一种或多种DVP的多核苷酸的植物。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括施用杀虫有效量的混合物，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该DVP选自本文所述的DVP中的一种或任何组合，例如，杀昆虫Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a变体多肽(DVP)，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐；其中将该混合物施用于害虫所在处，或施用至易受害虫侵袭的植物或动物。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括施用杀虫有效量的混合物，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该DVP具有与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐；其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括施用杀虫有效量的混合物，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括施用杀虫有效量的混合物，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括施用杀虫有效量的混合物，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括施用杀虫有效量的混合物，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括施用杀虫有效量的混合物，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括施用杀虫有效量的混合物，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括施用杀虫有效量的混合物，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:213或217-219。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括施用杀虫有效量的混合物，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:213或217-219。
在一些实施方案中，本发明提供了一种对抗、防治或抑制害虫的方法，该方法包括将杀虫有效量的混合物施用到害虫所在处，该混合物包含：(1)DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐；和(2)赋形剂；其中该害虫选自：Achema Sphinx Moth(天蛾幼虫)(Eumorpha achemon)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme))；粉斑螟蛾(Caudracautella)；Amorbia Moth(Amorbia humerosana)；粘虫(灰翅夜蛾属(Spodoptera)物种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、棉贪夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactyla)；杜鹃花毛虫(Datana major)；结草虫(常绿树蓑蛾(Thyridopteryx ephemeraeformis))；香蕉蛾(木豹蛾(Hypercompe scribonia))；香蕉弄蝶(Erionota thrax)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana))；加州槲蛾(Phryganidia californica)；春尺蠖(Paleacrita merriccata)；Cherry Fruitworm(樱小食心虫(Grapholita packardi))；China Mark Moth(圹水螟(Nymphula stagnata))；柑橘地老虎(柑橘夜蛾(Xylomygescurialis))；苹果蠹蛾(苹果小卷蛾(Cydia pomonella))；蔓越莓果虫(越橘蜂斑螟(Acrobasis vaccinii))；十字条纹菜青虫(卷心菜薄翅野螟(Evergestis rimosalis))；地老虎(夜蛾科(Noctuid)物种、小地老虎(Agrotis ipsilon))；道格拉斯冷杉毒蛾(枞树毒蛾(Orgyia pseudotsugata))；Ello Moth(天蛾幼虫)(木薯天蛾(Erinnyis ello))；榆树尺蠖(榆秋黄尺蛾(Ennomos subsignaria))；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小卷蛾(Lobesiabotrana))；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(Thymelicus lineola)；Essex Skipper；秋幕毛虫(Melissopus latiferreanus)；Filbert Leafroller(蔷薇黄卷蛾(Archips rosanus))；果树卷叶蛾(果树黄卷蛾(Archips argyrospilia))；葡萄浆果蛾(Paralobesia viteana)；荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)；葡萄叶雕叶虫(葡萄烟翅蛾(Harrisinaamericana))(仅地栽)；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)；Greenstriped Mapleworm(玫瑰栎蚕蛾(Dryocampa rubicunda))；Gummosos-Batrachedra comosae(Hodges)；舞毒蛾(Lymantria dispar)；铁杉尺蠖(东方铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria))；天蛾幼虫(烟草天蛾属(Manduca)物种)；菜粉蝶(Pieris rapae)；玉米天蚕蛾(玉米尺蚕蛾(Automerisio))；贾克松色卷蛾(Choristoneura pinus)；苹果浅褐卷叶蛾(苹淡褐卷蛾(Epiphyaspostvittana))；瓜虫(甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata))；合欢巢蛾(含羞草雕蛾(Homadaula anisocentra))；斜纹卷叶虫(蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana))；夹竹桃蛾(夹竹桃蛾幼虫(Syntomeida epilais))；杂食性卷叶蛾(Playnota stultana)；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata)；柑桔凤蝶(大黄带凤蝶(Papilio cresphontes))；桔卷叶蛾(桔带卷蛾(Argyrotaenia citrana))；梨小食心虫(东方果蛾(Grapholita molesta))；桃条麦蛾(桃枝麦蛾(Anarsia lineatella))；松蝴蝶(娆粉蝶(Neophasia menapia))；豆荚虫；红带卷叶蛾(红带卷蛾(Argyrotaenia velutinana))；红疣天社蛾(Schizuraconcinna)；Rindworm Complex；鞍背刺蛾毛虫(鞍背毛虫(Sibine stimulea))；鞍突毛虫(鞍背天社蛾(Heterocampa guttivitta))；盐沼毛虫(盐泽灯蛾(Estigmene acrea))；草地螟(草螟属(Crambus)物种)；尺蠖(榆秋黄尺蠖(Ennomos subsignaria))；秋星尺蠖(秋尺蠖(Alsophila pometaria))；云杉卷叶蛾(云杉色卷蛾(Choristoneura fumiferana))；天幕毛虫(各种枯叶蛾(Lasiocampidae))；萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶(Thecla basilides))；烟草天蛾(Manduca sexta)；烟草灰绿斑蛾(烟草粉螟(Ephestia elutella))；TuftedApple Budmoth(簇生苹果芽蛾(Platynota idaeusalis))；桃条麦蛾(桃枝麦蛾(Anarsialineatella))；豆杂色夜蛾(疆夜蛾(Peridroma saucia))；杂色卷叶蛾(Platynotaflavedana)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)；胡桃毛虫(Datana integerrima)；结网毛虫(美国白蛾(Hyphantria cunea))；西部栎柳毒蛾(老古毒蛾(Orgyia vetusta))；南方玉米螟(Diatraea crambidoides)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；桔根象甲；草莓根象甲；美核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘蔗犀金龟；咖啡果小蠹；一年生蓝草象鼻虫(Listronotus maculicollis)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟(Maladera castanea))；欧洲金龟子(Rhizotroqus majalis)；绿花金龟(绿六月花金龟(Cotinis nitida))；日本金龟子(日本弧丽金龟(Popillia japonica))；五月或六月甲虫(六月鳃角金龟属(Phyllophaga)物种)；圆头犀金龟(北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis))；东方丽金龟(Anomala orientalis)；南方蒙面金龟子(南方圆头犀金龟(Cyclocephala lurida))；谷象(象甲总科(Curculionoidea))；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)；水稻二化螟(Chilo suppressalis)；尖音库蚊(Culexpipiens)；致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)；小蔗螟(Diatraea saccharalis)；棉铃虫(Helicoverpa armigera)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)；绿棉铃虫(Heliothis virescens)；马铃薯甲虫；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)；玉米螟(Ostrinia nubilalis)；棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)；印度谷螟(Plodia interpunctella)；吊丝虫(Plutella xylostella)；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)；玉米夜蛾(Spodoptera exigua)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；和/或榆叶甲(Xanthogaleruca luteola)。
作物和害虫
可通过这些方法防治的具体作物害虫和昆虫包括以下：网翅目(Dictyoptera)(蟑螂)；等翅目(Isoptera)(白蚁)；直翅目(Orthoptera)(蝗虫、草蜢和蟋蟀)；双翅目(普通家蝇、蚊子、采采蝇、大蚊和果蝇)；膜翅目(Hymenoptera)(蚂蚁、黄蜂、蜜蜂、锯蝇、姬蜂和瘿蜂)；虱目(Anoplura)(咬虱和吸血虱)；蚤目(Siphonaptera)(蚤)；和半翅目(臭虫和蚜虫)，以及蛛形纲诸如蜱螨(蜱和螨)，和这些生物体各自藏匿的寄生虫。
“害虫”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。
昆虫害虫包括但不限于选自鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目(Dermaptera)、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目(Trichoptera)等的昆虫。更特别地，昆虫害虫包括鞘翅目、鳞翅目和双翅目。
用杀昆虫多肽处理的具有合适的农业、家庭和/或医学/兽医重要性的昆虫包括但不限于下列类别和目的成员：
鞘翅目包括肉食亚目(Adephaga)和多食亚目(Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)。多食亚目包括水龟虫总科(Hydrophiloidea)、隐翅虫总科(Staphylinoidea)、菊虎总科(Cantharoidea)、郭公虫总科(Cleroidea)、叩头虫总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科(Byrrhoidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、芫菁总科(Meloidea)、花蚤总科(Mordelloidea)、拟步总科(Tenebrionoidea)、长蠹虫总科(Bostrichoidea)、金龟总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)和象虫总科。步甲总科包括虎甲科(Cicindelidae)、步行虫科(Carabidae)和龙虱科(Dytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(Gyrinidae)。水龟虫总科包括水龟虫科。隐翅虫总科包括葬甲科(Silphidae)和隐翅虫科。菊虎总科包括花萤科(Cantharidae)和萤科(Lampyridae)。郭公虫总科包括郭公虫科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩头虫总科包括叩头虫科(Elateridae)和吉丁虫科(Buprestidae)。扁甲总科包括瓢虫科(Coccinellidae)。芫菁总科包括芫菁科。拟步总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜣科(Passalidae)和金龟子科(Scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科。象虫总科包括象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。
鞘翅目(Coleoptera)的示例包括但不限于：美国大象豆(菜豆象(Acanthoscelides obtectus))、叶甲虫(Agelastica alni)、叩甲(叩头虫(Agrioteslineatus)、黑叩头虫(Agriotes obscurus)、二色叩甲(Agriotes bicolor))、谷物甲虫(米扁虫(Ahasverus advena))、六月金龟子(马铃薯鳃金龟(Amphimallon solstitialis))、家具甲虫(家具窃蠹(Anobium punctatum)、山楂花象(Anthonomus)物种(象鼻虫))、小舌甘菜甲虫(舌甘菜隐食甲(Atomaria linearis))、地毯甲虫(圆皮蠹属(Anthrenus)物种、Attagenus物种)、豇豆象(四纹豆象(Callosobruchus maculates))、油炸水果甲虫(thefried fruit beetle)(酱曲露尾甲(Carpophilus hemipterus))、卷心菜豆荚象甲(白菜籽龟象(Ceutorhynchus assimilis))、油菜冬茎象甲(Ceutorhynchus picitarsis)、金针虫(烟草金针虫(Conoderus vespertinus)、Conoderus falli)、香蕉蛀茎象甲(香蕉根颈象甲(Cosmopolites sordidus))、新西兰草蛴螬(褐新西兰肋翅鳃角金龟(Costelytrazealandica))、六月金龟(绿花金龟(Cotinis nitida))、向日葵茎象甲(密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus))、红带皮蠹(火腿皮蠹(Dermestes lardarius))、玉米根虫(玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)、美洲玉米根虫(Diabrotica virgiferavirgifera)和巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi))、墨西哥瓢虫(墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis))、家天牛(Hylotropes bajulus)、苜蓿象鼻虫(紫苜蓿叶象(Hypera postica))、闪亮的蜘蛛甲虫(裸蛛甲(Gibbium psylloides))、烟草窃蠹(烟草甲(Lasioderma serricorne))、科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯甲虫)、中华粉蠹甲虫(中华粉蠹(Lyctus)物种)、露尾甲(油菜花露尾甲(Meligethes aeneus))、普通金龟子(大栗鳃金龟(Melolontha melolontha))、美洲蜘蛛甲虫(美洲蜘蛛甲(Mezium americanum))、金黄蛛甲(黄蛛甲(Niptus hololeucus))、谷物甲虫(苏里南锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)和大眼锯谷盗(Oryzaephilus mercator))、葡萄黑象甲(葡萄黑耳喙象(Otiorhynchussulcatus))、芥末甲虫(辣根猿叶甲(Phaedon cochleariae))、十字花科跳蚤甲虫(蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae))、黄曲条菜跳甲(黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata))、卷心菜蒸跳蚤甲虫(白菜茎跳甲(Psylliodes mchrysocephala)、标本虫(Ptinus)物种(蛛甲))、谷蠹(米长蠹(borer Rhizopertha dominica))、豌豆和象鼻虫(条纹根瘤象(Sitona lineatus))、稻谷甲虫(米象(Sitophilus oryzae)和谷象(Sitophilusgranaries))、红葵花籽象甲(向日葵红色种子象(Smicronyx fulvus))、窃蠹(药材甲(Stegobium paniceum))、黄粉虫甲虫(黄粉虫(Tenebrio molitor))、面粉甲虫(赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和杂拟谷盗(Tribolium confusum))、仓库和橱柜甲虫(斑皮蠹属(Trogoderma)物种)和向日葵甲虫(向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis))。
革翅目(Dermaptera)(蠼螋)的示例包括但不限于：欧洲蠼螋、普通蠼螋(Forficula auricularia)和条纹蠼螋、溪岸蠼螋(Labidura riparia)。
网翅目(Dictvontera)的示例包括但不限于：东方蟑螂(东方蜚蠊(Blattaorientalis))、德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))、马德拉蟑螂(马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae))、美洲蟑螂(美洲大蠊(Periplaneta americana))和烟黑蟑螂(黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa))。
Diplonoda的示例包括但不限于：斑点蛇千足虫(具斑马陆(Blaniulusguttulatus))、山蛩虫(Brachydesmus superus)和温室千足虫(温室马陆(Oxidusgracilis))。
双翅目包括长角亚目(Nematocera)、角亚目(Brachycera)和环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和瘿蚊科(Cecidomyiidae)。角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括分类无缝组(Aschiza)和无缝组。分类无缝组包括蚤蝇科(Phoridae)、食蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。分类无缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)和果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)和麻蝇科(Sarcophagidae)。
双翅目(Diptera)的示例包括但不限于：家蝇(普通家蝇)、盾波蝇(噬人瘤蝇(Cordylobia anthropophaga))、吸血蠓(库蠓(Culicoides)物种)、蜂虱蝇(蜂虱(Braula)物种)、甜菜潜叶花蝇(甜菜潜叶蝇(Pegomyia betae))、黑蝇(克蚋属(Cnephia)物种、真蚋属(Eusimulium)物种、蚋属(Simulium)物种)、马蝇(黄蝇属(Cuterebra)物种、胃蝇属(Gastrophilus)物种、狂蝇属(Oestrus)物种)、大蚊(大蚊属(Tipula)物种)、眼虫(潜蝇属(Hippelates)物种)、滋生污秽的苍蝇(丽蝇属(Calliphora)物种、厕蝇属(Fannia)物种、扁角水虻属(Hermetia)物种、丝光绿蝇属(Lucilia)物种、蝇属(Musca)物种、腐蝇属(Muscina)物种、绿蝇属(Phaenicia)物种、伏蝇属(Phormia)物种)、食肉蝇(麻蝇属(Sarcophaga)物种、污蝇属(Wohlfahrtia)物种)；麦秆蝇(黑麦秆蝇(Oscinella frit))、果蝇(Dacus物种、果蝇属(Drosophila)物种)、head and canon蝇(Hydrotea物种)、小麦瘿蚊(黑森瘿蚊(Mayetiola destructor))、牛角水牛蝇(黑角蝇属(Haematobia)物种)、马鹿蝇(斑虻属(Chrysops)物种、麻虻属(Haematopota)物种、虻属(Tabanus)物种)、虱蝇(羊虱蝇属(Lipoptena)物种、拟虱蝇属(Lynchia)物种和伪沼虱蝇属(Pseudolynchia)物种)、地中海果蝇(Ceratitus物种)、蚊子(伊蚊属(Aedes)物种、按蚊属(Anopheles)物种、库蚊属(Culex)物种、鳞蚊属(Psorophora)物种)、白蛉(白蛉属(Phlebotomus)物种、罗蛉属(Lutzomyia)物种)、锥蝇(蛆症金蝇(Chtysomya bezziana)和螺旋锥蝇(Cochliomyiahominivorax))、羊虱蝇(蜱蝇属(Melophagus)物种)；稳蝇(螫蝇属(Stomoxys)物种)、舌蝇(舌蝇属(Glossina)物种)和牛皮蝇(皮下蝇属(Hypoderma)物种)。
等翅目(Isontera)(白蚁)的示例包括但不限于：来自Hodotennitidae、木白蚁科、澳白蚁科、Rhinotennitidae、齿白蚁科、白蚁科和原白蚁科的物种。
半翅目(Heteroptera)的示例包括但不限于：臭虫(温带臭虫(Cimexlectularius))、棉红蝽(Dysdercus intermedius)、Sunn pest(麦扁盾蝽(Eurygasterintegriceps))、牧草盲椿(美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris))、喜绿蝽(黑须稻绿蝽(Nezara antennata))、南方绿椿象(稻绿蝽(Nezara viridula))和锥蝽(大锥蝽(Panstrogylus megistus)、Rhodnius ecuadoriensis、Rhodnius pallescans、长红锥蝽(Rhodnius prolixus)、Rhodnius robustus、二分锥蝽(Triatoma dimidiata)、骚扰锥蝽(Triatoma infestans)和泥色锥蝽(Triatoma sordida))。
同翅目(Homoptera)的示例包括但不限于：红圆蚧(肾圆盾蚧(Aonidiellaaurantii))、豆蚜(蚕豆蚜(Aphis fabae))、棉蚜或瓜蚜(瓜蚜(Aphis gossypii))、苹蚜(苹果蚜(Aphis pomi))、桔刺粉虱(茶园黑刺粉虱(Aleurocanthus spiniferus))、夹竹桃圆蚧(常春藤圆盾蚧(Aspidiotus hederae))、甘薯粉虱(烟粉虱(Bemesia tabaci))、菜蚜(甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae))、梨黄木虱(梨木虱(Cacopsylla pyricola))、茶藨毛蚜(Cryptomyzus ribis)、葡萄根瘤蚜(根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae))、桔木虱(柑橘木虱(Diaphorina citri))、马铃薯微叶蝉(马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae))、蚕豆微叶蝉(茄微叶蝉(Empoasca solana))、藤蔓叶蝉(假眼小绿叶蝉(Empoasca vitis))、绵蚜(苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum))、欧洲水果蚧(Eulecanium corni)、梅大尾蚜(桃大尾蚜(Hyalopterus arundinis))、小褐飞虱(灰飞虱(Laodelphax striatellus))、马铃薯蚜(马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae))、绿桃蚜(桃蚜(Myzus persicae))、黑尾叶蝉(水稻黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps))、稻褐飞虱(褐飞虱(Nilaparvata lugens))、成瘿蚜虫(天疱疮(Pemphigus)物种)、蛇麻疣额蚜(指头蚜(Phorodon humuli))、鸟樱桃蚜(禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi))、茶褐圆蚧(榄珠蜡蚧(Saissetia oleae))、麦二岔蚜(麦二叉蚜(Schizaphis graminum))、燕麦长管蚜(麦长管蚜(Sitobion avenae))和温室白粉虱(温室粉虱(Trialeurodes vaporariorum))。
等足目(Isopoda)的示例包括但不限于：西瓜虫(普通卷甲虫(Armadillidiumvulgare))和普通土虱(栉潮虫(Oniscus asellus))。
鳞翅目包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、尺蠖娥科(Geometridae)、灯蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾科(Tineidae)。
鳞翅目(Lepidoptera)的示例包括但不限于：苹果小卷蛾(Adoxophyes orana)(棉褐带卷蛾)、小地老虎(Agrotis ipsolon)(小地蚕)、果黄卷蛾(Archips podana)(果树卷蛾)、梨角折蛾(Bucculatrix pyrivorella)(pear leafminer)、棉叶穿孔潜蛾(Bucculatrix thurberiella)(棉叶潜蛾)、松树尺蠖(Bupalus piniarius)(pinelooper)、苹果蠹蛾(Carpocapsa pomonella)(苹果小卷蛾)、水稻二化螟(Chilosuppressalis)(二化螟)、云杉蚜虫(Choristoneura fumiferana)(东方云杉芽虫)、向日葵细卷叶蛾(Cochylis hospes)(带纹向日葵蛾)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)(巨腐玉米螟)、Earls insulana(埃及棉铃虫)、地中海面螟(Euphestia kuehniella)(地中海粉蛾)、环针单纹卷蛾(Eupoecilia ambiguella)(欧洲葡萄浆果蛾)、褐尾蠹(Euproctischrysorrhoea)(棕尾毒蛾)、东方毒蛾(Euproctis subflava)(柿黄青蛾)、蜡螟(Galleriamellonella)(大蜡螟)、棉铃虫(棉花暝蛉)、美洲棉铃虫(棉铃虫)、绿棉铃虫(烟青虫)、褐家蛾(Hofmannophila pseudopretella)(褐织叶蛾)、向日葵斑螟(Homeosoma electellum)(向日葵螟)、茶长卷蛾(Homona magnanima)(茶长卷叶蛾)、斑幕潜叶细蛾(Lithocolletisblancardella)(斑叶潜蝇)、华夏舞毒蛾(Lymantria dispar)(舞毒蛾)、枯叶蛾(Malacosoma neustria)(天幕毛虫)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)(菜夜蛾)、蓓带夜蛾(Mamestra configurata)(披肩粘虫)、天蛾幼虫烟草天蛾(Manduca sexta)和番茄天蛾(Manuduca quinquemaculata)、冬尺蛾(Operophtera brumata)(冬尺蠖)、玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲玉米螟)、小眼夜蛾(Panolis flammea)(松夜蛾)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)(红铃虫)、柑橘潜叶蛾(Phyllocnistis citrella)(桔细潜蛾)、欧洲粉蝶(Pieris brassicae)(菜粉蝶)、吊丝虫(Plutella xylostella)(小菜蛾)、Rachiplusia ni(大豆夜蛾)、弗吉尼亚虎蛾(Spilosoma virginica)(黄色飞蛾)、玉米夜蛾(Spodoptera exigua)(甜菜夜蛾)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(秋夜蛾)、海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)(斜纹夜蛾)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)(黄地老虎)、Spodoptera praefica(黄条行军虫)、棉大卷叶螟(Sylepta derogata)(棉卷叶暝)、衣蛾(Tineola bisselliella)(负袋夜蛾)、袋衣蛾(Tineola pellionella)(袋谷蛾)、栎绿卷蛾(Tortrix viridana)(欧洲栎绿卷叶蛾)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(菜尺蛾)和苹果巢蛾(Yponomeuta padella)(巢蛾)。
直翅目(Orthoptera)的示例包括但不限于：普通蟋蟀(家蟋蟀(Achetadomesticus))、树蝗虫(树蝗(Anacridium)物种)、飞蝗(亚洲飞蝗(Locusta migratoria))、双条纹蚱蜢(双带黑蝗(Melanoplus bivittatus))、长额负蝗(Melanoplusdfferentialis)、红腿蚱蜢(红腿蝗(Melanoplus femurrubrum))、迁徙蚱蜢(黑蝗(Melanoplus sanguinipes))、北方蝼蛄(六指蝼蛄(Neocurtilla hexadectyla))、红蝗虫(红翅蝗(Nomadacris septemfasciata))、短翅蝼蛄(Scapteriscus abbreviatus)、南美蝼蛄(南方蝼蛄(Scapteriscus borellii))、黄褐色蝼蛄(西印度蝼蛄(Scapteriscusvicinus))和沙漠蝗(沙漠蝗虫(Schistocerca gregaria))。
虱目(Phthiraptera)的示例包括但不限于：牛羽虱(牛毛虱(Bovicola bovis))、咬虱(畜虱属(Damalinia)物种)、猫羽虱(猫虱(Felicola subrostrata))、短鼻牛虱(牛血虱(Haematopinus eloysternus))、尾车专换虱(Haematopinus quadriperiussus)、猪虱(猪血虱(Haematopinus suis))、面虱(绵羊颚虱(Linognathus ovillus))、足虱(羊足颚虱(Linognathus pedalis))、狗吸血虱(棘颚虱(Linognathus setosus))、犊长颚虱(长鼻牛虱(Linognathus vituli))、雏鸡羽虱(鸡体虱(Menacanthus stramineus))、羽虱(鸡羽虱(Menopon gallinae))、体虱(人虱(Pediculus humanus))、阴虱(八角虫(Phthiruspubis))、牛管虱(水牛盲虱(Solenopotes capillatus))和狗啮毛虱(犬啮毛虱(Trichodectes canis))。
啮虫目(Psocoptera)的示例包括但不限于：书虱(嗜卷书虱(Liposcelisbostrychophila)、无色书虱(Liposcelis decolor)、嗜虫书虱(Liposcelis entomophila)和尘虱(Trogium pulsatorium))。蚤目的示例包括但不限于：禽蚤(鸟蚤(Ceratophyllusgallinae))、狗蚤(犬栉头蚤(Ctenocephalides canis))、猫栉头蚤(猫蚤(Ctenocephalides fells))、人蚤(扰蚤(Pulex irritans))和东方鼠蚤(印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis))。
综合纲(Symphyla)的示例包括但不限于：花园综合虫(洁幺蚰(Scutigerellaimmaculate))。
缨尾目(Thysanura)的示例包括但不限于：灰银鱼(灰衣鱼(Ctenolepismalongicaudata))、四线衣鱼(Ctenolepisma quadriseriata)、普通银鱼(蠹鱼(Lepismasaccharina))和家衣鱼(Thennobia domestica)；
缨翅目(Thysanoptera)的示例包括但不限于：烟草褐蓟马(烟草蓟马(Frankliniella fusca))、花蓟马(水稻花蓟马(Frankliniella intonsa))、西方花蓟马(西花蓟马(Frankliniella occidentalis))、棉芽蓟马(梳缺花蓟马(Frankliniellaschultzei))、温室条蓟马(温室蓟马(Hercinothrips femoralis))、大豆蓟马(Neohydatothrips variabilis)、凯利柑橘蓟马(柑橘蓟马(Pezothrips kellyanus))、鳄梨蓟马(Scirtothrips perseae)、瓜蓟马(棕榈蓟马(Thrips palmi))和棉蓟马(烟蓟马(Thrips tabaci))。
线虫(Nematodes)的示例包括但不限于：寄生线虫，诸如根结线虫、孢囊线虫和病变线虫，包括线虫属(Heterodera)物种、根结线虫属(Meloidogyne)物种和球形胞囊线虫属(Globodera)物种；特别是孢囊线虫的成员，包括但不限于：大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines)(大豆异皮线虫)；甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)；禾谷胞囊线虫(Heterodera avenae)(燕麦胞囊线虫)；和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯孢囊线虫)。病变线虫包括但不限于：短体线虫属(Pratylenchus)物种。
对本发明敏感的其他昆虫物种包括：引起公众和动物健康问题的节肢动物害虫，例如蚊子，例如来自伊蚊属、按蚊属和库蚊属的蚊子，来自蜱、蚤和蝇等的蚊子。
在一个实施方案中，DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于治疗体外寄生物。体外寄生物包括但不限于：蚤、蜱、疥螨、螨、蚊子、讨厌的咬人苍蝇、虱和包含前述体外寄生物中的一种或多种的组合。术语“蚤”包括蚤目的寄生蚤的常见或偶然种，并且特别是栉头蚤属(Ctenocephalides)类，特别是猫蚤(C.fells)、犬栉头蚤、鼠蚤(印鼠客蚤)和人蚤(扰蚤(Pulex irritans))。
