KR20230078719A - 해충 방제용 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리펩타이드 - Google Patents

해충 방제용 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리펩타이드 Download PDF

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알렉산드라 하제
브렉 데이비스
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베스타론 코포레이션
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Abstract

신규한 살충성 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 뉴클레오타이드; 배양물 및 식물에서 이들의 발현; 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 뉴클레오타이드를 생산하는 방법; 신규한 공정; 신규한 생산 기술; 신규한 제형; 및 신규한 유기체가 개시되어 있다. 본 개시내용은 또한 미국 사막 거미(디구에티아 카니티에스)에서 단리된 뮤-디구에톡신-Dc1a 펩타이드의 비자연 발생의 변형된 형태인, Dc1a-변이형 폴리펩타이드(DVP)로 명명된 신규한 유형의 펩타이드에 관한 것이다. 본원에서, 본 발명자들은 DVP를 인코딩하는 유전자; 유전자와 펩타이드의 다양한 제형 및 조합; 및 곤충 방제에 유용한 이들을 사용하는 방법을 설명한다. 나아가, 본 발명은 4개 이상의 디설파이드 결합을 갖는 폴리펩타이드에서 하나 이상의 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 생성되는, 시스틴 매듭(CK) 구조를 갖는 신규한 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)에 관한 것이다.

Description

해충 방제용 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리펩타이드
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 9월 28일자 출원된 미국 임시 출원 제63/084,339호에 대한 이익 및 우선권을 주장한다. 상기 언급된 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.
서열목록
본 출원은 2021년 9월 27일자 오후 6시 32분에 생성되어 본 출원과 함께 전자문서로 제출된 126 KB인 파일명 "225312-497884_ST25.txt"(126킬로바이트)의 서열목록 전체를 참조로 포함한다.
기술분야
본 개시내용은 살충성 단백질, 뉴클레오타이드, 펩타이드, 식물에서의 이들의 발현, 상기 펩타이드를 생산하는 방법, 신규한 제형, 및 곤충을 방제하는 방법을 제공한다.
유해한 곤충은 인간 건강과 식량 안보에 대한 전 세계적인 위협을 나타낸다. 곤충은 질환의 매개체이기 때문에 인간 건강에 위협을 가한다. 가장 악명높은 질환 매개 곤충 중 하나는 모기이다. 아노펠레스(Anopheles) 속의 모기는 지카 바이러스(Zika virus), 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus), 및 트리파노소마(Trypanosoma) 속의 원생동물에 의해 유발되는 질환인 말라리아의 주요 매개체이다. 또 다른 모기인 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti)는 황열병과 뎅기열을 유발하는 바이러스의 주요 매개체이다. 그리고, 아에데스 종 모기는 다양한 유형의 뇌염을 일으키는 바이러스의 매개체이기도 하다. 사상충증을 유발하는 기생 회충인 우체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti)와 브루기아 말라이(Brugia malayi)는 통상적으로 쿨렉스(Culex), 만소니아(Mansonia) 및 아노펠레스 속의 모기에 의해 전파된다.
모기와 유사하게, 쌍시목(Diptera)의 다른 구성원도 태곳적부터 인류를 괴롭혀왔다. 말파리와 사슴파리는 물릴 때 통증이 있는 것 이외에, 야토병의 박테리아 병원체(파스테우렐라 툴라렌시스(Pasteurella tularensis))와 탄저병의 박테리아 병원체(바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis))뿐 아니라, 열대 아프리카에서 로아사상충증(loiasis)을 유발하는 기생 회충(로아 로아(Loa loa))을 전달한다.
검정파리(크리소미아 메가세팔라(Chrysomya megacephala))와 집파리(무스카 도메스티카(Musca domestica))는 한 순간에 썩은 고기와 배설물에서 날아올라 다음 순간에 인간의 집과 음식에 내려앉아, 이질, 장티푸스, 콜레라, 소아마비, 요스(yaws), 나병 및 결핵을 전파하게 된다.
히펠라테스(Hippelates) 속의 눈각다귀(eye gnat)는 요스를 유발하는 스피로카에테(spirochaete) 병원체(트레포네마 페르테누(Treponema pertenue))를 운반할 수 있으며, 결막염(핑크아이(pinkeye))을 전파할 수도 있다. 글로시나(Glossina) 속의 체체파리는 아프리카 수면병을 유발하는 원생동물 병원체(트리파노소마 감비엔세(Trypanosoma gambiense) 및 트리파노소마 로데시엔세(T. rhodesiense))를 전달한다. 플레보토무스(Phlebotomus) 속의 모래파리는 남미에서 카리온병(Carrion's disease)(오로야열(Oroyo fever))을 유발하는 박테리아(바르토넬라 바실리포르미스(Bartonella bacilliformis))의 매개체이다. 이는, 아시아와 북아프리카에서, 모래파리열(파파타시열(Pappataci fever))을 유발하는 바이러스 인자뿐 아니라, 리슈만편모충증(Leishmaniasis)을 유발하는 원생동물 병원체(레이시마니아(Leishmania) 종)를 전파한다.
인간의 식량 안보 또한 곤충에 의해 위협받고 있다. 곤충 해충은 상업적 목적과 개인 용도로 지정된 식량 작물을 무차별적으로 표적으로 삼으며; 실제로, 곤충 해충으로 인한 피해는 전자의 경우 단순한 불편에서 재정적 파탄에 이르기까지, 후자의 경우 영양실조 또는 기아와 같은 극단적 상태에 이르기까지 광범위하다. 곤충 해충은 또한 가축에서 스트레스와 질환을 유발한다. 그리고, 한때 지리적 및 기후적 경계에 의해 제한되었던 곤충 해충은 전 세계적인 이동과 기후 변화로 인해 그 범위가 확장되었다.
본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP: diguetoxin variant polypeptide)를 설명한다. 본원에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
또한, 본 개시내용은 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이들의 조합과, 부형제로 이루어지는 조성물을 설명한다.
본 개시내용은 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드로서, 여기서 DVP가 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 설명한다: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
또한, 본 개시내용은 DVP를 생산하는 방법으로서, DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계(상기 DVP는 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함함: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임)); 상기 벡터를 효모 세포에 도입하는 단계; 및 DVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하의 성장 배지에서 효모 세포를 성장시키는 단계를 포함하는 방법을 설명한다.
본 개시내용은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이들의 조합과, 부형제로 이루어지는 조성물의 살충 유효량을, 해충의 서식지, 또는 해충의 공격을 받기 쉬운 식물 또는 동물에 적용하는 단계를 포함하는 방법을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 설명한다.
본 개시내용은 또한 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 효모 균주로서, 상기 DVP가 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 효모 균주를 설명한다: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
또한, 본 개시내용은 하기 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK: cystine knot) 구조를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 재조합 CRP로서,
Figure pct00001
화학식 (II)
(식 중, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며; 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지(topology)를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이고; NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이며; 여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음); 여기서 상기 재조합 CRP는 하나 이상의 비-CK(non-CK) 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 변형시키는 방식으로 생성되며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않고; 여기서 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형되며; 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고; 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타내는 재조합 CRP를 제공한다.
또한, 본 개시내용은 하기 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 포함하는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 생산하는 방법으로서,
Figure pct00002
화학식 (II)
(식 중, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며; 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이고; NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이며; 여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음); (a) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 제공하는 단계(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않음)와, (b) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형 가능한 CRP를 변형시키는 단계(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고; 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타냄)를 포함하는 방법을 설명한다.
본 개시내용은 또한 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)의 수율을 증가시키는 방법으로서, (a) 하기 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 갖는 재조합 CRP를 생성하는 단계를 포함하며,
Figure pct00003
화학식 (II)
(식 중, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며; 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이고; NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이며; 여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음); 여기서 상기 재조합 CRP는 하기 공정 (b) 및 (c)에 따라 생성되는 방법을 설명한다: (b) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 제공하는 단계(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않음); 및 (c) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형 가능한 CRP를 변형시키는 단계(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고; 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타냄).
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 217에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 217에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 218에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 218에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명한다.
또한, 본 개시내용은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함하는 융합 단백질로서, 여기서 상기 하나 이상의 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 설명한다: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
도 1은, 야생형(WT) Dc1a에 대한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 표준 곡선을 보여준다.
도 2는, 순수한 WT Dc1a에 대한 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 3은, DVP C41T/C51A와 C41T/C51A/W31F/Y32S/P36A의 상대 수율(relative yield)을 보여주는 그래프를 도시한 것이다. DVP C41T/C51A/W31F/Y32S/P36A는 C41T/C51A에 비해 발현이 69% 증가했다.
도 4는, C41T/C51A의 크로마토그램을 도시한 것이다. 배경, 폴딩된(folded) 변이체 및 미스폴딩된(misfolded) 변이체를 나타내는 피크는 괄호 안에 표시되어 있다.
도 5는, C41T/C51A/D38A/L42V의 크로마토그램을 도시한 것이다. 배경과 폴딩된 변이체를 나타내는 피크는 라벨로 표시되어 있다.
도 6은, 활성의 손실 없이 증가된 발현을 나타내는 DVP의 상대 발현(relative expression)의 요약을 보여주는 그래프를 도시한 것이다. 여기서, WT-Dc1a와 하기 DVP들을 분석하였다: (1) C41T/C51A; (2) C41T/C51A/D38A; (3) C41T/C51A/D38A/L42V; 및 (4) C41S/C51S/D38A/L42V.
도 7은, WT-Dc1a와 하기 DVP들의 효과를 평가하는 파리 녹다운(fly knockdown) 실험 결과를 보여준다: (1) C41T/C51A; (2) C41T/C51A/D38A; 및 (3) C41S/C51S/D38A/L42V. 24시간에서의 퍼센트 녹다운(즉, 걸을 수 없음)(24시간에서의 녹다운%)에 대해 파리를 평가하는 방식으로 용량 반응 곡선을 생성하였다.
도 8은, 24시간에서의 야생형(삼각형)과 하기 DVP들에 대한 녹다운%를 보여주는 그래프를 도시한 것이다: (1) C41T/C51A/D38A(서열번호 29)(다이아몬드) 및 C41S/C51S/D38A/L42V(서열번호 53)(정사각형).
도 9는, DVP-살충 단백질의 개략도를 도시한 것이다. 여기서, 구성요소는 하기와 같이 정의된다: "ERSP"는 소포체 신호 펩타이드를 나타내고; "UBI"는 유비퀴틴 단량체를 나타내고; "DVP"는 뮤-디구에톡신 변이형 폴리펩타이드를 나타내고; "L"은 개재 링커 펩타이드를 나타내고; "HIS"는 히스티딘 태그를 나타냄.
도 10은, 식물 발현 WT Dc1a와 DVP-살충 단백질의 His-Tag 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 각각의 레인은 변성 단백질 겔 조건 하에서 실행되고 표준 웨스턴 블롯 기술을 이용하여 가시화된 미정제 식물 추출물을 나타낸다. 웨스턴 블롯에서 시험된 샘플의 약식 명칭이 발현에 대한 등급 시스템과 함께 이미지 위에 열거되어 있다. 기호 (-)는 블롯 상에 검출된 단백질이 없음을 나타내고, 단백질이 검출되는 경우 기호 (+) 내지 (+++)는 검출된 양을 나타낸다. "LADDER"로 표시된 레인은 분자량 마커를 나타낸다. 레인 "PLANT NEG"는 음성 대조군(즉, 담배 단백질 추출물을 발현하는 GFP)을 나타낸다. "M#"로 표지된 레인은 평가된 DVP-살충 단백질에 대한 약식 명칭을 나타낸다. 레인 "WT"는 WT 뮤-디구에톡신-Dc1a 단백질을 갖는 살충 단백질을 나타낸다.
도 11은, 배경 DVP와 비교하여 고수율 DVP의 수율을 나타내는 그래프를 보여준다. 여기서, D38A, C41S 및 C51S 돌연변이를 갖는 배경 DVP에 점 돌연변이를 생성하였다. 배경 DVP에 대한 돌연변이에는 하기가 포함되었다: L42I; K2L; Y32S; K2L + Y32S; D38T; D38S; 및 D38M. rpHPLC를 통해 수율을 평가하고, 배경 DVP에 대해 정규화하였다. 추가 돌연변이 L42I; K2L; Y32S; K2L + Y32S; D38T; 및 D38S를 갖는 DVP는 모두 C41S/C51S/D38A DVP 배경(서열번호 47) 대조군에 비해 개선된 수율을 나타냈다.
도 12는, K2L, Y32S 및 L42I 돌연변이의 결과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 여기서, 하기 DVP들, (1) K2L/Y32S/L42I(서열번호 217)과 (2) K2L/Y32S/D38A/L42I/C41S/C51S(서열번호 218)의 수율을 WT Dc1a(서열번호 2)의 수율과 비교하였다. 돌연변이 K2L, Y32S 및 L42I의 조합은 발현 수준을 극적으로 증가시켰다.
도 13은, 시스틴 매듭(CK) 구조를 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 설명하는 화학식 (II)를 나타내는 개략도를 도시한 것이다. 여기서, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기를 나타내며; 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결된다(디설파이드 결합은 시스테인 잔기를 연결하는 선으로 표시됨). 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이다. NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 각각 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이다. 일부 구현예에서, NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않는다.
도 14는, HPLC로 측정된 WT ApsIII 및 ApsIII 시스테인 결실(dCys)의 상대 수율을 보여준다(n = 8). 파선은 중앙값을 나타내며; 점선은 사분위수 범위의 경계를 나타낸다.
정의
"5'-말단" 및 "3'-말단"이라는 용어는, 뉴클레오타이드 중합체(예를 들어, DNA)의 방향성, 즉, 말단-대-말단 배향을 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드의 5'-말단은 5번째 탄소가 있는 폴리뉴클레오타이드의 말단이다.
"5'-상동성 아암(arm)과 3'-상동성 아암" 또는 "5' 아암과 3' 아암" 또는 "좌측 아암과 우측 아암"은 숙주 유기체의 염색체 유전자좌의 성공적인 유전자 변형을 달성하기 위해 숙주 유기체에서 표적 게놈 서열 및/또는 관심 내인성 유전자와 상동적으로 재조합하는 벡터 및/또는 표적화 벡터의 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
"ACTX" 또는 "ACTX 펩타이드" 또는 "아트라코톡신"은 아트라시나에(Atracinae)과에 속하는 거미에서 단리된 살충 ICK 펩타이드의 패밀리를 나타낸다. 하나의 이러한 거미는 하드로니케 베르수타라(Hadronyche versuta)는 학명을 가진 호주 블루마운틴 깔대기 그물 거미(Australian Blue Mountains Funnel-web Spider)로 알려져 있다. 아트라시나에과 종의 ACTX 펩타이드의 예는 오메가-ACTX, 카파-ACTX 및 U-ACTX 펩타이드이다.
"ADN1 프로모터"는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 접착 결함 단백질 1 유전자에서 유도된 프로모터 서열로 구성된 DNA 분절을 나타낸다.
"영향을 미치다"는, 어떤 것이 또 다른 것에 어떻게 영향을 미치는지, 예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 약물 또는 화학물질이 곤충, 예를 들어 해충에 어떻게 영향을 미치는지를 나타낸다.
"정렬"은 서로에 대한 관계를 결정하기 위해 둘 이상의 서열(예를 들어, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열)을 비교하는 방법을 나타낸다. 정렬은 전형적으로 다양한 알고리즘을 적용하는 컴퓨터 프로그램을 통해 수행되지만, 수동으로 정렬을 수행하는 것도 가능하다. 정렬 프로그램은 전형적으로 가능한 최적 정렬 점수에 도달하기 위해 다양한 전략을 이용하여, 서열을 가능한 정렬을 반복하고 대체 표(substitution table)를 사용하여 정렬에 점수를 매긴다. 통상적으로 사용되는 정렬 알고리즘에는, 비제한적으로, CLUSTALW(문헌[Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J., CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994] 참조); CLUSTALV(문헌[Larkin M. A., et al., CLUSTALW2, ClustalW and ClustalX version 2, Bioinformatics 23(21): 2947-2948, 2007] 참조); Mafft; Kalign; ProbCons; 및 T-Coffee(문헌[Notredame et al., T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments, Journal of Molecular Biology 302: 205-217, 2000] 참조)가 포함된다. 전술한 알고리즘 중 하나 이상을 구현하는 예시적인 프로그램에는, 비제한적으로, DNAStar(DNAStar, Inc. 3801 Regent St. Madison, Wis. 53705)의 MegAlign, MUSCLE, T-Coffee, CLUSTALX, CLUSTALV, JalView, Phylip, 및 Accelrys(Accelrys, Inc., 10188 Telesis Ct, Suite 100, San Diego, Calif. 92121)의 Discovery Studio가 포함된다. 일부 구현예에서, 정렬은 2개 서열 사이의 유사성을 최대화하기 위해 비교하고자 하는 서열 중 하나 또는 둘 모두에 "위상 이동" 및/또는 "갭(gap)"을 도입할 것이며, 점수를 매기는 것은 정렬된 서열의 관계를 정량적으로 표현하는 과정을 나타낸다.
"알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드" 또는 "알파-MF 신호" 또는 "알파-MF" 또는 "알파 교배인자 분비 신호" 또는 "αMF 분비 신호"(모두 상호 교환적으로 사용됨)는, 알파-MF 펩타이드가 관심 재조합 펩타이드(예를 들어, DVP)에 작동 가능하게 연결된 경우, 재조합 발현 시스템에서 분비 발현(secreted expression)을 가능하게 하는 신호 펩타이드를 나타낸다. 알파-MF 펩타이드는 초기 재조합 폴리펩타이드를 재조합 발현 시스템(예를 들어, 효모 재조합 발현 시스템)의 분비 경로로 지시한다.
"작용제"는 하나 이상의 화학 물질, 분자, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 독, 살충제, 농약, 유기 화합물, 무기 화합물, 원핵생물 유기체 또는 진핵생물 유기체, 및 이들로부터 생성된 작용제를 나타낸다.
"농업적으로 허용 가능한 담체"는 농약 제형 기술에서 통상적으로 사용되는 모든 아쥬반트, 불활성 구성요소, 분산제, 계면활성제, 점착제, 결합제 등을 포함하며; 이는 농약 제형 분야의 당업자에게 널리 알려져 있다.
"아그로감염(agroinfection)"은 아그로박테리아 투메파시엔스(A. tumefaciens) 또는 아그로박테리아 리조게네스(A. rhizogenes)를 사용하여 DNA를 식물 세포에 도입하는 식물 형질전환 방법을 의미한다.
"BAAS"는 보리 알파-아밀라아제 신호 펩타이드를 의미하며, ERSP의 일례이다. BAAS의 하나의 예는 서열번호 60(NCBI 수탁번호 AAA32925.1)의 아미노산 서열을 갖는 BAAS이다.
"바이오매스(biomass)"는 임의의 측정된 식물 생성물을 나타낸다.
"이원 벡터" 또는 "이원 발현 벡터"는 대장균(E. coli) 균주와 아그로박테리움 균주 둘 모두에서 자체 복제 가능한 발현 벡터를 의미한다. 또한, 벡터는 아그로박테리움에 의해 복제되어 식물 세포로 전달되는 독성 유전자에 의해 인식되는 좌측 및 우측 경계 서열로 묶인 DNA(종종 t-DNA로 지칭됨)의 영역을 함유한다.
"bp" 또는 "염기쌍"은 a를 형성하는 서로 결합된 2개의 화학적 염기를 포함하는 분자를 나타낸다. 예를 들어, DNA 분자는 2개의 권선(winding) 가닥으로 이루어지며, 여기서 각각의 가닥은 데옥시리보오스와 포스페이트기가 교대로 이루어진 백본을 갖는다. 각각의 데옥시리보오스에는 4개의 염기, 즉, 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 티민(T) 중 하나가 부착되며, 여기서 아데닌은 티민과 염기쌍을 형성하고, 시토신은 구아닌과 염기쌍을 형성한다.
"C-말단"은 폴리펩타이드의 말단에 위치하는 유리 카르복실기(즉, -COOH)를 나타낸다.
"CE"는 화학식 (II)에 따른 CK 구조에서 시스틴 매듭 모티프의 디설파이드 결합 형성에 참여하는 제6 시스테인 잔기(즉, CVI)에 작동 가능하게 연결된 N-말단을 갖는 펩타이드 서브유닛을 나타낸다.
위첨자 로마 숫자와 함께 본원에 사용된 문자 "C", 즉, "CI", "CII", "CIII", "CIV", "CV" 및 "CVI"은 디설파이드 결합 형성에 참여하는 시스테인 잔기를 나타내며, 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이다. 따라서, 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 형성하도록 작동 가능한 하나 이상의 시스테인 잔기를 가질 수 있으며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않는다. 따라서, 위첨자 로마 숫자 I, II, III, IV, V 및 VI은, 각각, 디설파이드 결합 형성에 참여하는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 시스테인 잔기인 소정의 시스테인 잔기를 나타내며, 여기서 이러한 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 상기 언급된 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합인 디설파이드 결합이고; "CI", "CII", "CIII", "CIV", "CV" 및 "CVI", 및/또는 위첨자 로마 숫자 I, II, III, IV, V 및 VI으로 표지된 시스테인 잔기는, 다른 시스테인 잔기가 비-CK 디설파이드 결합을 형성하는지 여부에 관계없이 다른 시스테인 잔기가 변형 가능한 CRP에 존재할 수 있기 때문에, 아미노산 서열에서 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 시스테인 잔기를 나타내려는 것이 아니며 , 그렇게 해석되어서도 안된다. 예를 들어, 변형 가능한 CRP는 CI 잔기 앞의 아미노산 서열에서 발견되는 이의 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단으로 읽음)에 존재하는 하나 이상의 시스테인 잔기를 가질 수 있다. 마찬가지로, 비-CK 디설파이드 결합을 형성할 수도 형성하지 않을 수도 있는 펩타이드 서브유닛에 하나 이상의 시스테인 잔기가 존재할 수 있다.
"cDNA" 또는 "카피 DNA" 또는 "상보적 DNA"는 RNA의 분자에 상보적인 분자를 나타낸다. 일부 구현예에서, cDNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, cDNA는 역전사효소에 의해 촉매화되는 반응에서 단일 가닥 RNA 주형으로부터 합성된 이중 가닥 DNA일 수 있다. 또 다른 구현예에서, "cDNA"는 천연 성숙 mRNA 종에서 발견되는 서열 요소의 배열을 공유하는 모든 핵산을 나타내며, 여기서 서열 요소는 엑손과 3' 및 5' 비코딩 영역이다. 통상적으로, mRNA 종은 핵 RNA 스플라이싱에 의해 개재 인트론이 제거되어, 단백질을 인코딩하는 연속적인 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 생성하는 인접한 엑손을 가지고 있다. 일부 구현예에서, "cDNA"는 mRNA 주형과 상보적이며 이에서 유도된 DNA를 나타낸다.
"CEW"는 옥수수 귀벌레를 나타낸다.
"CK 구조" 또는 "시스틴 매듭 구조"는 CK 모티프를 갖는, 예를 들어 3개의 디설파이드 결합을 포함하는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 사이의 공유된 구조적 유사성을 나타내며, 여기서 시스테인 CI과 CIV; CII와 CV; 및 CIII과 CVI은 디설파이드 결합에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, "공유된 구조적 유사성"은 공유된 구조적 특징의 존재, 예를 들어 특정 위치에 있는 특정 아미노산의 존재 및/또는 동일성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, "공유된 구조적 유사성"이라는 용어는, 구조 요소(예를 들어, 루프, 시트, 나선, H-결합 공여체, H-결합 수용체, 글리코실화 패턴, 염 브릿지 및 디설파이드 결합)의 존재 및/또는 동일성을 나타낸다. 일부 구현예에서, "공유된 구조적 유사성"이라는 용어는, 서로에 대한 원자 또는 모이어티의 3차원 배열 및/또는 배향(예를 들어, 관심 작용제와 참조 작용제 사이의 거리 및/또는 각도)을 나타낸다. 일부 구현예에서, CK 구조는 하기 스캐폴드, 프레임워크, 구조 및/또는 백본을 포함한다: NE-CI-L1-CII-L2-CIII-L3-CIV-L4-CV-L5-CVI-CE(여기서 CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며; 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이고; NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이며; 여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음).
"절단 가능한 링커"는 링커를 참조한다.
"클로닝"은 하나의 공급원으로부터의 DNA 분절(예를 들어, 통상적으로 관심 유전자, 예를 들어 dvp)을 삽입하고, 이를 또 다른 공급원(예를 들어, 통상적으로 벡터, 예를 들어 플라스미드)으로부터의 DNA 분절과 재조합하고, 통상적으로 재조합된 DNA를 박테리아 또는 효모 숙주로 형질전환시키는 방식으로 재조합된 DNA 또는 "재조합 DNA"가 복제되도록 지시하는 과정 및/또는 방법을 나타낸다.
"코딩 서열" 또는 "CDS"는 적절한 조절 서열의 제어, 및 필요한 전사 및/또는 번역 분자 인자 존재 하에 위치하는 경우, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 전사(예를 들어, DNA의 경우) 또는 번역(예를 들어, mRNA의 경우)될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 서열을 나타낸다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노) 말단의 번역 개시 코돈과 3'(카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 통상적으로 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 것이다. 일부 구현예에서, 코딩 서열은 5' 및/또는 3' 말단에서 미번역 영역으로 플랭킹될 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 서열은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 산물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 서열은 또 다른 코딩 서열 또는 핵 국소화 신호와 같은 국소화 신호에 융합되거나 융합되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 서열은 벡터 또는 발현 작제물에 클로닝될 수 있거나, 게놈에 통합될 수 있거나, DNA 단편으로 존재할 수 있다.
"코돈 최적화"는 하나 이상의 내인성, 천연 및/또는 야생형 코돈이, 궁극적으로 여전히 동일한 아미노산을 코딩하지만, 해당 숙주에서 선호되는 코돈으로 대체되는 유전자의 생성을 나타낸다.
"상보적"은, 당업자가 이해하는 바와 같이, 2개의 폴리뉴클레오타이드의 상호작용 표면이 함께 위상적으로 호환되거나 매칭됨을 의미한다. 따라서, 2개의 서열이 서로 혼성화되어 안정한 역평행 이중 가닥 핵산 구조를 형성할 수 있는 경우, 이들은 서로 "상보적"이다. 제1 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 제2 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 결합 파트너의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일하거나, 제1 폴리뉴클레오타이드가 엄격한 혼성화 조건 하에서 제2 폴리뉴클레오타이드에 혼성화될 수 있는 경우, 제1 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드에 상보적이다. 따라서, 서열이 5'-TATAC-3'인 폴리뉴클레오타이드는 서열이 5'-GTATA-3'인 폴리뉴클레오타이드에 상보적이다.
"조건화된 배지(conditioned medium)"는 세포에 의해 사용되었고 세포 유래 물질이 풍부하지만 세포를 함유하지 않는 세포 배양 배지를 의미한다.
"카피 수"는 임의의 시간에 숙주 세포에 존재하는 벡터, 발현 카세트, 증폭 유닛, 유전자 또는 실제로 임의의 정의된 뉴클레오타이드 서열의 동일한 카피의 수를 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유전자 또는 또 다른 정의된 염색체 뉴클레오타이드 서열은 염색체 상에 1개, 2개 또는 그 이상의 카피로 존재할 수 있다. 자가 복제 벡터는 숙주 세포당 1개 또는 수백 개 카피로 존재할 수 있다.
"배양물" 또는 "세포 배양물"은 인공적인 시험관내 환경에서 세포를 유지하는 것을 나타낸다.
"배양"은 다양한 종류의 배지 상 또는 내에서 유기체를 번식시키는 것을 나타낸다. 예를 들어, "배양"이라는 용어는 액체 또는 고체 배지 내 적합한 조건 하에서 세포 집단을 성장시키는 것을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양은 (전형적으로 용기 또는 반응 기 내에서의) 관심 이종 폴리펩타이드 및/또는 다른 목적하는 최종 산물의 발효적 재조합 생산을 나타낸다.
"시스틴"은 산화된 시스테인 이량체를 나타낸다. 시스틴은 2개의 시스테인 분자의 산화를 통해 얻은 황 함유 아미노산이며, 디설파이드 결합으로 연결되어 있다.
"시스틴 매듭 모티프" 또는 "CK 모티프"는 3개의 디설파이드 결합을 포함하는 단백질 구조 모티프를 나타낸다. 본원에 사용된 "시스틴 매듭 모티프"라는 용어는, 3개의 디설파이드 결합, 즉, 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합을 함유하는 구조 모티프를 나타내며, 여기서 2개의 디설파이드 결합 사이에 존재하는 펩타이드 섹션은 루프를 형성하고, 이를 통해 제3 디설파이드 결합이 통과하여 로탁산(rotaxane) 하위구조가 형성된다. 제1 디설파이드 결합은 시스테인 잔기 CI과 CIV 사이에서 일어나고; 제2 디설파이드 결합은 시스테인 잔기 CII와 CV 사이에서 일어나고; 제3 디설파이드 결합은 시스테인 잔기 CIII과 CVI 사이에서 일어나며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고, 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이다. 일부 구현예에서, 디설파이드 결합 토폴로지는 하기 시스틴 매듭 모티프 중 하나를 형성한다: 저해제 시스틴 매듭(ICK: inhibitor cystine knot) 모티프; 성장인자 시스틴 매듭(GFCK: growth factor cystine knot) 모티프 또는 고리형 시스틴 매듭(CCK: cyclic cystine knot) 모티프.
"Dc1a" 또는 "뮤-디구에톡신-Dc1a"는 "사막 덤불 거미(desert bush spider)"로도 알려진 미국 사막 거미(디구에티아 카니티에스(Diguetia canities))에서 단리된 폴리펩타이드를 나타낸다. 야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a의 하나의 예는, 서열번호 1(NCBI 수탁번호 P49126.1)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다.
"제한 배지(defined medium)"는 알려진 화학 구성요소로 구성되어 있지만, 효모 추출물 또는 펩톤과 같은 미정제 단백질성 추출물 또는 부산물을 함유하지 않는 배지를 의미한다.
"축퇴" 또는 "코돈 축퇴"는 하나의 아미노산이 상이한 뉴클레오타이드 코돈에 의해 인코딩될 수 있는 현상을 나타낸다. 따라서, 단백질 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자의 핵산 서열은 축퇴로 인해 달라질 수 있다. 유전자 코드의 축퇴로 인해, 다수의 핵산 서열은 특정 활성을 갖는 소정의 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있으며; 이러한 기능적으로 동등한 변이체가 본원에서 고려된다.
"디설파이드 결합" 또는 "디설파이드 브릿지"는 측쇄 상의 2개의 티올기의 커플링에 의해 유도된 2개의 시스테인 아미노산 사이의 공유결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, 디설파이드 결합은 폴리펩타이드, 예를 들어 CRIP에 존재하는 2개의 상이한 티올기(-SH)의 산화적 폴딩을 통해 일어난다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 적어도 6개의 상이한 티올기(즉, 각각 티올기를 함유하는 6개의 시스테인 잔기)를 포함할 수 있기 때문에, 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 3개 이상의 분자내 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
"디설파이드 결합 토폴로지" 또는 "디설파이드 결합 연결 패턴" 또는 "디설파이드 결합 연결성"은 디설파이드 결합과 시스테인 잔기의 연결 패턴을 나타낸다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 CK 구조를 갖는 CRIP는 CI과 CIV; CII와 CV; 및 CIII과 CVI 사이에 디설파이드 결합 연결성을 갖는 3개의 디설파이드 결합을 형성하는 6개의 보존된 시스테인 잔기(번호 I 내지 VI)를 포함한다. 일부 구현예에서, 디설파이드 결합 연결성은 위상학적으로 일정하며, 이는 디설파이드 결합이, 예컨대 산화환원 조건을 사용하여 하나 이상의 디설파이드의 연결을 해제하는 방식으로 변경될 수 있음을 의미한다.
"이중 발현 카세트"는 동일한 벡터 상에 함유된 2개의 DVP 발현 카세트를 나타낸다.
"이중 전이유전자 펩타이드 발현 벡터" 또는 "이중 전이유전자 발현 벡터"는 DVP 발현 카세트의 2개의 카피를 함유하는 효모 발현 벡터를 의미한다.
"DNA"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 배열될 수 있는, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드(즉, 아데닌 [A], 구아닌 [G], 티민 [T] 또는 시토신 [C])의 중합체를 포함하는 데옥시리보핵산을 나타낸다. 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드를 생성한다.
"dNTP"는 DNA와 RNA를 구성하는 뉴클레오시드 트리포스페이트를 나타낸다.
"dvp" 또는 "뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드" 또는 "Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드" 또는 "변이형 뮤-디구에톡신-Dc1a 폴리뉴클레오타이드"는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. "뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는, 벡터 내 내포물인 DVP ORF에 함유된 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드 서열을 설명하기 위해 사용되는 경우, 및/또는 살충 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 설명하는 경우, "dvp" 및/또는 "Dvp"로 기재된다.
"DVP" 또는 "뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리펩타이드"는, 야생형 성숙 뮤-디구에톡신-Dc1a(서열번호 2)와 어떠한 점에서든 상이한 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 돌연변이체 또는 변이체를 나타내며; 예를 들어, 일부 구현예에서, 이러한 변이는 야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드에 대한 아미노산 치환, 아미노산 결실/삽입, 및/또는 돌연변이 또는 변이일 수 있다. 이러한 변이의 결과는, 야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a에 비해 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 보유하는 비(non)자연 발생 폴리펩타이드 및/또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
"DVP 발현 카세트"는 프로모터; 인핸서 요소; mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; 내부 리보솜 진입 부위(IRES); 인트론; 전사 후 조절 요소; 및 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 DVP ORF와 같은 하나 이상의 조절 요소를 나타낸다. 예를 들어, DVP 발현 카세트의 하나의 예는, DVP, ADH1 프로모터, LAC4 종결인자 및 알파-MF 분비 신호를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 분절을 함유하는 DNA의 하나 이상의 분절이다. DVP 발현 카세트는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하는 데 필요한 모든 핵산을 함유한다.
"DVP ORF"는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다.
"DVP ORF 다이어그램"은 다이어그램 또는 방정식 형태로 작성된 하나 이상의 DVP ORF의 조성을 나타낸다. 예를 들어, "DVP ORF 다이어그램"은 발현 ORF 내 함유된 DNA 분절에 대한 약어 또는 축약형 참조를 사용하여 작성될 수 있다. 따라서, 하나의 예에서, "DVP ORF 다이어그램"은 DNA 분절을 방정식 형태로, 각각, "ersp"(즉, ERSP 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열); "링커" 또는 "L"(즉, LINKER 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열); "sta"(즉, STA 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열) 및 "dvp"(즉, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열)로 도식화하는 방식으로, ERSP, LINKER, STA 및 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절을 설명할 수 있다. DVP ORF 다이어그램의 예는, "ersp-sta-(링커 i-dvp j)N" 또는 "ersp-(dvp j -링커 i ) N -sta" 및/또는 이들의 DNA 분절의 임의의 조합이다.