本发明可用于防治、抑制和/或杀灭主要作物的昆虫害虫，例如，在一些实施方案中，主要作物和对应的昆虫害虫包括但不限于：玉蜀黍：玉米螟(Ostrinia nubilalis)欧洲玉米螟；小地老虎(Agrotis ipsilon)小地蚕；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)玉米穗虫；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)秋夜蛾；西南玉米螟(Diatraea grandiosella)巨腐玉米螟；小玉米螟(Elasmopalpus lignosellus)小玉米茎蛀虫；小蔗螟(Diatraeasaccharalis)甘蔗螟虫；玉米根虫(Diabrotica virgifera)玉米根叶甲；长角叶甲(Diabrotica longicornis barberi)北方玉米根虫；黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundecimpunctata howardi)南方玉米根虫；梳爪叩甲属(Melanotus)物种金针虫；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)北方蒙面金龟子(白蛴螬)；圆头犀金龟(Cyclocephalaimmaculata)南方圆头犀金甲(白蛴螬)；日本弧丽金龟(Popillia japonica)日本金龟子；甜菜跳甲(Chaetocnema pulicaria)玉米跳甲；玉米隐喙象(Sphenophorus maidis)玉米象虫；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)玉米缢管蚜；玉蜀黍根蚜(Anuraphis maidiradicis)玉米根蚜；麦长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)麦虱；红腿蝗(Melanoplusfemurrubrum)红腿蚱蜢；黑血蝗(Melanoplus sanguinipes)迁徙蚱蜢；灰种蝇(Hylemyaplatura)种蝇；美洲黍潜蝇(Agromyza parvicornis)玉米斑潜蝇；玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscrurus)草地蓟马；窃蚁(Solenopsis milesta)窃叶蚁；棉红蜘蛛(Tetranychus urticae)二斑叶螨；高粱：斑禾草螟(Chilo partellus)高粱蛀虫；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)秋夜蛾；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)玉米穗虫；小玉米螟(Elasmopalpus lignosellus)小玉米茎蛀虫；粒伏地老虎(Feltia subterranea)颗粒地老虎；长毛食叶然金龟(Phyllophaga crinita)白蛴螬；伪金针虫属(Eleodes)、宽胸叩头虫属(Conoderus)和Aeolus物种金针虫；黑角负泥虫(Oulema melanopus)橙足负泥虫；甜菜跳甲(Chaetocnema pulicaria)玉米跳甲；玉米隐喙象(Sphenophorus maidis)玉米象虫；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)玉米缢管蚜；牛鞭草蚜(Sipha flava)蔗黄伪毛蚜；麦长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)麦虱；高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola)高粱蠓；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)红叶螨；棉红蜘蛛(Tetranychus urticae)二斑叶螨；小麦：一星粘虫(Pseudaletia unipunctata)粘虫；草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)秋夜蛾；小玉米螟(Elasmopalpus lignosellus)小玉米茎蛀虫；灰地老虎(Agrotis orthogonia)西方地老虎；小玉米螟(Elasmopalpus lignosellus)小玉米茎蛀虫；黑角负泥虫(Oulema melanopus)橙足负泥虫；北美苜蓿象甲(Hypera punctata)车轴草叶象甲；黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)南方玉米根虫；俄罗斯小麦蚜虫；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)麦二岔蚜；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)英国谷物蚜虫；红腿蝗(Melanoplus femurrubrum)红腿蚱蜢；异形黑蝗(Melanoplusdifferentialis)长额负蝗；黑血蝗(Melanoplus sanguinipes)迁徙蚱蜢；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor)小麦瘿蚊；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)小麦吸浆虫；美洲麦秆蝇(Meromyza americana)麦秆蝇；麦地种蝇(Hylemya coarctata)小麦球茎蝇；烟褐花蓟马(Frankliniella fusca)烟草蓟马；麦茎蜂(Cephus cinctus)小麦茎锯蝇；郁金香瘤瘿螨(Aceria tulipae)小麦卷叶螨；向日葵：向日葵芽蛾(Suleima helianthana)葵花螟；向日葵斑螟(Homoeosoma electellum)向日葵螟；向日葵叶甲(Zygogrammaexclamationis)向日葵甲虫；胡萝卜金龟(Bothyrus gibbosus)胡萝卜甲虫；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)葵花籽蠓；棉花：绿棉铃虫(Heliothis virescens)棉蚜虫；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)棉铃虫；玉米夜蛾(Spodoptera exigua)甜菜夜蛾；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)红铃虫；苜蓿叶象甲(Anthonomus grandis)棉铃象甲；瓜蚜(Aphis gossypii)棉蚜；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)棉跳盲蝽；纹翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)带状翅粉虱；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)牧草盲蝽；红腿蝗(Melanoplus femurrubrum)红腿蚱蜢；异形黑蝗(Melanoplus differentialis)长额负蝗；烟蓟马(Thrips tabaci)棉蓟马；烟褐花蓟马(Franklinkiella fusca)烟草蓟马；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)红叶螨；棉红蜘蛛(Tetranychus urticae)二斑叶螨；稻：小蔗螟(Diatraea saccharalis)甘蔗螟虫；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)秋夜蛾；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)玉米穗虫；青铜肖叶甲(Colaspis brunnea)葡萄肖叶甲；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)稻水象；米象(Sitophilus oryzae)稻象虫；二条黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)稻叶蝉；麦长蝽(Blissus leucopterus)麦虱；拟绿蝽(Acrosternum hilare)喜绿蝽；大豆：大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)大豆夜蛾；绒毛豆蛾(Anticarsia gemmatalis)梨豆夜蛾；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)绿三叶虫；玉米螟(Ostrinia nubilalis)欧洲玉米螟；小地老虎(Agrotis ipsilon)小地蚕；玉米夜蛾(Spodoptera exigua)甜菜夜蛾；绿棉铃虫(Heliothis virescens)棉蚜虫；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)棉铃虫；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)墨西哥瓢虫；桃蚜(Myzus persicae)绿桃蚜；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae)马铃薯微叶蝉；拟绿蝽(Acrosternum hilare)喜绿蝽；红腿蝗(Melanoplus femurrubrum)红腿蚱蜢；异形黑蝗(Melanoplus differentialis)长额负蝗；灰种蝇(Hylemya platura)种蝇；豆蓟马(Sericothrips variabilis)大豆蓟马；烟蓟马(Thrips tabaci)棉蓟马；土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani)草莓蜘蛛螨；棉红蜘蛛(Tetranychus urticae)二斑叶螨；大 麦：玉米螟(Ostrinia nubilalis)欧洲玉米螟；小地老虎(Agrotis ipsilon)小地蚕；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)麦二岔蚜；麦长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)麦虱；拟绿蝽(Acrosternum hilare)喜绿蝽；褐蝽(Euschistus servus)褐臭蝽；灰地种蝇(Delia platura)种蝇；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor)小麦瘿蚊；麦岩螨(Petrobialatens)麦卡腿蜘蛛；油菜籽：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)菜蚜；蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae)跳甲；蓓带夜蛾(Mamestra configurata)披肩粘虫；吊丝虫(Plutella xylostella)小菜蛾；蝇属(Delia)物种根蛆。
在一些实施方案中，DVP、DVP杀昆虫蛋白或其药学上可接受的盐可用于处理前述昆虫中的任一者或多者。
对本发明敏感的昆虫包括但不限于以下：科，诸如：蜚蠊目(Blattaria)、鞘翅目、弹尾目(Collembola)、双翅目、棘口吸虫目(Echinostomida)、半翅目、膜翅目、等翅目、鳞翅目、脉翅目(Neuroptera)、直翅目、小杆目(Rhabditida)、蚤目(Siphonoptera)和缨翅目。属种如下所示：黑行军虫(Actebia fennica)、小地老虎、黄地老虎(A.segetum)、绒毛豆蛾、桔带卷蛾、菜粉蝶(Artogeia rapae)、家蚕(Bombyx mori)、玉米茎蛀褐夜蛾、Cacyreusmarshall、水稻二化螟、云杉色卷蛾(Christoneura fumiferana)、C.occidentalis、C.pinus pinus、C.rosacena、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、可可豆荚螟(Conopomorpha cramerella)、Ctenopsuestis obliquana、苹果小卷蛾(Cydiapomonella)、黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)、甘蔗螟(Diatraea saccharallis)、西南玉米螟(D.grandiosella)、翠纹钻夜蛾(Earias vittella)、小玉米螟(Elasmolpalpuslignoselius)、非洲茎螟(Eldana saccharina)、地中海斑螟(Ephestia kuehniella)、夜小卷蛾(Epinotia aporema)、苹淡褐卷蛾、蜡螟、属—种、美洲棉铃虫、H.punctigera、棉铃虫、绿棉铃虫、美国白蛾、东方铁杉尺蠖、大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)、葡萄花翅小卷蛾、舞毒蛾(Lymantria dispar)、森林天幕毛虫(Malacosoma disstria)、甘蓝夜蛾、蓓带夜蛾(M.configurata)、烟草天蛾、Marasmia patnalis、豆荚螟(Maruca vitrata)、白斑毒蛾(Orgyia leucostigma)、玉米螟、亚洲玉米螟、Pandemis pyrusana、棉红铃虫、咖啡潜叶蛾(Perileucoptera coffeella)、Phthorimaea opercullela、Pianotortrix octo、荷兰石竹小卷蛾(Piatynota stultana)、欧洲粉蝶(Pieris brassicae)、印度谷螟(Plodiainterpunctala)、吊丝虫、大豆尺夜蛾、两色髯须夜蛾(Rachiplusia nu)、三化螟(Sciropophaga incertulas)、非洲大螟(Sesamia calamistis)、弗吉尼亚虎蛾(Spilosomavirginica)、玉米夜蛾、草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、非洲粘虫(Spodoptera exempta)、斜纹夜蛾、安第斯马铃薯块茎蛾(Tecia solanivora)、松异舟蛾(Thaumetopoea pityocampa)、粉纹夜蛾、蝙蝠蛾(Wiseana cervinata)、Wiseana copularis、Wiseana jocosa、蜚蠊目小蠊属(Blattaria blattella)、弹尾目奇跳属(Collembola xenylla)、Collembola folsomia、白符跳(Folsomia candida)、Echinostomida fasciola、Hemiptera oncopeltrus、半翅目小粉虱属(Hemiptera bemisia)、半翅目长管蚜属(Hemiptera macrosiphum)、半翅目缢管蚜属(Hemiptera rhopalosiphum)、半翅目瘤蚜属(Hemiptera myzus)、膜翅目松叶蜂属(Hymenoptera diprion)、膜翅目蜜蜂属(Hymenoptera apis)、膜翅目长体茧蜂属(Hymenoptera Macrocentrus)、膜翅目悬茧蜂属(Hymenoptera Meteorus)、HymenopteraNasonia、膜翅目火蚁属(Hymenoptera Solenopsis)、等翅目鼠妇属(Isopoda porcellio)、等翅目散白蚁属(Isoptera reticulitermes)、Orthoptera Achta、前气门亚目叶螨属(Prostigmata tetranychus)、小杆目拟丽突属(Rhabitida acrobeloides)、小杆目新小杆线虫属(Rhabitida caenorhabditis)、Rhabitida distolabrellus、小杆目浅腔属(Rhabitida panagrellus)、Rhabitida pristionchus、小杆目短体线虫属(Rhabitidapratylenchus)、小杆目钩口属(Rhabitida ancylostoma)、小杆目日圆属(Rhabitidanippostrongylus)、Rhabitida panagrellus、小杆目血矛线虫属(Rhabitidahaemonchus)、小杆目根结线虫属(Rhabitida meloidogyne)和蚤目栉首蚤属(Siphonaptera ctenocephalides)。
本公开提供了用于植物转化的方法，这些方法可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。转基因方法将是特别有用的方法的作物包括但不限于：苜蓿、棉花、番茄、玉蜀黍、小麦、玉米、甜玉米、紫花苜蓿、大豆、高粱、红豌豆、亚麻籽、红花、油菜籽、油菜、稻、大豆、大麦、向日葵、树(包括针叶树和落叶树)、花(包括商业上和温室中生长的那些)、羽扇豆、柳枝稷、甘蔗、马铃薯、番茄、烟草、十字花科植物、胡椒、甜菜、大麦和油菜、芸苔属物种、黑麦、小米、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
本公开提供了用于植物转化的方法，这些方法可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。转基因方法或植物嵌入式保护剂(PIP)将是特别有用的方法的作物包括但不限于：苜蓿、棉花、番茄、玉蜀黍、小麦、玉米、甜玉米、紫花苜蓿、大豆、高粱、红豌豆、亚麻籽、红花、油菜籽、油菜、稻、大豆、大麦、向日葵、树(包括针叶树和落叶树)、花(包括商业上和温室中生长的那些)、羽扇豆、柳枝稷、甘蔗、马铃薯、番茄、烟草、十字花科植物、胡椒、甜菜、大麦和油菜、芸苔属物种、黑麦、小米、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
在一些实施方案中，可向昆虫和/或害虫所在处施用本发明的组合物、混合物和/或方法，该昆虫和/或害虫选自：尺蠖；杂食性卷叶蛾；天蛾幼虫；菜粉蝶；小菜蛾；苜蓿绿夜蛾；结网毛虫；盐沼毛虫；粘虫；地老虎；十字条纹菜青虫；豆荚虫；黎豆夜蛾；大豆夜蛾；番茄螟蛉；豆杂色夜蛾；瓜虫；Rindworm complex；果树卷叶蛾；柑橘地老虎；实夜蛾属(Heliothis)；柑桔凤蝶；柑橘地老虎；红疣天社蛾；天幕毛虫；秋幕毛虫；胡桃毛虫；星尺蛾；舞毒蛾；杂色卷叶蛾；红带卷叶蛾；Tufted Apple Budmoth；梨小食心虫；FilbertLeafroller；斜纹卷叶虫；苹果蠹蛾；桃条麦蛾；葡萄叶雕叶虫；荷兰石竹小卷蛾；AchemaSphinx Moth(天蛾幼虫)；桔卷叶蛾；烟青虫；葡萄浆果蛾；尺蠖；苜蓿粉蝶；棉铃虫；头蛾；Amorbia Moth；杂食尺蠖；Ello Moth(天蛾幼虫)；玉米天蚕蛾；夹竹桃蛾；杜鹃花毛虫；天蛾幼虫；卷叶蛾；香蕉弄蝶；Batrachedra comosae(Hodges)；Thecla Moth；洋蓟羽蛾；ThistleButterfly；结草虫；春秋尺蠖；榆树尺蠖；加州槲蛾；松蝴蝶；云杉卷叶蛾；鞍突毛虫；道格拉斯冷杉毒蛾；西部栎柳毒蛾；黑头芽虫；合欢巢蛾；贾克松色卷蛾；鞍背刺蛾毛虫；Greenstriped Mapleworm；或铁杉尺蠖。
在一些实施方案中，可向昆虫和/或害虫所在处施用本发明的组合物、混合物和/或方法，该昆虫和/或害虫选自：Achema Sphinx Moth(天蛾幼虫)(Eumorpha achemon)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme))；粉斑螟蛾(Caudra cautella)；Amorbia Moth(Amorbia humerosana)；粘虫(灰翅夜蛾属(Spodoptera)物种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、棉贪夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactyla)；杜鹃花毛虫(Datanamajor)；结草虫(常绿树蓑蛾(Thyridopteryx ephemeraeformis))；香蕉蛾(木豹蛾(Hypercompe scribonia))；香蕉弄蝶(Erionota thrax)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana))；加州槲蛾(Phryganidia californica)；春尺蠖(Paleacritamerriccata)；Cherry Fruitworm(樱小食心虫(Grapholita packardi))；China Mark Moth(圹水螟(Nymphula stagnata))；柑橘地老虎(柑橘夜蛾(Xylomyges curialis))；苹果蠹蛾(苹果小卷蛾(Cydia pomonella))；蔓越莓果虫(越橘蜂斑螟(Acrobasis vaccinii))；十字条纹菜青虫(卷心菜薄翅野螟(Evergestis rimosalis))；地老虎(夜蛾科(Noctuid)物种、小地老虎(Agrotis ipsilon))；道格拉斯冷杉毒蛾(枞树毒蛾(Orgyia pseudotsugata))；Ello Moth(天蛾幼虫)(木薯天蛾(Erinnyis ello))；榆树尺蠖(榆秋黄尺蛾(Ennomossubsignaria))；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana))；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(Thymelicus lineola)；Essex Skipper；秋幕毛虫(Melissopus latiferreanus)；FilbertLeafroller(蔷薇黄卷蛾(Archips rosanus))；果树卷叶蛾(果树黄卷蛾(Archipsargyrospilia))；葡萄浆果蛾(Paralobesia viteana)；荷兰石竹小卷蛾(Platynotastultana)；葡萄叶雕叶虫(葡萄烟翅蛾(Harrisina americana))(仅地栽)；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)；Greenstriped Mapleworm(玫瑰栎蚕蛾(Dryocampa rubicunda))；Gummosos-Batrachedra comosae(Hodges)；舞毒蛾(Lymantria dispar)；铁杉尺蠖(东方铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria))；天蛾幼虫(烟草天蛾属(Manduca)物种)；菜粉蝶(Pierisrapae)；玉米天蚕蛾(玉米尺蚕蛾(Automeris io))；贾克松色卷蛾(Choristoneurapinus)；苹果浅褐卷叶蛾(苹淡褐卷蛾(Epiphyas postvittana))；瓜虫(甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata))；合欢巢蛾(含羞草雕蛾(Homadaula anisocentra))；斜纹卷叶虫(蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana))；夹竹桃蛾(夹竹桃蛾幼虫(Syntomeidaepilais))；杂食性卷叶蛾(Playnota stultana)；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata)；柑桔凤蝶(大黄带凤蝶(Papilio cresphontes))；桔卷叶蛾(桔带卷蛾(Argyrotaeniacitrana))；梨小食心虫(东方果蛾(Grapholita molesta))；桃条麦蛾(桃枝麦蛾(Anarsialineatella))；松蝴蝶(娆粉蝶(Neophasia menapia))；豆荚虫；红带卷叶蛾(红带卷蛾(Argyrotaenia velutinana))；红疣天社蛾(Schizura concinna)；Rindworm Complex；鞍背刺蛾毛虫(鞍背毛虫(Sibine stimulea))；鞍突毛虫(鞍背天社蛾(Heterocampaguttivitta))；盐沼毛虫(盐泽灯蛾(Estigmene acrea))；草地螟(草螟属(Crambus)物种)；尺蠖(榆秋黄尺蠖(Ennomos subsignaria))；秋星尺蠖(秋尺蠖(Alsophila pometaria))；云杉卷叶蛾(云杉色卷蛾(Choristoneura fumiferana))；天幕毛虫(各种枯叶蛾(Lasiocampidae))；萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶(Thecla basilides))；烟草天蛾(Manduca sexta)；烟草灰绿斑蛾(烟草粉螟(Ephestia elutella))；Tufted AppleBudmoth(簇生苹果芽蛾(Platynota idaeusalis))；树枝蛀虫(桃枝麦蛾(Anarsialineatella))；豆杂色夜蛾(疆夜蛾(Peridroma saucia))；杂色卷叶蛾(Platynotaflavedana)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)；胡桃毛虫(Datana integerrima)；结网毛虫(美国白蛾(Hyphantria cunea))；西部栎柳毒蛾(老古毒蛾(Orgyia vetusta))；南方玉米螟(Diatraea crambidoides)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；桔根象甲；草莓根象甲；美核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘蔗犀金龟；咖啡果小蠹；一年生蓝草象鼻虫(Listronotus maculicollis)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟(Maladera castanea))；欧洲金龟子(Rhizotroqus majalis)；绿花金龟(绿六月花金龟(Cotinis nitida))；日本金龟子(日本弧丽金龟(Popillia japonica))；五月或六月甲虫(六月鳃角金龟属(Phyllophaga)物种)；圆头犀金龟(北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis))；东方丽金龟(Anomala orientalis)；南方蒙面金龟子(南方圆头犀金龟(Cyclocephala lurida))；谷象(象甲总科(Curculionoidea))；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)；水稻二化螟(Chilo suppressalis)；尖音库蚊(Culexpipiens)；致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)；小蔗螟(Diatraea saccharalis)；棉铃虫(Helicoverpa armigera)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)；绿棉铃虫(Heliothis virescens)；马铃薯甲虫；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)；玉米螟(Ostrinia nubilalis)；棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)；印度谷螟(Plodia interpunctella)；吊丝虫(Plutella xylostella)；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)；玉米夜蛾(Spodoptera exigua)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；或榆叶甲(Xanthogaleruca luteola)。
在一些实施方案中，可向甲虫成虫所在处施用本发明的组合物、混合物和/或方法，该甲虫成虫选自：亚洲花园甲虫(栗色绒金龟(Maladera castanea))；金斑橡树蛀虫(Agrilus coxalis auroguttatus)；绿花金龟(绿六月花金龟(Cotinis nitida))；日本金龟子(日本弧丽金龟(Popillia japonica))；五月或六月甲虫(六月鳃角金龟属(Phyllophaga)物种)；东方丽金龟(Anomala orientalis)；和皂浆果螟(Agrilusprionurus)。
在一些实施方案中，可向昆虫和/或害虫所在处施用本发明的组合物、混合物和/或方法，该昆虫和/或害虫是选自以下的幼虫(一年生白蛴螬)：一年生蓝草象鼻虫(Listronotus maculicollis)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟(Maladera castanea))；欧金龟(欧洲金龟子(Rhizotroqus majalis))；绿花金龟(绿六月花金龟(Cotinis nitida))；日本金龟子(日本弧丽金龟(Popillia japonica))；五月或六月甲虫(六月鳃角金龟属(Phyllophaga)物种)；圆头犀金龟(北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis))；东方丽金龟(Anomala orientalis)；南方蒙面金龟子(南方圆头犀金龟(Cyclocephala lurida))；和谷象(象甲总科(Curculionoidea))。
胱氨酸结结构
富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)是富含半胱氨酸残基的肽，在一些实施方案中，这些肽用于在此类半胱氨酸残基之间形成二硫键。在一些实施方案中，CRP含有4、5、6、7、8、9、10或更多个半胱氨酸氨基酸。并且，在一些实施方案中，CRP中存在的半胱氨酸残基可形成3个或更多个二硫键。在一些实施方案中，二硫键有助于杀昆虫肽的折叠、三维结构和活性。
CRP由于其半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，当暴露于环境时可具有显著的稳定性。在一些实施方案中，CRP可具有杀昆虫特性。例如，在一些实施方案中，CRP可以是富含半胱氨酸的杀昆虫蛋白(CRIP)。并且，在一些实施方案中，半胱氨酸-半胱氨酸二硫键和由其形成的三维结构在这些蛋白质的杀昆虫性质中发挥重要作用。
在一些实施方案中，CRP中存在的3个二硫键可具有形成胱氨酸结(CK)基序的二硫键拓扑结构。胱氨酸结(CK)基序是含有至少三个二硫桥或键(在半胱氨酸分子对之间形成)的蛋白质结构基序。胱氨酸结由两个二硫键和它们的连接主链链段构成，在结构中形成内环，第三二硫键穿过该内环以形成互锁和交叉支撑结构，从而形成轮烷亚结构。
在一些实施方案中，3个二硫键具有二硫键拓扑结构，该二硫键拓扑结构产生以下CK基序中的一种CK基序：抑制剂胱氨酸结(ICK)基序、生长因子胱氨酸结(GFCK)基序或环状胱氨酸结(CCK)基序。
抑制剂胱氨酸结(ICK)或“knottin”是含有至少三个二硫键的蛋白质结构基序。与键之间的肽亚基一起，两个二硫键(分别连接第一和第四半胱氨酸以及第二和第五半胱氨酸)形成环，第三二硫键(连接序列中的第三和第六半胱氨酸)穿过该环，从而形成结。该基序在无脊椎动物毒素诸如来自蛛形纲和软体动物的那些毒素中是常见的。该基序也存在于植物中发现的一些抑制蛋白中。
包含ICK基序的蛋白质可以是16至60个氨基酸长，其中至少6个半胱氨酸核心氨基酸具有至少三个二硫桥，其中3个二硫桥是共价键，并且在六个半胱氨酸残基中，共价二硫键位于从N末端氨基酸开始的六个核心半胱氨酸氨基酸的第一(CI)和第四(CIV)、第二(CII)和第五(CV)以及第三(CIII)和第六(CVI)半胱氨酸之间。通常，这种类型的蛋白质包含β-发夹二级结构，通常由位于基序的第四和第六核心半胱氨酸之间的残基组成，发夹通过由基序的三个二硫键提供的结构交联而稳定。注意，在抑制性胱氨酸结基序中可存在另外的半胱氨酸/胱氨酸或半胱氨酸氨基酸。
环状胱氨酸结(CCK)或环肽类似于ICK，然而，CCK肽是环化的。CCK分为两个主要的结构亚家族：两种中较不常见的莫比乌斯环肽(Moebius cyclotide)在环5中含有顺式脯氨酸，诱导局部180°主链扭曲；另一个亚家族手镯环肽(bracelet cyclotide)则没有这个特征。胰蛋白酶抑制剂环肽基于序列变异和天然活性被分类到它们自己的家族中。胰蛋白酶抑制剂环肽与来自南瓜植物的被称为knottin或抑制剂胱氨酸结的非环状胰蛋白酶抑制剂家族的同源性比它们与其他环肽的同源性更高。此处，“环状”或“环化”是指包含氨基酸残基序列或其类似物而没有游离氨基和羧基末端的分子。在一些实施方案中，环化肽包含肽中所有氨基酸之间通过酰胺(肽)键的连接，但其他化学接头也是可能的。
生长因子胱氨酸结(GFCK)同样具有与ICK肽相似的基序，但其拓扑结构使得CI和CIV之间的键穿过环(分别在CII和CV半胱氨酸与CIII和CVI半胱氨酸之间形成)。
通过去除键得到式(II)的CK结构
本发明考虑和教导了工程化重组CRP的方法，该重组CRP包含根据以下式(II)的胱氨酸结(CK)结构、基本上由其组成或由其组成：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成该胱氨酸结基序的唯一二硫键；其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽亚基；其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在；其中所述重组CRP通过修饰具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP来产生，其中该一个或多个非CK二硫键不是该第一二硫键、该第二二硫键或该第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成该CK基序；其中通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰该可修饰CRP；其中从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP；并且其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
在一些实施方案中，根据下列方法来产生包含根据式(II)的CK结构、基本上由其组成或由其组成的CRIP：从具有七个或更多个半胱氨酸氨基酸残基的多肽中去除一个或多个半胱氨酸氨基酸残基，其中该多肽不具有根据式(II)的CK结构。
在一些实施方案中，从不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP中去除一个或多个半胱氨酸氨基酸残基，导致从可修饰CRP中去除一个或多个二硫键。
在一些实施方案中，从不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键，产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP；并导致以下效果：相对于不具有根据式(II)的CK结构的多肽，重组CRP在例如重组蛋白表达系统中的表达增加。
本领域普通技术人员已知有多种用于测量肽产量的方法。在一些实施方案中，肽产量可以是“标准化肽产量”，意指条件培养基中的肽产量除以测量肽产量时的对应细胞密度。肽产量可用单位体积中产生的肽的质量表示，例如，mg/升或mg/L，或用HPLC色谱中产生的肽的UV吸收峰面积表示，例如，mAu.sec。细胞密度可用培养物在600nm波长(OD600)下的可见光吸收表示。“OD”是指光密度。通常，OD是使用分光光度计测量的。当测量细胞群体随时间的生长时，OD600优于UV光谱；这是因为在600nm波长下，细胞不会像在太多UV光下那样受到伤害。“OD660nm”或“OD660nm”是指660纳米(nm)下的光密度。
在一些实施方案中，本发明的重组CRP包含具有根据式(II)的CK结构的蛋白质、基本上由其组成或由其组成。根据式(II)的CK结构是指半胱氨酸和二硫键拓扑结构的构型，其中具有根据式(II)的CK结构的蛋白质具有共有的结构相似性。此处，根据式(II)的CK结构包含通过三个二硫键连接的六个半胱氨酸残基、基本上由其组成或由其组成，其中二硫键连接在半胱氨酸CI和CIV、CII和CV以及CIII和CVI之间。
在一些实施方案中，相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平，具有根据式(II)的CK结构的重组CRP具有等于或大于以下水平的表达水平的增加：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或大于100％。
在一些实施方案中，本发明的重组CRP具有二硫键拓扑结构，其中该二硫键拓扑结构形成以下胱氨酸结基序中的一种胱氨酸结基序：抑制剂胱氨酸结(ICK)基序、生长因子胱氨酸结(GFCK)基序或环状胱氨酸结(CCK)基序。
在一些实施方案中，本发明的重组CRP具有二硫键拓扑结构，其中该二硫键拓扑结构形成ICK基序。
在一些实施方案中，可修饰CRP是具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中该一个或多个非CK二硫键不是第一二硫键、第二二硫键或第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成CK基序。
因此，在一些实施方案中，该一个或多个非CK二硫键是不是第一二硫键、第二二硫键和/或第三二硫键的任何另外的二硫键，因为第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成胱氨酸结基序的唯一二硫键。换句话讲，当存在不是第一二硫键、第二二硫键和/或第三二硫键，和/或不是与它们的连接主链链段一起在结构中形成内环的两个二硫键之一，和/或不是穿过该环以形成互锁和交叉支撑结构从而形成轮烷亚结构的第三二硫键的另外的二硫键时，则这种另外的二硫键是非CK二硫键。
在一些实施方案中，具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中该一个或多个非CK二硫键不是第一二硫键、第二二硫键或第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成CK基序；可通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰。
在一些实施方案中，从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP。
在一些实施方案中，从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键，产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP，其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
在一些实施方案中，相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平，具有根据式(II)的CK结构的重组CRP的表达水平的增加可以是重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平的表达增加约至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.8％、至少约0.9％、至少约1％、至少约1.25％、至少约1.5％、至少约1.75％、至少约2％、至少约2.25％、至少约2.5％、至少约2.75％、至少约3％、至少约3.25％、至少约3.5％、至少约3.75％、至少约4％、至少约4.25％、至少约4.5％、至少约4.75％、至少约5％、至少约5.25％、至少约5.5％、至少约5.75％、至少约6％、至少约6.25％、至少约6.5％、至少约6.75％、至少约7％、至少约7.25％,至少约7.5％、至少约7.75％、至少约8％、至少约8.25％、至少约8.5％、至少约8.75％、至少约9％、至少约9.25％、至少约9.5％、至少约9.75％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％、至少约26％、至少约27％、至少约28％、至少约29％、至少约30％、至少约31％、至少约32％、至少约33％、至少约34％、至少约35％、至少约36％、至少约37％、至少约38％、至少约39％、至少约40％、至少约41％、至少约42％、至少约43％、至少约44％、至少约45％、至少约46％、至少约47％、至少约48％、至少约49％、至少约50％、至少约50％、至少约51％、至少约52％、至少约53％、至少约54％、至少约55％、至少约56％、至少约57％、至少约58％、至少约59％、至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％或大于100％。
在一些实施方案中，相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平，具有根据式(II)的CK结构的重组CRP的表达水平的增加可以是范围为约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％，99.9％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％，340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％，590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％，840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％至约1000％的增加，或大于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平。
在一些实施方案中，可修饰CRP通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰。
在一些实施方案中，可修饰CRP为野生型μ-DGTX-Dc1a；DVP；Kappa-ACTX、ApsIII或其变体。
在一些实施方案中，可修饰CRP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-2、193、195或198。
在一些实施方案中，可修饰CRP由以下项中任一项所示的氨基酸序列组成：SEQ IDNO:1-2、193、195或198。
在一些实施方案中，重组CRP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-14、197、199或201。
在一些实施方案中，重组CRP由以下项中任一项所示的氨基酸序列组成：SEQ IDNO:6-14、197、199或201。
制备包含根据式(II)的CK结构的重组CRP的方法
在一些实施方案中，本发明提供了制备重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的方法，该重组CRP包含根据以下式(II)的胱氨酸结(CK)结构：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成该胱氨酸结基序的唯一二硫键；其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽亚基；其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在；所述方法包括：(a)提供具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中该一个或多个非CK二硫键不是该第一二硫键、该第二二硫键或该第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成该CK基序；以及(b)通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰该可修饰CRP；其中从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP；并且其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
在一些实施方案中，该方法提供了具有二硫键拓扑结构的重组CRP，其中该二硫键拓扑结构形成以下胱氨酸结基序中的一种胱氨酸结基序：抑制剂胱氨酸结(ICK)基序、生长因子胱氨酸结(GFCK)基序或环状胱氨酸结(CCK)基序。
在一些实施方案中，该方法提供了具有二硫键拓扑结构的重组CRP，其中该二硫键拓扑结构形成ICK基序。
在一些实施方案中，该方法提供了可修饰CRP，该可修饰CRP是具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中该一个或多个非CK二硫键不是第一二硫键、第二二硫键或第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成CK基序。因此，在一些实施方案中，该一个或多个非CK二硫键是不是第一二硫键、第二二硫键和/或第三二硫键的任何另外的二硫键，因为第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成胱氨酸结基序的唯一二硫键。换句话讲，当存在不是第一二硫键、第二二硫键和/或第三二硫键，和/或不是与它们的连接主链链段一起在结构中形成内环的两个二硫键之一，和/或不是穿过该环以形成互锁和交叉支撑结构从而形成轮烷亚结构的第三二硫键的另外的二硫键时，则这种另外的二硫键是非CK二硫键。
在一些实施方案中，该方法提供了具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中该一个或多个非CK二硫键不是第一二硫键、第二二硫键或第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成CK基序；可通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰。
在一些实施方案中，从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键，产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP，其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
在一些实施方案中，相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平，具有根据式(II)的CK结构的重组CRP的表达水平的增加可以是重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平的表达增加约至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.8％、至少约0.9％、至少约1％、至少约1.25％、至少约1.5％、至少约1.75％、至少约2％、至少约2.25％、至少约2.5％、至少约2.75％、至少约3％、至少约3.25％、至少约3.5％、至少约3.75％、至少约4％、至少约4.25％、至少约4.5％、至少约4.75％、至少约5％、至少约5.25％、至少约5.5％、至少约5.75％、至少约6％、至少约6.25％、至少约6.5％、至少约6.75％、至少约7％、至少约7.25％,至少约7.5％、至少约7.75％、至少约8％、至少约8.25％、至少约8.5％、至少约8.75％、至少约9％、至少约9.25％、至少约9.5％、至少约9.75％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％、至少约26％、至少约27％、至少约28％、至少约29％、至少约30％、至少约31％、至少约32％、至少约33％、至少约34％、至少约35％、至少约36％、至少约37％、至少约38％、至少约39％、至少约40％、至少约41％、至少约42％、至少约43％、至少约44％、至少约45％、至少约46％、至少约47％、至少约48％、至少约49％、至少约50％、至少约50％、至少约51％、至少约52％、至少约53％、至少约54％、至少约55％、至少约56％、至少约57％、至少约58％、至少约59％、至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％或大于100％。
在一些实施方案中，相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平，具有根据式(II)的CK结构的重组CRP的表达水平的增加可以是范围为约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％，99.9％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％，340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％，590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％，840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％至约1000％的增加，或大于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平。
在一些实施方案中，可修饰CRP通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰。
在一些实施方案中，可修饰CRP为野生型μ-DGTX-Dc1a；DVP；Kappa-ACTX、ApsIII或其变体。
在一些实施方案中，提供可修饰CRP的方法步骤包括提供具有以下项中任一项所示的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:1-2、193、195或198。
在一些实施方案中，产生重组CRP导致产生包含以下项中任一项所示的氨基酸序列的重组CRP：SEQ ID NO:6-14、197、199或201。
在一些实施方案中，该方法产生具有二硫键拓扑结构的重组CRP，该二硫键拓扑结构形成以下胱氨酸结基序中的一种胱氨酸结基序：抑制剂胱氨酸结(ICK)基序、生长因子胱氨酸结(GFCK)基序或环状胱氨酸结(CCK)基序。
在一些实施方案中，该方法提供了具有形成ICK基序的二硫键拓扑结构的重组CRP。
在一些实施方案中，该方法提供了可修饰CRP，其中该可修饰CRP为野生型μ-DGTX-Dc1a；DVP；Kappa-ACTX、ApsIII或其变体。
在一些实施方案中，该方法提供了可修饰CRP，该可修饰CRP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-2、193、195或198。
在一些实施方案中，该方法提供了可修饰CRP，该可修饰CRP由以下项中任一项所示的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1-2、193、195或198。
在一些实施方案中，该方法产生了重组CRP，该重组CRP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-14、197、199或201。
在一些实施方案中，该方法产生了重组CRP，该重组CRP由以下项中任一项所示的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6-14、197、199或201。
增加重组CRP的产量的方法
在一些实施方案中，本发明提供了增加重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的产量的方法，所述方法包括：(a)产生具有根据以下式(II)的胱氨酸结(CK)结构的重组CRP：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成该胱氨酸结基序的唯一二硫键；其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽亚基；其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在；其中根据下列方法来产生所述重组CRP：(b)提供具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中该一个或多个非CK二硫键不是第一二硫键、第二二硫键或第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成CK基序；以及(c)通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰该可修饰CRP；其中从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP；其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
在一些实施方案中，增加产量的方法提供了具有二硫键拓扑结构的重组CRP，其中该二硫键拓扑结构形成以下胱氨酸结基序中的一种胱氨酸结基序：抑制剂胱氨酸结(ICK)基序、生长因子胱氨酸结(GFCK)基序或环状胱氨酸结(CCK)基序。
在一些实施方案中，增加产量的方法提供了具有二硫键拓扑结构的重组CRP，其中该二硫键拓扑结构形成ICK基序。
在一些实施方案中，增加产量的方法提供了可修饰CRP，该可修饰CRP是具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中该一个或多个非CK二硫键不是第一二硫键、第二二硫键或第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成CK基序。因此，在一些实施方案中，该一个或多个非CK二硫键是不是第一二硫键、第二二硫键和/或第三二硫键的任何另外的二硫键，因为第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成胱氨酸结基序的唯一二硫键。换句话讲，当存在不是第一二硫键、第二二硫键和/或第三二硫键，和/或不是与它们的连接主链链段一起在结构中形成内环的两个二硫键之一，和/或不是穿过该环以形成互锁和交叉支撑结构从而形成轮烷亚结构的第三二硫键的另外的二硫键时，则这种另外的二硫键是非CK二硫键。
在一些实施方案中，增加产量的方法提供了具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中该一个或多个非CK二硫键不是第一二硫键、第二二硫键或第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成CK基序；可通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰。
在一些实施方案中，从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键，产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP，其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的蛋白质的产量或蛋白质的表达水平具有增加的蛋白质的表达水平或蛋白质的产量。
在一些实施方案中，相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平，具有根据式(II)的CK结构的重组CRP的表达水平的增加可以是重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平的表达增加约至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.8％、至少约0.9％、至少约1％、至少约1.25％、至少约1.5％、至少约1.75％、至少约2％、至少约2.25％、至少约2.5％、至少约2.75％、至少约3％、至少约3.25％、至少约3.5％、至少约3.75％、至少约4％、至少约4.25％、至少约4.5％、至少约4.75％、至少约5％、至少约5.25％、至少约5.5％、至少约5.75％、至少约6％、至少约6.25％、至少约6.5％、至少约6.75％、至少约7％、至少约7.25％,至少约7.5％、至少约7.75％、至少约8％、至少约8.25％、至少约8.5％、至少约8.75％、至少约9％、至少约9.25％、至少约9.5％、至少约9.75％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％、至少约26％、至少约27％、至少约28％、至少约29％、至少约30％、至少约31％、至少约32％、至少约33％、至少约34％、至少约35％、至少约36％、至少约37％、至少约38％、至少约39％、至少约40％、至少约41％、至少约42％、至少约43％、至少约44％、至少约45％、至少约46％、至少约47％、至少约48％、至少约49％、至少约50％、至少约50％、至少约51％、至少约52％、至少约53％、至少约54％、至少约55％、至少约56％、至少约57％、至少约58％、至少约59％、至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％或大于100％。
在一些实施方案中，相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平，具有根据式(II)的CK结构的重组CRP的表达产量水平的增加可以是范围为约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％，99.9％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％，340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％，590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％，840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％至约1000％的增加，或大于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平。
在一些实施方案中，增加产量的方法提供了可修饰CRP，该可修饰CRP通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰。
在一些实施方案中，增加产量的方法提供了可修饰CRP，该可修饰CRP为野生型μ-DGTX-Dc1a；DVP；Kappa-ACTX、ApsIII或其变体。
在一些实施方案中，提供可修饰CRP的增加产量步骤的方法包括提供具有以下项中任一项所示的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:1-2、193、195或198。
在一些实施方案中，增加产量的方法导致产生重组CRP，其中所述重组CRP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-14、197、199或201。
在一些实施方案中，增加产量的方法产生具有二硫键拓扑结构的重组CRP，该二硫键拓扑结构形成以下胱氨酸结基序中的一种胱氨酸结基序：抑制剂胱氨酸结(ICK)基序、生长因子胱氨酸结(GFCK)基序或环状胱氨酸结(CCK)基序。
在一些实施方案中，增加产量的方法提供了具有形成ICK基序的二硫键拓扑结构的重组CRP。
在一些实施方案中，增加产量的方法提供了可修饰CRP，其中该可修饰CRP为野生型μ-DGTX-Dc1a；DVP；Kappa-ACTX、ApsIII或其变体。
在一些实施方案中，增加产量的方法提供了可修饰CRP，该可修饰CRP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:1-2、193、195或198。
在一些实施方案中，增加产量的方法提供了可修饰CRP，该可修饰CRP由以下项中任一项所示的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1-2、193、195或198。
在一些实施方案中，增加产量的方法产生了重组CRP，该重组CRP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:6-14、197、199或201。
在一些实施方案中，增加产量的方法产生了重组CRP，该重组CRP由以下项中任一项所示的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6-14、197、199或201。
在一些实施方案中，本发明提供了重组CRP，该重组CRP包含根据以下式(II)的胱氨酸结(CK)结构、基本上由其组成或由其组成：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成该胱氨酸结基序的唯一二硫键；其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽亚基；其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在；其中所述重组CRP通过根据以下方法修饰野生型μ-DGTX-Dc1a、DVP、Kappa-ACTX、ApsIII或其变体来产生：从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键；其中从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP；并且其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的野生型μ-DGTX-Dc1a、DVP、Kappa-ACTX、ApsIII或其变体的表达水平具有增加的表达水平。
在一些实施方案中，可修饰CRP通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰。
在一些实施方案中，可修饰CRP为野生型μ-DGTX-Dc1a；DVP；Kappa-ACTX、ApsIII或其变体。
在一些实施方案中，可修饰CRP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-2、193、195或198。
在一些实施方案中，重组CRP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-14、197、199或201。
示例性胱氨酸结结构实施方案
在一些实施方案中，多肽可具有半胱氨酸和/或二硫键，但不具有根据本发明的式(II)的CK结构。例如，在一些实施方案中，多肽可具有七个或更多个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，多肽可具有四个或更多个二硫键。
此处，本发明人提供了源自可修饰CRP以便获得式(II)的CK结构的重组CRP，以及与其相关的方法。例如，在一些实施方案中，本发明包含具有7个半胱氨酸残基的可修饰CRP、基本上由其组成或由其组成，该CRP已被修饰成包括1个半胱氨酸残基的去除，其中1个半胱氨酸残基的去除产生具有式(II)的CK结构的多肽。
在一些实施方案中，本发明包含具有8个半胱氨酸残基的可修饰CRP、基本上由其组成或由其组成，该CRP已被修饰成包括2个半胱氨酸残基的去除，其中2个半胱氨酸残基的去除产生具有式(II)的CK结构的重组CRP。
在一些实施方案中，本发明包含具有9个半胱氨酸残基的可修饰CRP、基本上由其组成或由其组成，该CRP已被修饰成包括3个半胱氨酸残基的去除，其中3个半胱氨酸残基的去除产生具有式(II)的CK结构的重组CRP。
在一些实施方案中，本发明包含具有10个半胱氨酸残基的可修饰CRP、基本上由其组成或由其组成，该CRP已被修饰成包括4个半胱氨酸残基的去除，其中4个半胱氨酸残基的去除产生具有式(II)的CK结构的重组CRP。
在一些实施方案中，本发明包含具有4个或更多个二硫键的可修饰CRP、基本上由其组成或由其组成，其中该可修饰CRP已通过去除1个、2个、3个、4个、5个或更多个二硫键而被修饰成具有3个二硫键。
在一些实施方案中，本发明的可修饰CRP可通过从具有七个或更多个半胱氨酸氨基酸残基的可修饰CRP中去除一个或多个半胱氨酸氨基酸残基来修饰；其中该可修饰CRP不具有根据式(II)的CK结构，并且其中从该多肽去除该一个或多个半胱氨酸氨基酸残基导致从该可修饰CRP去除一个或多个非CK二硫键。
在一些实施方案中，本发明包含具有四个二硫键的多肽、基本上由其组成或由其组成，其中一个二硫键被去除以产生式(II)的CK结构，其中在以下半胱氨酸残基之间形成二硫键：CI和CIV；CII和CV；以及CIII和CVI；例如具有1-4、2-5、3-6二硫键连接性的胱氨酸结。
在一些实施方案中，本发明包含具有八个半胱氨酸的多肽、基本上由其组成或由其组成，其中两个半胱氨酸被去除以产生式(II)的CK结构，其中在以下半胱氨酸残基之间形成二硫键：CI和CIV；CII和CV；以及CIII和CVI；例如具有1-4、2-5、3-6二硫键连接性的胱氨酸结。
在一些实施方案中，本发明包括增加多肽表达的方法、基本上由其组成或由其组成，其中所述方法通过去除一个或多个半胱氨酸而发生，其中该方法包括以下一个或多个步骤、基本上由其组成或由其组成：(a)获得和/或创建该可修饰CRP的3D结构；(b)基于该可修饰CRP的3D结构预测用于去除一个或多个半胱氨酸的一个或多个位点；以及(c)通过去除一个或多个预测位点上的一个或多个半胱氨酸来修饰该可修饰CRP；其中去除所述一个或多个半胱氨酸允许去除至少一个非CK二硫键。
在一些实施方案中，本发明包含多肽、基本上由其组成或由其组成，该多肽是自然界中单个基因的产物，并且已通过去除一个或多个半胱氨酸残基而突变，其中所述半胱氨酸残基的去除允许一个或多个非CK二硫键的去除，相对于不含所述去除的半胱氨酸的可修饰CRP，所述半胱氨酸残基的去除增加了重组CRP的表达。
在一些实施方案中，本发明包含重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据以下式(II)的胱氨酸结结构：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成胱氨酸结基序的唯一二硫键；其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽亚基；其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在；其中所述重组CRP通过修饰具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP来产生，其中该一个或多个非CK二硫键不是第一二硫键、第二二硫键或第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成CK基序；其中该可修饰CRP通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰；其中从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP；并且其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平；并且其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE肽亚基的每个氨基酸序列与以下组的氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性：NE为AKDGDVEGPAG；L1为KKYDVE；L2为DSGE；L3不存在；L4为QKQYLWYKWRPLD；L5为RGLKSGFFSSKFV；并且CE为RDV。
在一些实施方案中，本发明包含重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRGLKSGFFSSKFVCRDV(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中，本发明包含重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有如下的氨基酸序列：AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRGLKSGFFSSKFVCRDV(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中，本发明包含重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：AICTGADRPCAAACPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(SEQ ID NO:199)。
在一些实施方案中，本发明包含重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有如下的氨基酸序列：AICTGADRPCAAACPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(SEQ ID NO:199)。
在一些实施方案中，本发明包含重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：AICTGADRPCAAAAPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(SEQ ID NO:201)。
在一些实施方案中，本发明包含重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有如下的氨基酸序列：AICTGADRPCAAAAPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(SEQ ID NO:201)。
在一些实施方案中，本发明包含重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：GSCNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNAIGGGASKTCGY(SEQ ID NO:197)。
在一些实施方案中，本发明包含重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有如下的氨基酸序列：GSCNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNAIGGGASKTCGY(SEQ ID NO:197)。
在一些实施方案中，本发明包含用于编码重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的多核苷酸、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRGLKSGFFSSKFVCRDV(SEQ ID NO:5)或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含用于编码重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的多核苷酸、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有如下的氨基酸序列：AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRGLKSGFFSSKFVCRDV(SEQ IDNO:5)或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含用于编码重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的多核苷酸、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：AICTGADRPCAAACPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(SEQ ID NO:199)或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含用于编码重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的多核苷酸、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有如下的氨基酸序列：AICTGADRPCAAACPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(SEQ ID NO:199)或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含用于编码重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的多核苷酸、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：AICTGADRPCAAAAPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(SEQ ID NO:201)或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含用于编码重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的多核苷酸、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有如下的氨基酸序列：AICTGADRPCAAAAPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(SEQ ID NO:201)或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含用于编码重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的多核苷酸、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有与以下氨基酸序列具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、至少99.6％同一性、至少99.7％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性或100％同一性的氨基酸序列：GSCNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNAIGGGASKTCGY(SEQ ID NO:197)或其互补核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含用于编码重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的多核苷酸、基本上由其组成或由其组成，所述CRP包含根据式(II)的CK结构，并且具有如下的氨基酸序列：GSCNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNAIGGGASKTCGY(SEQ ID NO:197)或其互补核苷酸序列。
实施例
本说明书中的实施例并不旨在并且也不应该用于限制本发明；提供它们仅是为了说明本发明。以下关于折叠表达的类别是：降低≤0.9；相似＝0.9-1.1；略微增加＝1.1-2.9；增加＝3.0-10.0；以及明显增加≥10。以下关于折叠活性的类别是：降低≥1.5；并且相似＝0.7-1.4。
实施例1.酵母转化
酵母转化
构建含有用于编码野生型Dc1a的多核苷酸或用于编码给定DVP的多核苷酸以及α交配因子分泌信号的序列的单独ORF。然后将这些ORF插入pKlac1载体(目录号N3740；NewEngland240County Road,Ipswich,MA 01938-2723)。pKlac1载体含有乳酸克鲁维酵母PLAC4-PBI启动子(1)、编码乳酸克鲁维酵母α-交配因子(α-MF)分泌结构域(用于分泌表达)的DNA、多克隆位点(MCS)、乳酸克鲁维酵母LAC4转录终止子(TT)和从酵母ADH2启动子(PADH2)表达的真菌乙酰胺酶选择标记基因(amdS)。此外，存在大肠杆菌复制起点(ORI)和氨苄青霉素抗性基因(ApR)用于pKLAC1在大肠杆菌中的繁殖。
然后将所得载体(即，pKlac1-WT-Dc1a和各种pKlac1-DVP载体)线性化，并转化到电感受态乳酸克鲁维酵母宿主细胞中，以便将线性化载体的多个拷贝稳定整合到乳酸克鲁维酵母宿主基因组的LAC4基因座上。
然后将转化的乳酸克鲁维酵母涂布在含有乙酰胺作为唯一氮源的选择琼脂上，以鉴定含有表达盒的多个插入及其乙酰胺酶选择的菌株。
实施例2.产量分析
产量分析
然后将WT Dc1a和DVP菌落在含有2％山梨醇和0.2％玉米浆的基本培养基中于23.5℃培养6天。折叠的WT Dc1a和DVP的表达通过在Chromololith C18柱(EMD)上的HPLC分离和15％-35％乙腈的洗脱梯度进行评估。对折叠和错误折叠的WT Dc1a和DVP峰进行定量，并与对照(最小n＝4)比较。因为野生型Dc1a在色谱图上没有可见的折叠峰，所以通过还原SDS-PAGE考马斯染色来估计其产生的总Dc1a，并且通过在离子交换色谱后定量各种Dc1a种类来估计折叠与未折叠Dc1a的比率。
实施例3.离子交换色谱
离子交换色谱
WT Dc1a和DVP使用SP-Sephadex C-25(GE Healthcare)通过阳离子交换进行纯化。将树脂在30mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)中平衡。将含有Dc1a的用过的上清液直接施加到pH小于3.0的珠子上。用2-3个柱体积(CV)的(1)30mM乙酸钠，pH 4.0，(2)30mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，pH 6.0，(3)30mM MES，pH 6.0，100mM氯化钠，和(4)30mM MES，pH 6.0，200mM氯化钠洗涤和逐步洗脱珠子。
对于不含增加净正电荷的突变的野生型Dc1a和DVP，折叠的WT Dc1a和DVP在洗脱缓冲液(3)中洗脱为尖峰，而错误折叠形式的Dc1a在较高盐浓度的缓冲液(4)中洗脱。正如预期的那样，增加Dc1a总电荷的突变体在较高盐浓度下洗脱。合并含有折叠的Dc1a的级分，并对水反复透析以去除盐和缓冲液。纯化的材料可在-80℃下无限期储存而不损失活性，或在4℃下储存超过6个月而不损失活性。
实施例4.HPLC标准曲线
HPLC标准曲线
使用HPLC分级在Chromolith C18柱(EMD)上将1至2毫克WT Dc1a进一步纯化至＞99％的纯度。冻干后，用16180M-1cm-1的消光系数(ε)通过A280吸光度定量Dc1A。使用5μg-100μg的浓度范围建立HPLC标准曲线，并将斜率用于未知样品的定量。图1和图2。
简而言之，HPLC标准曲线如下进行：将纯化的Dc1A在水中的系列稀释液注入Chromolith C18柱(4.6×100mm)中，以2mL min-1的流速和18％-36％乙腈梯度经8分钟洗脱。将六个样品的Dc1a峰面积对浓度作图，线性关系的斜率用于定量未知样品的浓度。达到1个吸光度单位高度的样品从计算中剔除，因为它们被认为超出了HPLC检测器的线性范围。
实施例5.去除Cys41和Cys51残基处的第四二硫键
去除Cys41和Cys51残基处的第四二硫键
为了测试Dc1a的Cys41和Cys51残基(即，第四二硫键连接的残基)处的突变是否能增加表达而不影响活性，对每个半胱氨酸进行聚焦突变扫描。这里假设用类似的小氨基酸取代野生型氨基酸序列半胱氨酸残基对肽活性的影响可忽略不计。聚焦突变扫描通过将Dc1a的野生型半胱氨酸突变为丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸或缬氨酸来进行。聚焦突变扫描的结果显示，所有突变都会使Dc1a的总体表达和正确折叠得到改善。表2。
Dc1A的聚焦突变分析结果显示，突变体“T/A”(或“C41T/C51A”)显示表达和活性的最佳组合；因此，C41T/C51A变体用作后续实验中进行的丙氨酸扫描的背景。
表2.残基Cys41和Cys51的聚焦突变。用于得出表3所示值的计算基于有效的折叠峰。
实施例6.Dc1a的丙氨酸扫描
Dc1a的丙氨酸扫描
为了确定哪些残基可能是造成表达和/或活性增加的原因，对C41T/C51A DVP进行丙氨酸扫描。