"DVP-살충 단백질"은 하기 (1) 및 (2)로 이루어진 임의의 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 아미노산 서열, 구성 또는 배열을 나타낸다: (1) 적어도 하나의 DVP, 또는 2개 이상의 DVP(여기서, 상기 2개 이상의 DVP는 동일하거나 상이할 수 있음); 및 (2) 추가의 비독소 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질(여기서, 상기 추가의 비독소 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은, 예를 들어, 일부 구현예에서, 하기 중 하나 이상을 수행하는 능력을 가짐: 곤충이 DVP-살충 단백질에 노출될 때, DVP 단독에 비해 곤충의 사멸률을 증가시키고/시키거나 곤충의 성장을 저해함; 예를 들어 숙주 세포 또는 발현 시스템에서 상기 DVP-살충 단백질의 발현을 증가시킴; 및/또는 DVP-살충 단백질의 번역 후 처리에 영향을 미침(예를 들어, DVP-살충 단백질의 분비 발현을 가능하게 함)). 일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 2개 이상의 DVP를 포함하는 중합체일 수 있다. 일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은, DVP가 링커 펩타이드, 예를 들어 절단 가능한 및/또는 절단 가능하지 않은 링커를 통해 작동 가능하게 연결된 둘 이상의 DVP를 포함하는 중합체일 수 있다. 일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 안정화 도메인(STA); 소포체 신호전달 단백질(ERSP); 곤충 절단 가능하거나 곤충 절단 가능하지 않은 링커(L); 및/또는 이들의 임의의 다른 조합과 같은 하나 이상의 단백질과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 (1) 야생형 Dc1a 단백질과, (2) 추가의 비독소 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예를 들어 ERSP; 링커; STA; UBI; 또는 히스티딘 태그 또는 유사한 마커를 포함하는 비자연 발생 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 (1) DVP와, (2) 알파 교배인자 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 (1) DVP와, (2) 알파 교배인자(알파-MF) 또는 α-교배인자(α-MF) 분비 도메인(분비 발현용)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 (1) DVP와, (2) 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis) α-교배인자(α-MF) 분비 도메인(분비 발현용)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 (1) 2개 이상의 DVP(여기서, DVP는 링커 펩타이드, 예를 들어 절단 가능한 및/또는 절단 가능하지 않은 링커를 통해 작동 가능하게 연결되어 있고, DVP는 동일하거나 상이함)과, (2) 알파-MF, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스 α-교배인자(α-MF) 분비 도메인(분비 발현용)을 포함할 수 있다.
"DVP 작제물"은 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드 분절(예를 들어, DVP-살충 단백질)의 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 모티프의 3차원 배열/배향을 나타낸다. 예를 들어, DVP ORF는 하기 구성요소 또는 모티프 중 하나 이상을 포함할 수 있다: DVP; 소포체 신호 펩타이드(ERSP); 링커 펩타이드(L); 번역 안정화 단백질(STA); 또는 이들의 임의의 조합. 그리고, 본원에 사용된 "DVP 작제물"이라는 용어는 구조 모티프의 지정 및/또는 배향을 설명하기 위해 사용된다. 즉, DVP 작제물은 소정의 DVP ORF 내 함유된 구성요소 또는 모티프의 배열과 배향을 설명한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP 작제물은, 비제한적으로, 하기 DVP-살충 단백질 중 하나의 배향을 설명한다: ERSP-DVP; ERSP-(DVP)N; ERSP-DVP-L; ERSP-(DVP)N-L; ERSP-(DVP-L)N; ERSP-L-DVP; ERSP-L-(DVP)N; ERSP-(L-DVP)N; ERSP-STA-DVP; ERSP-STA-(DVP)N; ERSP-DVP-STA; ERSP-(DVP)N-STA; ERSP-(STA-DVP)N; ERSP-(DVP-STA)N; ERSP-L-DVP-STA; ERSP-L-STA-DVP; ERSP-L-(DVP-STA)N; ERSP-L-(STA-DVP)N; ERSP-L-(DVP)N-STA; ERSP-(L-DVP)N-STA; ERSP-(L-STA-DVP)N; ERSP-(L-DVP-STA)N; ERSP-(L-STA)N-DVP; ERSP-(L-DVP)N-STA; ERSP-STA-L-DVP; ERSP-STA-DVP-L; ERSP-STA-L-(DVP)N; ERSP-(STA-L)N-DVP; ERSP-STA-(L-DVP)N; ERSP-(STA-L-DVP)N; ERSP-STA-(DVP)N-L; ERSP-STA-(DVP-L)N; ERSP-(STA-DVP)N-L; ERSP-(STA-DVP-L)N; ERSP-DVP-L-STA; ERSP-DVP-STA-L; ERSP-(DVP)N-STA-L ERSP-(DVP-L)N-STA; ERSP-(DVP-STA)N-L; ERSP-(DVP-L-STA)N; 또는 ERSP-(DVP-STA-L)N(여기서, N은 1 내지 200 범위의 정수임).
"ELISA" 또는 "iELISA"는 샘플을 플레이트의 표면에 고정시킨 후 하기와 같이 검출하는 검정 프로토콜을 의미한다: 1차 항체를 적용한 후, 무색 기질을 유색 기질로 전환시켜 샘플 전체에 걸쳐 검출 및 정량화할 수 있는 효소에 접합된 2차 항체를 적용함. 상기 프로토콜 동안, 에피토프에 결합된 항체만 검출을 위해 남도록 항체를 세척한다. 남게되는 샘플은 주로 단백질이며, ELISA로 회수된 단백질의 양의 정량화를 할 수 있다.
"내인성"은 자연적으로 발생하고/하거나 유기체에 존재하는 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 과정, 예를 들어 특정 유전자 조작 전 숙주 세포에 이미 존재하는 분자 또는 활성을 나타낸다.
"인핸서 요소"는 인핸서 요소 부재 하에서 프로모터로 인해 생성되는 전사 활성에 비해 프로모터에 대해 증가된 전사 활성을 발휘할 수 있는, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 나타낸다.
"ER" 또는 "소포체"는 일부 번역 후 변형 과정이 일어나는 모든 진핵생물에 대해 공통적인 세포하 세포소기관이다.
"ERSP" 또는 "소포체 신호 펩타이드"는 단백질 번역 리보솜/mRNA 복합체를 세포질 내 ER로 이동시키는, DVP를 인코딩하는 mRNA 분자의 단백질 번역 동안 숙주 세포 신호 인식 입자에 의해 인식되고 결합되는 아미노산의 N-말단 서열이다. 결과는, 단백질 번역이 계속되는 ER에 도킹할 때까지 단백질 번역이 중단되고, 생성된 단백질이 ER에 주입된다.
"ersp"는 펩타이드 ERSP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다.
"ER 트래피킹(trafficking)"은 번역 후 변형, 분류 및 수송을 위해 세포 발현된 단백질을 ER로 수송하는 것을 의미한다.
"발현 카세트"는 재조합 발현 시스템에서 전이유전자 또는 이종 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드의 전사를 완료하는 데 필요한 모든 DNA 요소를 나타낸다. 따라서, 일부 구현예에서, "발현 카세트"는 (1) 관심 DNA 서열, 예를 들어 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드와, 하기 (2) 내지 (6) 중 하나 이상을 나타낸다: (2) 프로모터, 종결인자 및/또는 인핸서 요소; (3) 적절한 mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; (4) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (5) 인트론; 및/또는 (6) 전사 후 조절 요소. (1)과, (2) 내지 (6) 중 적어도 하나의 조합을 "발현 카세트"라고 한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 발현 카세트는 (1) DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 이는 하기 (2) 내지 (6) 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: (2) 프로모터, 종결인자 및/또는 인핸서 요소; (3) 적절한 mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; (4) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (5) 인트론; 및/또는 (6) 전사 후 조절 요소.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 (1) DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 이는 (2) 프로모터, 종결인자 및/또는 인핸서 요소; (3) 적절한 mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; (4) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (5) 인트론; 및/또는 (6) 전사 후 조절 요소 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오타이드는 각각 (2) 내지 (6) 중 하나 이상을 추가로 포함하고, DVP는 동일하거나 상이할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 발현 카세트는 (1) DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 제1 이종 폴리뉴클레오타이드와 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 하나 이상의 추가 이종 폴리뉴클레오타이드를 나타낼 수 있으며, 이는 (2) 프로모터, 종결인자 및/또는 인핸서 요소; (3) 적절한 mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; (4) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (5) 인트론; 및/또는 (6) 전사 후 조절 요소 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있고; 여기서 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 제1 이종 폴리뉴클레오타이드와 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 하나 이상의 추가 이종 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나는 (2) 내지 (6) 중 하나 이상을 추가로 포함하거나; DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 제1 이종 폴리뉴클레오타이드 각각, 및 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 하나 이상의 추가 이종 폴리뉴클레오타이드 각각은, 각각 개별적으로, (2) 내지 (6) 중 하나 이상을 추가로 포함하고, DVP는 동일하거나 상이할 수 있다.
대안적인 구현예에서, 2개의 발현 카세트가 존재하며, 각각의 발현 카세트는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하고(즉, 이중 발현 카세트), 여기서 DVP는 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 구현예에서, 3개의 발현 카세트가 존재하며, 각각의 발현 카세트는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하고(즉, 삼중 발현 카세트), 여기서 DVP는 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 발현 카세트는 제1 발현 카세트를 함유하는 벡터에 제2 발현 카세트를 서브클로닝하는 방식으로 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 삼중 발현 카세트는 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트를 함유하는 벡터에 제3 발현 카세트를 서브클로닝하는 방식으로 생성될 수 있다. 발현 카세트 및 클로닝 기술에 관한 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며 본원에 설명되어 있다.
"FECT"는 코팅 단백질 유전자와 삼중 유전자 블록이 제거된 여우꼬리 모자이크 바이러스(Foxtail mosaic virus)를 사용하는 일시적 식물 발현 시스템을 의미한다.
"GFP"는 해파리, 아에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria) 유래의 녹색 형광 단백질을 의미한다.
"성장 배지"는 시험관내에서 세포를 성장시키는 데 사용되는 영양 배지를 나타낸다.
본원에 사용된 "내장(gut)"은 내장을 포함하는 임의의 기관, 구조, 조직, 세포, 세포외 기질 및/또는 공간, 예를 들어 전장, 예를 들어 입, 인두, 식도, 모이주머니(crop), 전위(proventriculus) 또는 소낭(crop); 중장, 예를 들어 중장 맹장, 곤충의 위(ventriculus); 후장, 예를 들어 유문, 회장, 직장 또는 항문; 위심막; 미세융모; 기저막; 근층; 말피기관(Malpighian tubule); 또는 직장 팽대(rectal ampulla)를 나타낼 수 있다.
"상동"은 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 나타낸다. 2개의 비교되는 서열 둘 모두의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 분자는 해당 위치에서 상동이다. 2개의 서열 사이의 상동성%는 2개의 서열이 공유하는 매칭 또는 상동 위치의 수를 비교하는 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 상동성은 2개의 폴리펩타이드 분자 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 2개의 비교되는 서열 둘 모두의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 분자는 해당 위치에서 상동이다. 2개의 서열 사이의 상동성은 2개의 서열이 공유하는 매칭 또는 상동 위치의 수의 함수이다. 예를 들어, 2개의 서열 내 10개 위치 중 6개가 매칭되거나 상동인 경우, 2개의 서열은 60% 상동이다. 예로서, DNA 서열 ATTGCC와 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다.
핵산과 관련하여 사용될 때 "상동성"이라는 용어는, 상보성의 정도를 나타낸다. 부분 상동성일 수 있거나, 완전 상동성, 따라서 동일할 수 있다. "서열 동일성"은 둘 이상의 핵산 사이의 관련성의 척도를 나타내며, 총 비교 길이에 대한 백분율로 제공된다. 동일성 계산은 각각의 더 큰 서열에서 동일하며 동일한 상대 위치에 있는 뉴클레오타이드 잔기를 고려한다.
"ICK 모티프" 또는 "ICK 모티프 단백질"은 3개의 디설파이드 브릿지를 갖는 적어도 6개의 반-시스틴(half-cystine) 코어 아미노산을 갖는 16개 내지 60개 아미노산 펩타이드를 나타낸다. 일부 구현예에서, 3개의 디설파이드 브릿지는 공유결합이고, 6개의 반-시스틴 잔기 중 공유 디설파이드 결합은 N-말단 아미노산에서 출발한 6개의 코어 반-시스틴 아미노산의 제1 반-시스틴과 제4 반-시스틴, 제2 반-시스틴과 제5 반-시스틴, 및 제3 반-시스틴과 제6 반-시스틴 사이에 있다. 일부 구현예에서, 이러한 모티프를 보유하는 펩타이드는 통상적으로 모티프의 제4 코어 반-시스틴과 제6 코어 반-시스틴 사이에 위치하는 잔기로 구성된 베타-헤어핀 2차 구조를 포함하며, 여기서 헤어핀은 모티프의 3개의 디설파이드 결합에 의해 제공되는 구조적 가교 결합에 의해 안정화된다. 일부 구현예에서, 추가의 시스테인/시스틴 또는 반-시스틴 아미노산이 저해제 시스틴 매듭 모티프 내에 존재할 수 있다.
"동일성"은 둘 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 비교하는 방식으로 결정되는, 이러한 서열 사이의 관계를 나타낸다. "동일성"이라는 용어는 또한 경우에 따라 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정되는, 이러한 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미한다. "동일성"과 "유사성"은, 비제한적으로, 하기에 기재된 것들을 포함하여, 당업자에게 알려진 다수의 방법 중 어느 하나에 의해 용이하게 계산될 수 있다: 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; 문헌[Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]; 및 문헌[Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)](상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 나아가, 동일성과 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 2개의 서열 사이의 동일성과 유사성을 결정하는 방법에는, 비제한적으로, GCG 프로그램 패키지(문헌[Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)]), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(문헌[Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)])가 포함된다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원(문헌[BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894]; 문헌[Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)])에서 공개적으로 이용 가능하며, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
"생체내"는 자연 환경(예를 들어, 동물 또는 세포), 및 자연 환경 내에서 일어나는 과정 또는 반응을 나타낸다.
"비활성"은 어떤 것이 사용 상태가 아닌 상태, 예를 들어 휴면 상태 및/또는 작동하지 않는 상태를 나타낸다. 예를 들어, 유전자의 맥락에서 사용되거나 유전자를 언급할 때, 비활성이라는 용어는 상기 유전자가 더 이상 유전자 산물을 활발하게 합성하지 않거나, 상기 유전자 산물이 단백질로 번역되지 않거나, 다르게는 유전자가 정상적인 기능을 수행하지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 비활성이라는 용어는, 유전자의 RNA 전사 실패, RNA 처리(예를 들어, pre-mRNA 처리; RNA 스플라이싱; 또는 다른 전사 후 변형) 실패; 비코딩 RNA 성숙에 대한 간섭; (예를 들어, 핵에서 세포질로의) RNA 방출에 대한 간섭; 번역; 단백질 폴딩, 전위, 단백질 수송에 대한 간섭; 및/또는 분자 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 전사 인자, 조절제, 저해제, 또는 상기 언급한 과정 중 임의의 것에 참여하는 다른 인자 중 임의의 것에 대한 저해 및/또는 간섭을 나타낼 수 있다.
"증가하는" 또는 "증가하다" 또는 "증가된" 또는 "증가시키다"는, 어떤 것(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현)을 크기, 양, 강도 또는 정도의 측면에서 더 크게 만드는 것을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성될 수 있으며, 여기서 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 가지면 하기 효과가 유도된다: 재조합 CRP의 발현 수준 증가, 및/또는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP에 비해 재조합 CRP의 수율 증가.
따라서, 일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP에서 "증가된 발현 수준" 또는 "발현 수준의 증가" 또는 "증가된 수율" 또는 "수율 증가"라는 용어는, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP에서 단백질의 양, 단백질의 발현 수준 및/또는 단백질의 수율이, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP에서 단백질의 양, 단백질의 발현 수준 및/또는 단백질의 수율에 비해, 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 0.6%, 적어도 약 0.7%, 적어도 약 0.8%, 적어도 약 0.9%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.25%, 적어도 약 1.5%, 적어도 약 1.75%, 적어도 약 2%, 적어도 약 2.25%, 적어도 약 2.5%, 적어도 약 2.75%, 적어도 약 3%, 적어도 약 3.25%, 적어도 약 3.5%, 적어도 약 3.75%, 적어도 약 4%, 적어도 약 4.25%, 적어도 약 4.5%, 적어도 약 4.75%, 적어도 약 5%, 적어도 약 5.25%, 적어도 약 5.5%, 적어도 약 5.75%, 적어도 약 6%, 적어도 약 6.25%, 적어도 약 6.5%, 적어도 약 6.75%, 적어도 약 7%, 적어도 약 7.25%, 적어도 약 7.5%, 적어도 약 7.75%, 적어도 약 8%, 적어도 약 8.25%, 적어도 약 8.5%, 적어도 약 8.75%, 적어도 약 9%, 적어도 약 9.25%, 적어도 약 9.5%, 적어도 약 9.75%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 적어도 약 30%, 적어도 약 31%, 적어도 약 32%, 적어도 약 33%, 적어도 약 34%, 적어도 약 35%, 적어도 약 36%, 적어도 약 37%, 적어도 약 38%, 적어도 약 39%, 적어도 약 40%, 적어도 약 41%, 적어도 약 42%, 적어도 약 43%, 적어도 약 44%, 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100% 또는 100% 초과로 증가한 것을 나타낸다.
"작동 불가능한"은 기능하지 않거나, 오작동하거나 또는 더 이상 기능할 수 없는 상태를 나타낸다. 예를 들어, 유전자의 맥락에서 사용되거나 유전자를 언급할 때, 작동 불가능한이라는 용어는, 상기 유전자가, 영구적으로 또는 일시적으로, 더 이상 이것이 정상적으로 작동하는 바와 같이 작동할 수 없다는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, "작동 불가능한"은, 유전자가 더 이상 유전자 산물을 합성하지 않거나, 상기 유전자 산물이 단백질로 번역되지 않거나, 다르게는 유전자가 정상적인 기능을 수행할 수 없는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 작동 불가능한이라는 용어는, 유전자의 RNA 전사 실패, RNA 처리(예를 들어, pre-mRNA 처리; RNA 스플라이싱; 또는 다른 전사 후 변형) 실패; 비코딩 RNA 성숙에 대한 간섭; (예를 들어, 핵에서 세포질로의) RNA 방출에 대한 간섭; 번역; 단백질 폴딩, 전위, 단백질 수송에 대한 간섭; 및/또는 분자 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 전사 인자, 조절제, 저해제, 또는 상기 언급한 과정 중 임의의 것에 참여하는 다른 인자 중 임의의 것에 대한 저해 및/또는 간섭을 나타낼 수 있다.
"곤충"은 "곤충강(Insecta)"에 속하는 모든 유기체를 포함한다. "성체 전(pre-adult)" 곤충이라는 용어는, 예를 들어 알, 유충 및 약충(nymph)을 포함하는, 성체 단계 이전 유기체의 임의의 형태를 나타낸다. 본원에 사용된 "곤충"이라는 용어는, 모든 작물, 채소 및 나무에 침입하는 것으로 알려진 진드기 및 곤충을 포함하는 임의의 절지동물 및 선충을 나타내며, 이에는 임업, 원예 및 농업 분야에서 해충으로 간주되는 곤충이 포함된다. 본원에 개시된 방법으로 보호될 수 있는 특정 작물의 예는, 대두, 옥수수, 면화, 알파파 및 채소 작물이다. 특정 작물 및 곤충의 목록은 본원에 포함되어 있다.
"곤충 내장 환경" 또는 "내장 환경"은 곤충 또는 곤충 유충의 전장, 중장 또는 후장 내에서 발견되는 특정 pH 및 프로테이나아제 조건을 의미한다.
"곤충 혈림프 환경"은 곤충 또는 곤충 유충 내에서 발견되는 특정 pH 및 프로테이나아제 조건을 의미한다.
본원에 사용된 "살충성"이라는 용어는, 일반적으로 곤충의 사멸률을 증가시키거나 곤충의 성장 속도를 저해하는 본원에 사용된 폴리펩타이드 또는 단백질의 능력을 나타내는 데 사용된다. 본원에 사용된 "살선충성"이라는 용어는, 선충의 사멸률을 증가시키거나 선충의 성장 속도를 저해하는 본원에 사용된 폴리펩타이드 또는 단백질의 능력을 나타낸다. 일반적으로, "선충"이라는 용어는 상기 유기체의 알, 유충, 아성체 및 성숙한 형태를 포함한다.
"살충 활성"은, 곤충이 화합물, 작용제 또는 펩타이드에 노출될 때 또는 노출된 후, 곤충이 죽거나, 움직임을 멈추거나 느리게 하는 것; 섭식을 멈추거나 느리게 하는 것; 성장을 멈추거나 느리게 하는 것; (예를 들어, 탐색, 먹이 찾기, 수면 행동 및/또는 짝짓기와 관련하여) 혼란스러워하는 것; 번데기가 되는 것을 실패하는 것; 번식을 방해하는 것; 및/또는 곤충이 자손을 생성하는 것을 막고/막거나 곤충이 번식력이 있는 자손을 생성하는 것을 막는 것을 의미한다.
"통합 발현 벡터" 또는 "통합 벡터"는 효모 세포 게놈의 특정 유전자좌에 그 자체가 삽입되어 안정적으로 효모 게놈의 일부가 될 수 있는 효모 발현 벡터를 의미한다.
"개재 링커"는 단백질의 상이한 부분을 분리하는 단백질 내 짧은 펩타이드 서열, 또는 업스트림 DNA 서열과 다운스트림 DNA 서열을 분리하기 위해 ORF 내 리딩 프레임에 배치되는 짧은 DNA 서열을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질이 번역 동안 이의 독립적인 2차 및 3차 구조 형성을 달성하도록 하기 위해 개재 링커가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 개재 링커는 식물 세포 환경, 곤충 및/또는 인시목 내장 환경, 및 곤충 혈림프 및 인시목 혈림프 환경에서 절단하는 데 민감하거나 대해 이에 저항성이 있을 수 있다.
"단리된"은 자연 환경에서 특정 물질 및/또는 구성요소를 분리하는 것을 나타내며, 예를 들어 소정의 속 또는 종에서 단리된 독소는 독소가 자연 환경에서 분리되었음을 의미한다.
"카파-ACTX 펩타이드" 또는 "κ-ACTX"(모두 상호 교환적으로 사용됨)는 아트라시나에 아과에 속하는 호주 깔대기 그물 거미에서 단리된 살충성 저해제 시스틴 매듭(ICK) 펩타이드의 패밀리에 속하는 펩타이드를 나타낸다. 하나의 이러한 거미는 하드로니케 베르수타라는 학명을 가진 호주 블루마운틴 깔대기 그물 거미이다. "AICTGADRPCAACCPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP"(서열번호 198)(UniProtKB/Swiss-Prot 번호 P82228.1)의 아미노산 서열을 갖는 예시적인 야생형 카파-ACTX 펩타이드가 본원에 제공된다.
"kb"는 킬로베이스, 즉, 1000개의 염기를 나타낸다. 본원에 사용된 "kb"라는 용어는 핵산 분자의 길이를 의미한다. 예를 들어, 1 kb는 길이가 1000개 뉴클레오타이드인 핵산 분자를 나타낸다. 길이가 1 kb인 이중 가닥 DNA의 길이는 2000개의 뉴클레오타이드(즉, 각 가닥에 1000개)를 함유한다. 대안적으로, 길이가 1 kb인 단일 가닥 RNA의 길이는 1000개의 뉴클레오타이드를 함유한다.
"kDa"은 1,000 달톤(dalton)에 해당하는 단위인 킬로달톤을 나타내며; "달톤"은 분자량(MW)의 단위이다.
"녹인(knock in 또는 knock-in)" 또는 "녹킹인(knocking-in)"은 내인성 유전자를 외인성 또는 이종 유전자, 또는 이의 일부로 대체하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, "녹인"이라는 용어는, 상동 재조합에 의해 목적하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 표적 유전자 유전자좌에 도입하여 목적하는 단백질을 발현시키는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, "녹인" 돌연변이는 유전자 서열을 변형시켜 기능상실(loss-of-function) 또는 기능획득(gain-of-function) 돌연변이를 생성할 수 있다. "녹인"이라는 용어는, 외인성 또는 이종 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편이 게놈(예를 들어, "녹인을 수행하였음" 또는 "이종 유전자를 녹인하였음"), 또는 생성된 세포 및/또는 유기체(예를 들어, 세포가 "녹인"이거나 동물이 "녹인"임)에 도입되는 절차를 나타낼 수 있다.
"녹아웃(knock out, knockout 또는 knock-out)" 또는 "녹킹아웃(knocking-out)"은 세포에서 내인성 DNA 서열에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 유전자 산물(예를 들어, mRNA)의 부분 또는 완전 억제를 나타낸다. 일부 구현예에서, "녹아웃"은 전체 유전자, 또는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자 일부의 표적화된 결실에 의해 달성될 수 있다. 그 결과, 결실은 유전자를 비활성, 부분적으로 비활성, 작동 불가능, 부분적으로 작동 불가능하게 되도록 만들거나, 다르게는 전체 유기체 내 임의의 세포 및/또는 해당 유전자가 정상적으로 발현되는 세포에서 유전자 또는 이의 산물의 발현을 감소시킬 수 있다. "녹아웃"이라는 용어는, 내인성 유전자가 완전히 또는 부분적으로 비활성 또는 작동 불가능하게 되도록 만들거나(예를 들어, "녹아웃을 수행하였음" 또는 "내인성 유전자를 녹아웃시켰음"), 또는 생성된 세포 및/또는 유기체(예를 들어, 세포가 "녹아웃"이거나 동물이 "녹아웃"임)가 완전히 또는 부분적으로 비활성 또는 작동 불가능하게 되도록 만드는 절차를 나타낼 수 있다.
"녹다운 용량 50" 또는 "KD50"은 집단, 예를 들어 무스카 도메스티카(일반 집파리) 및/또는 아에데스 아에깁티(모기) 집단의 50%에서 마비 또는 움직임의 중단을 유발하는 데 필요한 용량의 중앙값을 나타낸다.
"l" 또는 "링커"는 개재 링커 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 나타낸다.
"L1"은 화학식 (II)에 따른 CK 구조에서 시스틴 매듭 모티프의 디설파이드 결합 형성에 참여하는 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기(즉, CI과 CII) 사이에 위치한 펩타이드 서브유닛을 나타낸다.
"L2"는 화학식 (II)에 따른 CK 구조에서 시스틴 매듭 모티프의 디설파이드 결합 형성에 참여하는 제2 시스테인 잔기와 제3 시스테인 잔기(즉, CII와 CIII) 사이에 위치한 펩타이드 서브유닛을 나타낸다.
"L3"은 화학식 (II)에 따른 CK 구조에서 시스틴 매듭 모티프의 디설파이드 결합 형성에 참여하는 제3 시스테인 잔기와 제4 시스테인 잔기(즉, CIII과 CIV) 사이에 위치한 펩타이드 서브유닛을 나타낸다.
"L4"는 화학식 (II)에 따른 CK 구조에서 시스틴 매듭 모티프의 디설파이드 결합 형성에 참여하는 제4 시스테인 잔기와 제5 시스테인 잔기(즉, CIV와 CV) 사이에 위치한 펩타이드 서브유닛을 나타낸다.
"L5"는 화학식 (II)에 따른 CK 구조에서 시스틴 매듭 모티프의 디설파이드 결합 형성에 참여하는 제5 시스테인 잔기와 제6 시스테인 잔기(즉, CV와 CVI) 사이에 위치한 펩타이드 서브유닛을 나타낸다.
적절한 문맥에서 "L"은 번역 안정화 단백질(STA)을 추가의 폴리펩타이드, 예를 들어 DVP 및/또는 다중 DVP와 연결하는 개재 링커 펩타이드를 나타낸다. 아미노산을 언급할 때, "L"은 또한 류신을 의미할 수 있다.
"LAC4 프로모터" 또는 "Lac4 프로모터" 또는 "pLac4"는 클루이베로마이세스 락티스 β-갈락토시다아제 유전자에서 유도된 프로모터 서열로 구성된 DNA 분절을 나타낸다. LAC4 프로모터는 효모로 형질전환된 외인성 유전자의 발현을 유도하는 데 사용되는 강력하고 유도 가능한 리포터이다.
"LAC4 종결인자" 또는 "Lac4 종결인자"는 클루이베로마이세스 락티스 β-갈락토시다아제 유전자에서 유도된 전사 종결인자 서열로 구성된 DNA 분절을 나타낸다.
"인시목 내장 환경"은 인시목 곤충 또는 유충의 전장, 중장 또는 후장 내에서 발견되는 특정 pH 및 프로테이나아제 조건을 의미한다.
"인시목 혈림프 환경"은 인시목 곤충 또는 유충 내에서 발견되는 특정 pH 및 프로테이나아제 조건을 의미한다.
"LD20"은 집단의 20%를 사멸시키는 데 필요한 용량을 나타낸다.
"LD50"은 집단의 50%를 사멸시키는 데 필요한 용량을 의미하는 치사량 50을 나타낸다.
"링커" 또는 "LINKER" 또는 "펩타이드 링커" 또는 "L" 또는 "개재 링커"는 2개의 펩타이드를 함께 연결하도록 작동 가능한 짧은 펩타이드 서열을 나타낸다. 링커는 또한 업스트림 DNA 서열과 다운스트림 DNA 서열을 분리하기 위해 ORF의 리딩 프레임에 배치되는 짧은 DNA 서열을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 곤충 프로테아제에 의해 절단 가능할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 단백질이 번역 동안 이의 독립적인 2차 및 3차 구조 형성을 달성하게 할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 식물 세포 환경, 곤충 및/또는 인시목 내장 환경, 및/또는 곤충 혈림프 및 인시목 혈림프 환경에서 절단하는 데 민감하거나 대해 이에 저항성이 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 프로테아제에 의해 절단될 수 있으며, 예를 들어, 일부 구현예에서, 링커는 식물 프로테아제(예를 들어, 파파인(papain), 브로멜라인(bromelain), 피신(ficin), 악티니딘(actinidin), 진기바인(zingibain) 및/또는 카르도신(cardosin)), 곤충 프로테아제, 진균 프로테아제, 척추동물 프로테아제, 무척추동물 프로테아제, 박테리아 프로테아제, 포유류 프로테아제, 파충류 프로테아제 또는 조류 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 이원 또는 삼원 영역을 포함하며, 여기서 각각의 영역은 적어도 2가지 유형의 프로테아제(이중 하나는 곤충 및/또는 선충 프로테아제이고, 다른 하나는 인간 프로테아제임)에 의해 절단 가능하다. 일부 구현예에서, 링커는 하기 (적어도) 3가지 역할 중 하나를 가질 수 있다: 곤충 내장 환경에서 절단되는 것, 식물 세포에서 절단되는 것 또는 의도적으로 절단되지 않도록 디자인되는 것.
"배지"는 세포 배양물에서 세포를 배양하기 위한 영양분이 있는 용액을 나타낸다.
"MOA"는 작용 메커니즘을 나타낸다.
"변형 가능한 CRP"는 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖는 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합에 더하여, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 시스테인 풍부 단백질을 나타내며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않는다. 변형 가능한 CRP의 예에는, "CNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNCIGGGCSKTCGY"(서열번호 193; NCBI 수탁번호 P49268.1)의 아미노산 서열을 갖는 ApsIII 단백질; "AICTGADRPCAACCPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP"(서열번호 198; UniProtKB/Swiss-Prot 번호 P82228.1)의 아미노산 서열을 갖는 야생형 카파-ACTX 펩타이드; 및/또는 서열번호 1, 2 또는 195 중 어느 하나가 포함된다.
"분자량(MW)"은 분자의 질량 또는 중량을 나타내며, 이는 전형적으로 "달톤(Da)" 또는 킬로달톤(kDa)으로 측정된다. 일부 구현예에서, MW는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 분석용 초원심분리 또는 광산란을 사용하여 계산될 수 있다. 일부 구현예에서, SDS-PAGE 방법은 하기와 같다: 관심 샘플을 분자량 표준물 세트를 이용하여 겔에서 분리시킨다. 샘플을 실행한 후, 겔을 목적하는 염색으로 처리하고, 이어서 약 2시간 내지 14시간 동안 탈색한다. 다음 단계는 표준물 및 관심 단백질의 상대적인 이동 거리(Rf)를 결정하는 것이다. 이동 거리는 하기 방정식을 사용하여 결정할 수 있다:
Figure pct00004
식 (III)
다음으로, 표준물 밴드에 대해 얻은 값에 기반하여 MW의 로그를 결정할 수 있으며; 예를 들어, 일부 구현예에서, SDS-변성 폴리펩타이드의 분자량 및 이의 상대적인 이동 거리(Rf)의 로그를 그래프로 플롯팅한다. 그래프로 플롯팅한 후, 유도된 값을 내삽하여 알려지지 않은 단백질 밴드의 분자량을 제공한다.
"모티프"는 일부 생물학적 유의성을 갖는 것과 관련이 있고/있거나, 일부 효과를 발휘하거나 일부 생물학적 과정에 관여하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 나타낸다.
"다중 클로닝 부위" 또는 "MCS"는 관심 DNA 서열이 삽입될 수 있는 다수의 제한 부위를 함유하는 벡터에서 발견되는 DNA 분절을 나타낸다.
"돌연변이체"는 (예를 들어, DNA 서열에서) 변경을 갖는 유기체, DNA 서열, 펩타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열이며, 이러한 변경은 상기 유기체 및/또는 서열을 자연 발생 또는 야생형 유기체 및/또는 서열과 상이하게 만든다. 예를 들어, 야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a 폴리펩타이드는 변경되어 비자연 발생 DVP가 될 수 있다.
"NE"는 화학식 (II)에 따른 CK 구조에서 시스틴 매듭 모티프의 디설파이드 결합 형성에 참여하는 제1 시스테인 잔기(즉, CI)에 작동 가능하게 연결된 C-말단을 갖는 펩타이드 서브유닛을 나타낸다.
"N-말단"은 폴리펩타이드의 개시 또는 시작 부분에 위치하는 유리 아미노기(즉, -NH2)를 나타낸다.
"NCBI"는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 나타낸다.
"nm"은 나노미터를 나타낸다.
"비극성 아미노산"은 약한 소수성인 아미노산이며, 이에는 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌 및 메티오닌이 포함된다. 글리신 또는 gly은 본 발명의 디펩타이드에 대한 가장 바람직한 비극성 아미노산이다.
"정규화된 펩타이드 수율"은 펩타이드 수율이 측정되는 시점에서 상응하는 세포 밀도로 나눈 조건화된 배지의 펩타이드 수율을 의미한다. 펩타이드 수율은 부피 단위로 생성된 펩타이드의 질량, 예를 들어 리터당 mg 또는 mg/L, 또는 HPLC 크로마토그래프에서 생성된 펩타이드의 UV 흡광도 피크 면적, 예를 들어 mAu.sec.로 표시될 수 있다. 세포 밀도는 600 nm 파장(OD600)에서의 배양물의 가시광선 흡광도로 표시될 수 있다.
"OD"는 광학 밀도를 나타낸다. 전형적으로, OD는 분광광도계를 사용하여 측정된다.
"OD660nm" 또는 "OD660nm"는 660 나노미터(nm)에서의 광학 밀도를 나타낸다.
"1개 문자 코드"는 단백질의 1차 구조에서 다양한 아미노산을 구별하기 위해 1개 문자 코드로 열거된 펩타이드 서열을 의미한다: 알라닌=A, 아르기닌=R, 아스파라긴=N, 아스파르트산=D, 아스파라긴 또는 아스파르트산=B, 시스테인=C, 글루탐산=E, 글루타민=Q, 글루타민 또는 글루탐산=Z, 글리신=G, 히스티딘=H, 이소류신=I, 류신=L, 리신=K, 메티오닌=M, 페닐알라닌=F, 프롤린=P, 세린=S, 트레오닌=T, 트립토판=W, 티로신=Y, 및 발린=V.