通过在每个位置设计单个丙氨酸点突变体进行Dc1a的丙氨酸扫描。设计的构建体由Twist Biosciences(https://www.twistbioscience.com/；681Gateway Blvd SouthSan Francisco,CA 94080)合成并克隆。接下来，将4-8个转化体在23.5℃下在含有2％山梨醇和0.2％玉米浆的基本培养基中培养6天，并通过HPLC定量来评估它们的表达。将表达平均并相对于对照(C41T/C51A)归一化，评估表达改善的突变体对家蝇的生物活性。
丙氨酸扫描表明，几个残基的突变导致可观察到的表达增加。参见表3，以灰色突出显示。用诱变筛选进一步分析这些位置的表达、折叠和活性。
表3.C41T/C51A的丙氨酸扫描。具有C41T/C51A突变的背景突变体在下面所示位置进一步突变为丙氨酸残基。N/D＝未检测到。
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实施例7.残基A10、W31、Y32、K33和P36的诱变扫描
残基A10、W31、Y32、K33和P36的诱变扫描
为了进一步阐明对表达和/或活性有影响的另外的位置，对残基A10、W31、Y32、K33和P36进行了诱变扫描。
突变体由Twist Biosciences(https://www.twistbioscience.com/；681GatewayBlvd South San Francisco,CA 94080)合成并克隆。此处，将4-8个转化体在23.5℃下在含有2％山梨醇和0.2％玉米浆的基本培养基中培养6天，并通过HPLC定量来评估它们的表达。将表达平均并相对于对照(C41T/C51A)归一化，评估表达改善的突变体对家蝇的生物活性。
诱变扫描的结果如下示于表4中。位置W31突变为丙氨酸时活性降低，但用苯丙氨酸置换则使产量增加且活性没有损失。位置Y32在突变为丙氨酸时具有相似的产量增加和活性降低，但突变为丝氨酸时则显示良好的活性和增加的表达。P36突变为丙氨酸优于其他突变。将每个突变组合在一起(W31F、Y32S、P36A)导致表达比未修饰形式增加69％。图3。
表4.残基A10、W31、Y32、K33和P36的诱变扫描。N/D＝未检测到。
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实施例8.残基V17、D20和S21的诱变扫描
残基V17、D20和S21的诱变扫描
为了进一步阐明对表达和/或活性有影响的另外的位置，对残基V17、D20和S21进行了诱变扫描。如上所述合成并克隆突变体。
诱变扫描的结果如下示于表5中。位置D20显示良好的表达且没有活性损失；有趣的是，在该位置仅丙氨酸表现得比野生型残基更好。将D20A与位置V17或L42处的其他变异组合导致表达降低。当突变为丙氨酸时，位置S21显示表达增加，但活性降低。S21的其他突变都不能表现出相同的表达增加，因此没有进一步研究。
表5.残基V17、D20、S21的诱变扫描。此处显示的诱变扫描结果是在C41T/C51A背景上进行的；表达和/或杀昆虫活性的增加是相对于该背景的。
突变 表达改善 杀昆虫活性
D20A 增加 相似
D20K 相似 N/D
D20N 相似 N/D
D20S 相似 N/D
D20Y 降低 N/D
V17A 增加 相似
D20A、V17A 相似 N/D
D20A、V17D 相似 N/D
D20A、V17K 相似 N/D
D20A、V17S 相似 N/D
L42A 略微增加 相似
D20A、L42A 相似 N/D
D20A、L42S 降低 N/D
D20A、L42N 略微增加 N/D
D20A、L42V 略微增加 N/D
D20A、L42F 相似 N/D
S21A 增加 降低
S21G 降低 N/D
S21P 降低 N/D
S21T 降低 N/D
S21V 降低 N/D
S21D 降低 N/D
S21N 降低 N/D
S21K 相似 N/D
实施例9.位置D38的评价
位置D38的评价
为了进一步阐明对表达和/或活性有影响的另外的位置，对残基D38进行了诱变扫描。
因为当突变为丙氨酸时，位置D38的表达量大大增加，所以通过突变扫描对其进行筛选。然后，为了鉴定用于表达的突变体的最佳组合，评估了D38A与L42或V52突变体组合，以及与D20A在有或没有先前鉴定的由W31F、Y32S和P36A组成的优化突变体的情况下组合。根据上述方法合成并克隆突变体。将表达平均并相对于对照(C41T/C51A)归一化，评估表达改善的突变体对家蝇的生物活性。
诱变扫描的结果如下示于表6中。位置D38A显示表达大量增加而活性没有损失，HPLC上Dc1a峰的数目减少。参见图4和图5。没有其他突变体表现出类似的特征组合。接下来，用D38A评估L42和V52突变体的组合。虽然V52突变体降低了表达，但几个L42突变体在与D38A结合时导致表达增加，其中L42V显示出最强的结果。
表6.位置D38的评价。此处显示的诱变扫描结果是在C41T/C51A背景上进行的；因此，显示的相对产量是相对于该背景的。N/D＝未检测到。
评估对家蝇的杀昆虫活性。
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实施例10.半胱氨酸突变体的进一步优化
半胱氨酸突变体的进一步优化
对D38A DVP进行位置41和51处的半胱氨酸残基(即，为第四二硫键提供连接性的残基)的重新优化。因为在之前的实验中发现两个额外突变(即，D38A和L42V)在去除的第四二硫键附近是最佳的，所以重新优化C41和C51的突变，以在D38A存在时，在这些位置处找到突变体的最佳可能组合。根据上述方法合成并克隆突变体。
重新优化结果如下示于表7中。基于D38A的重新优化扫描的结果，选择C41S/C51S作为与D38A和L42V组合的最佳二硫键突变体组。图5和图6。
表7.D38A变体的重新优化。N/D＝未检测到。
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因此，在头对头测定中比较单个突变和组合突变的表达和活性。具有本文研究的四种突变组合的DVP，即C41S/C51S/D38A/L42V，具有氨基酸序列“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSVKSG FFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:53)，其表达比WT增加了近200倍，而没有损失对家蝇的生物活性。图6。
实施例11.家蝇注射
家蝇注射
使用CO2麻醉重14mg-20mg的成年家蝇(普通家蝇)，并将含WT Dc1a和以下DVP的0.5μL注射液进行胸内注射：(1)C41T/C51A；(2)C41T/C51A/D38A和(3)C41S/C51S/D38A/L42V。结果示于图7。
通过评估在24小时的蝇击倒(即，不能行走)百分比(在24小时的击倒％)来生成剂量-反应曲线。在CO2对照下，家蝇在几分钟后恢复行走的能力，此后不久恢复了飞行的能力。给予中等水平Dc1a的家蝇恢复了站立和行走的能力；然而，这些家蝇无法恢复飞行的能力。注射后15-30分钟后，家蝇开始表现出弛缓性麻痹，并伴有痉挛性麻痹的短暂发作，痉挛性麻痹的强度在1小时后达到顶点，并导致不能站立。在24小时时仍然麻痹但未死亡的家蝇表现出弛缓性麻痹，并且甚至在注射后长达72小时也没有恢复，此时会因脱水而死亡。图7。
如图7所示，DVP C41T/C51A/D38A和C41S/C51S/D38A/L42V在与WT-Dc1a相比时显示出优异的击倒能力。为了在24小时达到50％的击倒，C41T/C51A/D38A需要11.3pmol/g的剂量，C41S/C51S/D38A/L42V需要13.5pmol/g的剂量；或者，WT-Dc1a需要15.6pmol/g的剂量。
实施例12.玉米穗虫(CEW)注射
玉米穗虫(CEW)注射
评价注射到CEW中的DVP的测定如下进行：玉米穗虫(美洲棉铃虫)幼虫在其第四龄时被注射。购买美洲棉铃虫的卵(Benzon,Carlisle,PA)，并以通用鳞翅目食物(FrontierAgricultural Science,Newark,DE)饲养至四龄。在注射前，称重幼虫以计算pmol/g剂量。注射体积为1μL，并用30号针头和玻璃注射器在手动微量点滴仪(Burkard,Rickmansworth,Herts,England)中进行。注射后，将幼虫置于装有通用鳞翅目食物的新围栏中，并在注射后24小时评价它们的状况(包括死亡率、亚致死效应和行为)。
此处，将野生型Dc1a和C41T/C51A/D38A(SEQ ID NO:29)和C41S/C51S/D38A/L42V(SEQ ID NO:53)注射到CEW中，在24小时评估击倒百分比。
如图8所示，注射去除半胱氨酸的突变体导致CEW死亡率降低几个数量级。活性损失似乎局限于胱氨酸键位置(C41和C51)，因为C41A/C51A突变体在2500pmol/g的高剂量下没有活性。下面列出了比较家蝇和CEW击倒的表。
表8.家蝇死亡率和CEW死亡率的比较。
实施例13.改善CEW杀昆虫活性的突变
改善CEW杀昆虫活性的突变
进行Dc1a突变以筛选CEW活性的恢复。此处，根据上述方法合成并克隆突变体。简而言之，将4个单独的转化体在含有2％山梨醇和0.2％玉米浆的基本培养基中于23.5℃培养6天。合并上清液，并使用具有3000Da分子量截留值的离心过滤盒(Pall)浓缩10倍。然后将浓缩物注射到玉米穗虫(美洲棉铃虫)中。
玉米穗虫(CEW)幼虫在其第四龄时被注射。购买美洲棉铃虫的卵(BenzonResearch,7Kuhn Dr,Carlisle,PA,17015)，并以通用鳞翅目食物(Frontier AgriculturalScience,Newark,DE)饲养至四龄。在注射前，称重幼虫以计算pmol/g剂量。注射体积为1μL，并用30号针头和玻璃注射器在手动微量点滴仪(Burkard,Rickmansworth,Herts,England)中进行。注射部位靠近最后部腹足之一的底部。注射后，将幼虫置于装有通用鳞翅目食物的新围栏中，并在注射后24小时评价它们的状况(包括死亡率、亚致死效应和行为)。
表9.筛选改善CEW活性的突变体。
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表10.CEW击倒和表达分析。
表征后，位置C41的缬氨酸或甲硫氨酸显示产生与WT类似的更高活性，但缬氨酸会降低产量。D20突变为酪氨酸也能恢复WT样活性，即使当突变体是C41T/C51A时也是如此。
实施例14.DVP杀昆虫蛋白在植物中的表达
DVP杀昆虫蛋白在植物中的表达
评价DVP杀昆虫蛋白在植物、植物组织、植物细胞、植物种子或其部分中的表达。此处，使用被称为FECT的烟草瞬时表达系统技术(Liu Z&Kearney CM，BMC Biotechnology，2010年，第10卷：第88页，其公开内容全文以引用方式并入本文)进行DVP杀昆虫蛋白的克隆和表达。
简而言之，FECT载体包含用于农杆菌感染的T-DNA区，该区包含驱动没有编码病毒包膜蛋白质和三基因框的基因的狐尾花叶病毒RNA表达的CaMV 35S启动子。代替包膜蛋白质和三基因块的是一对亚克隆位点(Pac I和Avr II)，它们允许将DVP ORF在Pac I位点之后从N’到C’亚克隆，以实现高水平的瞬时病毒表达。这种“解除武装”病毒基因组阻止了植物间的传播。除了亚克隆以表达DVP的FECT载体之外，还共表达第二FECT载体，该第二FECT载体编码来自番茄丛矮病毒的RNA沉默抑制蛋白P19，以防止所引入T-DNA的转录后基因沉默(PTGS)。如下所述将含有瞬时植物表达系统的农杆菌注入烟草(本氏烟草)叶中。
此处所研究的DVP杀昆虫蛋白包含下列组分：内质网信号肽(ERSP)；泛素单体；间插接头肽；和组氨酸标签。
所用的ERSP基序是大麦α-淀粉酶信号肽(BAAS)，一种具有下列氨基酸序列(从N’到C’；单字母代码)的24个氨基酸的肽：MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG(SEQ ID NO:60)。
所用的玉蜀黍泛素单体是具有以下氨基酸序列(从N’到C’，单字母代码)的75个氨基酸的肽：QIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLADYNIQKESTLHLVLRLRGG(SEQ ID NO:183)(NCBI登录号XP_020404049.1)
用于编码在DVP杀昆虫蛋白中使用的DVP ORF的多核苷酸见下表11。
所用的间插接头肽具有以下氨基酸序列(从N’到C’，单字母代码)：ALKFLV(SEQ IDNO:184)或IGER(SEQ ID NO:54)。
所用的组氨酸标签具有以下氨基酸序列(从N’到C’，单字母代码)：HHHHHH(SEQ IDNO:185)。
因此，本实施例中使用的示例性DVP杀昆虫蛋白具有带有以下元件和取向的构建体：
ERSP-UBI-L-DVP-HIS
DVP杀昆虫蛋白的完整氨基酸序列的示例如下：
MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASGQIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLADYNIQKESTLHLVLRLRGGALKFLVAKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRCLKSGFFSSKCVCRDVHHHHHH(SEQ ID NO:186)
DVP杀昆虫蛋白的一般示意图示于图9。此处，前述构建体具有如下定义的组成部分：“ERSP”指内质网信号肽；“UBI”指泛素单体；“DVP”指Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a毒素或DVP；“L”指间插接头肽；“HIS”指组氨酸标签。
接下来，将用于编码DVP杀昆虫蛋白的多核苷酸，即具有下列ORF的DNA：“BAAS:UBI:L:DVP:HIS”或“baas-ubi-l-dvp-his”(其中BAAS是ERSP；UBI是泛素；L是接头肽)克隆到FECT表达载体的Pac I和Avr II限制性位点中以产生瞬时载体。然后使用如下冻融法将这些瞬时载体转化到根癌农杆菌菌株GV3101细胞中：将储存的感受态GV3101细胞在冰上解冻，然后与1μg-5μg纯瞬时载体DNA混合。然后将细胞-DNA混合物在冰上保持5分钟，并转移到-80℃5分钟；接着将混合物在37℃水浴中温育5分钟。然后将冻融处理的细胞稀释到1mLLB培养基中，并在室温下在摇床上振荡2小时至4小时。然后将细胞-LB混合物以5,000rcf离心2分钟来沉淀细胞，然后去除800μL LB上清液。然后将细胞重悬于剩余液体中，并将全部体积(大约200μL)的转化细胞-LB混合物涂布在具有适当抗生素(即，10μg/mL利福平、25μg/mL庆大霉素和50μg/mL卡那霉素)的LB琼脂平板上，并在28℃温育两天。然后挑取所得转化的菌落，并在6mL等分的LB培养基中培养，该培养基含有转化的DNA分析所需的适当抗生素，并产生转化的GV3101细胞的甘油储备物。
然后将转化的GV3101细胞划线接种到含有来自先前产生的甘油储备物的适当抗生素(如上所述)的LB平板上，并在28℃温育两天。转化的GV3101细胞的菌落用于接种5mLLB-MESA培养基(补充有10mM MES、20μM乙酰丁香酮的LB培养基)和上述相同的抗生素。然后将菌落在28℃生长过夜；然后通过以5000rpm离心10分钟收集细胞，并以1.0的最终OD600重悬于诱导培养基(10mM MES，10mM MgCl2，100μM乙酰丁香酮)中。然后将细胞在诱导培养基中于室温温育2小时至过夜。此时，细胞已准备好瞬时转化烟叶。
因为FECT使用P19表达和感兴趣的基因表达的混合物，所以在注射到植物叶中之前，将pFECT-P19转化的GV3101细胞的细胞培养物和感兴趣的基因培养物以等量混合在一起用于渗透烟叶。使用不带针头的3mL注射器通过注射将处理过的细胞浸润到本氏烟草植物附着叶的下侧。在浸润后6-8天评价烟叶中的蛋白质表达。
通过使用手动提取技术从烟草中纯化全长DVP杀昆虫蛋白。通过30mm直径的冲头从浸润区域获得叶组织，将叶组织卷起并置于具有两个5/32英寸直径的不锈钢研磨球的2mL锥形底管内，并在液氮中冷冻。然后使用Troemner-Talboys高通量匀浆器将样品匀浆。接下来，将750μL冰冷的总可溶性蛋白(TSP)提取液(磷酸钠溶液50mM，EDTA 1mM，pH 7.0)加入到管中并涡旋。然后将微管在室温下温育15分钟，然后在4℃下以16,000g离心15分钟。接下来，取100μL所得上清液并装入0.45μm Millipore MultiScreen过滤微量滴定板中的Pre-Sephadex G-50填充柱中，在底部具有空的接收Costar微量滴定板。然后将微量滴定板在4℃下以800g离心2分钟。将烟叶的所得滤液溶液(下文中称为“总可溶性蛋白提取物”或“TSP提取物”)准备用于下游分析。
然后使用标准蛋白质印迹技术分析样品。通过将10μL蛋白质样品与9μLInvitrogen 2X SDS上样缓冲液和2μL Novex 10X还原剂混合，并在85℃加热样品5分钟，制备蛋白质凝胶样品。然后将样品上样并在Novex Precast上运行，Novex Precast是在顶槽中含有0.1％硫代乙酸钠的16％Tricine凝胶的1x Invitrogen Tricine运行缓冲液以及Invitrogen SeeBlue Plus 2MWM。凝胶在150V下电泳75分钟。然后使用iBLOT系统上的7分钟转移程序将凝胶转移到新型PVDF膜上。一旦转移完成，将印迹膜移至容器中，用缓冲液A(1x TBS，由Quality Biological的10x TBS(0.25M tris碱，1.37M NaCl，0.03M KCL，pH7.4)制备)在室温下轻轻摇动洗涤五分钟。然后使用缓冲液B(含有1％ BSA的缓冲液A)进行封闭步骤1小时。然后用缓冲液C(含有0.05％ Tween 20的缓冲液B)冲洗印迹三次，每次5分钟。随后用缓冲液C中以1:10000稀释的Maine Biotech抗His抗体冲洗1小时。然后用缓冲液C冲洗印迹三次，每次5分钟。随后用在缓冲液C中以1:3000稀释的BioRad山羊抗小鼠AP缀合抗体(第二抗体)冲洗1小时。然后用缓冲液C冲洗印迹两次，每次5分钟，再用缓冲液A冲洗一次，每次5分钟。然后用BioRad AP显影剂使印迹显影，并通过用水冲洗而停止。
图10描绘了植物表达的dc1a和突变体的His-标签蛋白质印迹。每个孔代表在变性蛋白质凝胶条件下运行并用标准蛋白质印迹技术可视化的粗植物提取物。在图像上方列出了在蛋白质印迹中测试的样品的简称以及表达的评级系统。符号(-)表示印迹上未检测到蛋白质，并且如果检测到蛋白质，则符号(+)至(+++)表示通过目测检测到的相对量。标示“梯”的泳道示出了分子量标记。泳道“植物阴性对照”示出了阴性对照(即，表达GFP的烟草蛋白提取物)。标有“M#”的泳道表示所评价的DVP杀昆虫蛋白的简称，可在下表中找到。泳道“WT”表示具有WT Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a蛋白的DVP杀昆虫蛋白。
表11.测试的DVP杀昆虫蛋白和瞬时植物表达和昆虫活性的结果的总结(在以下实施例15的家蝇测定中评估的昆虫活性)。此处，“DVP序列”是指DVP杀昆虫构建体中的DVP：“ERSP-UBI-L-DVP-HIS”；构建体中的所有其他肽元件保持与上述相同。
*“ND”表示未检测到。“NA”表示不适用。在使用本氏烟草的这个实验中，没有检测到包含以下构建体的M6和M8 DVP杀昆虫蛋白的表达：ERSP-UBI-L-DVP-HIS，其中DVP是上表中M6或M8的对应DVP；因此，不能评估M6和M8突变体的活性，因此不适用。
实施例15.用植物表达的蛋白质进行的家蝇注射测定
用植物表达的蛋白质进行的家蝇注射测定
给家蝇注射从上述植物提取过程中获得的TSP提取物。在注射前，用CO2固定成年家蝇(普通家蝇)，并基于重量(12mg至20mg)选择家蝇用于注射。使用装有1cc注射器和30号针头的微量点滴仪，通过家蝇背侧胸腔的体壁，将每只家蝇0.5μL给定处理物(阴性对照或非天然存在的Mu-沙漠灌木蛛毒素-Dc1a蛋白杀昆虫蛋白)注射到家蝇体内。经注射的家蝇放入密闭容器中，容器盖上有潮湿的滤纸和呼吸孔，并根据注射后2小时的受影响评分进行评价。受影响评分包括击倒和死亡。
家蝇注射测定的结果如下所示。
表12.家蝇注射结果为植物中表达的DVP杀昆虫蛋白在注射后2小时的受影响百分比。此处，简称M#与上述相同。
样品 突变 受影响％
植物提取物(Neg) NA 0
CO2对照 NA 0
WT NA 100
M1 Y32S、P36A 60
M2 Y32K、P36A 60
M3 Y32H、P36A 80
M4 W31F、Y32S 100
M5 W31F、Y32S、P36A 60
M6 C41A、C51A 0
M8 Y32H、P36A、C41A、C51A 0
实施例16.高产量DVP
对具有C41S、C51S和D38A的氨基酸取代，即“AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSLKSG FFSSKSVCRDV”(C41S/C51S/D38A；SEQ ID NO:47)的DVP进行进一步评价以确定SEQ ID NO:47的点突变是否可导致改善的表达。对于此C41S/C51S/D38A DVP背景进行以下额外突变：L42I、K2L、Y32S、K2L+Y32S、D38T、D38S和D38M。
如上所述合成、克隆和表达多核苷酸构建体，并将产量相对于C41S/C51S/D38ADVP(SEQ ID NO:47)的平均产量归一化。创建用于编码下表中所示的DVP的构建体。
表13.高产量DVP。C41S/C51S/D38A DVP(SEQ ID NO:47)被进一步突变以包括以下突变：L42I、K2L、Y32S、K2L+Y32S、D38T、D38S和D38M。
如上所述(参见实施例1)，将表13中用于编码DVP的多核苷酸构建体插入pKlac1载体(目录号N3740；New England240County Road,Ipswich,MA 01938-2723)。然后将所得载体线性化，并转化到电感受态乳酸克鲁维酵母宿主细胞中，以便将线性化载体的多个拷贝稳定整合到乳酸克鲁维酵母宿主基因组的LAC4基因座上。然后将转化的乳酸克鲁维酵母涂布在含有乙酰胺作为唯一氮源的选择琼脂上，以鉴定含有表达盒的多个插入及其乙酰胺酶选择的菌株。
然后将菌落在含有2％山梨醇和0.2％玉米浆的基本培养基中于23.5℃培养6天。DVP的表达通过在Chromololith C18柱(EMD)上的HPLC分离和15％-35％乙腈的洗脱梯度进行评估。使用HPLC分级在Chromolith C18柱(EMD)上将1至2毫克WT ApsIII进一步纯化至＞99％的纯度。冻干后，用16180M-1cm-1的消光系数(ε)通过A280吸光度定量WT ApsIII。使用5μg-100μg的浓度范围建立HPLC标准曲线，并将斜率用于未知样品的定量。
将SEQ ID NO:210-219的DVP的产量与SEQ ID NO:47的DVP的产量进行比较。基于rpHPLC峰面积确定产量，然后相对于总的整合基因拷贝归一化。为了确定基因拷贝测量，使用酵母gDNA提取试剂盒(ThermoFisherScientific)提取gDNA，并使用delta delta Ct(ΔΔCt)方法通过qPCR分析确定拷贝数。峰面积相对于C41S/C51S/D38A DVP背景(SEQ ID NO:47)归一化。
如图11所示，C41S/C51S/D38A DVP背景的额外突变，即，L42I；K2L；Y32S；K2L+Y32S；D38T；和D38S；所有都具有相对于C41S/C51S/D38A DVP背景(SEQ ID NO:47)对照提高的产量。
实施例17.提高高产量DVP的突变
进一步评价实施例16中鉴定的DVP。此处，将以下DVP与野生型Dc1a(SEQ ID NO:2)进行比较：(1)具有以下氨基酸序列的K2L/Y32S/L42IDVP：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLDCRCIKSGFFSSKCVCRDV”(SEQ ID NO:217)；和(2)具有以下氨基酸序列的K2L/Y32S/D38A/L42I/C41S/C51S DVP：“ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV”(SEQ ID NO:218)。
根据实施例16中所述的方法合成并克隆上述DVP。如实施例16所述通过rpHPLC测定表达。峰面积相对于野生型Dc1a(SEQ ID NO:2)归一化。下表提供了DVP及其表达倍数提高的总结。
表14.突变提高了DVP的产量。将DVP：K2L/Y32S/L42I DVP(SEQ ID NO:217)和K2L/Y32S/D38A/L42I/C41S/C51S DVP(SEQ ID NO:218)的产量与WT Dc1a(SEQ ID NO:2)的产量进行比较。
如图12和表14所示，组合突变K2L、Y32S和L42I(SEQ ID NO:217)与野生型Dc1a相比，产量显著提高(提高19倍)。此外，在C41S/C51S/D38A DVP背景突变体(包括二硫键缺失(即，C41S/C41S))中组合K2L、Y32S和L42I突变，导致表达的甚至更大增加(提高63倍)。图12。
实施例18.胱氨酸结结构：概述
胱氨酸结结构本发明考虑和教导了工程化重组CRP的方法，该重组CRP包含根据以下式(II)的胱氨酸结(CK)结构、基本上由其组成或由其组成：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；其中半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；其中该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成该胱氨酸结基序的唯一二硫键；其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽亚基；其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在；其中所述重组CRP通过修饰具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP来产生，其中该一个或多个非CK二硫键不是该第一二硫键、该第二二硫键或该第三二硫键，并且其中该一个或多个非CK二硫键不形成该CK基序；其中通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰该可修饰CRP；其中从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的CK结构的重组CRP；并且其中具有根据式(II)的CK结构的重组CRP相对于不具有根据式(II)的CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
图13描绘了显示出式(II)的示意图，该示意图描述了具有胱氨酸结(CK)结构的重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)。此处，CI至CVI是半胱氨酸残基；半胱氨酸残基CI和CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；(二硫键由连接半胱氨酸残基的线表示)。该第一二硫键、该第二二硫键和该第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；其中该第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成胱氨酸结基序的唯一二硫键。NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是肽亚基，每个肽亚基包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列。在一些实施方案中，NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在。
实施例19.得到式(II)的CK结构：ApsIII
蛋白质Mu-cyrtautoxin-As1a(也称为“ApsIII”或“Aps-3”)是一种可修饰CRP，其被修饰成具有根据式(II)的CK结构。ApsIII是一种在活板门蛛(Apomastus schlingeri)中发现的杀昆虫蛋白。本文提供了示例性野生型ApsIII蛋白，其具有“CNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNCIGGGCSKTCGY”SEQ ID NO:193)(NCBI登录号P49268.1)的氨基酸序列。
野生型ApsIII蛋白在以下位置有四个二硫键：1至15；8至19；14至35；以及26至31。位置1至15、8至19、14至35处的二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；并且，跨越位置26至31的二硫键表示非CK二硫键，即，不参与产生胱氨酸结基序的二硫键。因此，去除跨越位置26至31的非CK二硫键，以产生具有根据式(II)的CK结构的重组ApsIII。
如上所述合成、克隆和表达多核苷酸构建体，并将产量相对于野生型ApsIII的平均值归一化。结果显示，当去除额外的非核心ICK二硫键时，产量提高了近50％。
简而言之，产生以下构建体：多核苷酸(SEQ ID NO:194)，其用于编码重组野生型ApsIII(SEQ ID NO:195)；和多核苷酸(SEQ ID NO:196)，其用于编码ApsIII dCys突变体(SEQ ID NO:197)。此处，ApsIII dCys突变体相对于SEQ ID NO:193所示的WT ApsIII序列具有C26A和C31A突变。C26A和C31A突变去除了第四二硫键。
如上所述(参见实施例1)，将这些多核苷酸构建体插入pKlac1载体(目录号N3740；New England240County Road,Ipswich,MA 01938-2723)。然后将所得载体线性化，并转化到电感受态乳酸克鲁维酵母宿主细胞中，以便将线性化载体的多个拷贝稳定整合到乳酸克鲁维酵母宿主基因组的LAC4基因座上。然后将转化的乳酸克鲁维酵母涂布在含有乙酰胺作为唯一氮源的选择琼脂上，以鉴定含有表达盒的多个插入及其乙酰胺酶选择的菌株。
然后将菌落在含有2％山梨醇和0.2％玉米浆的基本培养基中于23.5℃培养6天。WT ApsIII和ApsIII dCys的表达通过在Chromololith C18柱(EMD)上的HPLC分离和15％-35％乙腈的洗脱梯度进行评估。使用HPLC分级在Chromolith C18柱(EMD)上将1至2毫克WTApsIII进一步纯化至＞99％的纯度。冻干后，用16180M-1cm-1的消光系数(ε)通过A280吸光度定量WT ApsIII。使用5μg-100μg的浓度范围建立HPLC标准曲线，并将斜率用于未知样品的定量。
基于rpHPLC峰面积确定WT ApsIII和ApsIII dCys的产量(每种n＝8)，然后相对于总的整合基因拷贝归一化。为了确定基因拷贝测量，使用酵母gDNA提取试剂盒(ThermoFisherScientific)提取gDNA，并使用delta delta Ct(ΔΔCt)方法通过qPCR分析确定拷贝数。使用Graphpad Prism 9.2.0版生成显示相对产量的小提琴图。图14。结果显示，当去除额外的非CK二硫键时，产量提高了50.2％。
实施例20.得到式(II)的CK结构：K-ACTX肽
可修饰CRP Kappa-ACTX肽(也称为“Kappa-ACTX”或“κ-ACTX”)被修饰成具有根据式(II)的CK结构。
Kappa-ACTX是杀昆虫抑制剂胱氨酸结(ICK)肽家族的成员，该肽已从属于Atracinae亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离出来。一种这样的蜘蛛被称为澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛，其学名为澳大利亚漏斗网蜘蛛。本文提供了示例性的野生型Kappa-ACTX肽，具有以下氨基酸序列：“AICTGADRPCAACCPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP”(SEQ ID NO:198)(UniProtKB/Swiss-Prot No.P82228.1)。
野生型Kappa-ACTX蛋白在以下位置有四个二硫键：3至17；10至22；13至14；以及16至32。位置3至17、10至22和16至32处的二硫键是形成胱氨酸结基序的二硫键，并且二硫键拓扑结构形成ICK。跨越位置13至14的二硫键代表非CK二硫键，即，不参与产生胱氨酸结基序(即，ICK)的二硫键。因此，去除跨越位置13至14的非CK二硫键，以产生具有根据式(II)的CK结构的重组Kappa-ACTX。
编码Kappa-ACTX ORF的多核苷酸构建体由Twist Biosciences(https://www.twistbioscience.com；681Gateway Blvd South San Francisco,CA 94080)合成并克隆。Kappa-ACTX ORF编码以下蛋白：WT Kappa-ACTX(SEQ ID NO:198)；具有C13A突变的Kappa-ACTX突变体(SEQ ID NO:199)；具有C14A突变的Kappa-ACTX突变体(SEQ ID NO:200)；和具有C13A和C14A突变的Kappa-ACTX突变体(SEQ ID NO:201)。
对构建体进行密码子优化并合成为与乳酸克鲁维酵母α交配因子前/原序列(αMF)的融合体，并连接到pKlac1(目录号N3740；New England240County Road,Ipswich,MA 01938-2723)的NotI和HindIII限制位点中。pKlac1载体含有乳酸克鲁维酵母PLAC4-PBI启动子(1)、编码乳酸克鲁维酵母α-交配因子(α-MF)分泌结构域(用于分泌表达)的DNA、多克隆位点(MCS)、乳酸克鲁维酵母LAC4转录终止子(TT)和从酵母ADH2启动子(PADH2)表达的真菌乙酰胺酶选择标记基因(amdS)。此外，存在大肠杆菌复制起点(ORI)和氨苄青霉素抗性基因(ApR)用于pKLAC1在大肠杆菌中的繁殖。
用SacII消化载体以线性化并去除细菌Ori和选择标记，然后电穿孔到电感受态乳酸克鲁维酵母细胞中。然后将菌落在含有2％山梨醇和0.2％玉米浆的基本培养基中于23.5℃培养6天。在含有乙酰胺作为唯一氮源的选择板上选择多基因拷贝转化体。
产量比较是基于如上所述HPLC程序中确定的峰面积(mAU)。简而言之，表达蛋白质的克隆通过HPLC在Chromolith C18柱(4.6×100mm)上评估，并以2mL min-1的流速和5％-30％乙腈梯度洗脱5分钟。
下表显示了从Kappa-ACTX中去除邻位二硫键以获得根据式(II)的CK结构的结果。
表15.具有根据式(II)的CK结构的Kappa-ACTX突变体表达水平的增加。
如上表14所示，将Kappa-ACTX修饰成具有根据式(II)的CK结构导致产量增加。
序列表
<110> 韦斯塔隆公司
<120> 用于害虫防治的MU-沙漠灌木蛛毒素-DC1A变体多肽
<130> 225312-497884
<150> 美国临时申请号63/084,339
<151> 2020-09-28
<160> 249
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 94
<212> PRT
<213> 美国沙漠蜘蛛（Diguetia canities）
<400> 1
Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala Val Tyr
1 5 10 15
Ala Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp Ile Met Leu Asp Ser
20 25 30
Pro Ala Asp Met Glu Arg Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala
35 40 45
Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln
50 55 60
Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu
65 70 75 80
Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
85 90
<210> 2
<211> 56
<212> PRT
<213> 美国沙漠蜘蛛
<400> 2
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 3
<211> 56
<212> PRT
<213> 美国沙漠蜘蛛
<400> 3
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 4
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二硫键缺失
<400> 4
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Gly Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Phe Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 5
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二硫键缺失
<400> 5
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Gly Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Phe Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 6
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A DVP
<400> 6
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 7
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41A/ C51A (A/A) DVP
<400> 7
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Ala Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 8
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51A (S/A) DVP
<400> 8
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 9
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41V/ C51A (V/A) DVP
<400> 9
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Val Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 10
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41A/ C51T (A/T) DVP
<400> 10
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Ala Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 11
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41A/ C51S (A/S) DVP
<400> 11
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Ala Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 12
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41A/ C51V (A/V) DVP
<400> 12
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Ala Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Val Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 13
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 13
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 14
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51S DVP
<400> 14
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 15
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 15
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Ala Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ala Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Ala Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
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50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
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1 5 10 15
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20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 20
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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20 25 30
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35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A DVP
<400> 21
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1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 22
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ L42A DVP
<400> 22
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Ala Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 23
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ V52A DVP
<400> 23
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Ala Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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1 5 10 15
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35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ W31F/ Y32S/ P36A DVP
<400> 26
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Phe Ser
20 25 30
Lys Trp Arg Ala Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20A/ L42V DVP
<400> 28
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Ala Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A DVP
<400> 29
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 30
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38K DVP
<400> 30
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Lys Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 31
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38S DVP
<400> 31
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ser Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 32
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ V52T DVP
<400> 32
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
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35 40 45
Ser Lys Ala Thr Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ V52A DVP
<400> 33
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
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35 40 45
Ser Lys Ala Ala Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 34
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ V17E DVP
<400> 34
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 35
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ L42V DVP
<400> 35
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 36
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ L42S DVP
<400> 36
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Ser Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 37
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ L42E DVP
<400> 37
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Glu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 38
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ L42Q DVP
<400> 38
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Gln Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 39
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ D20A DVP
<400> 39
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Ala Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 40
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20A/ Y32S DVP
<400> 40
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Ala Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ser
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 41
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ Y32S DVP
<400> 41
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ser
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 42
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20A/ D38A/ Y32S DVP
<400> 42
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Ala Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ser
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 43
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20A/ W31F/ Y32S/ P36A DVP
<400> 43
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Ala Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Phe Ser
20 25 30
Lys Trp Arg Ala Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 44
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D38A DVP
<400> 44
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 45
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51T/ D38A (S/T + D38A) DVP
<400> 45
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 46
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51T/ D38A (T/T + D38A) DVP
<400> 46
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 47
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51S/ D38A (S/S + D38A) DVP
<400> 47
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 48
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51S/ D38A (T/S + D38A) DVP
<400> 48
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 49
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41V/ C51T/ D38A (V/T + D38A) DVP
<400> 49
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Val Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 50
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51V/ D38A (T/V + D38A) DVP
<400> 50
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Val Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 51
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51V/ D38A (S/V + D38A) DVP
<400> 51
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Val Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 52
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41V/ C51S/ D38A (V/S + D38A) DVP
<400> 52
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Val Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 53
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51S/ D38A/L42V (S/S + D38A/L42V) DVP
<400> 53
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 54
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGER
<400> 54
Ile Gly Glu Arg
1
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EEKKN
<400> 55
Glu Glu Lys Lys Asn
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ETMFKHGL
<400> 56
Glu Thr Met Phe Lys His Gly Leu
1 5
<210> 57
<211> 238
<212> PRT
<213> 维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）
<400> 57
Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe
50 55 60
Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg
65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 58
<211> 157
<212> PRT
<213> 雪滴花（Galanthus nivalis）
<400> 58
Met Ala Lys Ala Ser Leu Leu Ile Leu Ala Thr Ile Phe Leu Gly Val
1 5 10 15
Ile Thr Pro Ser Cys Leu Ser Glu Asn Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Thr
20 25 30
Leu Pro Thr Gly Gly Phe Leu Ser Ser Gly Ser Phe Val Phe Ile Met
35 40 45
Gln Glu Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asn Val Asp Lys Pro Ile Trp
50 55 60
Ala Thr Asn Thr Gly Gly Leu Ser Ser Asp Cys Ser Leu Ser Met Gln
65 70 75 80
Asn Asp Gly Asn Leu Val Val Phe Thr Pro Ser Asn Lys Pro Ile Trp
85 90 95
Ala Ser Asn Thr Asp Gly Gln Asn Gly Asn Tyr Val Cys Ile Leu Gln
100 105 110
Lys Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Thr Asn Arg Trp Ala Thr Gly
115 120 125
Thr Tyr Thr Gly Ala Val Gly Ile Pro Glu Ser Pro Pro Ser Glu Lys
130 135 140
Tyr Pro Ser Ala Gly Lys Ile Lys Leu Val Thr Ala Lys
145 150 155
<210> 59
<211> 225
<212> PRT
<213> 阿什杜松（Juniperus ashei）
<400> 59
Met Ala Arg Val Ser Glu Leu Ala Phe Leu Leu Ala Ala Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ile Ser Leu His Met Gln Glu Ala Gly Val Val Lys Phe Asp Ile Lys
20 25 30
Asn Gln Cys Gly Tyr Thr Val Trp Ala Ala Gly Leu Pro Gly Gly Gly
35 40 45
Lys Arg Leu Asp Gln Gly Gln Thr Trp Thr Val Asn Leu Ala Ala Gly
50 55 60
Thr Ala Ser Ala Arg Phe Trp Gly Arg Thr Gly Cys Thr Phe Asp Ala
65 70 75 80
Ser Gly Lys Gly Ser Cys Gln Thr Gly Asp Cys Gly Gly Gln Leu Ser
85 90 95
Cys Thr Val Ser Gly Ala Val Pro Ala Thr Leu Ala Glu Tyr Thr Gln
100 105 110
Ser Asp Gln Asp Tyr Tyr Asp Val Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Ile
115 120 125
Pro Leu Ala Ile Asn Pro Thr Asn Ala Gln Cys Thr Ala Pro Ala Cys
130 135 140
Lys Ala Asp Ile Asn Ala Val Cys Pro Ser Glu Leu Lys Val Asp Gly
145 150 155 160
Gly Cys Asn Ser Ala Cys Asn Val Phe Lys Thr Asp Gln Tyr Cys Cys
165 170 175
Arg Asn Ala Tyr Val Asp Asn Cys Pro Ala Thr Asn Tyr Ser Lys Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Gln Cys Pro Gln Ala Tyr Ser Tyr Ala Lys Asp Asp Thr
195 200 205
Ala Thr Phe Ala Cys Ala Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Ile Val Phe Cys
210 215 220
Pro
225
<210> 60
<211> 24
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 60
Met Ala Asn Lys His Leu Ser Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ser Gly
20
<210> 61
<211> 27
<212> PRT
<213> 皱叶烟草（Nicotiana plumbaginifolia）
<400> 61
Glu Met Gly Lys Met Ala Ser Leu Phe Ala Ser Leu Leu Val Val Leu
1 5 10 15
Val Ser Leu Ser Leu Ala Ser Glu Ser Ser Ala
20 25
<210> 62
<211> 26
<212> PRT
<213> 皱叶烟草
<400> 62
Met Gly Lys Met Ala Ser Leu Phe Ala Thr Phe Leu Val Val Leu Val
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ala Ser Glu Ser Ser Ala
20 25
<210> 63
<211> 78
<212> PRT
<213> 皱叶烟草
<400> 63
Ala Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala Gly Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr
1 5 10 15
Cys Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Thr
20 25 30
Gly Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr
35 40 45
Thr Cys Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr
50 55 60
Cys Thr Gly Ala Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr
65 70 75
<210> 64
<211> 78
<212> PRT
<213> 皱叶烟草
<400> 64
Ala Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala Gly Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr
1 5 10 15
Cys Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr Ala Cys Thr Thr Thr
20 25 30
Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr
35 40 45
Thr Cys Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr
50 55 60
Cys Thr Gly Ala Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr
65 70 75
<210> 65
<211> 224
<212> PRT
<213> 阿什杜松
<400> 65
Lys Phe Asp Ile Lys Asn Gln Cys Gly Tyr Thr Val Trp Ala Ala Gly
1 5 10 15
Leu Pro Gly Gly Gly Lys Arg Leu Asp Gln Gly Gln Thr Trp Thr Val
20 25 30
Asn Leu Ala Ala Gly Thr Ala Ser Ala Arg Phe Trp Gly Arg Thr Gly
35 40 45
Cys Thr Phe Asp Ala Ser Gly Lys Gly Ser Cys Gln Thr Gly Asp Cys
50 55 60
Gly Gly Gln Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Ala Val Pro Ala Thr Leu
65 70 75 80
Ala Glu Tyr Thr Gln Ser Asp Gln Asp Tyr Tyr Asp Val Ser Leu Val
85 90 95
Asp Gly Phe Asn Ile Pro Leu Ala Ile Asn Pro Thr Asn Ala Gln Cys
100 105 110
Thr Ala Pro Ala Cys Lys Ala Asp Ile Asn Ala Val Cys Pro Ser Glu
115 120 125
Leu Lys Val Asp Gly Gly Cys Asn Ser Ala Cys Asn Val Phe Lys Thr
130 135 140
Asp Gln Tyr Cys Cys Arg Asn Ala Tyr Val Asp Asn Cys Pro Ala Thr
145 150 155 160
Asn Tyr Ser Lys Ile Phe Lys Asn Gln Cys Pro Gln Ala Tyr Ser Tyr
165 170 175
Ala Lys Asp Asp Thr Ala Thr Phe Ala Cys Ala Ser Gly Thr Asp Tyr
180 185 190
Ser Ile Val Phe Cys Met Ala Arg Val Ser Glu Leu Ala Phe Leu Leu
195 200 205
Ala Ala Thr Leu Ala Ile Ser Leu His Met Gln Glu Ala Gly Val Val
210 215 220
<210> 66
<211> 105
<212> PRT
<213> 雪滴花
<400> 66
Asp Asn Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Thr Leu Ser Thr Gly Glu Phe Leu
1 5 10 15
Asn Tyr Gly Ser Phe Val Phe Ile Met Gln Glu Asp Cys Asn Leu Val
20 25 30
Leu Tyr Asp Val Asp Lys Pro Ile Trp Ala Thr Asn Thr Gly Gly Leu
35 40 45
Ser Arg Ser Cys Phe Leu Ser Met Gln Thr Asp Gly Asn Leu Val Val
50 55 60
Tyr Asn Pro Ser Asn Lys Pro Ile Trp Ala Ser Asn Thr Gly Gly Gln
65 70 75 80
Asn Gly Asn Tyr Val Cys Ile Leu Gln Lys Asp Arg Asn Val Val Ile
85 90 95
Tyr Gly Thr Asp Arg Trp Ala Thr Gly
100 105
<210> 67
<211> 27
<212> PRT
<213> 蛇锁海葵（Anemonia viridis）
<400> 67
Arg Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn
1 5 10 15
Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val
20 25
<210> 68
<211> 47
<212> PRT
<213> 蛇锁海葵
<400> 68
Gly Val Pro Cys Leu Cys Asp Ser Asp Gly Pro Ser Val Arg Gly Asn
1 5 10 15
Thr Leu Ser Gly Ile Ile Trp Leu Ala Gly Cys Pro Ser Gly Trp His
20 25 30
Asn Cys Lys Lys His Gly Pro Thr Ile Gly Trp Cys Cys Lys Gln
35 40 45
<210> 69
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Av3a
<400> 69
Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn
1 5 10 15
Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val
20 25
<210> 70
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Av3a-C1
<400> 70
Arg Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn
1 5 10 15
Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys
20 25
<210> 71
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Av3b
<400> 71
Lys Ser Cys Cys Pro Cys Tyr Trp Gly Gly Cys Pro Trp Gly Gln Asn
1 5 10 15
Cys Tyr Pro Glu Gly Cys Ser Gly Pro Lys
20 25
<210> 72
<211> 282
<212> DNA
<213> 美国沙漠蜘蛛
<400> 72
atgaaggttt ttgttgtact gttgtgcttg tctctggcag cagtttacgc cttggaggaa 60
agactagaca aagacgccga catcatgctt gattcaccag ccgacatgga aagagcgaag 120
gacggtgacg tggaagggcc tgcgggctgc aagaaatacg acgtagagtg cgacagtgga 180
gagtgctgcc agaagcagta cctgtggtac aagtggcgac ccctggattg ccgatgccta 240
aagagcggtt tcttcagcag caagtgcgtt tgcagagacg tg 282
<210> 73
<211> 168
<212> DNA
<213> 美国沙漠蜘蛛
<400> 73
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168
<210> 74
<211> 168
<212> DNA
<213> 美国沙漠蜘蛛
<400> 74
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168
<210> 75
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二硫键缺失
<400> 75
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
ggcttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tttgtttgta gagatgtt 168
<210> 76
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二硫键缺失
<400> 76
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
ggcttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tttgtttgta gagatgtt 168
<210> 77
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A DVP
<400> 77
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 78
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41A/ C51A (A/A) DVP
<400> 78
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
gcattgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 79
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51A (S/A) DVP
<400> 79
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 80
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41V/ C51A (V/A) DVP
<400> 80
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
gttttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 81
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41A/ C51T (A/T) DVP
<400> 81
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
gcattgaaat ctggtttctt ctcttctaaa actgtttgta gagatgtt 168
<210> 82
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41A/ C51S (A/S) DVP
<400> 82
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
gcattgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 83
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41A/ C51V (A/V) DVP
<400> 83
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
gcattgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gttgtttgta gagatgtt 168
<210> 84
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51S DVP
<400> 84
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 85
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51S DVP
<400> 85
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
agtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tcagtttgta gagatgttt 169
<210> 86
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ V17A DVP
<400> 86
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgc tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 87
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20A DVP
<400> 87
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 88
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ S21A DVP
<400> 88
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
gctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 89
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ W31A DVP
<400> 89
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg gcttataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 90
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ Y32A DVP
<400> 90
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tgggctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 91
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ P36A DVP
<400> 91
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagagcttt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 92
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A DVP