"작동 가능한"은 사용할 수 있는 능력, 어떤 것을 수행할 수 있는 능력 및/또는 일부 기능 또는 결과를 달성할 수 있는 능력을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, "작동 가능한"은 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, DNA 서열, RNA 서열, 또는 다른 뉴클레오타이드 서열 또는 유전자의 능력을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 단백질을 인코딩하도록 작동 가능할 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오타이드에 단백질을 생성하는 능력(예를 들어, mRNA를 전사시켜, 결국 단백질로 번역시킴)을 부여하는 정보가 함유되어 있다는 것을 의미한다.
"작동 가능하게 연결된"은 이와 같이 설명된 구성요소들이 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치(juxta위치)를 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 작동 가능하게 연결된은 둘 이상의 DNA, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 나타낼 수 있다. 다른 구현예에서, 작동 가능하게 연결된은, 하나의 DNA 서열의 전사 활성화가 다른 하나의 DNA 서열에 작용할 수 있도록 2개의 인접한 DNA 서열이 함께 배치되어 있는 것을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는, 둘 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 단일 폴리펩타이드 사슬을 생성하는 방식으로 연결되어 있는 둘 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있으며; 대안적으로, 작동 가능하게 연결된이라는 용어는, 하나의 펩타이드가 다른 하나의 펩타이드에 일부 영향을 미치는 방식으로 연결되어 있는 둘 이상의 펩타이드를 나타낼 수 있다. 또 다른 구현예에서, 작동 가능하게 연결된은, 하나의 전사 활성화가 다른 하나에 작용할 수 있도록 2개의 인접한 DNA 서열이 함께 배치되어 있는 것을 의미할 수 있다.
"ORF" 또는 "오픈 리딩 프레임"은 하나 이상의 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는, 번역 개시 신호(예를 들어, 각각, AUG 또는 ATG)와 알려진 종결 코돈 중 임의의 하나 이상 사이에 있는 RNA 또는 DNA 서열의 길이를 나타낸다. 달리 말하면, ORF는, 리보솜이 종결 코돈과 만나지 않았기 때문에 판독(즉, 초기 단백질에 아미노산을 부가함)을 지속할 수 있는 한 RNA 코드를 번역하는 리보솜의 관점에서 본 참조 프레임을 설명한다. 따라서, "오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF"는 코딩 서열의 번역 개시 코돈과 종결 코돈 사이에 인코딩된 아미노산 서열을 나타낸다. 본원에서, "개시 코돈"과 "종결 코돈"이라는 용어는, 각각, 단백질 합성(mRNA 번역)의 개시 및 사슬 종결을 지정하는 코딩 서열 내 3개의 인접한 뉴클레오타이드 단위(즉, 코돈)를 나타낸다.
일부 구현예에서, ORF는 개시 코돈(통상적으로 DNA의 경우 ATG, 및 RNA의 경우 AUG)으로 시작하여 종결 코돈(통상적으로 UAA, UAG 또는 UGA)으로 종결되는 코돈의 연속 스트레치이다. 다른 구현예에서, ORF는 번역 개시 신호(예를 들어, AUG 또는 ATG)와 알려진 종결 코돈 중 임의의 하나 이상 사이에 있는 RNA 또는 DNA 서열의 길이일 수 있으며, 여기서 상기 RNA 또는 DNA 서열의 길이는 하나 이상의 폴리펩타이드 서열을 인코딩한다. 일부 다른 구현예에서, ORF는 ATG 개시 코돈으로 시작하여 TGA, TAA 또는 TAG 종결 코돈으로 종결되는 단백질을 인코딩하는 DNA 서열일 수 있다. ORF는 또한 DNA가 인코딩하는 번역된 단백질을 의미할 수 있다. 일반적으로, 당업자는 "오픈 리딩 프레임"의 가장 넓은 정의가 단순히 종결 코돈을 함유하지 않는 일련의 코돈을 고려한다는 사실에 기반하여, "오픈 리딩 프레임" 및 "ORF"라는 용어를 "코딩 서열"이라는 용어와 구별한다. 따라서, ORF는 인트론을 함유할 수 있지만, 코딩 서열은 리보솜 번역 기구에 의해 실제로 아미노산으로 번역되는 코돈으로 나뉠 수 있는 뉴클레오타이드(예를 들어, 연결된 엑손)를 참조로 구별되며(즉, 코딩 서열은 인트론을 함유하지 않음); 본원에 사용된 "코딩 서열"; "CDS"; "오픈 리딩 프레임"; 및 "ORF"라는 용어는 상호 교환적으로 사용된다.
"탈재조합된(out-recombined)" 또는 "탈재조합"은 생체내 상동 재조합 동안 2개의 부위 특이적 재조합 부위(예를 들어, 표적 벡터의 상동성 아암에 상동인 표적 유전자의 5'-뉴클레오타이드 서열과 3'-뉴클레오타이드 서열)가 플랭킹된 유전자 및/또는 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 내인성 유전자)의 제거를 나타낸다. "녹아웃"을 참조한다.
"펩타이드 발현 벡터"는 이종 펩타이드 전이유전자를 함유하는 숙주 유기체 발현 벡터를 의미한다.
"펩타이드 발현 효모 균주", "펩타이드 발현 균주" 또는 "펩타이드 생산 균주"는 이종 펩타이드를 생산할 수 있는 효모 균주를 의미한다.
"펩타이드 링커"는 링커를 참조한다.
"펩타이드 서브유닛"은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에서 하나 이상의 시스테인 잔기의 업스트림, 다운스트림 및/또는 사이에 있는 하나 이상의 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 펩타이드 서브유닛은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP에서 시스테인 잔기의 업스트림, 다운스트림 및/또는 사이에 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드 서브유닛의 길이는 1개 내지 13개 아미노산 잔기일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 서브유닛의 길이는 13개 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하는 재조합 CRP에서 펩타이드 서브유닛은 NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE로 지정된다.
"펩타이드 전이유전자" 또는 "살충 펩타이드 전이유전자" 또는 "살충 단백질 전이유전자" 또는 "뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 전이유전자"는 DVP를 인코딩하고 생물학적 발현 시스템에서 번역될 수 있는 DNA 서열을 나타낸다.
"펩타이드 수율"은 펩타이드 발현 효모 균주의 세포로부터 생산된 조건화된 배지 내 살충 펩타이드 농도를 의미한다. 이는 부피 단위로 생성된 펩타이드의 질량, 예를 들어 리터당 mg 또는 mg/L, 또는 HPLC 크로마토그래프에서 생성된 펩타이드의 UV 흡광도 피크 면적, 예를 들어 mAu.sec.로 표시될 수 있다.
"해충"에는, 비제한적으로, 곤충, 진균, 박테리아, 선충, 응애, 진드기 등이 포함된다.
"살충 유효량"은 적어도 하나의 해충의 사멸을 유도할 수 있거나, 해충 성장, 섭식 또는 정상적인 생리학적 발달을 현저하게 감소시킬 수 있는 농약의 양을 나타낸다. 이러한 양은, 예를 들어 방제하고자 하는 특정 표적 해충, 처리하고자 하는 특정 환경, 위치, 식물, 작물 또는 농업 현장, 환경 조건, 및 살충 효과 폴리펩타이드 조성물의 적용 방법, 속도, 농도, 안정성 및 양과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 제형은 또한 기후 조건, 환경 고려사항 및/또는 적용 빈도 및/또는 해충 침입의 심각성에 따라 달라질 수 있다.
"약제학적으로 허용 가능한 염"은 산 또는 염기 염을 제조하는 방식으로 변형된 화합물을 나타낸다.
"식물"은 전체 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 부분, 식물 기관(예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 번식체, 배아 및 이들의 자손을 의미할 수 있다. 식물 세포는 분화되거나 미분화될 수 있다(예를 들어, 캘러스(callus), 현탁 배양 세포, 원형질체, 잎 세포, 뿌리 세포, 체관부 세포 및 꽃가루).
"식물 유전자이식 단백질"은 이를 인코딩하는 DNA 또는 RNA가 하나 이상의 식물 세포 내로 전달된 후 식물에서 발현되는 이종 종 유래의 단백질을 의미한다.
"식물 혼입 보호제" 또는 "PIP"는 유전자이식 식물에 의해 생성되는 살충 단백질, 및 식물이 단백질을 생산하는 데 필요한 유전 물질을 의미한다.
"식물 절단 가능한 링커"는 식물 프로테아제 인식 부위를 함유하고 식물 세포에서 단백질 발현 과정 동안 절단될 수 있는, 절단 가능한 링커 펩타이드, 또는 절단 가능한 링커 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 의미한다.
"식물 재생 배지"는 식물 성장에 필요한 요소와 비타민, 및 발아할 수 있는 배아로의 세포의 재생을 촉진시키고 조직 배양에서 유도된 묘목을 생성하는 데 필요한 식물 호르몬을 함유하는 임의의 배지를 의미한다. 종종, 배지는, 유전자이식 세포가 작용제에 대한 내성을 부여하는 선별 유전자를 발현하는 선별 가능한 작용제를 함유한다.
"플라스미드"는 관심 유전자(예를 들어, dvp)에 대한 담체로 작용하며, 유기체로 형질전환되거나 트랜스펙션될 때, 숙주 유기체와 독립적으로 플라스미드 내에 함유된 DNA 서열을 복제하고 발현시킬 수 있는 DNA 분절을 나타낸다. 플라스미드는 벡터의 일종이며, "클로닝 벡터"(즉, DNA 단편을 클로닝하고 일부 선별 지시자를 통해 플라스미드를 운반하는 숙주 집단을 선별하는 데 사용되는 단순 플라스미드) 또는 "발현 플라스미드"(즉, 대량의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 생산하는 데 사용되는 플라스미드)일 수 있다.
"극성 아미노산"은 극성인 아미노산으로, 이에는 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 트립토판 및 티로신이 포함되고; 바람직한 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민이며; 여기서 세린이 가장 고도로 바람직하다.
"폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드(예를 들어, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체)의 중합체 형태; 예를 들어 둘 이상의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 서열을 나타낸다. 본원에 사용된 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는, 이중 및 단일 가닥 DNA뿐 아니라, 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함하며; 이는 또한 폴리뉴클레오타이드의 변형된 및 미변형된 형태를 포함한다(폴리뉴클레오타이드에 대한 및 폴리뉴클레오타이드의 변형은, 예를 들어 메틸화, 인산화, 및/또는 캡핑을 포함할 수 있음). 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 하기 중 하나일 수 있다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그); 게놈 DNA; 게놈 DNA 단편; 엑손; 인트론; 메신저 RNA(mRNA); 전달 RNA; 리보솜 RNA; 리보자임; cDNA; 재조합 폴리뉴클레오타이드; 분지형 폴리뉴클레오타이드; 플라스미드; 벡터; 임의의 서열의 단리된 DNA; 임의의 서열의 단리된 RNA; 핵산 프로브; 전술한 것들 중 임의의 것의 프라이머 또는 증폭된 카피.
또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 유전자의 오픈 리딩 프레임을 인코딩하도록 작동 가능한 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 3차원 구조를 가질 수 있으며, 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 구조는 또한 폴리뉴클레오타이드의 방향성을 나타내는 5'- 또는 3'-단부 또는 말단에 의해 참조될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥에서 인접한 뉴클레오타이드는 전형적으로 3' 탄소와 5' 탄소 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된다. 하지만, 메틸렌, 포스포르아미데이트 연결 등을 포함하는 연결과 같은 상이한 뉴클레오타이드간 연결이 또한 사용될 수 있다. 이는, 각각의 5' 및 3' 탄소가 5' 및 3' 단부 또는 말단으로 불릴 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 각 말단에 노출될 수 있음을 의미한다. 5' 및 3' 말단은 또한, 각각, 포스포릴(PO4) 및 히드록실(OH) 말단으로 불릴 수 있는 데, 이는 해당 말단에 이러한 화학기가 부착되어 있기 때문이다. 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 또한 이중 가닥 분자와 단일 가닥 분자를 모두 나타낸다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드를 제조하거나 사용하는 임의의 구현예는, 이중 가닥 형태와, 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예측되는 2개의 상보적 단일 가닥 형태 각각을 모두 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체(비천연 염기를 갖는 뉴클레오타이드, 아자퓨린 또는 데아자 퓨린 등과 같은 변형된 천연 염기를 갖는 뉴클레오타이드 등 포함)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 또한, 예컨대 표지화 구성요소와의 접합에 의해 중합 후 추가로 변형될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드의 서열에 비뉴클레오타이드 구성요소가 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 말단은 해당 말단이 다른 폴리뉴클레오타이드와 특정한 방식으로 상호작용하는 것(예를 들어, 공유결합을 형성함)을 방지하기 위해 보호되거나 달리 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 하기 4가지 뉴클레오타이드 염기의 특정 서열로 구성될 수 있다: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 및 티민(T). 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드가 RNA인 경우 티민에 대한 천연 대체물로 우라실(U)이 또한 존재할 수 있다. 우라실은 DNA에서도 사용될 수 있다. 따라서, "서열"이라는 용어는, 천연 및 비천염 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 임의의 핵산 분자의 알파벳 표시를 나타낸다.
"RNA 분자" 또는 리보핵산 분자라는 용어는, 데옥시리보오스 당보다는 리보오스 당, 및 전형적으로 피리미딘 염기 중 하나로서 티민보다는 우라실을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 본 발명의 RNA 분자는 일반적으로 단일 가닥이지만, 이중 가닥일 수도 있다. RNA 샘플의 RNA 분자의 맥락에서, RNA 분자는 이것이 전사되는 DNA 가닥과 상보적인 뉴클레오타이드 염기의 선형 서열을 갖는, 세포 핵, 미토콘드리아 또는 엽록체에서 DNA로부터 전사되는 단일 가닥 분자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 이종 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조절 요소는 하나 이상의 프로모터; 인핸서; 사일런서(silencer); 작동인자; 스플라이싱 신호; 폴리아데닐화 신호; 종결 신호; RNA 방출 요소, 내부 리보솜 진입 부위(IRES); poly-U 서열; 또는 이들의 조합이다.
"전사 후 조절 요소"는 전사된 후 mRNA에 영향을 미치는 DNA 분절 및/또는 메커니즘이다. 전사 후 메커니즘에는, 스플라이싱 사건; 캡핑, 스플라이싱 및 Poly (A) 테일의 부가, 및 당업자에게 알려진 다른 메커니즘이 포함된다.
"프로모터"는 RNA 폴리머라아제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하는 DNA의 영역을 나타낸다.
"단백질"은 본 명세서에서"펩타이드" 및/또는 "폴리펩타이드"와 동일한 의미를 갖는다.
"비(ratio)"는 2개 이상의 양 사이 또는 2개 이상의 대상 사이의 관계(양 또는 수량)를 보여주는 2개의 양 사이 또는 2개의 대상 사이의 정량적 관계를 나타낸다. 따라서, 일부 구현예에서, 비는 첫 번째 값이 두 번째 값을 포함하거나 두 번째 값에 포함되는 횟수를 나타낸다.
"리딩 프레임"은 이중 가닥 DNA 분자의 6개의 가능한 리딩 프레임 중 하나(각 방향으로 3개)를 나타낸다. 사용되는 리딩 프레임은 어떠한 코돈이 DNA 분자의 코딩 서열 내에서 아미노산을 인코딩하는 데 사용되는 지를 결정한다. 일부 구현예에서, 리딩 프레임은 폴리뉴클레오타이드 및/또는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)에서 뉴클레오타이드의 서열을 연속적인 비중첩 삼중항 세트로 분할하는 방식이다.
"재조합 CRP"는 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP에서 유도된, 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 포함하는 비자연 발생 재조합 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 나타낸다. 본원에 사용된 "재조합"이라는 용어는, 예를 들어 자연 발생 대응물과 비교하여, 또는 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 갖지 않는 비자연 발생 단백질(예를 들어, 비천연의 변형 가능한 CRP)과 비교하여 부가, 결실 및/또는 치환을 포함하는 하나 이상의 변경을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 이러한 변경은, 예를 들어 재조합 DNA 기술에 의해 도입된다. "재조합"이라는 용어는 또한, 인간에 의해 생성된 아미노산 서열; 인공 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질; 융합 단백질; 및/또는 키메라 폴리펩타이드; 인간에 의해 생성된 뉴클레오타이드 서열; 인공 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, DNA, RNA 또는 유전자; 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 발현되면, 재조합 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질은, 예를 들어, 비제한적으로, 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당업자에게 알려진 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질은, 예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 합성을 포함하는 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다.
"재조합 DNA" 또는 "rDNA"는 둘 이상의 상이한 DNA 분절로 구성된 DNA를 나타낸다.
"재조합 벡터"는 외래 DNA가 삽입된 DNA 플라스미드 벡터를 의미한다.
"조절 요소"는 핵산 서열의 발현 및/또는 처리의 일부 양태를 제어하는 유전 요소를 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조절 요소는 전사 시 및 전사 후 수준에서 발견될 수 있다. 조절 요소는 시스-조절 요소(CRE) 또는 트랜스-조절 요소(TRE)일 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 요소는 하나 이상의 프로모터; 인핸서; 사일런서; 작동인자; 스플라이싱 신호; 폴리아데닐화 신호; 종결 신호; RNA 방출 요소, 내부 리보솜 진입 부위(IRES); poly-U 서열; 및/또는 예를 들어 발현을 증가 또는 감소시키고/시키거나 구성적 발현을 유도하기 위해 조직 특이적 방식으로; 시간 의존적 방식으로 유전자 발현에 영향을 미치는 다른 요소일 수 있다.
"제한 효소" 또는 "제한 엔도뉴클레아제"는 특정 제한 부위에서 DNA를 절단하는 효소를 나타낸다. 예를 들어, 제한 효소는 EcoRI, SacII 또는 BstXI 제한 부위에서 플라스미드를 절단하여 플라스미드가 선형화되게 하고, 관심 DNA가 결찰되게 할 수 있다.
"제한 부위"는 4개 내지 8개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 상의 위치를 나타내며, 이의 서열은 특정 제한 효소에 의해 인식된다.
"선별 유전자"는 유전적으로 변형된 유기체가 선택적 압력 하에서 성장할 수 있는 이점을 부여하는 유전자를 의미한다.
"혈청형(serovar 또는 serotype)"은 특징적인 항원 세트에 의해 구별되는 밀접하게 관련된 미생물의 그룹을 나타낸다. 일부 구현예에서, 혈청형은 항원적으로 및 혈청학적으로 구별되는 다양한 미생물이다.
"sp."는 종(species)을 나타낸다.
"ssp." 또는 "subsp."는 아종(subspecies)을 나타낸다.
"서브클로닝" 또는 "서브클로닝된"은 하나의 벡터에서 또 다른, 통상적으로 유리한 벡터로 DNA를 전달하는 과정을 나타낸다. 예를 들어, 돌연변이 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 pKLAC1 플라스미드로 형질전환된 효모 콜로니의 선택 후 pLB102 플라스미드에 서브클로닝될 수 있다.
"SSI"는 맥락에 따라 달라지는 두문자어이다. 일부 맥락에서, 이는, 생체내 상동 재조합이 숙주 유기체의 게놈 내 특정 부위에서 일어나는 것을 가능하게 하는 서열을 나타내는 데 사용되는 "부위 특이적 통합(site-specific integration)"을 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, "부위 특이적 통합"이라는 용어는, 전이유전자를 숙주 유기체의 게놈 내 표적 부위로 지시하여, 관심 유전자를 숙주 유기체의 사전 선택된 게놈 위치로 통합시킬 수 있는 과정을 나타낸다. 하지만, 다른 맥락에서, SSI는 벽, 창문, 바닥 및 천장과 같이 매개체가 존재하는 표면에 가변적인 분무 가능한 부피의 살충제를 분무하는 기술인 "실내 표면 분무(surface spraying indoor)"를 나타낼 수 있다.
"STA" 또는 "번역 안정화 단백질" 또는 "안정화 도메인" 또는 "안정화 단백질"(본원에서 상호 교환적으로 사용됨)은 단백질 분해의 세포 과정에 의해 표적화되지 않고 세포에 축적될 수 있는 충분한 3차 구조를 갖는 펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 단백질의 길이는 5개 내지 50개 아미노산일 수 있다. 번역 안정화 단백질은 ORF에서 살충 단백질 또는 DVP를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 단백질에 대한 DNA 서열에 의해 코딩된다. 작동 가능하게 연결된 STA는 DVP의 업스트림 또는 다운스트림에 존재할 수 있으며, 이는 개재 서열이 DNA 서열 중 임의의 것의 프레임 시프트를 유도하지 않는 한 2개의 서열(STA 및 DVP) 사이에 임의의 개재 서열을 가질 수 있다. 번역 안정화 단백질은 또한 내장 벽을 가로질러 곤충의 혈림프 내로 DVP의 전달을 증가시키는 활성을 가질 수 있다. STA의 예에는, 비제한적으로, GFP(녹색 형광 단백질; 서열번호 57; NCBI 수탁번호 P42212); GNA(서열번호 58; NCBI 수탁번호 AAL07474.1); 또는 Jun a 3(주니페루스 아쉐이(Juniperus ashei) 서열번호 59; NCBI 수탁번호 P81295.1)를 포함하여, 본 문헌에 기재되거나 교시된 번역 안정화 단백질 중 임의의 것이 포함된다.
"sta"는 번역 안정화 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드를 의미한다.
"균주"는 동일한 종의 다른 구성원과 구별되는, 동일한 계통에 속하는 표현형 및/또는 유전형 특성을 나타내는 유전자 변이체, 단리물, 하위유형, 이들의 군 또는 이들의 배양물을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, "균주"라는 용어는, 해당 종의 다른 효모 세포에 비해 어떠한 점에서든 다르게 만드는 하나 이상의 특징을 갖는 하나 이상의 효모 세포를 나타낼 수 있으며, 여기서 상기 다른 효모 세포는 하나 이상의 특징을 보유하지 않는다.
"구조 모티프"는 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드의 3차원 배열, 및/또는 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드 분절의 배열을 나타낸다. 예를 들어, ERSP-STA-L-DVP를 포함하는 폴리펩타이드는 ERSP 모티프, STA 모티프, LINKER 모티프 및 DVP 폴리펩타이드 모티프를 갖는다.
"독소"는 독액 및/또는 독, 특히 특정 동물, 고등 식물 및 병원성 박테리아에 의해 생산된 단백질 또는 접합된 단백질을 나타낸다. 일반적으로, "독소"라는 용어는 천연 생성물, 예를 들어 전갈, 거미, 뱀, 독버섯 등에서 발견되는 분자 및 펩타이드에 대한 것이지만, "독물"이라는 용어는 사람이 만든 생성물 및/또는 인공 생성물, 예를 들어 사람이 만든 화학 농약에 대한 것이다. 하지만, 본원에 사용된 "독소" 및 "독물"이라는 용어는 동의어로 사용된다.
"트랜스펙션"과 "형질전환"은 모두 외인성 및/또는 이종 DNA 또는 RNA(예를 들어, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터)를 숙주 유기체(예를 들어, 원핵생물 또는 진핵생물)에 도입하는 과정을 나타낸다. 일반적으로, 당업자는 때때로 외인성 및/또는 이종 DNA 또는 RNA가 박테리아 세포에 도입되는 과정을 설명하기 위해 "형질전환"이라는 용어를 사용하고; 외인성 및/또는 이종 DNA 또는 RNA를 진핵생물 세포에 도입하는 것을 설명하는 과정에 대해 "트랜스펙션"이라는 용어를 사용한다. 하지만, 본원에 사용된 "형질전환"과 "트랜스펙션"이라는 용어는, 과정이 외인성 및/또는 이종 DNA 또는 RNA를 원핵생물(예를 들어, 박테리아) 또는 진핵생물(예를 들어, 효모, 식물 또는 동물)에 도입하는 것을 설명하는 지에 관계없이, 동의어로 사용된다.
"전이유전자"는 식물로 형질전환되는 단백질을 인코딩하는 이종 및/또는 외인성 DNA 서열을 의미한다.
"유전자이식 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 유전자로 형질전환되고, 추가적인 선별 유전자를 통해 유전자이식 상태에 대해 선별된 세포를 의미한다.
"유전자이식 식물"은 식물의 모든 세포가 해당 전이유전자를 함유하도록 외래 DNA로 형질전환된 단일 세포에서 유도된 식물을 의미한다.
"일시적 발현 시스템"은 무장 해제된(disarmed) 식물 바이러스를 인코딩하는 DNA를 이것이 발현되는 식물 세포에 전달하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 기반 시스템을 의미한다. 식물 바이러스는 TSP의 최대 40%인 고농도에서 관심 단백질을 발현하도록 조작되었다.
"삼중 발현 카세트"는 동일한 벡터에 함유된 3개의 DVP 발현 카세트를 나타낸다.
"TRBO"는 바이러스 코팅 단백질 유전자가 제거된 담배 모자이크 바이러스를 사용하는 일시적 식물 발현 시스템을 의미한다.
"트립신 절단"은 절단 부위에서 절단 가능한 링커를 분리하기 위해 프로테아제 효소인 트립신(노출된 리신 및 아르기닌 아미노산 잔기를 인식함)을 사용하는 시험관내 검정을 의미한다. 이는 또한, 해당 부위를 절단하는 트립신 효소의 작용을 의미한다.
"TSP" 또는 "총 가용성 단백질"은 식물 조직 샘플에서 추출되어 추출 완충액에 가용화될 수 있는 단백질의 총량을 의미한다.
"UBI"는 유비퀴틴을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, UBI는 제아 메이스(Zea mays)에서 단리된 유비퀴틴 단량체를 나타낼 수 있다.
"var."는 품종(varietas) 또는 변종을 나타낸다. "var."라는 용어는 종 수준 및/또는 아종(존재하는 경우) 아래에 있는 분류 범주를 나타내는 데 사용된다. 일부 구현예에서, "var."라는 용어는, 미미하지만 영구적이거나 유전 가능한 특징이 동일한 아종 또는 종의 다른 구성원과 상이한 구성원을 나타낸다.
"변이체" 또는 "변이형 서열" 또는 "변이형 펩타이드"는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 또는 보존적 변형을 보유하는 아미노산 서열을 나타낸다. "변이체"에서 보존적 아미노산 치환은 변이가 없는 형태와 비교하여 변이체의 활성을 실질적으로 감소시키지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, "변이체"는 서열번호로 표시된 바와 같이, 개시된 및/또는 청구된 서열을 갖는 펩타이드와 비교할 때 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 보유한다.
"벡터"는 관심 이종 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, dvp)를 수용하는 DNA 분절을 나타낸다. 관심 이종 폴리뉴클레오타이드는 "삽입물" 또는 "전이유전자"로 알려져 있다.
"야생형" 또는 "WT"는 자연 발생 상태 또는 조건에서 발견 및/또는 관찰된 바와 같은, 유기체, 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 폴리펩타이드 서열의 표현형 및/또는 유전형(즉, 외관 또는 서열)을 나타낸다.
"효모 발현 벡터" 또는 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 이종 유전자 및/또는 발현 카세트를 효모 세포에 도입하여 전사 및 번역되게 할 수 있는 플라스미드를 의미한다.
"수율"은 펩타이드의 생산을 나타내며, 증가된 수율은 증가된 생산량, 증가된 생산 속도, 증가된 평균 수율 또는 수율 중간값, 및 더 높은 수율의 증가된 빈도를 의미할 수 있다. "식물의 수율"에서와 같이 식물 작물 성장 및/또는 생산과 관련하여 사용될 때 "수율"이라는 용어는, 식물에 의해 생산된 바이오매스의 질 및/또는 양을 나타낸다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계들의 그룹 또는 물질의 조성들의 그룹에 대한 언급은, 하나 및 복수(즉, 하나 이상)의 단계, 물질의 조성, 단계들의 그룹 또는 물질의 조성들의 그룹을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본 개시내용은, 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 고체상 및 액체 핵산 합성, 용액 중 펩타이드 합성, 고체상 펩타이드 합성, 면역학, 세포 배양 및 제형에 대한 통상적인 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 수행된다. 이러한 절차는, 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다: 문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989)] Vol I, II 및 III 전체; 문헌[DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford] 본문 전체; 문헌[Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford] 본문 전체, 및 특히 그 안의 Gait의 논문, pp1-22; Atkinson 등의 논문, pp35-81; Sproat 등의 논문, pp 83-115; 및 Wu 등의 논문, pp 135-151; 문헌[4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford] 본문 전체; 문헌[Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford] 본문 전체; 문헌[Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; 문헌[Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)] 시리즈 전체; 문헌[J. F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany)]; 문헌[Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R. L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342]; 문헌[Merrifield, R. B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154]; 문헌[Barany, G. and Merrifield, R. B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, 3. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wiinsch, E., ed. (1974)]; 문헌[Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Muler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart]; 문헌[Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg]; 문헌[Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg]; 문헌[Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)]; 및 문헌[Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000)](이러한 참고문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다"라는 단어와 "포함하는" 등과 같은 이의 변형은, 명시된 단계 또는 요소 또는 정수, 또는 단계들 또는 요소들 또는 정수들의 그룹을 포함한다는 것을 의미하지만, 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 정수, 또는 단계들 또는 요소들 또는 정수들의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본원에 언급된 모든 특허 출원, 특허 및 인쇄된 간행물은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원의 전문이 참조로 인용되는 것으로서 구체적으로 및 개별적으로 표시된 바와 동일한 정도로 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 그리고, 본원에 인용된 모든 특허 출원, 특허 및 인쇄된 간행물은, 임의의 정의, 주제 면책조항 또는 부정을 제외하고, 포함된 자료가 본원의 명시적 개시내용과 일치하지 않는 범위(이러한 경우 본 개시내용의 언어가 우선함)를 제외하고, 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
야생형 디구에톡신 및 DVP
"사막 덤불 거미"로도 알려진 미국 사막 거미(디구에티아 카니티에스)는 미국의 사막과 반사막 서식지에서 발견되는 원뿔형 그물 거미의 일종이다. 디구에티아 카니티에스는 살충 효과를 갖는 것으로 밝혀진 독소를 생성하지만, 이러한 독소는 포유류에게는 영향을 미치지 않는다. 문헌[Bende et al., A distinct sodium channel voltage-sensor locus determines insect selectivity of the spider toxin Dc1a. Nat Commun. 2014 Jul 11; 5: 4350] 참조.
디구에티아 카니티에스가 생성하는 독소 중 하나는, 특히, 뮤-디구에톡신-Dc1a(μ-DGTX-Dc1a 또는 간단히 "Dc1a"로도 알려짐)이다. 서열번호 1(NCBI 수탁번호 P49126.1)의 아미노산 서열을 갖는 디구에티아 카니티에스 유래의 예시적인 야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a 폴리펩타이드 서열이 본원에 제공된다.
서열번호 1에 예시된 야생형 Dc1a 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 영역과 프로펩타이드 영역을 포함한다. 폴리펩타이드 처리 후, 성숙 야생형 Dc1a 폴리펩타이드는 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는다. Dc1a는 연장된 N-말단 분절에서 유도된 3가닥 베타-시트, 및 잔기 C25와 C39 사이의 큰 시스틴간 루프와 함께, 저해제 시스틴 매듭(ICK) 모티프를 보유한다. Dc1a는 시스테인 C12와 C25; C19와 C39; C24와 C53; 및 C41과 C51 사이에 디설파이드 결합 연결성을 갖는다.
뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리펩타이드(DVP) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 야생형 성숙 뮤-디구에톡신-Dc1a(서열번호 2)와 상이한 돌연변이체 또는 변이체이며, 예를 들어, 일부 구현예에서, 이러한 변이는 야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 아미노산 치환, 아미노산 결실/삽입, 또는 변경일 수 있다. 이러한 변이의 결과는, 야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a에 비해 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 보유하는 비자연 발생 폴리펩타이드 및/또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
일부 구현예에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
일부 구현예에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, DVP는 2개 이상의 DVP의 동종중합체 또는 이종중합체일 수 있으며, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다.
일부 구현예에서, DVP는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않은 링커에 의해 분리되는 2개 이상의 DVP를 포함하는 융합된 단백질일 수 있으며, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 그리고, 일부 구현예에서, 링커는 곤충의 내장 또는 혈림프 내부에서 절단 가능하다.
일부 구현예에서, DVP는 하나 이상의 추가 펩타이드 및/또는 산물과 조합될 수 있다. 예를 들어, DVP는 본원에 기재된 바와 같은 DVP와 부형제를 포함하는 조성물의 일부일 수 있다.
일부 구현예에서, DVP는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩될 수 있다. 예를 들어, DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 DVP가 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임). 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드가 DVP를 인코딩하고, 여기서 X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거된다.
또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩한다.
또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩한다.
또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩한다.
또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자 또는 이의 부분은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 DVP, 또는 본원에 기재된 바와 같은 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP는 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다: (a) DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계(상기 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함함: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임)); (b) 상기 벡터를 효모 세포에 도입하는 단계; 및 (c) DVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하의 성장 배지에서 효모 세포를 성장시키는 단계. 일부 구현예에서, X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거된다.
일부 구현예에서, 벡터는 알파-MF 신호를 포함하는 플라스미드이다. 다른 구현예에서, 벡터는 효모 균주로 형질전환된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 효모 균주는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 한세눌라(Hansenula), 야로위아(Yarrowia) 또는 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속의 임의의 종에서 선택된다. 일부 구현예에서, 효모 균주는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)로 이루어지는 군에서 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 효모 균주는 클루이베로마이세스 락티스이다.
일부 구현예에서, DVP의 발현은 배지 1리터당 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L, 적어도 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 6,000 mg/L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/L, 적어도 11,000 mg/L, 적어도 12,000 mg/L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 13,000 mg/L, 적어도 14,000 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 16,000 mg/L, 적어도 17,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 18,000 mg/L, 적어도 19,000 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 적어도 60,000 mg/L, 적어도 70,000 mg/L, 적어도 80,000 mg/L, 적어도 90,000 mg/L 또는 적어도 100,000 mg/L의 수율로 DVP를 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP의 발현은 배지 1리터당 적어도 100 mg/L의 수율로 DVP를 제공한다.
일부 구현예에서, 배지에서 DVP의 발현은 배지에서 단일 DVP의 발현을 유도한다.
일부 구현예에서, 배지에서 DVP의 발현은 배지에서 2개 이상의 DVP 폴리펩타이드를 포함하는 DVP 중합체의 발현을 유도한다.
일부 구현예에서, 벡터는 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하며, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 DVP를 인코딩하도록 작동 가능하다. 일부 구현예에서, 벡터는 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하며, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 DVP 또는 상이한 발현 카세트의 DVP를 인코딩하도록 작동 가능하다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 DVP를 인코딩하도록 작동 가능하다.