<400> 92
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 93
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ L42A DVP
<400> 93
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actgctaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 94
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ V52A DVP
<400> 94
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgcttgta gagatgtt 168
<210> 95
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ W31F DVP
<400> 95
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg ttttataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 96
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ Y32S DVP
<400> 96
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 97
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ W31F/ Y32S/ P36A DVP
<400> 97
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg ttttctaaat ggagagcttt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 98
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20A/ L42N DVP
<400> 98
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actaataaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 99
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20A/ L42V DVP
<400> 99
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actgttaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 100
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A DVP
<400> 100
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 101
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38K DVP
<400> 101
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt gagatgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 102
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38S DVP
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gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt gtcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
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<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ V52T DVP
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gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctacttgta gagatgtt 168
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<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ V52A DVP
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gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgcttgta gagatgtt 168
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<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
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gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatga agaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
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<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ L42V DVP
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gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actgttaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
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<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ L42S DVP
<400> 107
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
acttctaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 108
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ L42E DVP
<400> 108
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actgaaaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 109
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ L42Q DVP
<400> 109
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actcaaaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 110
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ D20A DVP
<400> 110
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 111
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20A/ Y32S DVP
<400> 111
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 112
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ Y32S DVP
<400> 112
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 113
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20A/ D38A/ Y32S DVP
<400> 113
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 114
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20A/ W31F/ Y32S/ P36A DVP
<400> 114
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg ttttctaaat ggagagcttt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 115
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D38A DVP
<400> 115
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168
<210> 116
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51T/ D38A (S/T + D38A) DVP
<400> 116
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa agtgtttgta gagatgtt 168
<210> 117
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51T/ D38A (T/T + D38A) DVP
<400> 117
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa agtgtttgta gagatgtt 168
<210> 118
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51S/ D38A (S/S + D38A) DVP
<400> 118
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 119
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51S/ D38A (T/S + D38A) DVP
<400> 119
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 120
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41V/ C51T/ D38A (V/T + D38A) DVP
<400> 120
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
gttttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa actgtttgta gagatgtt 168
<210> 121
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51V/ D38A (T/V + D38A) DVP
<400> 121
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gttgtttgta gagatgtt 168
<210> 122
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51V/ D38A (S/V + D38A) DVP
<400> 122
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gttgtttgta gagatgtt 168
<210> 123
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41V/ C51S/ D38A (V/S + D38A) DVP
<400> 123
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
gttttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 124
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51S/ D38A/L42V (S/S + D38A/L42V) DVP
<400> 124
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
agtgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa tcggtttgca gggatgtt 168
<210> 125
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41N/ C51A/ D38A/ L42V DVP
<400> 125
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Asn Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 126
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41D/ C51A/ D38A/ L42V DVP
<400> 126
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Asp Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 127
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51A/ D38A/ L42V DVP
<400> 127
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 128
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41M/ C51A/ D38A/ L42V DVP
<400> 128
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Met Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 129
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51G/ D38A/ L42V DVP
<400> 129
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Gly Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 130
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51D/ D38A/ L42V DVP
<400> 130
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Asp Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 131
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51N/ D38A/ L42V DVP
<400> 131
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Asn Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 132
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51Q/ D38A/ L42V DVP
<400> 132
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Gln Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 133
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51E/ D38A/ L42V DVP
<400> 133
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Glu Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 134
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51V/ D38A/ L42V DVP
<400> 134
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Val Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 135
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51H/ D38A/ L42V DVP
<400> 135
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys His Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 136
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51M/ D38A/ L42V DVP
<400> 136
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Met Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 137
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41V/ C51V/ D38A/ L42V DVP
<400> 137
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Val Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Val Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 138
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41M/ C51M/ D38A/ L42V DVP
<400> 138
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Met Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Met Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 139
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41K/ C51E/ D38A/ L42V DVP
<400> 139
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Lys Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Glu Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 140
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41E/ C51K/ D38A/ L42V DVP
<400> 140
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Glu Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Lys Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 141
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20V/ D38A/ L42V DVP
<400> 141
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Val Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 142
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20G/ D38A/ L42V DVP
<400> 142
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Gly Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 143
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20K/ D38A/ L42V DVP
<400> 143
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Lys Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 144
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20E/ D38A/ L42V DVP
<400> 144
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Glu Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 145
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20L/ D38A/ L42V DVP
<400> 145
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Leu Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 146
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20N/ D38A/ L42V DVP
<400> 146
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1 5 10 15
Val Glu Cys Asn Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 147
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20Y/ D38A/ L42V DVP
<400> 147
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ S21G/ D38A/ L42V DVP
<400> 148
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Gly Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 149
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ E18P/ D38A/ L42V DVP
<400> 149
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Pro Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ E18K/ D38A/ L42V DVP
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Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
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Val Lys Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 151
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ E18S/ D38A/ L42V DVP
<400> 151
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Ser Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 152
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ E18D/ D38A/ L42V DVP
<400> 152
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Asp Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Val Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 153
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41N/ C51A/ D38A/ L42V DVP
<400> 153
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
aatgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gcagtttgca gggatgtt 168
<210> 154
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41D/ C51A/ D38A/ L42V DVP
<400> 154
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
gatgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gcagtttgca gggatgtt 168
<210> 155
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41S/ C51A/ D38A/ L42V DVP
<400> 155
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
tctgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gcagtttgca gggatgtt 168
<210> 156
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41M/ C51A/ D38A/ L42V DVP
<400> 156
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
atggtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gcagtttgca gggatgtt 168
<210> 157
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51G/ D38A/ L42V DVP
<400> 157
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa ggtgtttgca gggatgtt 168
<210> 158
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51D/ D38A/ L42V DVP
<400> 158
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gatgtttgca gggatgtt 168
<210> 159
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51N/ D38A/ L42V DVP
<400> 159
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa aatgtttgca gggatgtt 168
<210> 160
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51Q/ D38A/ L42V DVP
<400> 160
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa caagtttgca gggatgtt 168
<210> 161
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51E/ D38A/ L42V DVP
<400> 161
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gaagtttgca gggatgtt 168
<210> 162
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51V/ D38A/ L42V DVP
<400> 162
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gtcgtttgca gggatgtt 168
<210> 163
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51H/ D38A/ L42V DVP
<400> 163
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa catgtttgca gggatgtt 168
<210> 164
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51M/ D38A/ L42V DVP
<400> 164
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa atggtttgca gggatgtt 168
<210> 165
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41V/ C51V/ D38A/ L42V DVP
<400> 165
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
gtcgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gtagtttgca gggatgtt 168
<210> 166
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41M/ C51M/ D38A/ L42V DVP
<400> 166
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
atggtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa atggtttgca gggatgtt 168
<210> 167
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41K/ C51E/ D38A/ L42V DVP
<400> 167
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
aaagtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gaagtttgca gggatgtt 168
<210> 168
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41E/ C51K/ D38A/ L42V DVP
<400> 168
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
gaagtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa aaagtttgca gggatgtt 168
<210> 169
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20V/ D38A/ L42V DVP
<400> 169
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgtc 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 170
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20G/ D38A/ L42V DVP
<400> 170
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtggc 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 171
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20K/ D38A/ L42V DVP
<400> 171
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtaaa 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 172
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20E/ D38A/ L42V DVP
<400> 172
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgaa 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 173
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20L/ D38A/ L42V DVP
<400> 173
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgttta 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 174
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20N/ D38A/ L42V DVP
<400> 174
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtaat 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 175
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D20Y/ D38A/ L42V DVP
<400> 175
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgttat 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 176
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ S21G/ D38A/ L42V DVP
<400> 176
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60
ggaggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 177
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ E18P/ D38A/ L42V DVP
<400> 177
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt accttgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 178
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ E18K/ D38A/ L42V DVP
<400> 178
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt aaaatgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 179
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ E18S/ D38A/ L42V DVP
<400> 179
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt atcttgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 180
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ E18D/ D38A/ L42V DVP
<400> 180
gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agactgtgac 60
tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120
actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168
<210> 181