본 발명의 예시적인 DVP는 하기 표 1에 제공되어 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
일부 구현예에서, DVP는 디설파이드 결실을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 잔기 C41과 C51에 디설파이드 결합의 결실을 초래하는 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 디설파이드 결실을 갖는 DVP는 서열번호 2와 비교하여 C51G, C51F 및/또는 둘 모두의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 디설파이드 결실을 갖는 DVP는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "디설파이드 결실"이라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C51G, C51F 및/또는 둘 모두의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T와 C51A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C51G, C51F 및/또는 둘 모두의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41A와 C51A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41A/C51A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41A와 C51A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41S와 C51A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41S/C51A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41S와 C51A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41V와 C51A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41V/C51A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41V와 C51A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41A와 C51T의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41A/C51T"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41A와 C51T의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41A와 C51S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41A/C51S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41A와 C51S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41A와 C51V의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41A/C51V"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41A와 C51V의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T와 C51S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T와 C51S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41S와 C51S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41S/C51S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41S와 C51S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 V17A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/V17A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 V17A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 D20A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 16의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D20A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 D20A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 S21A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 17의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/S21A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 S21A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 W31A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 18의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/W31A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 W31A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 Y32A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 19의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/Y32A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 Y32A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 P36A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 20의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/P36A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 P36A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 L42A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 22의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/L42A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 L42A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 V52A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 23의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/V52A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 V52A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 W31F의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 24의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/W31F"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 W31F의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 Y32S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 25의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/Y32S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 Y32S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, W31F, Y32S 및 P36A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 26의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/W31F/Y32S/P36A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, W31F, Y32S 및 P36A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D20A 및 L42N의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 27의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D20A/L42N"이라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D20A 및 L42N의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D20A 및 L42V의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D20A/L42V"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D20A 및 L42V의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 D38K의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 30의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38K"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 D38K의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 D38S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 31의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A 및 D38S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 V52T의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 32의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A/V52T"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 V52T의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 V52A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 33의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A/V52A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 V52A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 V17E의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 34의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A/V17E"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 V17E의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 L42V의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A/L42V"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 L42V의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 L42S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A/L42S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 L42S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 L42E의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 37의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A/L42E"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 L42E의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 L42Q의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 38의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A/L42Q"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 L42Q의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 D20A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 39의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A/D20A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 D20A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D20A 및 Y32S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 40의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D20A/Y32S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D20A 및 Y32S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 Y32S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 41의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D38A/Y32S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D38A 및 Y32S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D20A, D38A 및 Y32S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 42의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D20A/D38A/Y32S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D20A, D38A 및 Y32S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D20A, W31F, Y32S 및 P36A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 43의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51A/D20A/W31F/Y32S/P36A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51A, D20A, W31F, Y32S 및 P36A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 44의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41S, C51T 및 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 45의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41S/C51T/D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41S, C51T 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51T 및 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 46의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51T/D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51T 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41S, C51S 및 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 47의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41S/C51S/D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41S, C51S 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51S 및 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 48의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51S/D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51S 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41V, C51T 및 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 49의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41V/C51T/D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41V, C51T 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51V 및 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 50의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41T/C51V/D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41T, C51V 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41S, C51V 및 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 51의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41S/C51V/D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41S, C51V 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41V, C51S 및 D38A의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 52의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41V/C51S/D38A"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41V, C51S 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41S, C51S, D38A 및 L42V의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 53의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41S/C51S/D38A/L42V"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41S, C51S, D38A 및 L42V의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 C41S, C51S, D38A 및 L42V의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 53의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "C41S/C51S/D38A/L42V"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 C41S, C51S, D38A 및 L42V의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 D38A, L42I, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 210의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "D38A/L42I/C41S/C51S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 D38A, L42I, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 K2L, D38A, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 211의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "K2L/D38A/C41S/C51S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 K2L, D38A, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 Y32S, D38A, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 212의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "Y32S/D38A/C41S/C51S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 Y32S, D38A, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 K2L, Y32S, D38A, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 213의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "K2L/Y32S/D38A/C41S/C51S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 K2L, Y32S, D38A, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 D38T, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 214의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "D38T/C41S/C51S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 D38T, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 D38S, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 215의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "D38S/C41S/C51S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 D38S, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 K2L, Y32S 및 L42I의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 217의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "K2L/Y32S/L42I"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 K2L, Y32S 및 L42I의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DVP는 서열번호 2와 비교하여 K2L, Y32S, L42I, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP는 서열번호 217의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, "K2L/Y32S/L42I/C41S/C51S"라는 용어는, 서열번호 2와 비교하여 K2L, Y32S, L42I, C41S 및 C51S의 아미노산 치환을 갖는 구현예를 나타낸다.
다양한 구현예에서, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 식물 세포, 효모 세포 또는 박테리아 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 살충성 DVP 유전자이식 단백질은 당업자에게 알려진 임의의 방식으로 식물 또는 이의 부분의 표면에 분무되거나 달리 적용될 수 있는 조성물로 제형화될 수 있다. 따라서, 숙주 세포, 예를 들어 식물 세포에서 적절한 조건 하에서 하나 이상의 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 DNA 작제물이 본원에 제공된다. 식물 세포의 기생 곤충에 의한 해충 감염을 방제하는 방법은, 본원에 기재된 바와 같은 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 재조합 기술을 통해 식물, 식물 조직 또는 식물 세포에 투여 또는 도입하는 단계와, 해충에 노출된 현장에서 상기 재조합적으로 변경된 식물, 식물 조직 또는 식물 세포를 성장시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, DVP는 DVP와 부형제로 이루어진 분무 가능한 조성물로 제형화되고, 직접 적용을 통해 감수성이 있는 식물에 직접 적용될 수 있어, 감염성 곤충이 DVP를 섭취하면 유해한 영향을 줄 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열번호 213, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열번호 128 또는 147에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 77 내지 114, 116 내지 122, 124, 156, 158, 164, 167, 168, 172, 174, 175, 220 내지 225, 또는 227 내지 219 중 어느 하나의 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 77 내지 114, 116 내지 122, 124, 156, 158, 164, 167, 168, 172, 174, 175, 220 내지 225, 또는 227 내지 219와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9% 또는 100% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 77 내지 114, 116 내지 122, 124, 156, 158, 164, 167, 168, 172, 174, 175, 220 내지 225, 또는 227 내지 219에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139 내지 140, 144, 146 및 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 213, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 213, 217 또는 218 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함한다.
DVP-살충 단백질
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 (1) 적어도 하나의 DVP 또는 2개 이상의 DVP와, (2) 추가의 비독소 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 임의의 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 아미노산 서열, 구성, 작제물 또는 배열일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이러한 추가 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 DVP 단독에 비해 DVP-살충 단백질에 노출된 곤충의 사멸률을 증가시키고/시키거나 곤충의 성장을 저해하는 능력; 예를 들어 숙주 세포에서 DVP-살충 단백질의 발현을 증가시키는 능력; 및/또는 DVP-살충 단백질의 번역 후 처리에 영향을 미치는 능력을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 2개 이상의 DVP를 포함하는 중합체일 수 있다. 또 다른 구현예에서, DVP-살충 단백질은, DVP가 링커 펩타이드, 예를 들어 절단 가능한 및/또는 절단 가능하지 않은 링커를 통해 작동 가능하게 연결된 둘 이상의 DVP를 포함하는 중합체일 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 안정화 도메인(STA); 소포체 신호전달 단백질(ERSP); 곤충 절단 가능하거나 곤충 절단 가능하지 않은 링커(L); 및/또는 이들의 임의의 다른 조합과 같은 하나 이상의 단백질과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은, 적절하게 폴딩될 때 또는 가장 자연스러운 열역학적 상태에서, 하나 이상의 곤충에 대해 살충 활성을 발휘하는 아미노산의 중합체일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 상이한 2개 이상의 DVP를 포함하는 중합체일 수 있다. 다른 구현예에서, 살충 단백질은 동일한 2개 이상의 DVP의 중합체일 수 있다.
또 다른 구현예에서, DVP-살충 단백질은 하나 이상의 DVP와, DVP-살충 단백질의 폴딩을 도울 수 있는 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 하나 이상의 DVP와, 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 안정성 또는 가용성을 돕는 단백질 태그이다. 다른 구현예에서, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 친화성 정제를 돕는 단백질 태그일 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 안정화 도메인(STA); 소포체 신호전달 단백질(ERSP); 곤충 절단 가능하거나 곤충 절단 가능하지 않은 링커; 하나 이상의 이종 펩타이드; 하나 이상의 추가 폴리펩타이드; 및/또는 이들의 임의의 다른 조합과 같은 하나 이상의 단백질과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 살충 단백질은 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 DVP 동종중합체, 예를 들어 동일한 DVP인 둘 이상의 DVP 단량체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 살충 단백질은 DVP 이종중합체, 예를 들어 DVP 단량체가 상이한 둘 이상의 DVP 단량체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며, 여기서 DVP는 동일하거나 상이하다.
절단 가능한 링커와 절단 가능하지 않은 링커의 생성을 위한 예시적인 방법은 미국 특허 출원 제15/727,277호; 및 PCT 출원 PCT/US2013/030042에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 DVP를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
"알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드" 또는 "알파-MF 신호" 또는 "알파-MF" 또는 "알파 교배인자 분비 신호" 또는 "αMF 분비 신호"(모두 상호 교환적으로 사용됨)는, 알파-MF 펩타이드가 관심 재조합 펩타이드(예를 들어, DVP)에 작동 가능하게 연결된 경우, 재조합 발현 시스템에서 분비 발현을 가능하게 하는 신호 펩타이드를 나타낸다. 알파-MF 펩타이드는 초기 재조합 폴리펩타이드를 재조합 발현 시스템(예를 들어, 효모 재조합 발현 시스템)의 분비 경로로 지시한다.
알파-MF 펩타이드는 당업계에 널리 알려져 있다. 비제한적으로, pKLAC1 벡터의 클루이베로마이세스 락티스 알파 교배인자 프리-프로 분비 리더(서열번호 246); NCBI 수탁번호 XP_454814(서열번호 247); Mf(알파)1/Mf(알파)2(서열번호 248; NCBI 수탁번호 QEU61411.1); 교배인자 알파 전구체 N-말단(서열번호 249; NCBI 수탁번호 KAG0674310) 등을 포함하는 예시적인 알파-MF 펩타이드가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 하나 이상의 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 하나 이상의 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, DVP는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T이며, 여기서 X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거됨).
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 DVP는 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 DVP는 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 DVP는 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며; 여기서 하나 이상의 DVP는 2개 이상의 DVP의 동종중합체 또는 이종중합체이고, 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며; 여기서 하나 이상의 DVP, 알파-MF 또는 이들의 조합은 절단 가능한 링커 또는 절단 가능하지 않은 링커에 의해 분리되어 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며; 여기서 절단 가능한 링커는 곤충의 내장 또는 혈림프 내부에서 절단 가능하다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며; 여기서 알파-MF 펩타이드는 효모 종에서 유도된 알파-MF 펩타이드이다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며; 여기서 알파-MF 펩타이드는 사카로마이세스, 피키아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 스키조사카로마이세스 속의 임의의 종에서 선택되는 효모 종에서 유도된 것이다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며; 여기서 알파-MF 펩타이드는 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비시아에 및 피키아 파스토리스로 이루어지는 군에서 선택되는 효모 종에서 유도된 것이다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며; 여기서 알파-MF 펩타이드는 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스에서 유도된 것이다.
일부 구현예에서, 알파-MF 펩타이드는 클루이베로마이세스 락티스에서 유도된 알파-MF 펩타이드일 수 있다.
일부 구현예에서, 알파-MF 펩타이드는 클루이베로마이세스 락티스 α-교배인자(α-MF) 분비 도메인(분비 발현용)일 수 있다.
일부 구현예에서, 알파-MF 펩타이드는 서열번호 246 내지 249 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 알파-MF 펩타이드는 서열번호 246에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 알파-MF 펩타이드는 서열번호 246 내지 249 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 알파-MF 펩타이드는 서열번호 246에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며; 여기서 하나 이상의 DVP는 서열번호 246 내지 249 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 알파-MF 펩타이드에 작동 가능하게 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 DVP(여기서, 하나 이상의 DVP는 서열번호 246 내지 249 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 알파-MF 펩타이드에 작동 가능하게 연결되어 있음)를 포함하고, 추가의 비독소 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 추가의 비독소 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은, 예를 들어, 일부 구현예에서, 하기 중 하나 이상을 수행하는 능력을 갖는다: 곤충이 DVP-살충 단백질에 노출될 때, DVP 단독에 비해 곤충의 사멸률을 증가시키고/시키거나 곤충의 성장을 저해함; 예를 들어 숙주 세포 또는 발현 시스템에서 상기 DVP-살충 단백질의 발현을 증가시킴; 및/또는 DVP-살충 단백질의 번역 후 처리에 영향을 미침(예를 들어, DVP-살충 단백질의 분비 발현을 가능하게 함).
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며; 여기서 2개 이상의 DVP가 존재한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함할 수 있으며; 여기서 2개 이상의 DVP가 존재하고, 여기서 DVP 및/또는 알파-MF 펩타이드는 링커 펩타이드, 예를 들어 절단 가능한 및/또는 절단 가능하지 않은 링커를 통해 작동 가능하게 연결되어 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결되고; 안정화 도메인(STA); 소포체 신호전달 단백질(ERSP); 곤충 절단 가능하거나 곤충 절단 가능하지 않은 링커(L); 및/또는 이들의 임의의 다른 조합과 같은 하나 이상의 단백질과 추가로 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 DVP를 사용하여 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함하는 융합 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 DVP를 사용하여 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함하는 융합 단백질을 생산할 수 있으며, 예를 들어, 여기서 하나 이상의 DVP는, 마찬가지로 본원에 기재된 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
예시적인 DVP 및 DVP-살충 단백질
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 47)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 47)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSVKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 53)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSVKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 53)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKMVCRDV"(서열번호 136)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKMVCRDV"(서열번호 136)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRDVKSGFFSSKEVCRDV"(서열번호 139)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRDVKSGFFSSKEVCRDV"(서열번호 139)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACREVKSGFFSSKKVCRDV"(서열번호 140)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACREVKSGFFSSKKVCRDV"(서열번호 140)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECESGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV"(서열번호 144)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECESGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV"(서열번호 144)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECNSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV"(서열번호 146)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECNSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV"(서열번호 146)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECYSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV"(서열번호 147)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECYSGECCQKQYLWYKWRPLACRTVKSGFFSSKAVCRDV"(서열번호 147)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 187)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 187)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWKKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 188)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWKKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 188)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWHKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 189)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWHKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 189)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLFSKWRPLDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 190)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLFSKWRPLDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 190)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLFSKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 191)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLFSKWRALDCRCLKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 191)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 209)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 209)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 210)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 210)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 211)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 211)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 212)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 212)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 213)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 213)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLTCRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 214)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLTCRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 214)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLSCRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 215)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLSCRSLKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 215)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLDCRCIKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 217)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLDCRCIKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 217)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 218)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 218)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 219)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 219)의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
DVP를 생산하는 방법
단백질을 생산하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 이용 가능한 다양한 기술이 존재한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질은 재조합 방법을 사용하여 생산되거나, 화학적으로 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 DVP는 단백질을 생산하는 임의의 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 비제한적으로, DVP는 효모 발현 시스템 또는 박테리아 발현 시스템과 같은 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. 하지만, 당업자는, 다른 단백질 생산 방법이 이용 가능하다는 것을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 재조합 발현 시스템을 사용하여 DVP를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는 DVP를 생산하는 방법을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다: (a) DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터를 숙주 세포, 예를 들어 박테리아 또는 효모, 또는 곤충, 또는 식물 세포, 또는 동물 세포에 도입하는 단계; 및 (c) DVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하의 성장 배지에서 효모 균주를 성장시키는 단계. 일부 관련 구현예에서, 숙주 세포는 효모 세포이다.
본 발명은 매우 다양한 숙주 세포에서 실행 가능하다(하기 숙주 세포 섹션 참조). 실제로, 본 발명의 최종 사용자는 사용자가 선택한 임의의 숙주 세포에서 본 교시내용을 실행할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 최종 사용자의 요구사항을 충족시키는 임의의 숙주 세포일 수 있으며; 즉, 일부 구현예에서, DVP의 발현은 다양한 숙주 세포를 사용하여 본원의 교시에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 사용자는 또 다른 것이 아니라 하나의 특정 유형의 숙주 세포(예를 들어, 효모 세포 또는 박테리아 세포)를 사용하기를 원할 수 있으며; 소정의 숙주 세포의 선호도는 가용성에서 비용에 이르기까지 다양할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는 DVP를 생산하는 방법을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다: (a) DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터를 숙주 세포, 예를 들어 박테리아 또는 효모, 또는 곤충, 또는 식물 세포, 또는 동물 세포에 도입하는 단계; 및 (c) DVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하의 성장 배지에서 효모 균주를 성장시키는 단계. 일부 관련 구현예에서, 숙주 세포는 효모 세포이다.
야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a의 단리 및 돌연변이화
다양한 예시적인 구현예에서, DVP는 야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a 폴리뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 생성하는 단계; 상기 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드 (dvp) 서열을 적절한 벡터에 삽입하는 단계; DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 발현되는 방식으로 숙주 유기체를 형질전환시키는 단계; 목적하는 양의 DVP를 생성하기 위해 숙주 유기체를 배양하는 단계; 이어서 숙주 유기체 내부 및/또는 주변에서 DVP를 정제하는 단계를 통해 얻을 수 있다.
야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a 독소는 독액에서 단리될 수 있으며, 이는 결국 당업자에게 알려진 임의의 기술을 사용하여 거미(예를 들어, 디구에티아 카니티에스)의 독샘에서 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 독액은 미국 특허 제5,688,764호에 기재된 방법에 따라 단리될 수 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a 폴리뉴클레오타이드 서열은 뮤-디구에톡신-Dc1a 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 지시된 프라이머 프로브를 사용하여 게놈 라이브러리를 스크리닝하는 방식으로 얻을 수 있다. 대안적으로, 야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 DVP 폴리뉴클레오타이드 서열은 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 DVP 폴리뉴클레오타이드 서열은 포스포르아미다이트; 트리에스테르, 포스파이트 또는 H-포스포네이트 방법과 같은 올리고뉴클레오타이드 합성 방법을 사용하여 생성될 수 있다(문헌[Engels, J. W. and Uhlmann, E. (1989), Gene Synthesis [New Synthetic Methods (77)]. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734] 참조(상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)).
야생형 뮤-디구에톡신-Dc1a 폴리뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 생성하는 단계는 당업자에게 널리 알려진 다양한 수단을 통해 달성될 수 있다. 돌연변이유발 방법에는, 쿤켈(Kunkel) 방법; 카세트 돌연변이유발; PCR 부위 지향적 돌연변이유발; "완벽한 살인자(perfect murder)" 기술(delitto perfetto); PCR과 하나의 재순환 가능한 마커를 이용한 직접 유전자 결실 및 부위 특이적 돌연변이유발; 긴 상동 영역을 사용하고 PCR과 하나의 재순환 가능한 마커를 이용한 직접 유전자 결실 및 부위 특이적 돌연변이유발; 전좌 "팝인 팝아웃(pop-in pop-out)" 방법; 및 CRISPR-Cas 9가 포함된다. 부위 지향적 돌연변이유발의 예시적인 방법은 문헌[Ruvkun & Ausubel, A general method for site-directed mutagenesis in prokaryotes. Nature. 1981 Jan 1; 289(5793):85-8]; 문헌[Wallace et al., Oligonucleotide directed mutagenesis of the human beta-globin gene: a general method for producing specific point mutations in cloned DNA. Nucleic Acids Res. 1981 Aug 11; 9(15):3647-56]; 문헌[Dalbadie-McFarland et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis as a general and powerful method for studies of protein function. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Nov; 79(21):6409-13]; 문헌[Bachman. Site-directed mutagenesis. Methods Enzymol. 2013; 529:241-8]; 문헌[Carey et al., PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 Aug 1; 2013(8):738-42]; 및 문헌[Cong et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 Feb 15; 339(6121):819-23]에서 확인할 수 있으며, 상기 언급된 모든 참고문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
DVP 폴리뉴클레오타이드의 화학적 합성
일부 구현예에서, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은, Genewiz®(예를 들어, TurboGENETM; PriorityGENE; 및 FragmentGENE), 또는 Sigma-Aldrich®(예를 들어, Custom DNA and RNA Oligos Design and Order Custom DNA Oligos)에서 제공되는 것들과 같은 상업적으로 입수 가능한 폴리뉴클레오타이드 합성 서비스를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. DNA 및/또는 맞춤형 화학적 합성 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 예시적인 방법은 당업계에 널리 알려져 있고, 1995년 2월 13일자 출원된 미국 특허 제5,736,135호, 일련 번호 제08/389,615호에 예시적으로 제공되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 또한, 문헌[Agarwal, et al., Chemical synthesis of polynucleotides. Angew Chem Int Ed Engl. 1972 Jun; 11(6):451-9]; 문헌[Ohtsuka et al., Recent developments in the chemical synthesis of polynucleotides. Nucleic Acids Res. 1982 Nov 11; 10(21): 6553-6570]; 문헌[Sondek & Shortle. A general strategy for random insertion and substitution mutagenesis: substoichiometric coupling of trinucleotide phosphoramidites. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Apr 15; 89(8): 3581-3585]; 문헌[Beaucage S. L., et al., Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach. Tetrahedron, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, NL, vol. 48, No. 12, 1992, pp. 2223-2311]; 문헌[Agrawal (1993) Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties; Methods in Molecular Biology Vol. 20] 참조(상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
폴리뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하면 상기 서열 내 뉴클레오타이드의 배열(즉, 시토신 [C], 구아닌 [G], 아데닌 [A] 또는 티민 [T] 분자의 배열)에 기반하여 목적하는 폴리펩타이드를 생성하도록 맞춤화된 DNA 서열이 생성될 수 있고; 화학적으로 합성된 DNA 폴리뉴클레오타이드로부터 전사된 mRNA 서열은 아미노산의 서열로 번역될 수 있으며, 여기서 각각의 아미노산은 mRNA 서열의 코돈에 상응한다. 따라서, mRNA 서열로부터 번역되는 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 조성은 20개 아미노산 중 어느 것이 성장하는 폴리펩타이드에 부가될 것인 지를 결정하는 기본 코돈을 변화시키는 방식으로 변경될 수 있으며; 따라서, 삽입, 치환, 결실 및 프레임시프트와 같은 DNA의 돌연변이는 기본 코돈에 따라 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 유발할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 합성될 수 있으며, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 주형 DNA 서열로부터 생성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, mRNA는 클로닝되고 적격 세포로 형질전환될 수 있다.
벡터 및 형질전환
본 발명의 벡터는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포(예를 들어, 효모 세포)에 도입하는 수단을 나타낸다. 당업자에게 알려진 이용 가능한 다양한 벡터 및 클로닝 전략이 존재한다.
본원에 사용된 "벡터"라는 용어는, 폴리뉴클레오타이드가 세포에의 도입을 위해 삽입될 수 있고(예를 들어, 형질전환), 복제될 수 있는 담체 핵산 분자를 나타낸다. 일부 구현예에서, 벡터는, 예를 들어, 비제한적으로, 하기 "벡터 요소"를 함유할 수 있다: 복제 기점(ORI); 선별을 가능하게 하는 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 항생제 내성을 부여하는 유전자 또는 제한 배지에서의 성장을 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열); 다중 클로닝 부위; 프로모터 영역; 프라이머 결합 부위; 및/또는 이들의 조합.
일부 구현예에서, 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열 중 일부는 "이종" 또는 "외인성"일 수 있으며, 이는 벡터가 도입되는 세포에 대해 이질적이거나, 서열이 세포 내 서열과 상동이지만 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내 위치에 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 효모 세포는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환될 수 있지만, 내인성 뉴클레오타이드 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내 위치에 있다.
벡터는 본 발명의 이종 폴리뉴클레오타이드를 제조하거나, 궁극적으로 재조합 효모 세포를 생성하기 위해 사용되는 세포를 형질전환시키는 수단으로, 및/또는 이종 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는 방법으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)가 포함된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 벡터는 이종 폴리뉴클레오타이드 및/또는 발현 카세트를 숙주 세포에 도입하여 전사되고 번역되게 할 수 있는 플라스미드일 수 있다.
당업자는 Sambrook 등의 문헌(1989)과 Ausubel 등의 문헌(1996)에 기재된 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제할 수 있을 것이다(상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 것에 더하여, 벡터는 또한 표적화 분자를 인코딩할 수 있다. 표적화 분자는 목적하는 폴리뉴클레오타이드를 특정 위치로 지시하는 분자이다.
일부 구현예에서, DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드는 증폭을 위해 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터에 삽입될 수 있으며, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)](상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)에 기재된 바와 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 증식될 수 있다.
화학적으로 합성된 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 돌연변이유발을 통해 변경된 야생형 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 DVP를 얻는 것은, DNA 서열을 적절한 벡터에 클로닝하는 방식으로 달성될 수 있다. 당업자에게 알려진 이용 가능한 다양한 발현 벡터, 숙주 유기체 및 클로닝 전략이 존재한다. 예를 들어, 벡터는 이종 유전자 및/또는 발현 카세트를 효모 세포에 도입하여 전사 및 번역되게 할 수 있는 플라스미드일 수 있다. "벡터"라는 용어는, 핵산 서열이 복제될 수 있는 세포에의 도입을 위해 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 나타내기 위해 사용된다. 벡터는 복제 기점(ORI); 선별이 가능하도록 항생제 내성을 부여하는 유전자; 다중 클로닝 부위; 프로모터 영역; 비박테리아 트랜스펙션을 위한 선별 마커; 및 프라이머 결합 부위와 같은 "벡터 요소"를 함유할 수 있다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있으며, 이는 벡터가 도입되는 세포에 대해 이질적이거나, 서열이 세포 내 서열과 상동이지만 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내 위치에 있다는 것을 의미한다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)가 포함된다. 당업자는 Sambrook 등의 문헌(1989)과 Ausubel 등의 문헌(1996)에 기재된 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제할 수 있을 것이다(상기 문헌들은 모두 본원에 참조로 인용됨). Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 것에 더하여, 벡터는 표적화 분자를 인코딩할 수 있다. 표적화 분자는 목적하는 핵산을 특정 조직, 세포 또는 다른 위치로 지시하는 분자이다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포로 형질전환될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 클로닝되고, 숙주 세포로 형질전환될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP ORF는 숙주 세포로 형질전환될 수 있다.
DVP(예를 들어, DVP ORF) 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열에 더하여, 조절 요소로 알려진 추가의 DNA 분절이 외래 DNA 또는 전이유전자의 증강된 발현을 가능하게 하는 벡터에 클로닝될 수 있으며; 이러한 추가 DNA 분절의 예에는 (1) 프로모터, 종결인자 및/또는 인핸서 요소; (2) 적절한 mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; (3) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (4) 인트론; 및 (5) 전사 후 조절 요소가 포함된다. 관심 DNA 분절(예를 들어, dvp)과 전술한 시스-작용 요소 중 어느 하나의 조합을 "발현 카세트"라고 한다.
일부 구현예에서, 발현 카세트 또는 DVP 발현 카세트는 하나 이상의 DVP 및/또는 하나 이상의 DVP-살충 단백질을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 카세트 또는 DVP 발현 카세트는 하나 이상의 DVP 및/또는 하나 이상의 DVP-살충 단백질과, 하기 (1) 내지 (5)와 같은 하나 이상의 추가 조절 요소를 함유할 수 있다: (1) 프로모터, 종결인자 및/또는 인핸서 요소; (2) 적절한 mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; (3) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (4) 인트론; 및 (5) 전사 후 조절 요소.
일부 구현예에서, 단일 발현 카세트는 상기 언급된 조절 요소 중 하나 이상과, DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP 발현 카세트는 DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드와, α-MF 신호; Kex2 부위; LAC4 종결인자; ADN1 프로모터; 및 5'-말단 및 3'-말단에 LAC4 프로모터가 플랭킹된 아세트아미다아제(amdS) 선별 마커를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터에 클로닝되는 다수의 발현 카세트가 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 발현 카세트가 존재할 수 있다. 대안적인 구현예에서, DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 2개의 발현 카세트(즉, 이중 발현 카세트)가 존재한다. 다른 구현예에서, DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 3개의 발현 카세트(즉, 삼중 발현 카세트)가 존재한다.
일부 구현예에서, 이중 발현 카세트는 제1 DVP 발현 카세트를 함유하는 벡터에 제2 DVP 발현 카세트를 서브클로닝하는 방식으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 삼중 발현 카세트는 제1 DVP 발현 카세트와 제2 DVP 발현 카세트를 함유하는 벡터에 제3 DVP 발현 카세트를 서브클로닝하는 방식으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 폴리뉴클레오타이드는 다양한 클로닝 전략, 및 당업자가 용이하게 이용 가능한 상업용 클로닝 키트 및 재료를 사용하여 벡터에 클로닝될 수 있다. 예를 들어, DVP 폴리뉴클레오타이드는 SnapFast; Gateway; TOPO; Gibson; LIC; InFusionHD; 또는 Electra 전략과 같은 전략을 사용하여 벡터에 클로닝될 수 있다. DVP를 생산하는 데 사용될 수 있는 다수의 상업적으로 입수 가능한 벡터가 존재한다. 예를 들어, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 DVP 폴리뉴클레오타이드를 생성하고, 실온에서 5분 동안 pCRTMII-TOPO 벡터 또는 PCRTM2.1-TOPO® 벡터(Invitrogen에서 TOPO® TA Cloning ® 키트로 상업적으로 입수 가능함)와 조합한 후; TOPO® 반응액을 이후에 색상 변화에 기반하여 선택될 수 있는 적격 세포로 형질전환시킬 수 있다(문헌[Janke et al., A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 2004 Aug; 21(11):947-62]; 또한 문헌[Adams et al. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor, NY, 1997] 참조(상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)).
일부 구현예에서, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및/또는 인공 염색체(예를 들어, YAC)와 같은 벡터에 클로닝될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주로 대장균을 사용하여 하기를 수행하는 방식으로, 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터에 삽입될 수 있다: 관심 DNA 분절을 삽입하는 데 필요한 제한 효소를 사용하여 벡터 DNA 약 2 μg 내지 5 μg을 소화시킨 후, 완전한 소화를 달성하기 위해 밤새 인큐베이션시키고(자가 결찰/재순환을 회피하기 위해 알칼리성 포스파타아제를 사용하여 5'-말단을 탈인산화시킬 수 있음); 소화된 벡터를 겔 정제함. 다음으로, 관심 DNA 분절, 예를 들어 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 PCR을 통해 증폭시키고, 당업자에게 알려진 기술을 사용하여(예를 들어, PCR 클린업 키트를 사용하여) PCR 반응물로부터 임의의 과량의 효소, 프라이머, 혼입되지 않은 dNTP, 짧은-실패한 PCR 산물, 및/또는 염을 제거한다. 하기를 포함하는 혼합물을 생성하여 관심 DNA 분절을 벡터에 결찰시킨다: 약 20 ng의 벡터; 약 100 ng 내지 1,000 ng의 관심 DNA 분절; 2 μL의 10x 완충액(즉, 30 mM Tris-HCl, 4 mM MgCl2, 26 μM NAD, 1 mM DTT, 50 μg/ml BSA, pH 8, 25℃에서 보관); 1 μL의 T4 DNA 리가아제; H2O를 첨가하여 전체의 총 부피를 20 μL로 만듬. 이어서, 결찰 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하거나, 16℃에서 밤새 인큐베이션할 수 있다. 이어서, 결찰 반응액(즉, 약 1 μL)을, 예를 들어 전기천공 또는 화학적 방법을 사용하여 적격 세포로 형질전환시키고, 콜로니 PCR을 수행하여 관심 DNA 분절을 함유하는 벡터를 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP(예를 들어, DVP ORF)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, DVP 발현 카세트를 함께 구성하는 다른 DNA 분절과 함께, 숙주 효모 세포로부터의 분비를 위해 디자인될 수 있다. DVP 발현 카세트를 디자인하는 예시적인 방법은 하기와 같다: 상기 카세트는 신호 펩타이드 서열로 시작하여, 이어서 Kex2 절단 부위(리신-아르기닌)를 인코딩하는 DNA 서열, 이어서 5'-말단에 글리신-세린 코돈이 부가된 DVP 폴리뉴클레오타이드 전이유전자(DVP ORF), 최종적으로 3'-말단에 종결 코돈을 가질 수 있음. 이어서, 모든 이러한 요소는 효모 세포에서 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)으로서 융합 펩타이드로 발현된다. α-교배인자(αMF) 신호 서열은 재조합 효모의 내인성 분비 경로를 통해 재조합 살충 펩타이드의 대사 처리를 촉진시키기 위해 가장 흔히 사용되며, 즉, 발현된 융합 펩타이드가 전형적으로 소포체에 진입하고, 여기서 α-교배인자 신호 서열이 신호 펩티다아제 활성에 의해 제거되고, 이어서 생성된 전구-살충 펩타이드가 골지체에 트래피킹되고, 여기서 상기 언급된 리신-아르기닌 디펩타이드가 Kex2 엔도프로테아제에 의해 완전히 제거되고, 그 후 성숙 폴리펩타이드(즉, DVP)가 세포 밖으로 분비된다.
일부 구현예에서, 재조합 효모 세포에서 폴리펩타이드 발현 수준은 특정 숙주 효모 종에 기반하여 코돈을 최적화하는 방식으로 증강될 수 있다. 소정의 숙주 유기체의 내인성 오픈 리딩 프레임에서 관찰되는 코돈의 자연 발생 빈도는 고효율 발현을 위해 반드시 최적화될 필요가 없다. 나아가, 상이한 효모 종(예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스, 피키아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비시아에 등)은 고효율 발현을 위한 상이한 최적 코돈을 갖는다. 따라서, 신호 서열, Kex2 절단 부위 및 DVP를 인코딩하는 서열 요소를 포함하는 DVP 발현 카세트에 대해 코돈 최적화가 고려되어야 하는 데, 이는 이러한 서열 요소가 초기에 재조합 효모 세포에서 하나의 융합 펩타이드로 번역되기 때문이다.
일부 구현예에서, 코돈 최적화된 DVP 발현 카세트는 효모 발현을 위한 효모 특이적 발현 벡터 내로 결찰될 수 있다. 에피솜 벡터와 통합 벡터를 비롯하여 효모 발현에 이용 가능한 다수의 발현 벡터가 존재하며, 이들은 통상적으로 특정 효모 균주에 대해 디자인된다. 펩타이드 생산에 사용되는 특정 효모 발현 시스템을 고려하여 적절한 발현 벡터를 신중하게 선택해야 한다. 일부 구현예에서, 형질전환된 효모 세포의 염색체 내로 통합되고, 세포 분열 및 증식 주기를 통해 안정하게 유지되는 통합 벡터가 사용될 수 있다. 통합 DNA 서열은 형질전환된 효모 종에서 표적화된 게놈 DNA 유전자좌에 상동이며, 이러한 통합 서열에는 pLAC4, 25S rDNA, pAOX1 및 TRP2 등이 포함된다. 살충 펩타이드 전이유전자의 위치는 통합 DNA 서열에 인접하거나(삽입 벡터) 통합 DNA 서열 내에 존재할 수 있다(대체 벡터).
일부 구현예에서, 발현 벡터 또는 클로닝 벡터는 대장균에서 DNA 제조를 위한 대장균 요소, 예를 들어 대장균 복제 기점, 항생제 선별 마커 등을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 관심 전이유전자의 발현에 필요한 일련의 서열 요소, 예를 들어 전사 프로모터, 종결인자, 효모 선별 마커, 숙주 효모 DNA에 상동인 통합 DNA 서열 등을 함유할 수 있다. 천연 및 조작된 프로모터를 비롯하여 이용 가능한 다수의 적합한 효모 프로모터, 예를 들어 pLAC4, pAOX1, pUPP, pADH1, pTEF, pGal1 등과 같은 효모 프로모터가 존재하며, 일부 구현예에서는 다른 것들이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 아세트아미드 원영양성(prototrophy) 선별; 제오신(zeocin) 내성 선별; 게네티신(geneticin) 내성 선별; 노우르세오트리신(nourseothricin) 내성 선별; 우라실 결핍 선별; 및/또는 기타 선별 방법과 같은 선별 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) amdS 유전자가 선별 마커로 사용될 수 있다. 예시적인 선별 마커 사용 방법은 미국 특허 제6,548,285호(1997년 4월 3일자 출원); 제6,165,715호(1998년 6월 22일자 출원); 및 제6,110,707호(1997년 1월 17일자 출원)에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 pKLAC1 벡터에 삽입될 수 있다. pKLAC1은 New England Biolabs® Inc.(항목 번호(NEB #E1000))에서 상업적으로 입수 가능하다. pKLAC1은 효모 클루이베로마이세스 락티스에서 재조합 단백질(예를 들어, DVP)의 고수준 발현을 달성하도록 디자인되었다. pKLAC1 플라스미드는 단독으로, 또는 클루이베로마이세스 락티스 단백질 발현 키트의 일부로 주문될 수 있다. pKLAC1 플라스미드는 SacII 또는 BstXI 제한 효소를 사용하여 선형화될 수 있으며, αMF 분비 신호의 MCS 다운스트림을 보유한다. αMF 분비 신호는 재조합 단백질을 분비 경로로 지시하며, 이는 후속으로 Kex2를 통해 절단되어 관심 펩타이드, 예를 들어 DVP를 생성한다. Kex2는 분비 경로의 전구단백질 활성화에 관여하고, 상업적으로 입수 가능한(PeproTech®; 항목 번호 450-45), 칼슘 의존성 세린 프로테아제이다.
일부 구현예에서, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 pLB102 플라스미드에 삽입되거나, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 결찰된 pKLAC1 플라스미드로 형질전환된 효모 콜로니의 선별 후 pLB102 플라스미드에 서브클로닝될 수 있다. DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 결찰된 pKLAC1 플라스미드로 형질전환된 효모, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스는, 형질전환된 효모 세포가 유일한 질소 공급원으로 아세트아미드를 함유하는 YCB 배지에서 성장할 수 있도록 하는 아세트아미다아제(amdS)에 기반하여 선택될 수 있다. DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 결찰된 pKLAC1 플라스미드로 형질전환된 양성 효모 콜로니가 식별되면.
일부 구현예에서, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 당업자가 용이하게 이용 가능한 다른 상업적으로 입수 가능한 플라스미드 및/또는 벡터에 삽입될 수 있으며, 예를 들어 플라스미드는 Addgene(비영리 플라스미드 보관소); GenScript®; Takara®; Qiagen®; 및 PromegaTM에서 입수 가능하다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 DVP 발현 카세트로 형질전환된 효모 세포는 효모 배양물에서 DVP를 배지 1리터당 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L, 적어도 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 6,000 mg/L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/L, 적어도 11,000 mg/L, 적어도 12,000 mg/L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 13,000 mg/L, 적어도 14,000 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 16,000 mg/L, 적어도 17,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 18,000 mg/L, 적어도 19,000 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 적어도 60,000 mg/L, 적어도 70,000 mg/L, 적어도 80,000 mg/L, 적어도 90,000 mg/L 또는 적어도 100,000 mg/L의 DVP의 수율로 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 DVP 발현 카세트로 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스의 배양물은, 하기를 함유하는 성장 배지 1리터당 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L, 적어도 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 6,000 mg/L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/L, 적어도 11,000 mg/L, 적어도 12,000 mg/L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 13,000 mg/L, 적어도 14,000 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 16,000 mg/L, 적어도 17,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 18,000 mg/L, 적어도 19,000 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 적어도 60,000 mg/L, 적어도 70,000 mg/L, 적어도 80,000 mg/L, 적어도 90,000 mg/L 또는 적어도 100,000 mg/L의 DVP의 수율로 효모 배양물에서 DVP를 생산할 수 있다: (1) MSM 배지 레시피: 2 g/L 시트르산소듐 2수화물; 1 g/L 황산칼슘 2수화물(0.79 g/L 무수 황산칼슘); 42.9 g/L 일염기성 인산포타슘; 5.17 g/L 황산암모늄; 14.33 g/L 황산포타슘; 11.7 g/L 황산마그네슘 7수화물; 2 mL/L PTM1 미량 염 용액; 0.4 ppm 비오틴(500X, 200 ppm 스톡); 1% 내지 2% 순수한 글리세롤 또는 다른 탄소 공급원. (2) PTM1 미량 염 용액: 황산구리-5H2O 6.0 g; 요오드화소듐 0.08 g; 황산망간-H2O 3.0 g; 몰리브덴산소듐-2H2O 0.2 g; 붕산 0.02 g; 염화코발트 0.5 g; 염화아연 20.0 g; 황산제1철-7H2O 65.0 g; 비오틴 0.2 g; 황산 5.0 ml; 최종 부피 1리터까지 물을 첨가함. 클루이베로마이세스 락티스 제한 배지(DMSor)에 대한 예시적인 조성은 하기와 같다: 11.83 g/L KH2PO4, 2.299 g/L K2HPO4, 20 g/L의 발효 당, 예를 들어 갈락토오스, 말토오스, 라토트리오스, 수크로오스, 프룩토오스 또는 글루코오스, 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소첨가된 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨, 1 g/L MgSO4.7H2O, 10 g/L (NH4)SO4, 0.33 g/L CaCl2.2H2O, 1 g/L NaCl, 1 g/L KCl, 5 mg/L CuSO4.5H2O, 30 mg/L MnSO4.H2O, 10 mg/L, ZnCl2, 1 mg/L KI, 2 mg/L CoCl2.6H2O, 8 mg/L Na2MoO4.2H2O, 0.4 mg/L H3BO3, 15 mg/L FeCl3.6H2O, 0.8 mg/L 비오틴, 20 mg/L Ca-판토테네이트, 15 mg/L 티아민, 16 mg/L 미오-이노시톨, 10 mg/L 니코틴산 및 4 mg/L 피리독신; 선별 마커, 및 최적 발현을 가능하게 하는 조건 하에서의 배양.
일부 구현예에서, DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트가 벡터에 삽입되어, 약 100 mg/L의 DVP(효모 발효 브로스의 상청액)의 수율을 생성할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 2개의 발현 카세트가 벡터, 예를 들어 pKS022 플라스미드에 삽입되어, 약 2 g/L의 DVP(효모 발효 브로스의 상청액)의 수율을 생성할 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 3개의 발현 카세트가 벡터, 예를 들어 pLB103bT 플라스미드에 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 최적화된 DVP 전이유전자의 하나 이상의 카피를 클루이베로마이세스 락티스 게놈 내로 통합시킬 수 있도록 하기 위해 다수의 DVP 발현 카세트가 효모로 트랜스펙션될 수 있다. 다수의 DVP 발현 카세트를 클루이베로마이세스 락티스 게놈에 도입하는 예시적인 방법은 하기와 같다: 온전한 LAC4 프로모터 요소, 코돈 최적화된 DVP ORF 요소 및 pLAC4 종결인자 요소를 포함하는 DVP 발현 카세트 DNA 서열을 합성하고; 온전한 발현 카세트를 pLB10V5의 pLAC4 종결인자의 다운스트림인 Sal I 제한 부위와 Kpn I 제한 부위 사이의 pLB103b 벡터에 결찰시켜 이중 전이유전자 DVP 발현 벡터, pKS022를 생성하고; 이어서 Sac II 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 이중 전이유전자 벡터, pKS022를 선형화시키고, 전기천공을 통해 클루이베로마이세스 락티스의 YCT306 균주로 형질전환시킨다. 이어서, 생성된 효모 콜로니를 아세트아미다아제 발현 세포만 질소의 대사 공급원으로서 효율적으로 사용할 수 있는, 5 mM 아세트아미드가 보충된 YCB 한천 플레이트 상에서 성장시킨다. 효모 콜로니를 평가하기 위해, pKS022 효모 플레이트에서 약 100개 내지 400개 콜로니를 선택할 수 있다. 콜로니의 접종물을 각각 탄소 공급원으로서 2% 당 알코올이 첨가된 한정된 클루이베로마이세스 락티스 배지 2.2 mL에서 배양한다. 배양물을 280 rpm으로 진탕시키면서 23.5℃에서 6일 동안 배양한 후, 배양물 내 세포 밀도는 600 nm(OD600)에서의 광 흡광도로 표시될 때 최대 수준에 도달할 것이다. 이어서, 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 배양액으로부터 제거하고, HPLC 수율 분석을 위해 생성된 상청액(조건화된 배지)를 0.2 μm 멤브레인을 통해 여과한다.
발현 카세트
DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드에 더하여, 조절 요소로 알려진 추가의 DNA 분절이 이종 폴리뉴클레오타이드의 증강된 발현을 가능하게 하는 벡터에 클로닝될 수 있다. 이러한 조절 요소의 예에는 하기가 포함된다: (1) 프로모터, 종결인자 및/또는 인핸서 요소; (2) 적절한 mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; (3) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (4) 인트론; 및 (5) 전사 후 조절 요소.
상기 기재된 바와 같이, 관심 DNA 분절(예를 들어, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드)과 외래 시스-작용 요소 중 어느 하나와의 조합을 "발현 카세트"라고 한다.
따라서, 일부 구현예에서, 조절 요소로 알려진 이러한 추가 DNA 분절은 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드에 대해 임의의 배향으로 작동 가능하게 연결될 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 벡터는 발현 카세트를 포함할 수 있으며, 여기서 발현 카세트는 하기 (1) 내지 (5) 중 하나 이상을 포함한다: (1) 프로모터, 종결인자 및/또는 인핸서 요소; (2) 적절한 mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; (3) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (4) 인트론; 및 (5) DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드의 증강된 발현을 가능하게 하는 전사 후 조절 요소.
그리고, 일부 구현예에서, 벡터는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 다수의 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 여기서 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 각각의 개별 이종 폴리뉴클레오타이드는, 각각, 하기 (1) 내지 (5) 중 하나 이상을 포함하는 자체의 발현 카세트를 갖는다: (1) 프로모터, 종결인자 및/또는 인핸서 요소; (2) 적절한 mRNA 안정화 폴리아데닐화 신호; (3) 내부 리보솜 진입 부위(IRES); (4) 인트론; 및 (5) DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 각각의 이종 폴리뉴클레오타이드의 증강된 발현을 가능하게 하는 전사 후 조절 요소.
일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다.
클로닝 전략
적절한 폴리뉴클레오타이드를 벡터에 삽입하는 것은 다양한 절차에 의해 수행될 수 있다.
일반적으로, DNA 서열은 적절한 제한 엔도뉴클레아제에 의한 삽입물과 벡터의 소화 후 벡터 내 목적하는 위치에 결찰된다. 대안적으로, 삽입물과 벡터 둘 모두의 평활 말단이 결찰될 수 있다. 다양한 클로닝 기술이 문헌[Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1997] 및 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 개시되어 있으며; 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이러한 절차 및 다른 절차는 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드는 당업자가 용이하게 이용 가능한 다른 상업적으로 입수 가능한 플라스미드 및/또는 벡터에 삽입될 수 있으며, 예를 들어 플라스미드는 Addgene(비영리 플라스미드 보관소); GenScript®; Takara®; Qiagen®; 및 PromegaTM에서 입수 가능하다.
일부 구현예에서, 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, SV40의 유도체; 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합에서 유도된 벡터, 백시니아바이러스, 아데노바이러스, 계두바이러스 및 가성광견병바이러스와 같은 바이러스 DNA를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 척추동물 세포와 같은 진핵생물 세포와 호환되는 벡터가 사용될 수 있다. 진핵생물 세포 벡터는 당업계에 널리 알려져 있으며, 상업적 공급원으로부터 입수 가능하다. 고려되는 벡터는 원핵생물 서열(박테리아에서 벡터의 증식을 용이하게 하기 위해)과, 비박테리아 세포에서 기능성인 하나 이상의 진핵생물 전사 단위를 모두 함유할 수 있다. 전형적으로, 이러한 벡터는 목적하는 재조합 DNA 분자의 삽입을 위한 편리한 제한 부위를 제공한다. pcDNAI, pSV2, pSVK, pMSG, pSVL, pPVV-1/PML2d 및 pTDT1(ATCC No. 31255) 유래 벡터는 비인간 세포의 트랜스펙션에 적합한 포유류 벡터의 예이다. 일부 구현예에서, 전술한 벡터 중 일부는 원핵생물 세포와 진핵생물 세포 둘 모두에서 복제 및 약물 내성 선별을 유리하게 하기 위해, pBR322와 같은 박테리아 플라스미드 유래의 서열로 변형될 수 있다. 대안적으로, 소 유두종 바이러스(BPV-1) 또는 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(pHEBo, pREP 유래 및 p205)와 같은 바이러스 유도체가 돼지 세포에서 단백질의 발현에 사용될 수 있다. 플라스미드의 제조와 숙주 세포의 형질전환에서 이용되는 다양한 방법은 당업계에 널리 알려져 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드에 더하여, 벡터는 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열뿐 아니라, 프로모터, 작동인자, 개시 코돈, 정지 코돈, 폴리아데닐화 신호 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며; 목적에 따라 다양한 형태로 작제될 수 있다. 개시 코돈과 정지 코돈은 일반적으로 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 작제물이 투여된 대상에서 기능성이야 하며, 코딩 서열과 함께 프레임 내에 있어야 한다.
일부 구현예에서, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 선별 마커를 포함할 수 있으며, 복제 가능한 발현 벡터는 복제 기점을 포함한다. 벡터는 자가 복제 가능할 수 있거나, 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
전사적 활성 유전자를 표적으로 하는 경우, 작제물의 디자인이 내인성 프로모터에 의해 지시되는 바와 같이 마커를 전사되게 한다면 프로모터의 사용은 필요하지 않을 수 있다. 이러한 표적화된 변형을 수행하기 위한 예시적인 작제물과 벡터가 본원에 기재되어 있다. 하지만, 이러한 접근법에 사용될 수 있는 다른 벡터가 당업자에게 알려져 있으며, 이는 본 발명에 따른 사용을 위해 용이하게 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 벡터가 사용될 수 있다. 기본 표적화 벡터는 부위 특이적 통합(SSI) 서열, 예를 들어 표적화되는 내인성 DNA 분절에 상동인 서열의 5'-상동성 아암과 3'-상동성 아암을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 벡터는 또한 선택적으로 하나 이상의 양성 및/또는 음성 선별 마커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 유전자 기능을 파괴하고/하거나 형질전환 후 통합된 표적화 벡터 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포를 식별하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 벡터의 사용은 (전이유전자와 내인성 유전자가 유사한 경우) 내인성 유전자와 구별 가능한 제한 패턴을 생성하기 위해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 이종 폴리뉴클레오타이드를 이용할 수 있다.
상동성 아암
당업자는, 표적화된 유전자 변형이, 벡터의 게놈으로의 통합이 이루어질 수 있도록 표적화된 유전자와 상동성인 영역(또는 이의 플랭킹 영역)을 포함하는 핵산 분자 벡터의 사용을 필요로 한다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 표적화 벡터는 일반적으로 하기와 같은 3개의 주요 영역을 함유하도록 디자인된다: (1) 표적화되는 유전자좌에 상동인 제1 영역; (2) 표적 유전자좌에 삽입되고/되거나 표적화된 유전자좌의 일부를 특이적으로 대체하는 이종 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 관심 단백질을 인코딩하도록 작동 가능하고/하거나 항생제 내성 단백질과 같은 선별 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함함)인 제2 영역; 및 (3) 제1 영역과 마찬가지로 표적화된 유전자좌에 상동이지만, 전형적으로 게놈의 제1 영역과 인접하지 않은 제3 영역.
표적화 벡터와 표적화된 내인성 또는 야생형 유전자좌 사이의 상동성 재조합은 표적화 벡터에 나타난 2개의 상동성 영역 사이의 임의의 유전자좌 서열의 결실, 및 해당 서열의, 예를 들어 관심 폴리뉴클레오타이드 및 선택적으로 하나 이상의 추가 조절 요소를 인코딩하는 이종 서열로의 대체, 또는 해당 서열 내로의, 예를 들어 관심 폴리뉴클레오타이드 및 선택적으로 하나 이상의 추가 조절 요소를 인코딩하는 이종 서열의 삽입을 유도한다.
상동성 재조합을 용이하게 하기 위해, 표적화 벡터(상기 참조)의 제1 영역과 제3 영역은 표적화된 유전자(또는 플랭킹 영역)와 실질적인 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. "실질적인 동일성"은, 또 다른 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 및 보다 더욱 바람직하게는 100% 동일한 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 서열 동일성은 전형적으로 BLAST®(Basic Local Alignment Search Tool) 또는 BLAST® 2와 이에 지정된 디폴트 매개변수를 사용하여 측정된다(문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990]; 문헌[Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-250, 1999] 참조). 이러한 소프트웨어 프로그램은 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 대한 상동성 정도를 지정하여 유사한 서열을 매칭한다. 따라서, 상동성 재조합을 용이하게 하기 위해 표적화된 유전자 유전자좌와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 및 보다 더욱 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 서열이 본 발명에 사용될 수 있다.
2개의 상동성 영역(즉, 상기 언급된 제1 영역과 제3 영역)의 총 크기는, 예를 들어 대략 1 킬로베이스(kb) 내지 25 킬로베이스(kb)(예를 들어, 대략 2 kb 내지 20 kb, 대략 5 kb 내지 15 kb, 또는 대략 6 kb 내지 10 kb)일 수 있고, 표적화된 유전자좌의 일부를 대체하는 제2 영역의 크기는, 예를 들어 대략 0.5 kb 내지 5 kb(예를 들어, 대략 1 kb 내지 4 kb, 대략 1 kb 내지 3 kb, 대략 1 kb 내지 2 kb, 또는 대략 3 kb 내지 4 kb)일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 벡터는 일반적으로 선별 마커와 부위 특이적 통합(SSI) 서열을 포함할 수 있다. SSI 서열은 관심 전이유전자, 예를 들어 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며; 이는 "5'-상동성 아암과 3'-상동성 아암" 또는 "5' 아암과 3' 아암" 또는 "좌측 아암과 우측 아암" 또는 "상동성 아암"으로 불리는 2개의 게놈 DNA 단편이 플랭킹되어 있다. 이러한 상동성 아암은 숙주 유기체의 염색체 유전자좌의 성공적인 유전자 변형을 달성하기 위해 숙주 유기체에서 표적 게놈 서열 및/또는 관심 내인성 유전자와 재조합된다.
표적화 벡터에 대한 상동성 아암을 디자인할 때, 5'-아암과 3'-아암은 모두 서열의 효율적인 생체내 짝짓기 및 교차 형성을 가능하게 하기 위해 표적화되는 내인성 서열과 충분한 서열 상동성을 가져야 한다. 그리고, 상동성 아암 길이는 가변적이지만, 두 개의 아암에 대해 총 적어도 5 kb 내지 8 kb를 포함하는 상동성(더 짧은 아암의 길이가 1 kb 이상임)이 성공적인 재조합을 보장하는 데 도움이 될 수 있는 일반적인 지침이다.
일부 구현예에서, 5'-상동성 아암 및/또는 3'-상동성 아암은 다양할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상이한 유전자좌는 상이한 위치에서 관심 서열을 교환하기 위해 5'-상동성 아암 및/또는 3'-상동성 아암, 예를 들어 본원에 기재된 상동성 아암의 업스트림 및/또는 다운스트림에 의해 표적화될 수 있다.
벡터 디자인 및 생체내 상동성 재조합에 대한 추가의 예시적인 방법은 하기 문헌에서 확인할 수 있다: "Positive-negative selection methods and vectors"라는 발명의 명칭의 미국 특허 제5,464,764호(1993년 2월 4일자 출원; 출원인 University of Utah Research Foundation, Salt Lake City, UT); "Protein production and protein delivery"라는 발명의 명칭의 미국 특허 제5,733,761호(1995년 5월 26일자 출원; 출원인 Transkaryotic Therapies, Inc., Cambridge, MA); "Gene targeting in animal cells using isogenic DNA constructs"라는 발명의 명칭의 미국 특허 제5,789,215호(1997년 8월 7일자 출원; 출원인 GenPharm International, San Jose, CA); "Efficient construction of gene targeting vectors"라는 발명의 명칭의 미국 특허 제6,090,554호(1997년 10월 31일자 출원; 출원인 Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA); "Procedure for specific replacement of a copy of a gene present in the recipient genome by the integration of a gene different from that where the integration is made"라는 발명의 명칭의 미국 특허 제6,528,314호(1995년 6월 6일자 출원; 출원인 Institut, Pasteur); "Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy and protein production"라는 발명의 명칭의 미국 특허 제6,537,542호(2000년 4월 14일자 출원; 출원인 Transkaryotic Therapies, Inc., Cambridge, MA); "Method of producing functional protein domains"라는 발명의 명칭의 미국 특허 제8,048,645호(2001년 8월 1일자 출원; 출원인 Merck Serono SA); 및 "Systems and methods for protein production"라는 발명의 명칭의 미국 특허 제8,173,394호(2009년 4월 6일자 출원; 출원인 Wyeth LLC, Madison, NJ)(상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
선별 마커에 대한 예시적인 설명 및 방법은 하기 문헌에 제공되어 있다: 문헌[Wigler et al., Cell 11:223 (1977)]; 문헌[Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)]; 문헌[Lowy et al., Cell 22:817 (1980)]; 문헌[Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980)]; 문헌[O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)]; 문헌[Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)]; 문헌[Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)]; 문헌[Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)]; 문헌[Mulligan, Science 260:926-932 (1993)]; 문헌[Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)]; 문헌[Santerre et al., Gene 30:147 (1984)]; 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N Y (1993)]; 문헌[Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, N Y (1990)](챕터 12 및 13); 문헌[Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, N Y (1994)]; 문헌[Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]; 미국 특허 제6,548,285호(1997년 4월 3일자 출원); 제6,165,715호(1998년 6월 22일자 출원); 및 제6,110,707호(1997년 1월 17일자 출원)(상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
예시적인 벡터
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 이종 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열((i) DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함함)과, (b) 5'-상동성 아암과 3'-상동성 아암(여기서, 상기 5'-상동성 아암과 상기 3'-상동성 아암은, 각각, 이종 폴리뉴클레오타이드의 업스트림과 다운스트림에 위치함)을 포함하는 벡터를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며; 여기서 상기 벡터는 이종 폴리뉴클레오타이드의 내인성 숙주 세포 유전자좌로의 상동성 재조합 매개 통합을 가능하게 하도록 작동 가능하고; 상기 상동성 재조합 매개 통합은 내인성 숙주 세포 DNA 분절을 이종 폴리뉴클레오타이드로 대체한다.
일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열((i) DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함함)이 벡터(예를 들어, 플라스미드)에 클로닝되거나 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 즉, (i) DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 뉴클레오타이드 서열의 구성요소 중 임의의 것이 벡터에 클로닝되거나 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 숙주 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 벡터로 형질전환되며, 상기 이종 폴리뉴클레오타이드는 임의의 배향으로 작동 가능하게 연결된 하기 뉴클레오타이드 서열을 포함한다: (i) DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드는 다양한 클로닝 전략, 및 당업자가 용이하게 입수 가능한 상업용 클로닝 키트 및 재료를 사용하여 벡터에 클로닝될 수 있다.
예를 들어, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오타이드 서열은, SnapFast; Gateway; TOPO; Gibson; LIC; InFusionHD; 또는 Electra 전략과 같은 전략을 사용하여 벡터에 클로닝될 수 있다.
본 발명의 벡터를 생산하는 데 사용될 수 있는 다수의 상업적으로 입수 가능한 벡터가 존재한다. 예를 들어, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드를 생성하고, 실온에서 5분 동안 pCRTMII-TOPO 벡터 또는 PCRTM2.1-TOPO® 벡터(Invitrogen에서 TOPO® TA Cloning ® 키트로 상업적으로 입수 가능함)와 조합한 후; TOPO® 반응액을 이후에 색상 변화에 기반하여 선택될 수 있는 적격 세포로 형질전환시킬 수 있다(문헌[Janke et al., A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 2004 Aug; 21(11):947-62]; 또한 문헌[Adams et al. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor, NY, 1997] 참조(상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)).
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및/또는 인공 염색체(예를 들어, YAC)와 같은 벡터에 클로닝될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드는 숙주로 대장균을 사용하여 하기를 수행하는 방식으로, 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터에 삽입될 수 있다: 관심 DNA 분절을 삽입하는 데 필요한 제한 효소를 사용하여 벡터 DNA 약 2 μg 내지 5 μg을 소화시킨 후, 완전한 소화를 달성하기 위해 밤새 인큐베이션시키고(자가 결찰/재순환을 회피하기 위해 알칼리성 포스파타아제를 사용하여 5'-말단을 탈인산화시킬 수 있음); 소화된 벡터를 겔 정제함. 다음으로, 관심 DNA 분절, 예를 들어 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드를 PCR을 통해 증폭시키고, 당업자에게 알려진 기술을 사용하여(예를 들어, PCR 클린업 키트를 사용하여) PCR 반응물로부터 임의의 과량의 효소, 프라이머, 혼입되지 않은 dNTP, 짧은-실패한 PCR 산물, 및/또는 염을 제거한다. 하기를 포함하는 혼합물을 생성하여 관심 DNA 분절을 벡터에 결찰시킨다: 약 20 ng의 벡터; 약 100 ng 내지 1,000 ng의 관심 DNA 분절; 2 μL의 10x 완충액(즉, 30 mM Tris-HCl, 4 mM MgCl2, 26 μM NAD, 1 mM DTT, 50 μg/ml BSA, pH 8, 25℃에서 보관); 1 μL의 T4 DNA 리가아제; H2O를 첨가하여 전체의 총 부피를 20 μL로 만듬. 이어서, 결찰 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하거나, 16℃에서 밤새 인큐베이션할 수 있다. 이어서, 결찰 반응액(즉, 약 1 μL)을, 예를 들어 전기천공 또는 화학적 방법을 사용하여 적격 세포로 형질전환시키고, 콜로니 PCR을 수행하여 관심 DNA 분절을 함유하는 벡터를 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드는, 발현 ORF를 함께 구성하는 다른 DNA 분절과 함께, 숙주 효모 세포로부터의 분비를 위해 디자인될 수 있다. 발현 ORF를 디자인하는 예시적인 방법은 하기와 같다: ORF는 신호 펩타이드 서열로 시작하여, 이어서 Kex2 절단 부위(리신-아르기닌)를 인코딩하는 DNA 서열, 이어서 5'-말단에 글리신-세린 코돈이 부가된 이종 폴리뉴클레오타이드 전이유전자, 최종적으로 3'-말단에 종결 코돈을 가질 수 있음. 이어서, 모든 이러한 요소는 효모 세포에서 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)으로서 융합 펩타이드로 발현된다. α-교배인자(αMF) 신호 서열은 재조합 효모의 내인성 분비 경로를 통해 재조합 살충 펩타이드의 대사 처리를 촉진시키기 위해 가장 흔히 사용되며, 즉, 발현된 융합 펩타이드가 전형적으로 소포체에 진입하고, 여기서 α-교배인자 신호 서열이 신호 펩티다아제 활성에 의해 제거되고, 이어서 생성된 전구-살충 펩타이드가 골지체에 트래피킹되고, 여기서 상기 언급된 리신-아르기닌 디펩타이드가 Kex2 엔도프로테아제에 의해 완전히 제거되고, 그 후 성숙 DVP 또는 DVP-살충 단백질이 세포 밖으로 분비된다.
일부 구현예에서, 재조합 세포에서 폴리펩타이드 발현 수준은 특정 숙주 효모 종에 기반하여 코돈을 최적화하는 방식으로 증강될 수 있다. 소정의 숙주 유기체의 내인성 오픈 리딩 프레임에서 관찰되는 코돈의 자연 발생 빈도는 고효율 발현을 위해 반드시 최적화될 필요가 없다. 나아가, 상이한 효모 종(예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스, 피키아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비시아에 등)은 고효율 발현을 위한 상이한 최적 코돈을 갖는다. 따라서, 신호 서열, Kex2 절단 부위 및 이종 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열 요소를 포함하는 발현 ORF에 대해 코돈 최적화가 고려되어야 하는 데, 이는 이러한 서열 요소가 초기에 재조합 효모 세포에서 하나의 융합 펩타이드로 번역되기 때문이다.
일부 구현예에서, 코돈 최적화된 발현 ORF는 효모 발현을 위한 효모 특이적 발현 벡터 내로 결찰될 수 있다. 에피솜 벡터와 통합 벡터를 비롯하여 효모 발현에 이용 가능한 다수의 발현 벡터가 존재하며, 이들은 통상적으로 특정 효모 세포에 대해 디자인된다. 펩타이드 생산에 사용되는 특정 효모 발현 시스템을 고려하여 적절한 발현 벡터를 신중하게 선택해야 한다. 일부 구현예에서, 형질전환된 효모 세포의 염색체 내로 통합되고, 세포 분열 및 증식 주기를 통해 안정하게 유지되는 통합 벡터가 사용될 수 있다. 통합 DNA 서열은 형질전환된 효모 종에서 표적화된 게놈 DNA 유전자좌에 상동이며, 이러한 통합 서열에는 pLAC4, 25S rDNA, pAOX1 및 TRP2 등이 포함된다. 살충 펩타이드 전이유전자의 위치는 통합 DNA 서열에 인접하거나(삽입 벡터) 통합 DNA 서열 내에 존재할 수 있다(대체 벡터).
일부 구현예에서, 발현 벡터는 대장균에서 DNA 제조를 위한 대장균 요소, 예를 들어 대장균 복제 기점, 항생제 선별 마커 등을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 관심 전이유전자의 발현에 필요한 일련의 서열 요소, 예를 들어 전사 프로모터, 종결인자, 효모 선별 마커, 숙주 효모 DNA에 상동인 통합 DNA 서열 등을 함유할 수 있다. 천연 및 조작된 프로모터를 비롯하여 이용 가능한 다수의 적합한 효모 프로모터, 예를 들어 pLAC4, pAOX1, pUPP, pADH1, pTEF, pGal1 등과 같은 효모 프로모터가 존재하며, 일부 구현예에서는 다른 것들이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드는 당업자가 용이하게 이용 가능한 다른 상업적으로 입수 가능한 플라스미드 및/또는 벡터에 삽입될 수 있으며, 예를 들어 플라스미드는 Addgene(비영리 플라스미드 보관소); GenScript®; Takara®; Qiagen®; 및 PromegaTM에서 입수 가능하다.
DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터의 제조 후, 본 발명의 재조합 효모 세포를 생산하기 위해 벡터를 효모 세포로 형질전환시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 벡터는 (a) 이종 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열((i) DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함함)과, (b) 5'-상동성 아암과 3'-상동성 아암(여기서, 상기 5'-상동성 아암과 상기 3'-상동성 아암은, 각각, 이종 폴리뉴클레오타이드의 업스트림과 다운스트림에 위치함)을 포함하며; 여기서 상기 벡터는 이종 폴리뉴클레오타이드의 내인성 효모 숙주 세포 유전자 유전자좌로의 상동성 재조합 매개 통합을 가능하게 하도록 작동 가능하고; 상기 상동성 재조합 매개 통합은 내인성 효모 숙주 세포 유전자 DNA 분절을 이종 폴리뉴클레오타이드로 대체한다.
일부 구현예에서, 벡터는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이트 또는 이의 상보적 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 서열을 포함할 수 있다.
형질전환 및 세포 배양 방법
"형질전환"과 "트랜스펙션"이라는 용어는 모두 외인성 및/또는 이종 DNA 또는 RNA를 숙주 유기체에 도입하는 과정을 설명한다. 일반적으로, 당업자는 때때로 외인성 및/또는 이종 DNA 또는 RNA가 박테리아 세포에 도입되는 과정을 설명하기 위해 "형질전환"이라는 용어를 사용하고; 외인성 및/또는 이종 DNA 또는 RNA를 진핵생물 세포에 도입하는 것을 설명하는 과정에 대해 "트랜스펙션"이라는 용어를 사용한다. 하지만, 본원에 사용된 "형질전환"과 "트랜스펙션"이라는 용어는, 과정이 외인성 및/또는 이종 DNA 또는 RNA를 원핵생물(예를 들어, 박테리아) 또는 진핵생물(예를 들어, 효모, 식물 또는 동물)에 도입하는 것을 설명하는 지에 관계없이, 동의어로 사용된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드로 형질전환될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 발현 카세트를 함유하는 벡터는 발현 플라스미드에 클로닝되고, 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 효모 세포는 본원에 기재된 효모 세포 중 어느 하나일 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 하기 방법을 사용하여 형질전환될 수 있다: 전기천공; 세포 스퀴징(cell squeezing); 미세주사; 임팔펙션(impalefection); 정수압의 사용; 소노포레이션(sonoporation); 광학 트랜스펙션; 연속 주입; 리포펙션; 아데노바이러스, 아데노연관바이러스, 렌티바이러스, 단순헤르페스바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스의 사용; 화학적 포스페이트 방법; DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI)을 통한 세포내이입; 원형질체 융합; 유체역학적 전달; 마그네토펙션(magnetofection); 핵감염; 및/또는 기타. 트랜스펙션 및/또는 형질전환 기술에 관한 예시적인 방법은 문헌[Makrides (2003), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elvesier; Wong, TK & Neumann, E. Electric field mediated gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 107, 584-587 (1982)]; 문헌[Potter & Heller, Transfection by Electroporation. Curr Protoc Mol Biol. 2003 May; CHAPTER: Unit-9.3]; 문헌[Kim & Eberwine, Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 2010 Aug; 397(8): 3173-3178]에서 확인할 수 있으며, 이러한 참고문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 전기천공을 사용하여 하나 이상의 DVP 발현 카세트로 세포를 형질전환시킬 수 있으며, 이는 효모 배양물에서 DVP를 배지 1리터당 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L, 적어도 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 6,000 mg/L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/L, 적어도 11,000 mg/L, 적어도 12,000 mg/L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 13,000 mg/L, 적어도 14,000 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 16,000 mg/L, 적어도 17,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 18,000 mg/L, 적어도 19,000 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 적어도 60,000 mg/L, 적어도 70,000 mg/L, 적어도 80,000 mg/L, 적어도 90,000 mg/L 또는 적어도 100,000 mg/L의 DVP의 수율로 생산할 수 있다.
전기천공은 전기를 세포에 가하여 세포막을 투과성으로 만드는 기술로, 이는 결국 외인성 DNA가 세포에 도입되게 한다. 전기천공은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 전기천공을 달성하는 데 필요한 도구 및 장치는 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어, Gene Pulser Xcell™ Electroporation Systems, Bio-Rad®; Neon® Transfection System for Electroporation, Thermo-Fisher Scientific; 및 기타 도구 및/또는 장치). 예시적인 전기천공 방법은 문헌[Potter & Heller, Transfection by Electroporation. Curr Protoc Mol Biol. 2003 May; CHAPTER: Unit-9.3]; 문헌[Saito (2015) Electroporation Methods in Neuroscience. Springer press]; 문헌[Pakhomov et al., (2017) Advanced Electroporation Techniques in Biology and Medicine. Taylor & Francis]에 예시되어 있으며; 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 전기천공은 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터를 효모에 도입하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP 발현 카세트는 플라스미드에 클로닝되고, 전기천공을 통해 숙주 세포로 형질전환된다.