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41V/ C51T/ D38A/ L42V DVP
<400> 181
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Val Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 182
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41N/ C51A DVP
<400> 182
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Asn Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 183
<211> 75
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 183
Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val
1 5 10 15
Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys
20 25 30
Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln
35 40 45
Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser
50 55 60
Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75
<210> 184
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 184
Ala Leu Lys Phe Leu Val
1 5
<210> 185
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组氨酸标签
<400> 185
His His His His His His
1 5
<210> 186
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DVP杀昆虫蛋白
<400> 186
Met Ala Asn Lys His Leu Ser Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ser Gly Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr
20 25 30
Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn
35 40 45
Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln
50 55 60
Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu
85 90 95
Arg Gly Gly Ala Leu Lys Phe Leu Val Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu
100 105 110
Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu
115 120 125
Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys
130 135 140
Arg Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp
145 150 155 160
Val His His His His His His
165
<210> 187
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32S/ P36A DVP
<400> 187
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ser
20 25 30
Lys Trp Arg Ala Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 188
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32K/ P36A DVP
<400> 188
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Lys
20 25 30
Lys Trp Arg Ala Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 189
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32H/ P36A DVP
<400> 189
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp His
20 25 30
Lys Trp Arg Ala Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 190
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> W31F/ Y32S DVP
<400> 190
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Phe Ser
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 191
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> W31F/ Y32S/ P36A DVP
<400> 191
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Phe Ser
20 25 30
Lys Trp Arg Ala Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 192
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32H/ P36A/ C41A/ C51A DVP
<400> 192
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp His
20 25 30
Lys Trp Arg Ala Leu Asp Cys Arg Ala Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 193
<211> 37
<212> PRT
<213> 活板门蛛（Apomastus schlingeri）
<400> 193
Cys Asn Ser Lys Gly Thr Pro Cys Thr Asn Ala Asp Glu Cys Cys Gly
1 5 10 15
Gly Lys Cys Ala Tyr Asn Val Trp Asn Cys Ile Gly Gly Gly Cys Ser
20 25 30
Lys Thr Cys Gly Tyr
35
<210> 194
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rWT AspII DNA
<400> 194
Gly Gly Cys Ala Gly Thr Thr Gly Cys Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gly Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Thr Gly Thr Ala Cys
20 25 30
Cys Ala Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Thr Gly Thr
35 40 45
Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly Thr Gly
50 55 60
Cys Ala Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala
65 70 75 80
Cys Thr Gly Thr Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala
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Thr Gly Cys Thr Cys Thr Ala Ala Gly Ala Cys Ala Thr Gly Cys Gly
100 105 110
Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ala Ala
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 195
Gly Ser Cys Asn Ser Lys Gly Thr Pro Cys Thr Asn Ala Asp Glu Cys
1 5 10 15
Cys Gly Gly Lys Cys Ala Tyr Asn Val Trp Asn Cys Ile Gly Gly Gly
20 25 30
Cys Ser Lys Thr Cys Gly Tyr
35
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 196
Gly Gly Cys Ala Gly Thr Thr Gly Cys Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gly Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Thr Gly Thr Ala Cys
20 25 30
Cys Ala Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Thr Gly Thr
35 40 45
Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly Thr Gly
50 55 60
Cys Ala Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala
65 70 75 80
Cys Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala
85 90 95
Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Ala Gly Ala Cys Ala Thr Gly Cys Gly
100 105 110
Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ala Ala
115 120
<210> 197
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rApsIII dCys
<400> 197
Gly Ser Cys Asn Ser Lys Gly Thr Pro Cys Thr Asn Ala Asp Glu Cys
1 5 10 15
Cys Gly Gly Lys Cys Ala Tyr Asn Val Trp Asn Ala Ile Gly Gly Gly
20 25 30
Ala Ser Lys Thr Cys Gly Tyr
35
<210> 198
<211> 37
<212> PRT
<213> 澳大利亚漏斗网蜘蛛（Hadronyche versuta）
<400> 198
Ala Ile Cys Thr Gly Ala Asp Arg Pro Cys Ala Ala Cys Cys Pro Cys
1 5 10 15
Cys Pro Gly Thr Ser Cys Lys Ala Glu Ser Asn Gly Val Ser Tyr Cys
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<220>
<223> Kappa-ACTX C13A
<400> 199
Ala Ile Cys Thr Gly Ala Asp Arg Pro Cys Ala Ala Ala Cys Pro Cys
1 5 10 15
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20 25 30
Arg Lys Asp Glu Pro
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> Kappa-ACTX C14A
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Ala Ile Cys Thr Gly Ala Asp Arg Pro Cys Ala Ala Cys Ala Pro Cys
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Cys Pro Gly Thr Ser Cys Lys Ala Glu Ser Asn Gly Val Ser Tyr Cys
20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
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Ala Ile Cys Thr Gly Ala Asp Arg Pro Cys Ala Ala Ala Ala Pro Cys
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20 25 30
Arg Lys Asp Glu Pro
35
<210> 202
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ Y29A DVP
<400> 202
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
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50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ G45A DVP
<400> 203
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Ala Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ F47A DVP
<400> 204
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Ala Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ R54A DVP
<400> 205
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Ala Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ Y32A DVP
<400> 206
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ala
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 207
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ P36A DVP
<400> 207
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Ala Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val
50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ L42H DVP
<400> 208
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1 5 10 15
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50 55
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<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32S/ D38A/ C41S/ L42I/ C51S DVP
<400> 209
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
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50 55
<210> 210
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP
<400> 210
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
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35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 211
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K2L/ D38A/ C41S/ C51S DVP
<400> 211
Ala Leu Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
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Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
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Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 212
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32S/ D38A/ C41S/ C51S DVP
<400> 212
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ser
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 213
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K2L/ Y32S/ D38A/ C41S/ C51S DVP
<400> 213
Ala Leu Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ser
20 25 30
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35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 214
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D38T/ C41S/ C51S DVP
<400> 214
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Thr Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 215
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D38S/ C41S/ C51S DVP
<400> 215
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ser Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 216
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D38M/ C41S/ C51S DVP
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Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Met Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 217
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K2L/ Y32S/ L42I DVP
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Ala Leu Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Ile Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 218
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K2L/ Y32S/ D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP
<400> 218
Ala Leu Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ser
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Ile Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val
50 55
<210> 219
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K2L/ D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP
<400> 219
Ala Leu Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp
1 5 10 15
Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr
20 25 30
Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Ile Lys Ser Gly Phe Phe Ser
35 40 45
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50 55
<210> 220
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP
<400> 220
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tctattaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 221
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K2L/ D38A/ C41S/ C51S DVP
<400> 221
gctttggatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 222
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32S/ D38A/ C41S/ C51S DVP
<400> 222
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 223
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K2L/ Y32S/ D38A/ C41S/ C51S DVP
<400> 223
gctttggatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 224
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D38T/ C41S/ C51S DVP
<400> 224
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt gacttgtaga 120
tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 225
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D38S/ C41S/ C51S DVP
<400> 225
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt gtcttgtaga 120
tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 226
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D38M/ C41S/ C51S DVP
<400> 226
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt gatgtgtaga 120
tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 227
<211> 168
<212> DNA
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<220>
<223> K2L/ Y32S/ L42I DVP
<400> 227
gctttggatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120
tgtattaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168
<210> 228
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K2L/ Y32S/ D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP
<400> 228
gctttggatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tctattaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 229
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K2L/ D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP
<400> 229
gctttggatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tctattaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 230
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41V/ C51T/ D38A/ L42V DVP
<400> 230
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
gttttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa actgtttgta gagatgtt 168
<210> 231
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41N/ C51A DVP
<400> 231
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
aatttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 232
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32S/ P36A DVP
<400> 232
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagagcttt ggattgtaga 120
tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168
<210> 233
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32K/ P36A DVP
<400> 233
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggaaaaaat ggagagcttt ggattgtaga 120
tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168
<210> 234
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32H/ P36A DVP
<400> 234
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggcataaat ggagagcttt ggattgtaga 120
tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168
<210> 235
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> W31F/ Y32S DVP
<400> 235
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg ttctctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120
tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168
<210> 236
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> W31F/ Y32S/ P36A DVP
<400> 236
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg ttctctaaat ggagagcttt ggattgtaga 120
tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168
<210> 237
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32H/ P36A/ C41A/ C51A DVP
<400> 237
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggcataaat ggagagcttt ggattgtaga 120
gctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 238
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ Y29A DVP
<400> 238
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaagctttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 239
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ G45A DVP
<400> 239
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctgctttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 240
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ F47A DVP
<400> 240
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttcgc ttcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 241
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ R54A DVP
<400> 241
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgtg ctgatgtt 168
<210> 242
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ Y32A DVP
<400> 242
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tgggctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 243
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ P36A DVP
<400> 243
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagagcttt ggattgtaga 120
actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 244
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C41T/ C51A/ D38A/ L42H DVP
<400> 244
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120
actcataaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168
<210> 245
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y32S/ D38A/ C41S/ L42I/ C51S DVP
<400> 245
gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60
tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120
tctattaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168
<210> 246
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳酸克鲁维酵母α交配因子前-原分泌前导序列
<400> 246
Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val
1 5 10 15
Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro
20 25 30
Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly
35 40 45
Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile
50 55 60
Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp
65 70 75 80
Asp Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Pro Arg
85 90 95
Gly Thr Val Asp Gly Ala Pro Ala Ala Ala
100 105
<210> 247
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α-MF肽
<400> 247
Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val
1 5 10 15
Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro
20 25 30
Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly
35 40 45
Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile
50 55 60
Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp
65 70 75 80
Asp Leu Lys Lys Arg Glu Ala Asp Ala Ser Pro Trp Ser Trp Ile Thr
85 90 95
Leu Arg Pro Gly Gln Pro Ile Phe Lys Arg Glu Ala Asn Ala Asp Ala
100 105 110
Asn Ala Glu Ala Ser Pro Trp Ser Trp Ile Thr Leu Arg Pro Gly Gln
115 120 125
Pro Ile Phe Lys Arg Glu Ala Asn Ala Asp Ala Asn Ala Asp Ala Ser
130 135 140
Pro Trp Ser Trp Ile Thr Leu Arg Pro Gly Gln Pro Ile Phe Lys Arg
145 150 155 160
Glu Ala Asn Pro Glu Ala Glu Ala Asp Ala Lys Pro Ser Ala Trp Ser
165 170 175
Trp Ile Thr Leu Arg Pro Gly Gln Pro Ile Phe
180 185
<210> 248
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mf(α)1/Mf(α)2
<400> 248
Met Lys Phe Ser Thr Ile Phe Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val
1 5 10 15
Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro
20 25 30
Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly
35 40 45
Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile
50 55 60
Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp
65 70 75 80
Asp Leu Thr Lys Arg Glu Ala Asp Ala Ser Pro Trp Ser Trp Ile Thr
85 90 95
Leu Arg Pro Gly Gln Pro Ile Phe Lys Arg Glu Ala Asn Ala Asp Ala
100 105 110
Asn Ala Asp Ala Ser Pro Trp Ser Trp Ile Thr Leu Arg Pro Gly Gln
115 120 125
Pro Ile Phe Lys Arg Glu Ala Ser Ala Glu Ala Glu Ala Asp Ala Lys
130 135 140
Pro Ser Ala Trp Ser Trp Ile Thr Leu Arg Pro Gly Gln Pro Ile Phe
145 150 155 160
<210> 249
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 交配因子α前体N末端
<400> 249
Met Arg Leu Ser Ala Val Phe Val Ser Ala Ile Ala Leu Leu Ser Thr
1 5 10 15
Val Ile Ala Ala Pro Ile Thr Glu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Ser Ile
20 25 30
Lys Val Pro Ser Glu Ala Ile Leu Gly Phe Leu Asp Leu Thr Ala Asp
35 40 45
Asp Asp Val Gly Leu Val Lys Ile Asn Asn Gly Thr His Ser Gly Ile
50 55 60
Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Tyr Ala Asn Glu Thr
65 70 75 80
Ile Leu Ser Lys Arg Glu Ala Ser Ala Glu Ala Asp Pro Trp Lys Glu
85 90 95
Ala Ser Pro Glu Ala Glu Ala Glu Ala Asp Pro Trp Lys Trp Leu Ser
100 105 110
Phe Arg Val Gly Gln Pro Ile Tyr Lys Arg Glu Ala Ser Pro Glu Ala
115 120 125
Glu Ala Asp Pro Trp Lys Trp Leu Ser Phe Arg Ile Gly Gln Pro Ile
130 135 140
Tyr
145

Claims (100)

1.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的DVP，其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
3.根据权利要求1所述的DVP，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求3所述的DVP，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求4所述的DVP，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求1所述的DVP，其中所述DVP是两种或更多种DVP的均聚物或杂聚物，其中每种DVP的氨基酸序列相同或不同。
7.根据权利要求1所述的DVP，其中所述DVP是融合蛋白，所述融合蛋白包含由可切割接头或不可切割接头分离的两种或更多种DVP，并且其中每种DVP的氨基酸序列可相同或不同。
8.根据权利要求7所述的DVP，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴内是可切割的。
9.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至8中任一项所述的DVP或其组合和赋形剂。
10.一种用于编码DVP的多核苷酸，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或它们的互补核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中如果所述多核苷酸编码DVP，其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
12.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219。
15.一种生产DVP的方法，所述方法包括：
(a)制备包含第一表达盒的载体，所述第一表达盒包含用于编码DVP的多核苷酸和/或其互补核苷酸序列，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；
(b)将所述载体引入酵母细胞；以及
(c)在用于能够使所述DVP表达和分泌到生长培养基中的条件下，在所述生长培养基中培养所述酵母细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP是两种或更多种DVP的均聚物或杂聚物，其中每种DVP的氨基酸序列相同或不同。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP是融合蛋白，所述融合蛋白包含由可切割接头或不可切割接头分离的两种或更多种DVP，并且其中每种DVP的氨基酸序列可相同或不同。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴内是可切割的。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述载体是包含α-MF信号的质粒。
24.根据权利要求15所述的方法，其中所述载体转化到酵母细胞中。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述酵母细胞选自酵母(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、汉逊酵母(Hansenula)属、耶氏酵母(Yarrowia)属或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属的任何物种。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述酵母细胞选自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述酵母细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
28.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP分泌到所述生长培养基中。
29.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP的表达提供了：每升酵母培养基至少70mg/L、至少80mg/L、至少90mg/L、至少100mg/L、至少110mg/L、至少120mg/L、至少130mg/L、至少140mg/L、至少150mg/L、至少160mg/L、至少170mg/L、至少180mg/L、至少190mg/L、200mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1,000mg/L、至少1,250mg/L、至少1,500mg/L、至少1,750mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L、至少3,000mg/L、至少3,500mg/L、至少4,000mg/L、至少4,500mg/L、至少5,000mg/L、至少5,500mg/L、至少6,000mg/L、至少6,500mg/L、至少7,000mg/L、至少7,500mg/L、至少8,000mg/L、至少8,500mg/L、至少9,000mg/L、至少9,500mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L、至少12,000mg/L、至少12,500mg/L、至少13,000mg/L、至少14,000mg/L、至少15,000mg/L、至少16,000mg/L、至少17,000mg/L、至少17,500mg/L、至少18,000mg/L、至少19,000mg/L、至少20,000mg/L、至少25,000mg/L、至少30,000mg/L、至少40,000mg/L、至少50,000mg/L、至少60,000mg/L、至少70,000mg/L、至少80,000mg/L、至少90,000mg/L或至少100,000mg/L的DVP的产量。
30.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP在所述培养基中的表达导致单个DVP在所述培养基中的表达。
31.根据权利要求15所述的方法，其中所述DVP在所述培养基中的表达导致包含两种或更多种DVP多肽的DVP聚合物在所述培养基中的表达。
32.根据权利要求15所述的方法，其中所述载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒用于编码所述第一表达盒的所述DVP。
33.根据权利要求15所述的方法，其中所述载体包含两个或三个表达盒，每个表达盒用于编码所述第一表达盒的所述DVP，或不同表达盒的DVP。
34.根据权利要求15所述的方法，其中所述表达盒用于编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述表达盒用于编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述表达盒用于编码DVP，所述DVP具有以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219。
37.一种对抗、防治或抑制害虫的方法，包括将杀虫有效量的根据权利要求9所述的组合物施用到所述害虫所在处，或施用到易受所述害虫侵袭的植物或动物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述害虫选自：Achema Sphinx Moth(天蛾幼虫)(Eumorpha achemon)；苜蓿粉蝶(纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme))；粉斑螟蛾(Caudracautella)；Amorbia Moth(Amorbia humerosana)；粘虫(灰翅夜蛾属(Spodoptera)物种，例如甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、棉贪夜蛾、一星粘虫)；洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactyla)；杜鹃花毛虫(Datana major)；结草虫(常绿树蓑蛾(Thyridopteryx ephemeraeformis))；香蕉蛾(木豹蛾(Hypercompe scribonia))；香蕉弄蝶(Erionota thrax)；黑头芽虫(西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana))；加州槲蛾(Phryganidia californica)；春尺蠖(Paleacrita merriccata)；Cherry Fruitworm(樱小食心虫(Grapholita packardi))；China Mark Moth(圹水螟(Nymphula stagnata))；柑橘地老虎(柑橘夜蛾(Xylomygescurialis))；苹果蠹蛾(苹果小卷蛾(Cydia pomonella))；蔓越莓果虫(越橘蜂斑螟(Acrobasis vaccinii))；十字条纹菜青虫(卷心菜薄翅野螟(Evergestis rimosalis))；地老虎(夜蛾科(Noctuid)物种、小地老虎(Agrotis ipsilon))；道格拉斯冷杉毒蛾(枞树毒蛾(Orgyia pseudotsugata))；Ello Moth(天蛾幼虫)(木薯天蛾(Erinnyis ello))；榆树尺蠖(榆秋黄尺蛾(Ennomos subsignaria))；欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小卷蛾(Lobesiabotrana))；欧洲弄蝶(无斑豹弄蝶(Thymelicus lineola)；Essex Skipper；秋幕毛虫(Melissopus latiferreanus)；Filbert Leafroller(蔷薇黄卷蛾(Archips rosanus))；果树卷叶蛾(果树黄卷蛾(Archips argyrospilia))；葡萄浆果蛾(Paralobesia viteana)；荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)；葡萄叶雕叶虫(葡萄烟翅蛾(Harrisinaamericana))；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)；Greenstriped Mapleworm(玫瑰栎蚕蛾(Dryocampa rubicunda))；Gummosos-Batrachedra comosae(Hodges)；舞毒蛾(Lymantriadispar)；铁杉尺蠖(东方铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria))；天蛾幼虫(烟草天蛾属(Manduca)物种)；菜粉蝶(Pieris rapae)；玉米天蚕蛾(玉米尺蚕蛾(Automeris io))；贾克松色卷蛾(Choristoneura pinus)；苹果浅褐卷叶蛾(苹淡褐卷蛾(Epiphyaspostvittana))；瓜虫(甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata))；合欢巢蛾(含羞草雕蛾(Homadaula anisocentra))；斜纹卷叶虫(蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana))；夹竹桃蛾(夹竹桃蛾幼虫(Syntomeida epilais))；杂食性卷叶蛾(Playnota stultana)；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata)；柑桔凤蝶(大黄带凤蝶(Papilio cresphontes))；桔卷叶蛾(桔带卷蛾(Argyrotaenia citrana))；梨小食心虫(东方果蛾(Grapholita molesta))；桃条麦蛾(桃枝麦蛾(Anarsia lineatella))；松蝴蝶(娆粉蝶(Neophasia menapia))；豆荚虫；红带卷叶蛾(红带卷蛾(Argyrotaenia velutinana))；红疣天社蛾(Schizuraconcinna)；Rindworm Complex(各种鳞翅目昆虫)；鞍背刺蛾毛虫(鞍背毛虫(Sibinestimulea))；鞍突毛虫(鞍背天社蛾(Heterocampa guttivitta))；盐沼毛虫(盐泽灯蛾(Estigmene acrea))；草地螟(草螟属(Crambus)物种)；尺蠖(榆秋黄尺蠖(Ennomossubsignaria))；秋星尺蠖(秋尺蠖(Alsophila pometaria))；云杉卷叶蛾(云杉色卷蛾(Choristoneura fumiferana))；天幕毛虫(各种枯叶蛾(Lasiocampidae))；萝褐灰蝶(Geyr)(菠萝褐灰蝶(Thecla basilides))；烟草天蛾(Manduca sexta)；烟草灰绿斑蛾(烟草粉螟(Ephestia elutella))；Tufted Apple Budmoth(簇生苹果芽蛾(Platynotaidaeusalis))；桃条麦蛾(桃枝麦蛾(Anarsia lineatella))；豆杂色夜蛾(疆夜蛾(Peridroma saucia))；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana)；黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)；胡桃毛虫(Datana integerrima)；结网毛虫(美国白蛾(Hyphantriacunea))；西部栎柳毒蛾(老古毒蛾(Orgyia vetusta))；南方玉米螟(Diatraeacrambidoides)；玉米穗虫；甘薯小象甲；胡椒茎象甲；桔根象甲；草莓根象甲；美核桃象甲；榛象甲；稻水象甲；苜蓿叶象甲；三叶草象甲；茶枝小蠹虫；根象甲；甘蔗犀金龟；咖啡果小蠹；一年生蓝草象鼻虫(Listronotus maculicollis)；亚洲花园甲虫(栗色绒金龟(Maladera castanea))；欧洲金龟子(Rhizotroqus majalis)；绿花金龟(绿六月花金龟(Cotinis nitida))；日本金龟子(日本弧丽金龟(Popillia japonica))；五月或六月甲虫(六月鳃角金龟属(Phyllophaga)物种)；圆头犀金龟(北方圆头犀金龟(Cyclocephalaborealis))；东方丽金龟(Anomala orientalis)；南方蒙面金龟子(南方圆头犀金龟(Cyclocephala lurida))；谷象(象甲总科(Curculionoidea))；埃及伊蚊；玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)；水稻二化螟(Chilo suppressalis)；尖音库蚊(Culex pipiens)；致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)；小蔗螟(Diatraeasaccharalis)；棉铃虫(Helicoverpa armigera)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)；绿棉铃虫(Heliothis virescens)；马铃薯甲虫；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)；玉米螟(Ostrinia nubilalis)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)；印度谷螟(Plodiainterpunctella)；吊丝虫(Plutella xylostella)；大豆尺夜蛾(Pseudoplusiaincludens)；玉米夜蛾(Spodoptera exigua)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；和榆叶甲(Xanthogaleruca luteola)。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述害虫选自：埃及伊蚊(Aedes aegypti)；玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)；水稻二化螟(Chilo suppressalis)；尖音库蚊(Culexpipiens)；致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)；小蔗螟(Diatraea saccharalis)；棉铃虫(Helicoverpa armigera)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)；绿棉铃虫(Heliothis virescens)；马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)；玉米螟(Ostrinia nubilalis)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)；印度谷螟(Plodia interpunctella)；吊丝虫(Plutella xylostella)；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)；玉米夜蛾(Spodopteraexigua)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；和榆叶甲(Xanthogaleruca luteola)。
40.一种包含用于编码DVP的多核苷酸的载体，所述DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
41.根据权利要求40所述的载体，其中所述多核苷酸用于编码DVP，所述DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219。
42.根据权利要求41所述的载体，其中所述多核苷酸用于编码DVP，所述DVP具有与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219。
43.一种酵母细胞，包含：
(a)第一表达盒，包含用于编码DVP的多核苷酸或其互补核苷酸序列，所述DVP包含与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T。
44.根据权利要求43所述的酵母细胞，其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
45.根据权利要求43中任一项所述的酵母细胞，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
46.根据权利要求45中任一项所述的酵母细胞，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219。
47.根据权利要求46中任一项所述的酵母细胞，其中所述DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219。
48.根据权利要求43所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞选自酵母(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、汉逊酵母(Hansenula)属、耶氏酵母(Yarrowia)属或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属的任何物种。
49.根据权利要求48所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞选自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
50.根据权利要求49所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。
51.一种重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)，所述重组CRP包含根据式(II)的胱氨酸结(CK)结构：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；
其中半胱氨酸残基CI至CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；
其中所述第一二硫键、所述第二二硫键和所述第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；
其中所述第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成所述胱氨酸结基序的唯一二硫键；
其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是肽亚基，所述肽亚基包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列；
其中NE、L3、CE或它们的组合任选地不存在；
其中所述重组CRP通过修饰具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP来产生，其中所述一个或多个非CK二硫键不是所述第一二硫键、所述第二二硫键或所述第三二硫键，并且其中所述一个或多个非CK二硫键不形成所述CK基序；
其中所述可修饰CRP通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰；
其中从具有一个或多个非CK二硫键的所述可修饰CRP中去除所述一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的所述CK结构的所述重组CRP；并且
其中具有根据式(II)的所述CK结构的所述重组CRP相对于不具有根据式(II)的所述CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
52.根据权利要求51所述的重组CRP，其中所述二硫键拓扑结构形成以下胱氨酸结基序中的一种胱氨酸结基序：抑制剂胱氨酸结(ICK)基序、生长因子胱氨酸结(GFCK)基序或环状胱氨酸结(CCK)基序。
53.根据权利要求52所述的重组CRP，其中所述二硫键拓扑结构形成ICK基序。
54.根据权利要求51所述的重组CRP，其中所述可修饰CRP为野生型μ-DGTX-Dc1a；DVP；Kappa-ACTX、ApsIII或其变体。
55.根据权利要求54所述的重组CRP，其中所述可修饰CRP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-2、193、195或198。
56.根据权利要求55所述的重组CRP，其中所述重组CRP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-14、197、199或201。
57.一种制备重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的方法，所述重组CRP包含根据以下式(II)的胱氨酸结(CK)结构：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；
其中半胱氨酸残基CI至CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；
其中所述第一二硫键、所述第二二硫键和所述第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；
其中所述第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成所述胱氨酸结基序的唯一二硫键；
其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是肽亚基，所述肽亚基包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列；
其中NE、L3、CE或它们的组合任选地不存在；
所述方法包括：
(a)提供具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中所述一个或多个非CK二硫键不是所述第一二硫键、所述第二二硫键或所述第三二硫键，并且其中所述一个或多个非CK二硫键不形成所述CK基序；以及
(b)通过从具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰所述可修饰CRP；
其中从具有一个或多个非CK二硫键的所述可修饰CRP中去除所述一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的所述CK结构的所述重组CRP；并且
其中具有根据式(II)的所述CK结构的所述重组CRP相对于不具有根据式(II)的所述CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述二硫键拓扑结构形成以下胱氨酸结基序中的一种胱氨酸结基序：抑制剂胱氨酸结(ICK)基序、生长因子胱氨酸结(GFCK)基序或环状胱氨酸结(CCK)基序。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述二硫键拓扑结构形成ICK基序。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述可修饰CRP为野生型μ-DGTX-Dc1a；DVP；Kappa-ACTX、ApsIII或其变体。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述可修饰CRP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-2、193、195或198。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述重组CRP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-14、197、199或201。
63.一种增加重组富含半胱氨酸的蛋白质(CRP)的产量的方法，所述方法包括：
(a)产生具有根据以下式(II)的胱氨酸结(CK)结构的重组CRP：
其中CI至CVI是半胱氨酸残基；
其中半胱氨酸残基CI至CIV通过第一二硫键连接；CII和CV通过第二二硫键连接；并且CIII和CVI通过第三二硫键连接；
其中所述第一二硫键、所述第二二硫键和所述第三二硫键具有形成胱氨酸结基序的二硫键拓扑结构；
其中所述第一二硫键、第二二硫键和第三二硫键是形成所述胱氨酸结基序的唯一二硫键；
其中NE、L1、L2、L3、L4、L5和CE是肽亚基，所述肽亚基包含具有1个至13个氨基酸残基长度的氨基酸序列；
其中NE、L3、CE或它们的任何组合任选地不存在；
其中根据下列方法来产生所述重组CRP：
(b)提供具有一个或多个非CK二硫键的可修饰CRP，其中所述一个或多个非CK二硫键不是所述第一二硫键、所述第二二硫键或所述第三二硫键，并且其中所述一个或多个非CK二硫键不形成所述CK基序；
(c)通过从具有一个或多个非CK二硫键的所述可修饰CRP中去除一个或多个非CK二硫键来修饰所述可修饰CRP；
其中从具有一个或多个非CK二硫键的所述可修饰CRP中去除所述一个或多个二硫键产生具有根据式(II)的所述CK结构的所述重组CRP；并且
其中具有根据式(II)的所述CK结构的所述重组CRP相对于不具有根据式(II)的所述CK结构的可修饰CRP的表达水平具有增加的表达水平。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述二硫键拓扑结构形成以下胱氨酸结基序中的一种胱氨酸结基序：抑制剂胱氨酸结(ICK)基序、生长因子胱氨酸结(GFCK)基序或环状胱氨酸结(CCK)基序。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述二硫键拓扑结构形成ICK基序。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述可修饰CRP为野生型μ-DGTX-Dc1a；DVP；Kappa-ACTX、ApsIII或其变体。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述可修饰CRP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-2、193、195或198。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述重组CRP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-14、197、199或201。
69.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
70.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
71.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由以下项中任一项所示的氨基酸组成：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
72.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
73.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
74.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由以下项中任一项所示的氨基酸组成：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
75.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
76.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
77.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由以下项中任一项所示的氨基酸组成：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219；或其药学上可接受的盐。
78.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:213或217-219；或其药学上可接受的盐。
79.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由与以下项中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:213或217-219；或其药学上可接受的盐。
80.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由以下项中任一项所示的氨基酸组成：SEQ ID NO:213或217-219；或其药学上可接受的盐。
81.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含SEQ ID NO:213所示的氨基酸；或其药学上可接受的盐。
82.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由SEQ ID NO:213所示的氨基酸组成；或其药学上可接受的盐。
83.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含SEQ ID NO:217所示的氨基酸；或其药学上可接受的盐。
84.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由SEQ ID NO:217所示的氨基酸组成；或其药学上可接受的盐。
85.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含SEQ ID NO:218所示的氨基酸；或其药学上可接受的盐。
86.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由SEQ ID NO:218所示的氨基酸组成；或其药学上可接受的盐。
87.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP包含SEQ ID NO:219所示的氨基酸；或其药学上可接受的盐。
88.一种对一种或多种昆虫物种具有杀昆虫活性的沙漠灌木蛛毒素变体多肽(DVP)，所述DVP由SEQ ID NO:219所示的氨基酸组成；或其药学上可接受的盐。
89.一种融合蛋白，包含可操作地连接到α交配因子(α-MF)肽的一种或多种DVP；其中所述一种或多种DVP具有与根据以下式(I)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或至少95％同一性的氨基酸序列：A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V，其中DVP相对于SEQ ID NO:2所示的沙漠灌木蛛毒素的野生型序列包含至少一个氨基酸取代，并且其中X1为K或L；X2为V、A或E；X3为D、Y或A；X4为S或A；X5为W、A、F；X6为Y、A、S、H或K；X7为P或A；X8为D、A、K、S、T或M；X9为C、G、T、A、S、M或V；X10为L、A、N、V、S、E、I或Q；X11为C、F、A、T、S、M或V；并且X12为V、A或T；或其药学上可接受的盐。
90.根据权利要求89所述的融合蛋白，其中如果X9为G、T、A、S、M或V，或者X11为F、A、T、S、M或V，则去除二硫键。
91.根据权利要求89所述的融合蛋白，其中所述一种或多种DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-43、45-51、53、128、130、136、139-140、144、146-147、187-191、202-215或217-219。
92.根据权利要求91所述的融合蛋白，其中所述一种或多种DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-11、15-16、20-22、24-26、29、35、45-48、53、128、136、139-140、144、146-147、187-191、207、210-215或217-219。
93.根据权利要求92所述的融合蛋白，其中所述一种或多种DVP包含以下项中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、53、136、139-140、144、146-147、187-191、210-215或217-219。
94.根据权利要求89所述的融合蛋白，其中所述一种或多种DVP是两种或更多种DVP的均聚物或杂聚物，其中每种DVP的氨基酸序列相同或不同。
95.根据权利要求89所述的融合蛋白，其中所述一种或多种DVP、所述α-MF或它们的组合由可切割接头或不可切割接头分离。
96.根据权利要求95所述的融合蛋白，其中所述可切割接头在昆虫的肠道或血淋巴内是可切割的。
97.根据权利要求89所述的融合蛋白，其中所述α-MF肽为源自酵母物种的α-MF肽。
98.根据权利要求97所述的融合蛋白，其中所述酵母物种选自酵母(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、汉逊酵母(Hansenula)属、耶氏酵母(Yarrowia)属或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属的任何物种。
99.根据权利要求98所述的融合蛋白，其中所述酵母物种选自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
100.根据权利要求99所述的融合蛋白，其中所述酵母物种是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。
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