일부 구현예에서, DVP 발현 카세트를 플라스미드에 클로닝하고, 전기천공을 통해 효모 세포로 형질전환시키는 것은 하기 단계를 통해 달성될 수 있다: 약 10 mL 내지 200 mL의 효모 추출물 펩톤 덱스트로오스(YEPD)에 적합한 효모 종, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비시아에, 피키아 파스토리스 등을 접종하고, 효모 배양물의 초기 지수 단계(예를 들어, 약 0.6 내지 2 x 108개 세포/mL)까지 진탕기 상에서 30℃에서 인큐베이션하는 단계; 멸균 원심분리 튜브에 효모를 수거하여 4℃에서, 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고(주의: 절차 동안 세포를 차갑게 유지), 40 mL의 얼음 냉각된 멸균 탈이온수로 세포를 세척하고, 세포를 23,000 rpm으로 5분 동안 펠릿화하는 단계; 세척 단계를 반복하고, 20 mL의 1 M 발효 당, 예를 들어 갈락토오스, 말토오스, 라토트리오스, 수크로오스, 프룩토오스 또는 글루코오스, 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소첨가된 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨 중에 세포를 재현탁시킨 후, 3,000 rpm으로 5분 동안 회전시키는 단계; 적절한 부피의 얼음 냉각된 1 M 발효 당, 예를 들어 갈락토오스, 말토오스, 라토트리오스, 수크로오스, 프룩토오스 또는 글루코오스, 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소첨가된 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨을 이용하여 최종 세포 밀도 3 x 109개 세포/mL(1.5 x 109개 세포/mL 내지 6 x 109개 세포/mL가 허용 가능한 세포 밀도임)까지 세포를 재현탁시키는 단계; 사전 냉각된 0.2 cm 전기천공 큐벳(주의: 샘플이 알루미늄 큐벳의 양쪽 측면과 접촉하고 있는 지 확인)에서 40 μl의 효모 현탁액을 DVP를 인코딩하는 선형 폴리뉴클레오타이드(약 1 μg)를 함유하는 벡터 약 1 μl 내지 4 μl(100 ng/μl 내지 300 ng/μl의 농도로)와 혼합하는 단계; RC 회로의 5 ms의 최적 시간 상수를 위해 2000 V에서 단일 펄스를 제공한 후, 세포를 0.5 ml의 YED 및 0.5 mL의 1 M 발효 당, 예를 들어 갈락토오스, 말토오스, 라토트리오스, 수크로오스, 프룩토오스 또는 글루코오스, 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소첨가된 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨 혼합물에서 회수하고, 선별 플레이트 상에 확산시키는 단계.
일부 구현예에서, 전기천공은 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터를 효모에 도입하는 데, 예를 들어 DVP를 플라스미드에 클로닝하고, 전기천공을 통해 클루이베로마이세스 락티스 세포로 형질전환시키는 데 사용될 수 있으며, 이는 하기 단계를 통해 달성될 수 있다: 약 10 mL 내지 200 mL의 효모 추출물 펩톤 덱스트로오스(YEPD)를 접종하고, 효모 배양물의 초기 지수 단계(예를 들어, 약 0.6 내지 2 x 108개 세포/mL)까지 진탕기 상에서 30℃에서 인큐베이션하는 단계; 멸균 원심분리 튜브에 효모를 수거하여 4℃에서, 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고(주의: 절차 동안 세포를 차갑게 유지), 40 mL의 얼음 냉각된 멸균 탈이온수로 세포를 세척하고, 세포를 23,000 rpm으로 5분 동안 펠릿화하는 단계; 세척 단계를 반복하고, 20 mL의 1 M 발효 당, 예를 들어 갈락토오스, 말토오스, 라토트리오스, 수크로오스, 프룩토오스 또는 글루코오스, 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소첨가된 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨 중에 세포를 재현탁시킨 후, 3,000 rpm으로 5분 동안 회전시키는 단계; 적절한 부피의 얼음 냉각된 1 M 발효 당, 예를 들어 갈락토오스, 말토오스, 라토트리오스, 수크로오스, 프룩토오스 또는 글루코오스, 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소첨가된 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨을 이용하여 최종 세포 밀도 3 x 109개 세포/mL까지 세포를 재현탁시키는 단계; 사전 냉각된 0.2 cm 전기천공 큐벳(주의: 샘플이 알루미늄 큐벳의 양쪽 측면과 접촉하고 있는 지 확인)에서 40 μl의 효모 현탁액을 DVP를 인코딩하는 선형 폴리뉴클레오타이드(약 1 μg)를 함유하는 벡터 약 1 μl 내지 4 μl과 혼합하는 단계; RC 회로의 5 ms의 최적 시간 상수를 위해 2000 V에서 단일 펄스를 제공한 후, 세포를 0.5 ml의 YED 및 0.5 mL의 1 M 발효 당, 예를 들어 갈락토오스, 말토오스, 라토트리오스, 수크로오스, 프룩토오스 또는 글루코오스, 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소첨가된 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨 혼합물에서 회수하고, 선별 플레이트 상에 확산시키는 단계.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 예시된 방법, 즉, 효모를 이용하는 본 발명의 벡터, 및 형질전환 및 발효 방법을 사용하면, 배지 1리터당 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L, 적어도 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 6,000 mg/L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/L, 적어도 11,000 mg/L, 적어도 12,000 mg/L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 13,000 mg/L, 적어도 14,000 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 16,000 mg/L, 적어도 17,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 18,000 mg/L, 적어도 19,000 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 적어도 60,000 mg/L, 적어도 70,000 mg/L, 적어도 80,000 mg/L, 적어도 90,000 mg/L 또는 적어도 100,000 mg/L의 DVP의 양으로 DVP를 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 전기천공은 하기 단계를 통해 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터를 식물 원형질체에 도입하는 데 사용될 수 있다: 원형질체 용액(예를 들어, 약 8 mL의 10 mM 2-[N-모르폴리노]에탄설폰산(MES), pH 5.5; 0.01%(w/v) 펙틸라아제(pectylase); 1%(w/v) 마세로자임(macerozyme); 40 mM CaCl2; 및 0.4 M 만니톨) 중에서 멸균 식물 물질을 인큐베이션하고, 혼합물을 30℃에서 약 3시간 내지 6시간 동안 회전식 진탕기에 첨가하여 원형질체를 생성하는 단계; 80 μm-메쉬 나일론 스크린 여과를 통해 잔해물을 제거하는 단계; 스크린을 약 4 ml의 식물 전기천공 완충액(예를 들어, 5 mM CaCl2; 0.4 M 만니톨; 및 PBS)을 이용하여 헹구는 단계; 멸균 15 mL 원추형 원심분리 튜브에 원형질체를 조합한 후, 약 300 × g로 약 5분 동안 원심분리하는 단계; 원심분리 후, 상청액을 폐기하고, 5 mL의 식물 전기천공 완충액을 이용하여 세척하는 단계; 원형질체를 식물 전기천공 완충액 중에 액체 1 mL당 약 1.5 x 106개 내지 2 x 106개 원형질체로 재현탁시키는 단계; 약 0.5 mL의 원형질체 현탁액을 얼음 위에 고정한 하나 이상의 전기천공 큐벳에 옮기고, 벡터를 첨가하는 단계(주의: 안정한 형질전환의 경우, 벡터는 상기 기재된 제한 방법 중 어느 하나를 사용하여 선형화되어야 하며, 약 1 μg 내지 10 μg의 벡터가 사용될 수 있고; 일시적 발현의 경우, 벡터는 초나선 상태로 유지될 수 있으며, 약 10 μg 내지 40 μg의 벡터가 사용될 수 있음); 벡터와 원형질체 현탁액을 혼합하는 단계; 큐벳을 전기천공 기기에 위치시키고, 약 1 kV 내지 2 kV(반응을 최적화시키는 동안 초기에 3 μF 내지 25 μF의 정전용량이 사용될 수 있음)로 1회 이상 충격을 가하는 단계; 큐벳을 다시 얼음으로 옮기는 단계; 형질전환된 세포를 완전 배지에 20배 희석하는 단계; 및 약 48시간 후 원형질체를 수거하는 단계.
이종 폴리뉴클레오타이드 혼입 분석
DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드의 혼입은 당업계에 알려진 방법에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 정량적 PCR(qPCR)과 파라로그 비 검정(PRT: paralog ratio test)이 이종 폴리뉴클레오타이드가 혼입되었는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, qPCR은 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 이종 폴리뉴클레오타이드의 재조합 숙주 세포로의 혼입을 확인하는 데 사용된다.
정량적 PCR(qPCR)은 실시간 PCR에 의한 유전자 발현의 분석과 카피 수 변화의 정량화에 이용되어 왔다. qPCR은 알려지지 않은 카피 수를 갖는 시험 유전자좌와 알려진 카피 수를 갖는 참조 유전자좌의 증폭을 포함한다. 검정에는 형광 염료와 삽입(intercalating) 염료의 두 가지 접근법이 있다. 어느 접근법에서든, 형광은 PCR 주기마다 두 배가 되며, 지정된 형광 임계 수준을 달성하는 데 필요한 주기 수로부터 시작 주형의 양을 결정할 수 있다. 실제 qPCR 실험은 샘플 제조 후 반나절이 소요된다. qPCR 데이터 분석을 위해 통상적으로 사용되는 방법에는 PCR 신호를 표준 곡선과 관련짓는 절대 정량화와, 한 군의 표적 전사체의 PCR 신호를 또 다른 군의 신호와 관련짓는 상대 정량화가 있다.
DNA 카피 수를 측정하기 위해, 앰플리콘은 해당 유전자에 대해 고유한 서열을 갖는 엑손 또는 인트론 내에 위치해야 한다. 2개의 카피를 갖는 대조군 유전자를 또한 포함시켜야 한다. 모든 구성요소를 함유하는 마스터 믹스를 준비하고, 96웰 또는 384웰 플레이트에 분배한다. 각각의 반응에 주형 및/또는 프라이머를 첨가한다. 검정은 qPCR 기기에서 수행되며, 데이터는 실시간으로 수집된다.
DVP의 화학적 합성
펩타이드 합성, 또는 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드의 화학적 합성을 사용하여 DVP를 생성할 수 있다: 이러한 방법은 당업자에 의해 및/또는 상업적 판매회사(예를 들어, GenScript®; Piscataway, New Jersey)의 사용을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 화학적 펩타이드 합성은 액체상 펩타이드 합성(LPPS) 또는 고체상 펩타이드 합성(SPPS)을 사용하여 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 펩타이드 합성은 일반적으로 후속 아미노산의 카르복실기를 선행 아미노산의 N-말단에 커플링시켜 초기 폴리펩타이드 사슬을 생성하는 전략을 사용하여 달성될 수 있으며, 이러한 방법은 자연에서 일어나는 폴리펩타이드 합성의 유형이다.
펩타이드 탈보호는 폴리펩타이드의 화학적 합성에서 중요한 첫 번째 단계이다. 펩타이드 탈보호는 아미노산의 관능기가 원치 않거나 비특이적인 반응 또는 부반응에 참여하는 것을 방지하기 위해 화학물질을 사용하여 아미노산의 반응성기를 차단하는 과정이며; 즉, 아미노산은 이러한 바람직하지 않은 반응에 참여하는 것으로부터 "보호된다".
펩타이드 사슬을 합성하기 전, 아미노산은 사슬이 형성되도록(즉, 아미노산이 결합하도록) 하기 위해 "탈보호"되어야 한다. N-말단을 보호하는 데 사용되는 화학물질에는 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)과 tert-부톡시카르보닐(Boc)이 포함되며, 이들은 각각 약염기(예를 들어, 피페리딘)와 중간 정도의 강산(예를 들어, 트리플루오로아세트산(TFA))을 사용하여 제거될 수 있다.
필요한 C-말단 보호제는 사용되는 화학적 펩타이드 합성 전략의 유형에 따라 달라진다: 예를 들어, LPPS는 C-말단 아미노산의 보호를 필요로 하지만, SPPS는 보호기로 작용하는 고체 지지체로 인해 필요하지 않다. 측쇄 아미노산은 개별 펩타이드 서열과 N-말단 보호 전략에 따라 달라지는 몇 가지 상이한 보호기의 사용을 필요로 하지만; 전형적으로, 측쇄 아미노산을 위해 사용되는 보호기는 tert-부틸(tBu) 또는 벤질(Bzl) 보호기를 기반으로 한다.
펩타이드 합성 절차의 다음 단계는 아미노산 커플링이다. 아미노산 커플링을 수행하기 위해서는, 들어오는 아미노산의 C-말단 카르복실산이 활성화되어야 한다: 이는 들어오는 아미노산의 카르복실기와 반응하여 O-아실이소우레아 중간체를 형성하는 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 또는 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)와 같은 카르보디이미드를 사용하여 수행될 수 있다. 이어서, O-아실이소우레아 중간체가 성장하는 펩타이드 사슬의 N-말단 상에 있는 1차 아미노기를 통한 친핵성 공격을 통해 대체된다. 카르보디이미드에 의해 생성된 반응성 중간체는 아미노산의 라세미화를 유도할 수 있다. 아미노산의 라세미화를 회피하기 위해, O-아실이소우레아 중간체와 반응하도록 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)과 같은 시약이 첨가된다. 사용될 수 있는 다른 커플링제에는, 추가의 활성화 염기와 함께, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 및 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP)가 포함된다. 최종적으로, 아미노산 탈보호 및 커플링에 이어,
합성 과정의 마지막에, 폴리펩타이드로부터 보호기의 제거가 일어나야 하며, 이러한 과정은 통상적으로 산분해를 통해 일어난다. 펩타이드 절단에 필요한 시약을 결정하는 것은 사용되는 보호 체계 및 전반적인 합성 방법과 상관관계가 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Bzl 및 Boc 기를 절단하는 데 브롬화수소(HBr); 플루오린화수소(HF); 또는 트리플루오로메탄 설폰산(TFMSA)이 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 구현예에서, TFA와 같은 덜 강한 산은 tBut 및 Fmoc 기의 산분해를 가능하게 할 수 있다. 최종적으로, 펩타이드가 펩타이드의 물리화학적 특징(예를 들어, 전하, 크기, 소수성 등)에 기반하여 정제될 수 있다. 펩타이드를 정제하는 데 사용될 수 있는 기술에는, 역상 크로마토그래피(RPC); 크기 배제 크로마토그래피; 분할 크로마토그래피; 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC); 및 이온 교환 크로마토그래피(IEC)를 포함하는 정제 기술이 포함된다.
예시적인 펩타이드 합성 방법은 문헌[Anderson G. W. and McGregor A. C. (1957) T-butyloxycarbonylamino acids and their use in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 79, 6180-3]; 문헌[Carpino L. A. (1957) Oxidative reactions of hydrazines. Iv. Elimination of nitrogen from 1, 1-disubstituted-2-arenesulfonhydrazides1-4. Journal of the American Chemical Society. 79, 4427-31]; 문헌[McKay F. C. and Albertson N. F. (1957) New amine-masking groups for peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 79, 4686-90]; 문헌[Merrifield R. B. (1963) Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society. 85, 2149-54]; 문헌[Carpino L. A. and Han G. Y. (1972) 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group. The Journal of Organic Chemistry. 37, 3404-9]; 및 문헌[A Lloyd-Williams P. et al. (1997) Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins. Boca Raton: CRC Press. 278]; 미국 특허 제3,714,140호(1971년 3월 16일자 출원); 제4,411,994호(1978년 6월 8일자 출원); 제7,785,832호(2006년 1월 20일자 출원); 제8,314,208호(2006년 2월 10일자 출원); 및 제10,442,834호(2015년 10월 2일자 출원); 및 미국 특허 출원 제2005/0165215호(2004년 12월 23일자 출원)에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
세포 배양 및 발효 기술
세포 배양 기술은 당업계에 널리 알려져 있다. 일부 구현예에서, 배양 방법 및/또는 재료는 선택된 숙주 세포에 기반한 적합화(예를 들어, pH, 온도, 배지 함량 등의 변경)를 반드시 필요로 할 것이다. 일부 구현예에서, 배지 배양물은 유일한 탄소원(예를 들어, 소르비톨)을 함유한다. 일부 구현예에서, 임의의 알려진 배양 기술을 이용하여 본 발명의 재조합 효모 세포를 생산할 수 있다.
예시적인 배양 방법은 미국 특허 제3,933,590호; 제3,946,780호; 제4,988,623호; 제5,153,131호; 제5,153,133호; 제5,155,034호; 제5,316,905호; 제5,330,908호; 제6,159,724호; 제7,419,801호; 제9,320,816호; 제9,714,408호; 및 제10,563,169호에 제공되어 있으며; 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
숙주 세포
본 발명의 방법, 조성물, DVP 및 DVP-살충 단백질은 임의의 세포 유형, 예를 들어 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 구현될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 원핵생물이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체와 같은 원시세균(Archaebacteria) 또는 진정세균(Eubacteria)일 수 있다. 유용한 박테리아의 예에는, 에스케리키아(Escherichia)(예를 들어, 대장균), 바실리(Bacilli)(예를 들어, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas) 종(예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 또는 파라코쿠스(Paracoccus)가 포함된다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 단세포 세포일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 그람 양성 박테리아와 같은 박테리아 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 하기로 이루어지는 속에서 선택되는 박테리아일 수 있다: 칸디다투스 클로라시도박테리움(Candidatus Chloracidobacterium), 아르트로박테르(Arthrobacter), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프란키아(Frankia), 미크로코쿠스(Micrococcus), 마이코박테리움(Mycobacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 아쿠이펙스 박테로이데스(Aquifex Bacteroides), 포르피로모나스(Porphyromonas), 박테로이데스, 포르피로모나스, 플라보박테리움(Flavobacterium), 클라미디아(Chlamydia), 프로스테코박테르(Prosthecobacter), 베루코미크로비움(Verrucomicrobium), 클로로플렉수스(Chloroflexus), 크루코쿠스(Chroococcus), 메리스모페디아(Merismopedia), 시네코코쿠스(Synechococcus), 아나바에나(Anabaena), 노스톡(Nostoc), 스피룰리나(Spirulina), 트리코데스미움(Trichodesmium), 플레우로캅사(Pleurocapsa), 프로클로로코쿠스(Prochlorococcus), 프로클로론(Prochloron), 바실러스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 데할로박테르(Dehalobacter), 에풀로피시움(Epulopiscium), 루미노코쿠스(Ruminococcus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 렙토스피릴룸(Leptospirillum), 니트로스피라(Nitrospira), 테르모데설포박테리움(Thermodesulfobacterium), 겜마타(Gemmata), 피렐룰라(Pirellula), 플란크토마이세스(Planctomyces), 카울로박테르(Caulobacter), 아그로박테리움, 브라디리조비움(Bradyrhizobium), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 프로스테코미크로비움(Prosthecomicrobium), 리조비움(Rhizobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 시노리조비움(Sinorhizobium), 로도박테르(Rhodobacter), 로세오박테르(Roseobacter), 아세토박테르(Acetobacter), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 리케치아(Rickettsia), 리케치아 코노리(Rickettsia conorii), 미토콘드리아(Mitochondria), 울바키아(Wolbachia), 에리트로박테르(Erythrobacter), 에리트로미크로비움(Erythromicrobium), 스핑고모나스(Sphingomonas), 알칼리게네스(Alcaligenes), 부크홀데리아(Burkholderia), 렙토트릭스(Leptothrix), 스파에로틸루스(Sphaerotilus), 티오바실러스(Thiobacillus), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 갈리오넬라(Gallionella), 스피릴룸(Spirillum), 아조아르쿠스(Azoarcus), 아에로모나스(Aeromonas), 숙시노모나스(Succinomonas), 숙시니비브리오(Succinivibrio), 루미노박테르(Ruminobacter), 니트로소코쿠스(Nitrosococcus), 티오캅사(Thiocapsa), 엔테로박테르(Enterobacter), 에스케리키아, 클레브시엘라, 살모넬라(Salmonella), 시겔라, 위글레스워르티아(Wigglesworthia), 예르시니아(Yersinia), 콕시엘라(Coxiella), 레지오넬라(Legionella), 할로모나스(Halomonas), 파스테우렐라(Pasteurella), 아시네토박테르(Acinetobacter), 아조토박테르(Azotobacter), 슈도모나스, 시크로박테르(Psychrobacter), 베기아토아(Beggiatoa), 티오마르가리타(Thiomargarita), 비브리오(Vibrio), 잔토모나스(Xanthomonas), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 캄필로박테르(Campylobacter), 헬리코박테르(Helicobacter), 믹소코쿠스(Myxococcus), 데설포사르시나(Desulfosarcina), 게오박테르(Geobacter), 데설푸로모나스(Desulfuromonas), 보렐리아(Borrelia), 렙토스피라(Leptospira), 트레포네마(Treponema), 페트로토가(Petrotoga), 테르모토가(Thermotoga), 데이노코쿠스(Deinococcus) 또는 테르무스(Thermus).
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 하기 박테리아 종 중 하나에서 선택될 수 있다: 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 시르쿨란스(Bacillus circulans), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 라우투스(Bacillus lautus), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 투린기엔시스, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 무리누스(Streptomyces murinus), 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 알비칸스(Streptomyces albicans), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 플리카토스포루스(Streptomyces plicatosporus), 에스케리키아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리키아 블라타에(Escherichia blattae), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 에스케리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르만니(Escherichia hermannii), 에스케리키아 세네갈렌시스(Escherichia senegalensis), 에스케리키아 불네리스(Escherichia vulneris), 슈도모나스 아비에타니필라(Pseudomonas abietaniphila), 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici), 슈도모나스 아가롤리티쿠스(Pseudomonas agarolyticus), 슈도모나스 알칼리필라(Pseudomonas alcaliphila), 슈도모나스 알기노보라(Pseudomonas alginovora), 슈도모나스 안데르소니(Pseudomonas andersonii), 슈도모나스 안타르크티카(Pseudomonas antarctica), 슈도모나스 아스플레니(Pseudomonas asplenii), 슈도모나스 아젤라이카(Pseudomonas azelaica), 슈도모나스 바투미시(Pseudomonas batumici), 슈도모나스 보레알리스(Pseudomonas borealis), 슈도모나스 브라시카세아룸(Pseudomonas brassicacearum), 슈도모나스 클로리티디스무탄스(Pseudomonas chloritidismutans), 슈도모나스 크레모리콜로라타(Pseudomonas cremoricolorata), 슈도모나스 디테르페니펠라(Pseudomonas diterpeniphila), 슈도모나스 필리신덴스(Pseudomonas filiscindens), 슈도모나스 프레데릭스베르겐시스(Pseudomonas frederiksbergensis), 슈도모나스 긴게리(Pseudomonas gingeri), 슈도모나스 그라미니스(Pseudomonas graminis), 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii), 슈도모나스 할로데니트리피칸스(Pseudomonas halodenitrificans), 슈도모나스 할로필라(Pseudomonas halophila), 슈도모나스 히비스시콜라(Pseudomonas hibiscicola), 슈도모나스 히드로게노보라(Pseudomonas hydrogenovora), 슈도모나스 인디카(Pseudomonas indica), 슈도모나스 자포니카(Pseudomonas japonica), 슈도모나스 제세니(Pseudomonas jessenii), 슈도모나스 킬로넨시스(Pseudomonas kilonensis), 슈도모나스 코린시스(Pseudomonas koreensis), 슈도모나스 리니(Pseudomonas lini), 슈도모나스 루리다(Pseudomonas lurida), 슈도모나스 루테아(Pseudomonas lutea), 슈도모나스 마르기나타(Pseudomonas marginata), 슈도모나스 메리디아나(Pseudomonas meridiana), 슈도모나스 메소아시도필라(Pseudomonas mesoacidophila), 슈도모나스 파카스트렐라에(Pseudomonas pachastrellae), 슈도모나스 팔레로니아나(Pseudomonas palleroniana), 슈도모나스 파라풀바(Pseudomonas parafulva), 슈도모나스 파보난세아에(Pseudomonas pavonanceae), 슈도모나스 프로테올리카(Pseudomonas proteolyica), 슈도모나스 프시크로필라(Pseudomonas psychrophila), 슈도모나스 프시크로톨레란스(Pseudomonas psychrotolerans), 슈도모나스 푸디카(Pseudomonas pudica), 슈도모나스 라토니스(Pseudomonas rathonis), 슈도모나스 레악탄스(Pseudomonas reactans), 슈도모나스 리조스파에라에(Pseudomonas rhizosphaerae), 슈도모나스 살모노니(Pseudomonas salmononii), 슈도모나스 테르마에룸(Pseudomonas thermaerum), 슈도모나스 테르모카르복시도보란스(Pseudomonas thermocarboxydovorans), 슈도모나스 테르모톨레란스(Pseudomonas thermotolerans), 슈도모나스 티베르발렌시스(Pseudomonas thivervalensis), 슈도모나스 움손겐시스(Pseudomonas umsongensis), 슈도모나스 반코우베렌시스(Pseudomonas vancouverensis), 슈도모나스 위스콘시넨시스(Pseudomonas wisconsinensis), 슈도모나스 잔토마리나(Pseudomonas xanthomarina), 슈도모나스 지아메넨시스(Pseudomonas xiamenensis), 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 알칼리게네스(Pseudomonas alcaligenes), 슈도모나스 안구일리셉티카(Pseudomonas anguilliseptica), 슈도모나스 시트로넬로리스(Pseudomonas citronellolis), 슈도모나스 플라베센스(Pseudomonas flavescens), 슈도모나스 진주엔시스(Pseudomonas jinjuensis), 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina), 슈도모나스 니트로레두센스(Pseudomonas nitroreducens), 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 슈도알칼리게네스(Pseudomonas pseudoalcaligenes), 슈도모나스 레시노보란스(Pseudomonas resinovorans), 슈도모나스 스트라미나에(Pseudomonas straminae), 슈도모나스 아우란티아카(Pseudomonas aurantiaca), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 프라기(Pseudomonas fragi), 슈도모나스 룬덴시스(Pseudomonas lundensis), 슈도모나스 타에트롤렌스(Pseudomonas taetrolens), 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans), 슈도모나스 브레네리(Pseudomonas brenneri), 슈도모나스 세드리나(Pseudomonas cedrina), 슈도모나스 콘겔란스(Pseudomonas congelans), 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata), 슈도모나스 코스탄티니(Pseudomonas costantinii), 슈도모나스 엑스트레모리엔탈리스(Pseudomonas extremorientalis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 풀기다(Pseudomonas fulgida), 슈도모나스 게사르디(Pseudomonas gessardii), 슈도모나스 리바넨시스(Pseudomonas libanensis), 슈도모나스 만델리(Pseudomonas mandelii), 슈도모나스 마르기날리스(Pseudomonas marginalis), 슈도모나스 메디테라네아(Pseudomonas mediterranea), 슈도모나스 미굴라에(Pseudomonas migulae), 슈도모나스 무시돌렌스(Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 오리엔탈리스(Pseudomonas orientalis), 슈도모나스 포아에(Pseudomonas poae), 슈도모나스 로데시아에(Pseudomonas rhodesiae), 슈도모나스 신잔타(Pseudomonas synxantha), 슈도모나스 톨라시(Pseudomonas tolaasii), 슈도모나스 트리비알리스(Pseudomonas trivialis), 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii), 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans), 슈도모나스 페르투시노게나(Pseudomonas pertucinogena), 슈도모나스 풀바(Pseudomonas fulva), 슈도모나스 몬테일리(Pseudomonas monteilii), 슈도모나스 모셀리(Pseudomonas mosselii), 슈도모나스 오리지하비탄스(Pseudomonas oryzihabitans), 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 발레아리카(Pseudomonas balearica), 슈도모나스 루테올라(Pseudomonas luteola) 또는 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 아벨라나에(Pseudomonas avellanae), 슈도모나스 카나비나(Pseudomonas cannabina), 슈도모나스 카리카파피아에(Pseudomonas caricapapyae), 슈도모나스 시코리(Pseudomonas cichorii), 슈도모나스 코로나파시엔스(Pseudomonas coronafaciens), 슈도모나스 푸스코바기나에(Pseudomonas fuscovaginae), 슈도모나스 트레마에(Pseudomonas tremae) 또는 슈도모나스 비리디플라바(Pseudomonas viridiflava).
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 진핵생물일 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 하기 계통군에 속하는 세포일 수 있다: 후편모생물(Opisthokonta); 녹색식물(Viridiplantae)(예를 들어, 조류(algae) 및 식물); 아메바류(Amebozoa); 사족충류(Cercozoa); 피하낭류(Alveolata); 해양 편모류(Marine flagellates); 부등편모조류(Heterokonta); 반상크리스타류(Discicristata); 또는 엑스카바타(Excavata).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은, 예를 들어 후생동물(Metazoan), 동정편모충류(Choanoflagellata) 또는 진균인 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 진균인 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 하기 진핵생물 문에 속하는 세포일 수 있다: 자낭균류(Ascomycota), 담자균류(Basidiomycota), 호상균류(Chytridiomycota), 미포자충류(Microsporidia) 또는 접합균류(Zygomycota).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 하기 속 중 하나에 속하는 진균인 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다: 아스페르길루스(Aspergillus), 클라도스포리움(Cladosporium), 마그나포르테(Magnaporthe), 모르켈라(Morchella), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 사카로마이세스(Saccharomyces), 크립토코쿠스(Cryptococcus) 또는 우스틸라고(Ustilago).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 하기 종 중 하나에 속하는 진균인 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다: 사카로마이세스 세레비시아에, 사카로마이세스 보울라르디(Saccharomyces boulardi), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum); 아스페르길루스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 테레우스(A. terreus), 아스페르길루스 아와모리(A. awamori); 클라도스포리움 엘라툼(Cladosporium elatum), 클라도스포리움 헤르바룸(Cladosporium Herbarum), 클라도스포리움 스파에로스페르뭄(Cladosporium Sphaerospermum), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium Cladosporioides); 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea), 마그나포르테 오리자에(Magnaporthe oryzae), 마그나포르테 리조필라(Magnaporthe rhizophila); 모르켈라 델리시오사(Morchella deliciosa), 모르켈라 에스쿨렌타(Morchella esculenta), 모르켈라 코니카(Morchella conica); 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa), 네우로스포라 인테르메디아(Neurospora intermedia), 네우로스포라 테트라스페르마(Neurospora tetrasperma); 페니실리움 노타툼(Penicillium notatum), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움 로쿠에포르티(Penicillium roquefortii) 또는 페니실리움 심플리시시뭄(Penicillium simplicissimum).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비시아에 또는 피키아 파스토리스인 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 하기 속 중 하나에 속하는 진균일 수 있다: 아스페르길루스(Aspergillus), 클라도스포리움(Cladosporium), 마그나포르테(Magnaporthe), 모르켈라(Morchella), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 사카로마이세스(Saccharomyces), 크립토코쿠스(Cryptococcus) 또는 우스틸라고(Ustilago).
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 사카로마이세타세아에과의 구성원일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 사카로마이세타세아에과 내 하기 속 중 하나일 수 있다: 브레타노마이세스(Brettanomyces), 칸디다(Candida), 시테로마이세스(Citeromyces), 시니클로마이세스(Cyniclomyces), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 이사트켄키아(Issatchenkia), 카자크스타니아(Kazachstania), 클루이베로마이세스, 코마가타엘라(Komagataella), 쿠라이시아(Kuraishia), 라칸세아(Lachancea), 로데로마이세스(Lodderomyces), 나카세오마이세스(Nakaseomyces), 파키솔렌(Pachysolen), 피키아(Pichia), 사카로마이세스, 스파타스포라(Spathaspora), 테트라피시스포라(Tetrapisispora), 반데르왈토지마(Vanderwaltozyma), 토룰라스포라(Torulaspora), 윌리옵시스(Williopsis), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 또는 지고토룰라스포라(Zygotorulaspora).
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 하기 중 하나일 수 있다: 아스페르길루스 플라버스, 아스페르길루스 테레우스, 아스페르길루스 아와모리, 클라도스포리움 엘라툼, 클라도스포리움 헤르바룸, 클라도스포리움 스파에로스페르뭄, 클라도스포리움 클라도스포리오이데스, 마그나포르테 그리세아, 마그나포르테 오리자에, 마그나포르테 리조필라, 모르켈라 델리시오사, 모르켈라 에스쿨렌타, 모르켈라 코니카, 네우로스포라 크라사, 네우로스포라 인테르메디아, 네우로스포라 테트라스페르마, 페니실리움 노타툼, 페니실리움 크리소게눔, 페니실리움 로쿠에포르티 또는 페니실리움 심플리시시뭄.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 칸디다 속 내 종일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 하기 중 하나일 수 있다: 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 아스칼라피다룸(Candida ascalaphidarum), 칸디다 암픽시아에(Candida amphixiae), 칸디다 안타르크티카(Candida antarctica), 칸디다 아르겐테아(Candida argentea), 칸디다 아틀란티카(Candida atlantica), 칸디다 아트모스파에리카(Candida atmosphaerica), 칸디다 아우리스(Candida auris), 칸디다 블란키(Candida blankii), 칸디다 블라타에(Candida blattae), 칸디다 브라카렌시스(Candida bracarensis), 칸디다 브로멜리아세아룸(Candida bromeliacearum), 칸디다 카르포필리아(Candida carpophila), 칸디다 카르바잘리스(Candida carvajalis), 칸디다 세람비시다룸(Candida cerambycidarum), 칸디다 카울리오데스(Candida chauliodes), 칸디다 코리달리스(Candida corydalis), 칸디다 도세이(Candida dosseyi), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis), 칸디다 에르가텐시스(Candida ergatensis), 칸디다 프룩투스(Candida fructus), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 페르멘타티(Candida fermentati), 칸디다 구일리에르몬디(Candida guilliermondii), 칸디다 하에물로니(Candida haemulonii), 칸디다 후밀리스(Candida humilis), 칸디다 인섹타멘스(Candida insectamens), 칸디다 인섹토룸(Candida insectorum), 칸디다 인테르메디아, 칸디다 제프레시(Candida jeffresii) 또는 칸디다 케피르(Candida kefyr).
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 클루이베로마이세스 속 내 종일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 하기 중 하나일 수 있다: 클루이베로마이세스 아에스투아리(Kluyveromyces aestuarii), 클루이베로마이세스 돕잔스키(Kluyveromyces dobzhanskii), 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 클루이베로마이세스 논페르멘탄스(Kluyveromyces nonfermentans) 또는 클루이베로마이세스 위케라미(Kluyveromyces wickerhamii).
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 피키아 속 내 종일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 하기 중 하나일 수 있다: 피키아 파리노세(Pichia farinose), 피키아 아노말라(Pichia anomala), 피키아 히디(Pichia heedii), 피키아 구일리에르몬디, 피키아 클루이베리(Pichia kluyveri), 피키아 멤브라니파시엔스(Pichia membranifaciens), 피키아 노르베겐시스(Pichia norvegensis), 피키아 오메리(Pichia ohmeri), 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica) 또는 피키아 서브펠리쿨로사(Pichia subpelliculosa).
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 사카로마이세스 속 내 종일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 하기 중 하나일 수 있다: 사카로마이세스 아르보리콜루스(Saccharomyces arboricolus), 사카로마이세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 불데리(Saccharomyces bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스(Saccharomyces cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스(Saccharomyces cariocus), 사카로마이세스 세레비시아에, 사카로마이세스 세레비시아에 변종 보울라르디, 사카로마이세스 케발리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스(Saccharomyces dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 에우바야누스(Saccharomyces eubayanus), 사카로마이세스 엑시구오우스(Saccharomyces exiguous), 사카로마이세스 플로렌티누스(Saccharomyces florentinus), 사카로마이세스 프라길리스(Saccharomyces fragilis), 사카로마이세스 쿠드리아브제비(Saccharomyces kudriavzevii), 사카로마이세스 마르티니아에(Saccharomyces martiniae), 사카로마이세스 미카타에(Saccharomyces mikatae), 사카로마이세스 모나센시스(Saccharomyces monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 스펜세로룸(Saccharomyces spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스(Saccharomyces turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스(Saccharomyces unisporus), 사카로마이세스 우바룸 또는 사카로마이세스 조나투스(Saccharomyces zonatus).
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 하기 중 하나일 수 있다: 사카로마이세스 세레비시아에, 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카, 스키조사카로마이세스 폼베 또는 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala).
재조합 DVP를 생성하기 위해 숙주 유기체로서 효모 세포를 사용하는 것은 당업자에게 널리 알려진 예외적인 방법이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은, 비제한적으로, 사카로마이세스, 피키아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 스키조사카로마이세스 속의 임의의 종을 포함하는 임의의 종의 효모를 이용하여 수행될 수 있으며, 사카로마이세스 종에는 사카로마이세스의 임의의 종, 예를 들어 하기 균주에서 선택되는 사카로마이세스 세레비시아에 종이 포함된다: INVSc1, YNN27, S150-2B, W303-1B, CG25, W3124, JRY188, BJ5464, AH22, GRF18, W303-1A 및 BJ3505. 일부 구현예에서, 피키아의 임의의 종, 예를 들어 피키아 종, 피키아 파스토리스, 예를 들어 피키아 파스토리스를 포함하는 피키아 종의 구성원은 하기 균주에서 선택된다: Bg08, Y-11430, X-33, GS115, GS190, JC220, JC254, GS200, JC227, JC300, JC301, JC302, JC303, JC304, JC305, JC306, JC307, JC308, YJN165, KM71, MC100-3, SMD1163, SMD1165, SMD1168, GS241, MS105, 임의의 pep4 녹아웃 균주 및 임의의 prb1 녹아웃 균주뿐 아니라, 하기 균주에서 선택되는 피키아 파스토리스: Bg08, X-33, SMD1168 및 KM71. 일부 구현예에서, 클루이베로마이세스의 임의의 종, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스를 포함하는 임의의 클루이베로마이세스 종이 본원에 기재된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있으며, 본 발명자들은 클루이베로마이세스 락티스 균주가 하기 균주에서 선택될 수 있지만, 반드시 그럴 필요가 있는 것은 아님을 교시한다: GG799, YCT306, YCT284, YCT389, YCT390, YCT569, YCT598, NRRL Y-1140, MW98-8C, MS1, CBS293.91, Y721, MD2/1, PM6-7A, WM37, K6, K7, 22AR1, 22A295-1, SD11, MG1/2, MSK110, JA6, CMK5, HP101, HP108 및 PM6-3C, 이에 더하여, 클루이베로마이세스 락티스 종은 GG799, YCT306 및 NRRL Y-1140에서 선택됨.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 아스페르길루스 오리자에일 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus)일 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)일 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스일 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 바실러스 서브틸리스일 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은, 비제한적으로, 한세눌라의 임의의 종, 및 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 포함하는 한세눌라 종의 임의의 종을 포함하는 임의의 종의 효모를 이용하여 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은, 비제한적으로, 야로위아 종의 임의의 종, 예를 들어 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하는 임의의 종의 효모를 이용하여 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 절차 및 방법은, 비제한적으로, 스키조사카로마이세스의 임의의 종, 및 바람직하게는 스키조사카로마이세스 폼베를 포함하는 스키조사카로마이세스 종의 임의의 종을 포함하는 임의의 종의 효모를 이용하여 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 클루이베로마이세스 락티스, 사카로마이세스 세레비시아에, 피키아 파스토리스 등과 같은 효모 종이 숙주 유기체로 사용될 수 있다. 효모 세포 배양 기술은 당업자에게 널리 알려져 있다. 예시적인 효모 세포 배양 방법은 문헌[Evans, Yeast Protocols. Springer (1996)]; 문헌[Bill, Recombinant Protein Production in Yeast. Springer (2012)]; 문헌[Hagan et al., Fission Yeast: A Laboratory Manual, CSH Press (2016)]; 문헌[Konishi et al., Improvement of the transformation efficiency of Saccharomyces cerevisiae by altering carbon sources in pre-culture. Biosci Biotechnol Biochem. 2014; 78(6):1090-3]; 문헌[Dymond, Saccharomyces cerevisiae growth media. Methods Enzymol. 2013; 533:191-204]; 문헌[Looke et al., Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 2011 May; 50(5):325-8]; 및 문헌[Romanos et al., Culture of yeast for the production of heterologous proteins. Curr Protoc Cell Biol. 2014 Sep 2; 64:20.9.1-16]에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
효모 세포 발효 배지 및 스톡에 대한 레시피는 하기에 기재되는 바와 같다: (1) MSM 배지 레시피: 2 g/L 시트르산소듐 2수화물; 1 g/L 황산칼슘 2수화물(0.79 g/L 무수 황산칼슘); 42.9 g/L 일염기성 인산포타슘; 5.17 g/L 황산암모늄; 14.33 g/L 황산포타슘; 11.7 g/L 황산마그네슘 7수화물; 2 mL/L PTM1 미량 염 용액; 0.4 ppm 비오틴(500X, 200 ppm 스톡); 1% 내지 2% 순수한 글리세롤 또는 다른 탄소 공급원. (2) PTM1 미량 염 용액: 황산구리-5H2O 6.0 g; 요오드화소듐 0.08 g; 황산망간-H2O 3.0 g; 몰리브덴산소듐-2H2O 0.2 g; 붕산 0.02 g; 염화코발트 0.5 g; 염화아연 20.0 g; 황산제1철-7H2O 65.0 g; 비오틴 0.2 g; 황산 5.0 ml; 최종 부피 1리터까지 물을 첨가함. 클루이베로마이세스 락티스 제한 배지(DMSor)에 대한 예시적인 조성은 하기와 같다: 11.83 g/L KH2PO4, 2.299 g/L K2HPO4, 20 g/L의 발효 당, 예를 들어 갈락토오스, 말토오스, 라토트리오스, 수크로오스, 프룩토오스 또는 글루코오스, 및/또는 당 알코올, 예를 들어 에리트리톨, 수소첨가된 전분 가수분해물, 이소말트, 락티톨, 말티톨, 만니톨 및 자일리톨, 1 g/L MgSO4.7H2O, 10 g/L (NH4)SO4, 0.33 g/L CaCl2.2H2O, 1 g/L NaCl, 1 g/L KCl, 5 mg/L CuSO4.5H2O, 30 mg/L MnSO4.H2O, 10 mg/L, ZnCl2, 1 mg/L KI, 2 mg/L CoCl2.6H2O, 8 mg/L Na2MoO4.2H2O, 0.4 mg/L H3BO3, 15 mg/L FeCl3.6H2O, 0.8 mg/L 비오틴, 20 mg/L Ca-판토테네이트, 15 mg/L 티아민, 16 mg/L 미오-이노시톨, 10 mg/L 니코틴산 및 4 mg/L 피리독신.
효모 세포는 접종 후 멸균된 공기 투과성 덮개로 밀봉되는 48웰 딥웰 플레이트에서 배양할 수 있다. 플레이트 상에서 배양된 효모, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스의 콜로니를 선택하여, 딥웰 플레이트에 웰당 DMSor로 구성된 배지를 2.2 mL 접종할 수 있다. 접종된 딥웰 플레이트를 냉장 인큐베이터-진탕기에서 280 rpm으로 진탕시키면서 23.5℃에서 6일 동안 성장시킬 수 있다. 접종 후 6일차에, 조건화된 배지를 4000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 수거해야 하며, 0.22 μm 멤브레인이 있는 필터 플레이트를 사용하여 여과하고, 여기서 여과된 배지를 HPLC 분석에 적용한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 하기 단계 (a) 내지 (c)에 따라 생산될 수 있다: (a) DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계(상기 DVP는 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함함: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임)); (b) 상기 벡터를 효모 세포에 도입하는 단계; 및 (c) DVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하의 성장 배지에서 효모 세포를 성장시키는 단계.
일부 구현예에서, 효모 세포는 하기 단계 (a) 내지 (c)에 따라 생산될 수 있다: (a) DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계(상기 DVP는 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함함: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임)); (b) 상기 벡터를 효모 세포에 도입하는 단계; 및 (c) DVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하의 성장 배지에서 효모 세포를 성장시키는 단계(여기서, X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거됨).
일부 구현예에서, 효모 세포는 하기 단계 (a) 내지 (c)에 따라 생산될 수 있다: (a) DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계(상기 DVP는 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함함: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임)); (b) 상기 벡터를 효모 세포에 도입하는 단계; 및 (c) DVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하의 성장 배지에서 효모 세포를 성장시키는 단계(여기서, X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거됨).
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP는 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP는 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP는 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP는 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP는 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP는 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP는 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP는 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP는 2개 이상의 DVP의 동종중합체 또는 이종중합체이고, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않은 링커에 의해 분리되는 2개 이상의 DVP를 포함하는 융합된 단백질이고, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 링커는 곤충의 내장 또는 혈림프 내부에서 절단 가능하다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 벡터는 알파-MF 신호를 포함하는 플라스미드이다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 벡터는 효모 세포로 형질전환된다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 효모 세포는 사카로마이세스, 피키아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 스키조사카로마이세스 속의 임의의 종에서 선택된다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 효모 세포는 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비시아에 및 피키아 파스토리스로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 효모 세포는 클루이베로마이세스 락티스이다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP의 발현은 배지 1리터당 적어도 70 mg/L, 80 mg/L, 90 mg/L, 100 mg/L, 110 mg/L, 120 mg/L, 130 mg/L, 140 mg/L, 150 mg/L, 160 mg/L, 170 mg/L, 180 mg/L, 190 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 1,000 mg/L, 1,250 mg/L, 1,500 mg/L, 1,750 mg/L 또는 적어도 20,000 mg/L의 수율로 DVP를 제공한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 DVP의 발현은 배지 1리터당 적어도 100 mg/L의 수율로 DVP를 제공한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 배지에서 DVP의 발현은 배지에서 단일 DVP의 발현을 유도한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 배지에서 DVP의 발현은 배지에서 2개 이상의 DVP 폴리펩타이드를 포함하는 DVP 중합체의 발현을 유도한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 벡터는 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 DVP를 인코딩하도록 작동 가능하다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 벡터는 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 DVP 또는 상이한 발현 카세트의 DVP를 인코딩하도록 작동 가능하다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현하도록 작동 가능할 수 있으며, 여기서 발현 카세트는 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능하다.
상기 언급된 방법 중 임의의 것 및/또는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 DVP 또는 DVP-살충 단백질 중 하나 이상을 생산할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 본 개시내용에 기재된 DVP 중 하나 이상을 생산할 수 있으며, 예를 들어 DVP는, 마찬가지로 본원에 기재된 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
효모 형질전환, DVP 정제 및 분석
예시적인 효모 형질전환 방법은 하기와 같다: DVP ORF를 운반하는 발현 벡터를 효모 세포로 형질전환시킨다. 먼저, 발현 벡터를 통상적으로 상동 재조합을 통한 염색체 통합을 촉진시키기 위해 특정 제한 효소 절단에 의해 선형화시킨다. 이어서, 선형 발현 벡터를 화학적 또는 전기천공 형질전환 방법에 의해 효모 세포로 형질전환시키고, 상동 재조합에 의해 효모 게놈의 표적화된 유전자좌에 통합시킨다. 통합은 동일한 염색체 유전자좌에서 수차례 일어날 수 있기 때문에, 형질전환된 효모 세포의 게놈은 DVP 발현 카세트의 다수의 카피를 함유할 수 있다. 발현 벡터로 조작되고, DVP ORF와 함께 효모 염색체에 공동 통합된 선별 마커를 선호하는 성장 조건을 사용하여 성공적으로 형질전환된 효모 세포를 식별할 수 있으며; 이러한 마커의 예에는, 비제한적으로, 아세트아미드 원영양성, 제오신 내성, 게네티신 내성, 노우르세오트리신 내성 및 우라실 원영양성이 포함된다.
예측 불가능하고 가변적인 요인, 예컨대 유전자 및 유전자의 네트워크의 후성적 변형, 및 형질전환 절차를 거치는 집단 내 개별 세포에서 일어나는 통합 사건의 수 변동의 영향으로 인해, 소정의 형질전환 과정의 개별 효모 콜로니는 DVP ORF를 생산하는 능력이 다를 것이다. 따라서, DVP 전이유전자를 운반하는 유전자이식 효모 콜로니는 고수율 균주에 대해 스크리닝되어야 한다. 이러한 스크리닝을 위한 2가지 효과적인 방법(각각 후속 분석을 위한 조건화된 배지 샘플을 제공하기 위해 유전자이식 효모의 소규모 배양물의 성장에 의존함)은 역상 HPLC 또는 집파리 주사 절차를 사용하여 양성 유전자이식 효모 콜로니로부터 조건화된 배지 샘플을 분석한다.
유전자이식 효모 배양은 각 튜브에 5 mL 내지 10 mL의 제한 배지가 첨가된 14 mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 배양 튜브를 사용하거나, 각 웰에 2.2 mL의 제한 배지가 첨가된 48웰 딥웰 배양 플레이트에서 수행할 수 있다. 후속 스크리닝 단계를 위해 수거된 조건화된 배지에서 단백질 배경을 감소시키기 위해, 미정제 단백질성 추출물, 또는 효모 추출물 또는 펩톤과 같은 부산물을 함유하지 않는 제한 배지가 배양에 사용된다. 배양은 최대 세포 밀도에 이를 때까지 최적 온도에서, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스의 경우 23.5℃에서 약 5일 내지 6일 동안 수행된다. 이제 형질전환된 효모 세포에 의해 DVP가 생산되고, 세포에서 나와 성장 배지로 분비된다. 스크리닝을 위한 샘플을 제조하기 위해, 원심분리를 통해 배양액에서 세포를 제거하고, 상청액을 조건화된 배지로 수집한 후, 0.22 μm 필터 멤브레인을 통해 여과하여 세척하고, 균주 스크리닝을 준비한다.
일부 구현예에서, DVP로 형질전환된 양성 효모 콜로니는 추정 효모 콜로니의 역상 HPLC(rpHPLC) 스크리닝을 통해 스크리닝될 수 있다. 이러한 스크리닝 방법에서, 결합된 상이 C18인 HPLC 분석 컬럼이 사용될 수 있다. 아세토니트릴과 물이 이동상 용매로 사용되고, 220 nm로 설정된 UV 흡광도 검출기가 펩타이드 검출에 사용된다. 적절한 양의 조건화된 배지 샘플을 rpHPLC 시스템에 로딩하고, 이동상 용매의 선형 구배로 용리한다. HPLC 크로마토그래프에서 살충 펩타이드의 해당 피크 면적을 사용하여 조건화된 배지 내 DVP 농도를 정량화한다. 알려진 양의 순수한 DVP를 동일한 HPLC 프로토콜을 이용하여 동일한 rpHPLC 컬럼을 통해 실행하여 펩타이드의 머무름 시간을 확인하고, 정량화를 위한 표준 펩타이드 HPLC 곡선을 생성한다.
양성 클루이베로마이세스 락티스 세포의 예시적인 역상 HPLC 스크리닝 과정은 하기와 같다: DVP ORF를 발현 벡터, pKLAC1에 삽입하고, 클루이베로마이세스 락티스 균주, YCT306(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)으로 형질전환시킬 수 있다. pKLAC1 벡터는 통합 발현 벡터이다. DVP 전이유전자가 pKLAC1에 클로닝되고, YCT306으로 형질전환되면, 이의 발현은 LAC4 프로모터에 의해 제어되었다. 생성된 형질전환된 콜로니는 α-교배인자 신호 펩타이드, Kex2 절단 부위, 및 성숙 DVP를 포함하는 프리-프로펩타이드를 생산하였다. α-교배인자 신호 펩타이드는 프리-프로펩타이드가 내인성 분비 경로로 들어가는 것을 안내하며, 성숙 DVP는 성장 배지로 방출된다.
일부 구현예에서, DVP 발현을 위한 코돈 최적화는 두 차례 수행될 수 있다: 예를 들어, 첫 번째 회차에서, 고발현 DNA 서열의 일부 공통 특성에 기반하여, α-교배인자 신호 펩타이드, Kex2 절단 부위 및 DVP를 발현하는 DVP ORF의 다수의 변이체를 디자인하고, 클루이베로마이세스 락티스의 YCT306 균주에서 이의 발현 수준을 평가하여 초기 클루이베로마이세스 락티스 발현 알고리즘을 생성함; 두 번째 최적화 회차에서, 초기 클루이베로마이세스 락티스 발현 알고리즘에 기반하여 추가 변이형 DVP ORF를 디자인하여 클루이베로마이세스 락티스 발현 알고리즘을 추가로 미세조정하고, 클루이베로마이세스 락티스에서 DVP 발현에 대한 최상의 ORF를 식별함. 일부 구현예에서, 전술한 최적화로부터 생성된 DNA 서열은 α-MF 신호 펩타이드, Kex2 절단 부위 및 DVP를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 가질 수 있으며, 이는 Hind III 및 Not I 제한 부위를 사용하여 pKLAC1 벡터에 클로닝되어 DVP 발현 벡터를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 효모, 피키아 파스토리스가 DVP 발현 카세트로 형질전환될 수 있다. 피키아 파스토리스를 형질전환시키는 예시적인 방법은 하기와 같다: 효모 벡터를 사용하여 DVP 발현 카세트를 피키아 파스토리스로 형질전환시킬 수 있다. 벡터는 당업자에게 알려진 상업적 판매회사에서 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 통합 벡터일 수 있으며, 이종 전이유전자 발현을 증강시키기 위해 우라실 포스포리보실트랜스퍼라아제 프로모터(pUPP)를 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 상이한 선별 전략을 제공할 수 있으며; 예를 들어, 일부 구현예에서, 벡터 사이의 유일한 차이점은, 하나의 벡터는 숙주 효모에 G418 내성을 제공할 수 있지만, 다른 벡터는 제오신 내성을 제공할 수 있다는 점이다. 일부 구현예에서, 2가지 효모 발현 벡터에의 서브클로닝을 위해 DVP를 인코딩하는 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍을 디자인하고 합성할 수 있다. 혼성화 반응은 상응하는 상보적 올리고뉴클레오타이드를 30 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl(모두 최종 농도), pH 8 중에 최종 농도 20 μM로 혼합한 후, 95℃에서 20분 동안 인큐베이션하고, 이어서 92℃에서 시작하여 20분마다 3℃ 온도 강하로 17℃에서 종결되는 9시간 인큐베이션을 수행하는 방식으로 수행할 수 있다. 혼성화 반응으로 DVP를 인코딩하는 DNA 단편이 생성될 것이다. 2가지 피키아 파스토리스 벡터를 BsaI-HF 제한 효소로 소화시킨 후, 반응의 이중 가닥 DNA 산물을 표준 절차를 사용하여 선형화된 피키아 파스토리스 벡터에 서브클로닝할 수 있다. 서브클론의 서열을 확인한 후, 플라스미드 분취액을 전기천공에 의해 피키아 파스토리스 균주(예를 들어, Bg08)로 트랜스펙션시킬 수 있다. 벡터로 조작된 요소에 의해 부여된 내성(예를 들어, 이러한 예에서, 제오신 또는 G418에 대한 내성)에 기반하여 생성된 형질전환된 효모를 선별할 수 있다.
펩타이드 수율 스크리닝 및 평가
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질 수율은 Onyx monolithic 4.5 x 100 mm, C18 역상 분석용 HPLC 컬럼 및 자동 주입기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여 평가될 수 있다. Onyx 모놀리식 4.5 x 100 mm, C18 역상 분석용 HPLC 컬럼 및 자동 주입기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템의 예시적인 사용은 하기와 같다: 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 세포에서 여과된 조건화된 배지 샘플을 Onyx monolithic 4.5 x 100 mm, C18 역상 분석용 HPLC 컬럼 및 자동 주입기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여, HPLC 분석에 사용되는 2가지 이동상 용매를 구성하는 0.1% 트리플루오로아세트산 함유 HPLC 등급 물과 아세토니트릴을 분석하는 방식으로 분석하고; HPLC 크로마토그래프를 사용하여 DVP 또는 Dvp-살충 단백질 모두의 피크 면적을 분석한 후, 이를 사용하여 조건화된 배지 중 펩타이드 농도를 계산하고, 이를 정규화된 펩타이드 수율로서 상응하는 최종 세포 밀도(OD600 측정치로 결정됨)로 추가로 정규할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질로 형질전환된 양성 효모 콜로니는 집파리 주사 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다. DVP 또는 DVP-살충 단백질은 등쪽 흉부의 체벽을 통해 계량된 용량으로 주사될 때 집파리를 마비/사멸시킬 수 있다. DVP 또는 DVP-살충 단백질의 효능은, 각각, 주사된 집파리의 50% 녹다운 비율 또는 사멸률을 유발하는 펩타이드의 마비/치사량 중앙값(PD50/LD50)으로 정의될 수 있다. 순수한 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 통상적으로 집파리 주사 검정에 사용하여 표준 용량 반응 곡선을 생성하고, 이로부터 PD50/LD50 값을 결정할 수 있다. 순수한 DVP 또는 DVP-살충 단백질의 표준 용량 반응 곡선의 분석에서 얻은 PD50/LD50 값을 사용하면, 상응하는 조건화된 배지의 연속 희석으로 수행된 집파리 주사 검정을 사용하여 형질전환된 효모에 의해 생산된 DVP 또는 DVP-살충 단백질의 정량화를 달성할 수 있다.
예시적인 집파리 주사 생물검정은 하기와 같다: 집파리 주사 생물검정으로부터 전체 용량 반응 곡선을 생성하기 위해 조건화된 배지를 연속으로 희석한다. 주사 전, CO2를 이용하여 성체 집파리(무스카 도메스티카)를 고정시키고, 주사를 위해 12 mg 내지 18 mg 집파리를 선택한다. 1 cc 시린지 및 30게이지 니들이 장착된 마이크로어플리케이터(microapplicator)를 사용하여 연속 희석된 조건화된 배지 샘플의 용량(파리당 0.5 μL)을 등쪽 흉부의 체벽을 통해 집파리에 주사한다. 주사된 집파리를 습한 여과지가 있고 뚜껑에 호흡 구멍이 있는 폐쇄된 용기에 위치시키고, 주사 24시간 후에 녹다운 비율 또는 사멸률 점수로 검사한다. 정규화된 수율을 계산한다. 펩타이드 수율은 mg/L 단위로의 조건화된 배지 중 펩타이드 농도를 의미한다. 하지만, 펩타이드 수율이 항상 균주 생산 속도를 정확하게 비교하기에 충분한 것은 아니다. 개별 균주는 성장 속도가 상이할 수 있기 때문에, 배양물이 수거될 때, 상이한 배양물의 세포 밀도가 다를 수 있다. 세포 밀도가 높은 배양물은 균주의 펩타이드 생산 속도가 더 높은 또 다른 균주보다 생산 속도가 낮더라도 배지 중 펩타이드 농도가 더 높을 수 있다. 따라서, "정규화된 수율"이라는 용어는 펩타이드 수율을 상응하는 배양물 중 세포 밀도로 나눈 값으로, 이는 균주 간 펩타이드 생산 속도의 비교를 더 용이하게 한다. 세포 밀도는 600 nm에서의 흡광도로 표시되며, 이의 단위는 "A"(흡광도 단위)이다.
DVP 또는 DVP-살충 단백질로의 형질전환을 거친 효모 콜로니를 스크리닝하면 수백개의 잠재적인 콜로니로부터 고수율 효모 균주를 식별할 수 있다. 이러한 균주를 본원에 기재된 최적화된 발효 배지 및 발효 조건을 사용하여 생물반응기에서 발효시켜, DVP 또는 DVP-살충 단백질을 적어도 4 g/L 또는 적어도 3 g/L 또는 적어도 2 g/L의 수율로 달성할 수 있다. 더 높은 생산 속도(mg/L로 표시됨)는, 약 100 mg/L 내지 약 100,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 90,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 80,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 70,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 60,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 50,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 40,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 30,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 20,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 17,500 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 15,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 12,500 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 10,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 9,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 8,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 7,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 6,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 5,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 약 3,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 2,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 1,500 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 1,000 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 750 mg/L; 또는 약 100 mg/L 내지 500 mg/L; 또는 약 150 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 200 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 300 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 400 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 750 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 1,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 1,250 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 1,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 2,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 2,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 3,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 3,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 4,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 4,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 5,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 6,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 7,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 8,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 9,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 10,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 12,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 15,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 17,500 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 20,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 30,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 40,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 50,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 60,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 70,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 80,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 약 90,000 mg/L 내지 100,000 mg/L; 또는 상기 제공된 임의의 값의 임의의 범위, 또는 전환 전 펩타이드를 생산하는 데 사용된 바와 동일하거나 유사한 생산 방법을 사용하여 전환 전 펩타이드를 이용하여 달성될 수 있는 것보다 훨씬 더 큰 수율일 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 염
본원에 사용된 "약제학적으로 허용 가능한 염"과 "농업적으로 허용 가능한 염"이라는 용어는 동의어이다. 일부 구현예에서, 적용 가능한 경우, 본원에 기재된 DVP의 약제학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 용매화물, 결정 형태 및 개별 이성질체, 거울상이성질체, 호변이성질체, 부분입체이성질체 및 전구약물이 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적으로 허용 가능한 염은 모 화합물의 목적하는 약리학적 활성을 보유한다. 이러한 염에는 하기가 포함된다: 무기산을 이용하여 형성된 산 부가 염; 유기산을 이용하여 이용된 산 부가 염; 또는 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알루미늄 이온으로 대체되거나; 에탄올아민 등과 같은 유기 염기와 배위하는 경우 형성되는 염.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용 가능한 염에는 통상적인 독성 또는 비독성 염이 포함된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 통상적인 비독성 염에는 푸마레이트, 포스페이트, 시트레이트, 클로르히드레이트 등과 같은 것들이 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적으로 허용 가능한 염은 통상적인 화학적 방법을 통해 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 물 또는 유기 용매, 또는 이 둘의 혼합물 중에서 반응시키는 방식으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418]에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 중 하나일 수 있다: 히드로클로라이드; 소듐; 설페이트; 아세테이트; 포스페이트 또는 디포스페이트; 클로라이드; 포타슘; 말레에이트; 칼슘; 시트레이트; 메실레이트; 니트레이트; 타르타레이트; 알루미늄; 또는 글루코네이트.
일부 구현예에서, 염을 형성하는 데 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 산의 목록은 하기일 수 있다: 글리콜산; 히푸르산; 브롬화수소산; 염산; 이소부티르산; 락트산(DL); 락토비온산; 라우르산; 말레산; 말산(- L); 말론산; 만델산(DL); 메탄설폰산; 나프탈렌-1,5-디설폰산; 나프탈렌-2-설폰산; 니코틴산; 질산; 올레산; 옥살산; 팔미트산; 파모산; 인산; 프로피온산; 피로글루탐산(- L); 살리실산; 세바스산; 스테아르산; 석신산; 황산; 타르타르산(+ L); 티오시안산; 톨루엔설폰산(p); 운데실렌산; 1-히드록시-2-나프토산; 2,2-디클로로아세트산; 2-히드록시에탄설폰산; 2-옥소글루타르산; 4-아세트아미도벤조산; 4-아미노살리실산; 아세트산; 아디프산; 아스코르브산(L); 아스파르트산(L); 벤젠설폰산; 벤조산; 캄포르산(+); 캄포르-10-설폰산(+); 카프르산(데칸산); 카프로산(헥산산); 카프릴산(옥탄산); 탄산; 신남산; 시트르산;' 시클람산; 도데실황산; 에탄-1,2-디설폰산; 에탄설폰산; 포름산; 푸마르산; 갈락타르산; 겐티스산; 글루코헵톤산(D); 글루콘산(D); 글루쿠론산(D); 글루탐산; 글루타르산; 또는 글리세로인산.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 임의의 유기 또는 무기 부가 염일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 염은 유리산으로 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산은 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등일 수 있다. 유기산은 시트르산, 아세트산, 락트산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글루콘산, 석신산, 타르타르산, 갈락투론산, 엠본산(embonic acid), 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산, 말론산 등일 수 있다.
일부 구현예에서, 염은 알칼리 금속 염(소듐 염, 포타슘 염 등)과 알칼리 토금속 염(칼슘 염, 마그네슘 염 등)을 포함한다. 예를 들어, 산 부가 염은 아세테이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 바이카르보네이트/카르보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 히벤제이트, 히드로클로라이드/클로라이드, 히드로브로마이드/브로마이드, 히드로요오다이드/요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프탈레이트, 2-납실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/히드로겐 포스페이트/디히드로겐 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 아르기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올라민, 글리신, 리신, 마그네슘, 메글루민, 올라민, 포타슘, 소듐, 트로메타민, 아연 염 등을 포함할 수 있으며, 그 중에서, 히드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 포름산, 트리플루오로아세트산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 스테아르산, 석신산, 에틸석신산, 락토비온산, 글루콘산, 글루코헵톤산, 벤조산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 2-히드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 라우릴황산, 말산, 아스파르트산, 글루탐산, 아디프산, 시스테인, N-아세틸시스테인, 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산, 요오드화수소산, 니코틴산, 옥살산, 피크르산, 티오시안산, 운데칸산, 폴리아크릴레이트 또는 카르복시비닐 중합체와 같은 산을 이용한 염일 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 무기 또는 유기 염기로부터 제조될 수 있다. 무기 염기에서 유도된 염에는, 비제한적으로, 소듐, 포타슘, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 2가 철, 아연, 구리, 2가 망간, 알루미늄, 3가 철, 3가 망간 염 등이 포함된다. 바람직한 무기 염은 암모늄, 소듐, 포타슘, 칼슘 및 마그네슘 염이다. 유기 염기에서 유도된 염에는, 비제한적으로, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘 등을 포함하는, 1차, 2차 및 3차 아민, 자연 발생 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 및 고리형 아민의 염이 포함된다. 바람직한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 피페리딘, 트로메타민 및 콜린이다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 염을 나타낸다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 문헌[J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)]에 약제학적으로 허용 가능한 염을 상세하게 설명하였으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 염은 본 발명의 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 그 자리에서, 또는 별도로 유리 염기 관능기를 적합한 유기산과 반응시키는 방식으로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 비독성 산 부가 염의 예는, 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 석신산 또는 말론산과 같은 유기산을 이용하여, 또는 이온 교환과 같은 당업계에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약제학적으로 허용 가능한 염에는, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 요오드화수소, 2-히드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등이 포함된다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염에는 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등이 포함된다. 추가의 약제학적으로 허용 가능한 염에는, 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 할라이드, 히드록시드, 카르복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 반대이온을 사용하여 형성된 아민 양이온이 포함된다.
약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 예시적인 설명은 문헌[P. H. Stahl and C. G. Wermuth, (editors), Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, John Wiley & Sons, Aug 23, (2002)]에 제공되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
식물 또는 이의 부분으로의 DVP 혼입
본원에 기재된 바와 같은 DVP, 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 DVP를 포함하는 살충 단백질은, DVP 또는 DVP-살충 단백질, 및/또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 안정한 또는 일시적 발현을 위해 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자 및/또는 이의 식물 부분에 혼입될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질은 당업계에 알려진 재조합 기술을 사용하여 식물에 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질은 하나 이상의 DVP 단량체를 포함할 수 있는 살충 단백질의 형태일 수 있다.
유전자이식 식물, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자에 대해 본 섹션에 사용된 "DVP"라는 용어는 또한 DVP-살충 단백질을 포함하며, "DVP 폴리뉴클레오타이드"는 하나 이상의 DVP를 포함하는 살충 단백질을 발현 및/또는 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 그룹을 포함하기 위해 유사하게 사용된다.
DVP를 식물에 혼입시키는 목적은, 곤충에 의해 소비되는 식물 조직에서 발현되는 유전자이식 DVP의 곤충 소비를 통해 DVP 및/또는 DVP-살충 단백질을 해충에게 전달하는 것이다. 곤충이 이의 먹이를 통해(예를 들어, DVP로 형질전환된 유전자이식 식물을 섭식하는 곤충을 통해) DVP를 소비하면, 소비된 DVP는 성장을 저해하거나, 움직임을 방해하거나 또는 심지어 곤충을 사멸시키는 능력을 가질 수 있다. 따라서, DVP 폴리뉴클레오타이드 및/또는 DVP 폴리펩타이드를 발현하는 유전자이식 식물은, 비제한적으로, 표피(예를 들어, 엽육); 주피; 체관부; 목질부; 실질; 후각조직(collenchyma); 후막조직(sclerenchyma); 및 1차 및 2차 분열조직을 포함하는 다양한 식물 조직에서 상기 DVP 폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 프로모터를 함유하는 조절 영역에 작동 가능하게 연결되어, 식물의 엽육 조직에서 DVP의 발현을 유도할 수 있다.
DVP, 및/또는 DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 유전자이식 식물은 당업자에게 널리 알려진 다양한 방법 및 프로토콜 중 어느 하나에 의해 생성될 수 있으며; 이러한 본 발명의 방법은 뉴클레오타이드 작제물을 사용되는 식물에 도입하는 특정 방법을 필요로 하지 않고, 단지 뉴클레오타이드 작제물이 식물의 적어도 하나의 세포의 내부에 접근할 수 있다는 것만을 필요로 한다. 뉴클레오타이드 작제물을 식물에 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이에는, 비제한적으로, 안정한 형질전환 방법, 일시적 형질전환 방법 및 바이러스 매개 방법이 포함된다. "유전자이식 식물" 또는 "형질전환된 식물" 또는 "안정적으로 형질전환된" 식물 또는 세포 또는 조직은, 식물 세포 내에 혼입 또는 통합된 외인성 핵산 서열 또는 DNA 단편을 갖는 식물을 나타낸다. 이러한 핵산 서열에는, 외인성이거나 형질전환되지 않은 식물 세포에 존재하지 않는 것들뿐 아니라, 내인성이거나 형질전환되지 않은 식물 세포에 존재할 수 있는 것들도 포함된다. "이종"은 일반적으로 이들이 존재하고, 감염, 트랜스펙션, 미세주사, 전기천공, 미세투영 등에 의해 세포에 첨가된 세포 또는 천연 게놈의 일부에 내인성이 아닌 핵산 서열을 나타낸다.
식물 세포의 형질전환은 당업계에 알려진 몇 가지 기술 중 하나에 따라 수행될 수 있다. 전형적으로, 관심 외인성 또는 이종 펩타이드 또는 폴리펩타이드(예를 들어, DVP)를 발현하는 작제물은, 유전자의 전사를 유도하는 프로모터뿐 아니라, 전사 종결 및 폴리아데닐화를 가능하게 하는 3' 미번역 영역을 함유할 수 있다. 이러한 작제물의 디자인 및 구조화는 당업계에 널리 알려져 있다. 일부 구현예에서, 유전자는, 생성된 펩타이드가 분비되거나, 달리 식물 세포 내에서 특정 영역 및/또는 세포소기관으로 표적화되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 유전자는 펩타이드를 소포체로 전달하는 것을 용이하게 하는 신호 펩타이드를 함유하도록 조작될 수 있다. 또한, 인트론의 mRNA 처리가 발현에 필요하기 때문에, 인트론을 함유하도록 식물 발현 카세트를 조작하는 것이 바람직할 수 있다.
전형적으로, 식물 발현 카세트는 식물 형질전환 벡터에 삽입될 수 있다. 이러한 식물 형질전환 벡터는 식물 형질전환을 달성하는 데 필요한 하나 이상의 DNA 벡터로 구성될 수 있다. 예를 들어, 하나 초과의 인접한 DNA 분절로 구성된 식물 형질전환 벡터를 이용하는 것이 당업계에서 통상적인 관행이다. 이러한 벡터는 당업계에서 종종 "이원 벡터"로 지칭된다. 이원 벡터뿐 아니라 헬퍼 플라스미드를 갖는 벡터가 아그로박테리움 매개 형질전환에 가장 흔히 사용되며, 여기서 효율적인 형질전환을 달성하는 데 필요한 DNA 분절의 크기 및 복잡성은 상당히 크기 때문에, 기능을 별도의 DNA 분자로 분리하는 것이 유리하다. 이원 벡터는 전형적으로 T-DNA 전달에 필요한 시스-작용 서열(예컨대, 좌측 경계와 우측 경계), 식물 세포에서 발현을 가능하게 하도록 조작된 선별 마커, 및 "관심 유전자"(유전자이식 식물의 생성이 요구되는 식물 세포에서 발현을 가능하게 하도록 조작된 유전자)를 함유하는 플라스미드 벡터를 함유한다. 이러한 플라스미드 벡터에는 박테리아 복제에 필요한 서열이 또한 존재한다. 시스-작용 서열은 식물 세포로의 효율적인 전달 및 식물 세포에서의 발현을 가능하게 하는 방식으로 배열된다. 예를 들어, 선별 마커 유전자와 DVP는 좌측 경계와 우측 경계 사이에 위치한다. 종종, 제2 플라스미드 벡터는 아그로박테리움에서 식물 세포로의 T-DNA 전달을 매개하는 트랜스-작용 인자를 함유한다. 이러한 플라스미드는 종종, 당업계에서 이해되는 바와 같이(문헌[Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451]), 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염, 및 경계 서열에서의 절단 및 바이러스 매개 DNA 전달에 의한 DNA의 전달을 가능하게 하는 독성 기능(Vir 유전자)을 함유한다. 몇 가지 유형의 아그로박테리움 균주(예를 들어, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 등)가 식물 형질전환에 사용될 수 있다. 제2 플라스미드 벡터는 미세투영, 미세주사, 전기천공, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 다른 방법을 통해 식물을 형질전환시키는 데 필요하지 않다.
일반적으로, 식물 형질전환 방법은 이종 DNA를 표적 식물 세포(예를 들어, 미성숙 또는 성숙 배아, 현탁 배양물, 미분화된 캘러스, 원형질체 등)로 전달한 후, 형질전환되지 않은 세포 덩어리의 그룹으로부터 형질전환된 식물 세포를 회수하기 위해 (선별 마커 유전자에 따라) 적절한 선별의 최대 역치 수준을 적용하는 것을 포함한다. 외식편은 전형적으로 동일한 배지의 새로운 공급 장치로 옮겨져, 일상적으로 배양된다. 후속으로, 형질전환된 세포는 최대 역치 수준으로 선별제가 보충된 재생 배지에 배치된 후 싹(shoot)으로 분화된다. 이어서, 싹은 발근된 싹 또는 묘목을 회수하기 위해 선택적 발근 배지로 옮겨진다. 이어서, 유전자이식 묘목은 성숙 식물로 성장하고, 번식력이 있는 종자를 생성한다(예를 들어, 문헌[Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282]; 문헌[Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750]). 외식편은 전형적으로 동일한 배지의 새로운 공급 장치로 옮겨져, 일상적으로 배양된다. 유전자이식 식물을 생성하는 기술 및 방법에 대한 일반적인 설명은 문헌[Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239] 및 문헌[Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120]에서 확인할 수 있다. 형질전환된 물질은 다수의 세포를 함유하기 때문에, 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포는 모두 적용된 표적 캘러스 또는 조직 또는 세포 그룹의 임의의 조각에 존재한다. 형질전환되지 않은 세포를 사멸시키고 형질전환된 세포가 증식하도록 하는 능력은 형질전환된 식물 배양물을 생성한다. 종종, 형질전환되지 않은 세포를 제거하는 능력은 형질전환된 식물 세포의 신속한 회수 및 유전자이식 식물의 성공적인 생성에 한계가 있다.
형질전환 프로토콜뿐 아니라 뉴클레오타이드 서열을 식물에 도입하는 프로토콜은, 형질전환을 위해 표적화된 식물 또는 식물 세포의 유형, 즉, 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물에 따라 달라질 수 있다. 유전자이식 식물의 생성은, 비제한적으로, 미세주사, 전기천공, 직접 유전자 전달, 아그로박테리움에 의한 이종 DNA의 식물 세포로의 도입(아그로박테리아 매개 형질전환), 입자에 부착된 이종 외래 DNA가 있는 식물 세포의 공격, 탄도 입자 가속, 에어로졸 빔 형질전환, Lec1 형질전환, 및 DNA를 전달하는 다양한 다른 비입자 직접 매개 방법을 포함하는 몇 가지 방법 중 하나를 통해 수행될 수 있다. 예시적인 형질전환 프로토콜은 미국 출원 공개 제20010026941호; 미국 특허 제4,945,050호; 국제 공개 WO 91/00915; 및 미국 출원 공개 제2002015066호에 개시되어 있으며, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
엽록체가 또한 용이하게 형질전환될 수 있으며, 엽록체의 형질전환에 대한 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530]; 문헌[Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917]; 문헌[Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606] 참조(상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 엽록체 형질전환 방법은 선별 마커를 함유하는 DNA의 입자 총(gun) 전달, 및 상동 재조합을 통한 색소체(plastid) 게놈으로의 DNA의 표적화에 따라 달라진다. 또한, 색소체 형질전환은 핵 인코딩되고 색소체를 지향하는 RNA 폴리머라아제의 조직 선호 발현에 의한 침묵 색소체 매개 전이유전자의 전사활성화에 의해 달성될 수 있다. 이러한 시스템은 문헌[McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305]에 보고되어 있다.
이종 외래 DNA를 식물 세포에 통합시킨 후, 당업자는 형질전환되지 않은 세포를 사멸시키기 위해 배지에 적절한 선별 화학물질/시약(예를 들어, 항생제)의 최대 역치 수준을 적용하고, 상기 생존 세포를 정기적으로 새로운 배지로 이동시키는 방식으로 이러한 선별 처리로부터 생존하는 추정적으로 형질전환된 세포를 분리하고 성장시킬 수 있다. 적절한 선별을 이용한 연속 계대 및 접종을 통해, 당업자는 플라스미드 벡터로 형질전환된 세포를 식별하고 증식시킨다. 분자적 및 생화학적 방법을 사용하여 유전자이식 식물의 게놈에 통합된 관심 이종 유전자의 존재를 확인할 수 있다.
형질전환된 세포는 당업자에게 알려진 통상의 방법에 따라 식물로 성장할 수 있다. 예를 들어, 문헌[McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84] 참조(상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 이어서, 이러한 식물은 성장하고, 동일한 형질전환된 균주 또는 상이한 균주로 수분되어, 식별된 목적하는 표현형 특징의 구성적 발현을 갖는 혼성체를 생성할 수 있다. 목적하는 표현형 특징의 발현이 안정적으로 유지되고 유전되도록 2대 이상을 성장시킬 수 있으며, 목적하는 표현형 특징의 발현이 달성되도록 종자를 수확할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 개시내용은 게놈에 안정적으로 통합된 본 발명의 뉴클레오타이드 작제물, 예를 들어 본 발명의 발현 카세트를 갖는 형질전환된 종자("유전자이식 종자"로도 지칭됨)를 제공한다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 곤충 프로테이나아제, 프로테아제 및 펩티다아제(본원에서 집합적으로 "프로테아제"로 지칭됨)에 대한 기질로 작용하는 DVP-살충 단백질을 제공한다.
일부 구현예에서, DVP의 발현을 수용할 수 있는 유전자이식 식물 또는 이의 부분은 하기를 포함할 수 있다: 알팔파, 바나나, 보리, 콩, 브로콜리, 양배추, 카놀라, 당근, 카사바, 피마자, 콜리플라워, 셀러리, 병아리콩, 배추, 감귤류, 코코넛, 커피, 옥수수, 클로버, 목화, 쑥, 오이, 더글라스 전나무(Douglas fir), 가지, 유칼립투스, 아마, 마늘, 포도, 홉, 리크, 양상추, 로블롤리 소나무(Loblolly pine), 수수, 멜론, 너트, 귀리, 올리브, 양파, 관상용 풀, 야자, 목초, 완두콩, 땅콩, 고추, 비둘기콩, 소나무, 감자, 포플러, 호박, 라디아타 소나무(Radiata pine), 무, 유채, 쌀, 대목, 호밀, 홍화, 관목, 수수, 남송, 대두, 시금치, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 사탕옥수수, 스위트검, 고구마, 스위치그래스, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디, 수박 및 밀 식물.
일부 구현예에서, 유전자이식 식물은 본원에 기재된 DNA 작제물로 초기에 형질전환된 세포로부터 성장할 수 있다. 다른 구현예에서, 유전자이식 식물은 특정 조직 또는 식물 부분, 예를 들어 잎, 줄기, 꽃, 꽃받침, 과실, 뿌리, 종자, 또는 이들의 조합에서 인코딩된 DVP를 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 식물, 식물 조직, 식물 세포 또는 식물 종자는 DVP로 형질전환될 수 있으며, 여기서 DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 임의의 DVP(예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 DVP)의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 식물, 식물 조직, 식물 세포 또는 식물 종자는 서열번호 187 내지 191 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환될 수 있다.
일부 구현예에서, 식물, 식물 조직, 식물 세포 또는 식물 종자는 DVP로 형질전환될 수 있으며, 여기서 DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 2개 이상의 DVP 폴리펩타이드의 동종중합체 또는 이종중합체이고, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이하다.
식물로의 뉴클레오타이드 혼입, 이로부터 발현된 단백질
유전자이식 식물에서 이종 폴리펩타이드 발현에 대한 도전은 숙주 유기체에서 발현 시 도입된 폴리펩타이드가 목적하는 효과(예를 들어, 살충 활성)를 유지하는 것이며; 이러한 효과를 유지하는 한 가지 방법은 작동 가능하게 연결된 소포체 신호 펩타이드(ERSP)의 사용을 통해 적절한 단백질 폴딩의 가능성을 증가시키는 것이다. 유전자이식 단백질의 효과를 유지하는 또 다른 방법은 번역 안정화 단백질(STA)을 혼입시키는 것이다.
식물은 상기 기재된 트랜스펙션 방법 중 임의의 것을 사용하여, 하나 이상의 DVP를 포함하는 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 인코딩하는 DNA 서열로 일시적으로 또는 안정적으로 트랜스펙션될 수 있다. 대안적으로, 식물은 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 트랜스펙션될 수 있으며, 여기서 상기 DVP는 소포체 신호 펩타이드(ERSP); 링커, 번역 안정화 단백질(STA) 또는 이들의 조합을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유전자이식 식물 또는 식물 게놈은 소포체 신호 펩타이드(ERSP); DVP; 및/또는 개재 링커 펩타이드(LINKER, L)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환되어, 이종 DNA로부터 전사된 mRNA가 형질전환된 식물에서 발현되게 하고, 후속으로 상기 mRNA가 펩타이드로 번역되게 할 수 있다.
소포체 신호 펩타이드(ERSP)
ER에 대한 재조합 단백질의 세포하 표적화는 상기 재조합 단백질에 작동 가능하게 연결된 ERSP의 사용을 통해 달성될 수 있으며; 이는 이러한 단백질의 정확한 조립 및/또는 폴딩을 가능하게 하고, 식물에 이러한 재조합 단백질이 높은 수준으로 축적되게 한다. 세포내 저장으로의 숙주 단백질의 구획화에 관한 예시적인 방법은 문헌[McCormick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(2):703-708, 1999]; 문헌[Staub et al., Nature Biotechnology 18:333-338, 2000]; 문헌[Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109, 1998]; 및 문헌[Stoger et al., Plant Mol. Biol. 42:583-590, 2000]에 개시되어 있으며, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 따라서, 재조합 단백질의 정확한 조립 및/또는 폴딩을 달성하기 위한 하나의 방법은, 소포체 신호 펩타이드(ERSP)를 관심 재조합 단백질에 작동 가능하게 연결하는 것이다.
일부 구현예에서, 소포체 신호 펩타이드(ERSP)를 포함하는 펩타이드는 DVP에 작동 가능하게 연결될 수 있으며(ERSP-DVP로 지정됨), 여기서 상기 ERSP는 상기 펩타이드의 N-말단이다. 일부 구현예에서, ERSP 펩타이드의 길이는 3개 내지 60개 아미노산, 5개 내지 50개 아미노산, 20개 내지 30개 아미노산이다.
일부 구현예에서, DVP ORF는 이의 5'-말단에서 ersp로 시작한다. DVP가 유전자이식 식물에서 발현될 때 적절하게 폴딩되고 기능성이 되도록 하기 위해, 이는 프레임 내에서 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 융합된 ersp 뉴클레오타이드를 가져야 한다. 세포 번역 과정 동안, 번역된 ERSP는 신호 인식 입자로 불리는 세포 구성요소와의 결합을 통해 번역되는 DVP가 식물 세포의 소포체(ER)에 삽입되도록 지시할 수 있다. ER 내에서, ERSP 펩타이드는 신호 펩티다아제에 의해 절단되고, DVP는 ER로 방출되며, 여기서 DVP는 번역 후 변형 과정, 예를 들어 디설파이드 결합 형성 동안 적절하게 폴딩된다. 임의의 추가적인 머무름 단백질 신호 없이, 단백질은 ER을 통해 골지체로 수송되며, 여기서 이는 최종적으로 원형질막 외부와 아포플라스틱(apoplastic) 공간 내로 분비된다. DVP는 식물에서 살충 용량에 도달하기 위해 아포플라스틱 공간에 효율적으로 축적될 수 있다.
ERSP 펩타이드는 식물 번역된 DVP 복합체의 N-말단 영역에 있으며, ERSP 부분은 약 3개 내지 60개 아미노산으로 구성된다. 일부 구현예에서, 이는 5개 내지 50개 아미노산이다. 일부 구현예에서, 이는 10개 내지 40개 아미노산이지만, 가장 흔히 15개 내지 20개; 20개 내지 25개; 또는 25개 내지 30개 아미노산으로 구성된다. ERSP는 단백질의 수송을 지시하기 때문에 신호 펩타이드로 불린다. 신호 펩타이드는 표적화 신호, 신호 서열, 수송 펩타이드 또는 국소화 신호로도 불릴 수 있다. ER 트래피킹을 위한 신호 펩타이드의 길이는 종종 15개 내지 30개 아미노산 잔기이며, 양으로 하전된 아미노 말단과, 극성이지만 하전되지 않은 카르복시 말단 영역으로 플랭킹된 소수성 잔기의 코어로 구성된 3부(tripartite) 구조를 갖는다. (문헌[Zimmermann, et al, "Protein translocation across the ER membrane," Biochimica et Biohysica Acta, 2011, 1808: 912-924]).
다수의 ERSP가 알려져 있다. ERSP가 식물 ERSP에서 유도될 필요는 없으며, 비식물 ERSP도 본원에 기재된 절차를 이용하여 작동될 수 있다. 하지만, 다수의 식물 ERSP가 널리 알려져 있으며, 본 발명자들은 본원에서 일부 식물 유래 ERSP를 설명한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ERSP는 보리 알파-아밀라아제 신호 펩타이드(BAAS)일 수 있으며, 이는 호르데움 불가레(Hordeum vulgare)라는 식물에서 유도된 것으로, 하기 아미노산 서열을 갖는다: "MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG"(서열번호 60).
식물의 아포플라스틱 공간으로 발현되고 방출되는 것으로 알려진 단백질의 게놈 서열에서 선택되는 식물 ERSP는, BAAS, 당근 엑스텐신 및 담배 PR1과 같은 예를 포함한다. 하기 참고문헌은 추가의 설명을 제공하며, 이러한 참고문헌들은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다: 문헌[De Loose, M. et al. "The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts" Gene, 99 (1991) 95-100](De Loose, M. 등은 단백질의 소포체로의 전위를 위한 전형적인 신호 펩타이드를 함유하는 서열인, 니코티아나 플룸바기니폴리아(Nicotiana plumbaginifolia)로부터의 확장 인코딩 유전자의 구조분석을 설명하였음); 문헌[Chen, M.H. et al. "Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular compartments of plant cells" Plant Physiology, 2004 Jul; 135(3): 1367-77. Epub 2004 Jul 2](Chen, M.H. 등은 유전자이식 담배에서 신호 펩타이드 존재 유무 하의 α-아밀라아제의 발현을 분석하는 방식으로 식물 세포에서 α-아밀라아제의 세포하 국소화를 연구하였음). 이러한 참고문헌 등은 본원에 기재된 방법, 절차, 및 펩타이드, 단백질 및 뉴클레오타이드 복합체 및 작제물에 사용될 수 있는 신호 펩타이드를 교시하고 개시한다.
일부 구현예에서, ERSP는, 비제한적으로, 하기 중 하나를 포함할 수 있다: BAAS; 담배 엑스텐신 신호 펩타이드; 변형된 담배 엑스텐신 신호 펩타이드; 또는 주니페루스 아쉐이의 Jun a 3 신호 펩타이드. 예를 들어, 일부 구현예에서, 식물은 소포체 신호 펩타이드(ERSP) 및 DVP로 본원에 기재된 펩타이드 중 임의의 것을 인코딩하는 뉴클레오타이드로 형질전환될 수 있다.
담배 엑스텐신 신호 펩타이드 모티프는 ERSP의 또 다른 예시적인 유형이다. 문헌[Memelink et al, the Plant Journal, 1993, V4: 1011-1022]; 문헌[Pogue GP et al, Plant Biotechnology Journal, 2010, V8: 638-654] 참조(상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
일부 구현예에서, DVP ORF는 담배 엑스텐신 신호 펩타이드 모티프를 인코딩하도록 작동 가능한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 하나의 구현예에서, DVP ORF는 서열번호 61에 따른 엑스텐신 모티프를 인코딩할 수 있다. 또 다른 구현예에서, DVP ORF는 서열번호 62에 따른 엑스텐신 모티프를 인코딩할 수 있다.
엑스텐신 신호 모티프가 있는 구현예를 생성하는 방법에 대한 예시적인 예는 하기와 같다: 4개의 합성 DNA 프라이머가 있는 올리고 연장 PCR을 사용하여 엑스텐신 모티프를 인코딩하는 DNA 서열(예를 들어, 서열번호 63 또는 서열번호 64에 제시된 DNA 서열)을 디자인하고; 주형으로 작용하는 엑스텐신 DNA 서열과 함께 PCR을 사용하여 말단 부위, 예를 들어 5'-말단에 있는 Pac I 제한 부위 및 3'-말단에 있는 GFP 서열 5'-말단과 같은 제한 부위를 추가하여 단편을 생성할 수 있으며; 단편을 정방향 PCR 프라이머로 사용하여 DVP ORF를 인코딩하는 DNA 서열, 예를 들어 pFECT 벡터에 함유된 "gfp-l-dvp"를 증폭시켜, (N' 말단에서 C' 말단으로) "ERSP-GFP-L-DVP"(여기서 ERSP는 엑스텐신임)를 인코딩하는 DVP ORF를 생성한다. 이어서, 생성된 DNA 서열을 FECT 벡터의 Pac I 및 Avr II 제한 부위에 클로닝하여, GFP 융합된 DVP의 일시적 식물 발현을 위한 pFECT-DVP 벡터를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 예시적인 발현 시스템은, DVP ORF를 함유하는 FECT 발현 벡터가 아그로박테리움, GV3101로 형질전환되고, 형질전환된 GV3101이 DVP ORF의 일시적 발현을 위해 담배잎에 주입되는 것을 포함할 수 있다.
번역 안정화 단백질(STA)
번역 안정화 단백질(STA)은 식물 조직에서 DVP의 양을 증가시킬 수 있다. DVP ORF 중 하나인 ERSP-DVP는 트랜스펙션된 식물에서 적절하게 폴딩된 DVP를 발현하는 데 충분하지만, 일부 구현예에서, 해충 손상으로부터 식물의 효과적인 보호를 위해서는 식물 발현된 DVP가 축적되어야 할 수 있다. 적절하게 작제된 DVP ORF의 트랜스펙션을 이용하여, 유전자이식 식물은 더 많은 양의 정확하게 폴딩된 DVP를 발현하고 축적할 수 있다. 식물이 더 많은 양의 적절하게 폴딩된 DVP를 축적하는 경우, 식물을 공격하고 먹는 해충을 보다 용이하게 대항, 저해 및/또는 사멸시킬 수 있다. 유전자이식 조직에 폴리펩타이드의 축적을 증가시키는 하나의 방법은 번역 안정화 단백질(STA)을 사용하는 것이다. 번역 안정화 단백질은 식물 조직에 DVP의 축적을 유의하게 증가시키는 데 사용될 수 있기 때문에, 해충 저항성과 관련하여 DVP로 트랜스펙션된 식물의 효능을 증가시킬 수 있다. 번역 안정화 단백질은 단백질 분해의 세포 과정에 의해 표적화되지 않고 세포에 축적될 수 있는 충분한 3차 구조를 갖는 단백질이다.
일부 구현예에서, 번역 안정화 단백질은 또 다른 단백질의 도메인일 수 있거나, 전체 단백질 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 번역 안정화 단백질은 5개 내지 50개 아미노산, 50개 내지 250개 아미노산(예를 들어, GNA), 250개 내지 750개 아미노산(예를 들어, 키티나아제) 및 750개 내지 1500개 아미노산(예를 들어, 인한신(enhancin))일 수 있다.
번역 안정화 단백질의 하나의 구현예는 적어도 하나의 DVP를 포함하는 융합 단백질의 중합체일 수 있다. 번역 안정화 단백질의 사용을 예시하기 위해 번역 안정화 단백질의 특정예가 본원에 제공된다. 이러한 예는 어떠한 방식으로든 본 개시내용 또는 청구범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 유용한 번역 안정화 단백질은 당업계에 널리 알려져 있으며, 이러한 유형의 임의의 단백질이 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 펩타이드의 생산을 평가하고 시험하는 절차는 모두 당업계에 알려져 있고 본원에 기재되어 있다. 하나의 번역 안정화 단백질의 하나의 예는 녹색 형광 단백질(GFP)(서열번호 57; NCBI 수탁번호 P42212.1)이다.
일부 구현예에서, 소포체 신호 펩타이드(ERSP)를 포함하는 단백질은 DVP에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 이는 차례로 번역 안정화 단백질(STA)에 작동 가능하게 연결된다. 본원에서, 이러한 구성은 ERSP-STA-DVP 또는 ERSP-DVP-STA로 지정되며, 여기서 상기 ERSP는 상기 단백질의 N-말단이고, 상기 STA는 DVP의 N-말단 측(업스트림) 또는 DVP의 C-말단 측(다운스트림)에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ERSP 또는 DVP 중 임의의 것을 포함하는 ERSP-STA-DVP 또는 ERSP-DVP-STA로 지정된 단백질은, STA, 예를 들어 GFP(녹색 형광 단백질; 서열번호 57; NCBI 수탁번호 P42212) 또는 Jun a 3(주니페루스 아쉐이; 서열번호 59; NCBI 수탁번호 P81295.1)를 포함하여 본 문헌에서 설명되거나 교시된 번역 안정화 단백질 중 임의의 것에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
번역 안정화 단백질의 추가 예는 하기 참고문헌에서 확인할 수 있으며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다: 문헌[Kramer, K.J. et al. "Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta" Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 23, Issue 6, September 1993, pp. 691-701](Kramer, K.J. 등은 담배 박각시벌레, 만두카 섹스타(Manduca sexta)로부터 키티나아제 인코딩 cDNA를 단리하고 시퀀싱하였음); 문헌[Hashimoto, Y. et al. "Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virus" Journal of General Virology, (1991), 72, 2645-2651]. 이러한 참고문헌 등은 본원에 기재된 방법, 절차, 및 펩타이드, 단백질 및 뉴클레오타이드 복합체 및 작제물에 사용될 수 있는 번역 안정화 단백질을 교시하고 개시한다.
일부 구현예에서, DVP ORF는 STA를 함유하는 DVP ORF를 사용하여 식물, 예를 들어 담배 식물, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)로 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, STA는 Jun a 3일 수 있다. 성숙 Jun a 3은 일부 사람들에게는 알레르겐이기도 한 약 30 kDa의 식물 방어 단백질이다. Jun a 3은 주니페루스 아쉐이 나무에서 생산되며, 일부 구현예에서, 번역 안정화 단백질(STA)로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, Jun a 3 아미노산 서열은 서열번호 65에 제시된 서열일 수 있다. 다른 구현예에서, Jun a 3 아미노산 서열은 서열번호 59에 제시된 서열일 수 있다.
링커
링커 단백질은 DVP ORF를 포함하는 상이한 모티프의 적절한 폴딩을 돕는다. 본 발명에 기재된 DVP ORF는 또한 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(dvp)과 번역 안정화 단백질(sta) 사이, 또는 발현 ORF가 다수의 DVP 도메인 발현을 포함하는 경우, DVP를 인코딩하는 다수의 폴리뉴클레오타이드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 즉, (l-dvp) N 또는 (dvp-l) N 사이의 개재 링커 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 개재 링커 펩타이드(LINKER 또는 L)는 발현된 DVP 작제물의 상이한 부분들을 분리하고, 발현 과정 동안 복합체의 상이한 부분의 적절한 접힘을 돕는다. 발현된 DVP 작제물에서, 상이한 기능성 도메인을 분리하기 위해 상이한 개재 링커 펩타이드가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, LINKER는 DVP에 부착되며, 이러한 2가 기는 보호하고자 하는 식물에 적절하게 폴딩된 DVP의 축적을 용이하게 하기 위해 최대 10회(N=1 내지 10) 및 가능하게는 심지어 10회 초과(예를 들어, N = 200)로 반복될 수 있다.
일부 구현예에서, 개재 링커 펩타이드의 길이는 1개 내지 30개 아미노산일 수 있다. 하지만, 이는 식물에서 발현된 DVP의 필수 구성요소는 아니다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 절단 가능한 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 DVP를 포함한다. 다른 구현예에서, DVP-살충 단백질은 절단 가능하지 않은 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 DVP를 포함한다.
절단 가능한 링커 펩타이드는 형질전환된 식물에서 발현된 DVP 복합체로부터 적절하게 DVP를 방출시키도록 DVP ORF에 대해 디자인되어, 해충 손상과 관련하여 DVP가 식물에 제공하는 보호를 개선시킬 수 있다. 개재 링커 펩타이드의 하나의 유형은 식물 절단 가능한 링커 펩타이드이다. 이러한 유형의 링커 펩타이드는 식물 번역 후 변형 동안 발현된 DVP ORF 복합체로부터 완전히 제거될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이러한 유형의 개재 링커 펩타이드에 의해 연결된 적절하게 접힌 DVP는 식물에서 번역 후 변형 동안 발현된 DVP ORF 복합체로부터 식물 세포에 방출될 수 있다.
또 다른 유형의 절단 가능한 개재 링커 펩타이드는 식물에서 발현 과정 동안 절단 가능하지 않다. 하지만, 이는 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파르테이트 프로테아제 또는 메탈로프로테아제에 특이적인 프로테아제 절단 부위를 갖는다. 절단 가능한 링커 펩타이드의 유형은 곤충 및 인시목 내장 환경 및/또는 곤충 혈림프 및 인시목 혈림프 환경에서 발견되는 프로테아제에 의해 소화되어, 곤충 내장 또는 혈림프에 DVP를 방출할 수 있다. 본 개시내용에 교시된 정보를 사용하여 본 발명에서 유용한 LINKER의 다른 예를 만들거나 찾는 것은 당업자에게 일상적인 것이어야 한다.
일부 구현예에서, DVP ORF는 절단 가능한 유형의 개재 링커, 예를 들어 "IGER"(서열번호 54)의 아미노산 코드를 갖는 서열번호 54에 열거된 유형을 함유할 수 있다. 개재 링커 또는 LINKER의 분자량은 473.53 달톤이다. 다른 구현예에서, 개재 링커 펩타이드(LINKER)는 또한 임의의 유형의 프로테아제 절단 부위가 없는 것, 즉, 절단 불가능한 개재 링커 펩타이드, 예를 들어 링커 "ETMFKHGL"(서열번호 56)일 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 둘 이상의 절단 가능한 펩타이드를 가질 수 있으며, 여기서 살충 단백질은 곤충 절단 가능한 링커(L)를 포함하고, 곤충 절단 가능한 링커는 프레임 내에서 (DVP-L)n(여기서, "n"은 1 내지 200, 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 10 범위의 정수임)을 포함하는 작제물과 융합된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 DVP-살충 단백질은 곤충 절단 가능한 링커(L)와 작동 가능하게 연결된 DVP, 및/또는 반복 작제물 (L-DVP)n 또는 (DVP-L)n(여기서, "n"은 1 내지 200, 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 10 범위의 정수임)과 작동 가능하게 연결된 소포체 신호 펩타이드(ERSP)를 포함한다.
일부 구현예에서, 소포체 신호 펩타이드(ERSP)를 포함하는 단백질은 DVP 및 개재 링커 펩타이드(L 또는 링커)에 작동 가능하게 연결될 수 있으며; 이러한 작제물은 ERSP-L-DVP 또는 ERSP-DVP-L로 지정되고, 여기서 상기 ERSP는 상기 단백질의 N-말단이고, 상기 L 또는 링커는 DVP의 N-말단 측(업스트림) 또는 DVP의 C-말단 측(다운스트림)에 있을 수 있다. 본원에 기재된 ERSP 또는 DVP 중 임의의 것을 포함하는 ERSP-L-DVP 또는 ERSP-DVP-L로 지정된 단백질은, 절단 불가능한 링커 펩타이드, 또는 단백질 발현 과정 동안 식물 세포에서 절단 가능할 수 있거나 곤충 내장 환경 및/또는 혈림프 환경에서 절단 가능할 수 있는 절단 가능한 링커 펩타이드일 수 있는 링커 "L"을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은, 비제한적으로, 하기 서열을 포함하는, 본원에 기재된 또는 본 문헌에 교시된 개재 링커 펩타이드(LINKER 또는 L) 중 임의의 것을 포함할 수 있다: IGER(서열번호 54), EEKKN(서열번호 55) 및 ETMFKHGL(서열번호 56), 또는 이들의 조합.
다양한 구현예에서, 예시적인 살충 단백질은 하기를 포함하는 단백질 작제물을 포함할 수 있다: (ERSP)-(DVP-L)n; (ERSP)-(L)-(DVP-L)n; (ERSP)-(L-DVP)n; (ERSP)-(L-DVP)n-(L)(여기서, n은 1 내지 200, 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 10 범위의 정수임). 상기 기재된 다양한 관련 구현예에서, DVP는 상기 언급된 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리펩타이드이고, L은 절단 가능하지 않은 또는 절단 가능한 펩타이드이고, n은 1 내지 200 범위의 정수, 바람직하게는 1 내지 100 범위의 정수, 및 더욱 바람직하게는 1 내지 10 범위의 정수이다. 일부 구현예에서, DVP-살충 단백질은 동일하거나 상이한 DVP 펩타이드와 동일하거나 상이한 곤충 절단 가능한 펩타이드를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, C-말단 DVP는 이의 C-말단에서 곤충 내장 환경에서 절단되도록 작동 가능한 절단 가능한 펩타이드와 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, N-말단 DVP는 이의 N-말단에서 곤충 내장 환경에서 절단되도록 작동 가능한 절단 가능한 펩타이드와 작동 가능하게 연결된다.
곤충 내장 환경에서 발견되는 이용 가능한 프로테아제 및 펩티다아제 중 일부는 곤충의 생애 단계에 따라 달라지는데, 이러한 효소가 종종 공간적으로 및 시간적으로 발현되기 때문이다. 곤충의 소화 시스템은 소화관과 관련 샘으로 구성된다. 음식물이 입으로 들어가고, 소화 프로테아제 및 펩티다아제를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 분비물과 혼합된다. 전장과 후장은 기원이 외배엽이다. 전장은 일반적으로 날 음식물의 저장 창고 역할을 한다. 전장에서부터, 음식물의 별개의 덩어리는 중장(중간창자 또는 위)으로 이동한다. 중장은 음식물 영양소의 소화 및 흡수 장소이다. 일반적으로, 중장에서 특정 프로테아제 및 펩티다아제의 존재는 내장의 pH를 따른다. 인간 위장계의 특정 프로테아제 및 펩티다아제에는, 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 카르복시펩티다아제, 아미노펩티다아제 및 디펩티다아제가 포함된다.
곤충 내장 환경은 초식동물 종의 소화계에서 소화 동안 펩타이드와 단백질이 분해되는 영역을 포함한다. 곤충 내장 환경에서 발견되는 이용 가능한 프로테아제 및 펩티다아제 중 일부는 하기를 포함할 수 있다: (1) 세린 프로테아제; (2) 시스테인 프로테아제; (3) 아스파르트산 프로테아제, 및 (4) 메탈로프로테아제.
초식성 곤충의 소화 시스템에서 2가지 우세한 프로테아제 부류는 세린 프로테아제와 시스테인 프로테아제이다. Murdock 등의 문헌(1987)에는 딱정벌레목에 속하는 다양한 해충의 중장 효소에 대한 정교한 연구가 수행되어 있으며, Srinivasan 등의 문헌(2008)에는 인시목에 속하는 해충의 중장 효소에 대해 보고되어 있다. 세린 프로테아제는 유충 내장 환경에서 지배적이고, 인시목에서 총 소화 활성의 약 95%에 기여하는 것으로 알려져 있지만, 딱정벌레목 종은 시스테인 프로테아제를 포함하여 보다 넓은 범위의 우세한 내장 프로테아제를 가지고 있다.
파파인 패밀리는 광범위한 특이성을 갖는 엔도펩티다아제(예컨대 파파인), 매우 좁은 특이성을 갖는 엔도펩티다아제(예컨대 글리실 엔도펩티다아제), 아미노펩티다아제, 디펩티딜펩티다아제, 및 엔도펩티다아제 활성과 엑소 펩티다아제 활성을 모두 갖는 펩티다아제(예컨대, 카텝신 B 및 H)를 포함하여 매우 다양한 활성을 갖는 펩티다아제를 함유한다. 다양한 곤충의 중장에서 발견되는 다른 예시적인 프로테이나아제에는, 트립신 유사 효소, 예를 들어 트립신 및 키모트립신, 펩신, 카르복시펩티다아제-B 및 아미노트리펩티다아제가 포함된다.
세린 프로테아제는 거의 모든 동물 및 미생물에 광범위하게 분포되어 있다(Joanitti 등의 문헌(2006)). 고등 유기체에서, 유전자의 거의 2%가 이러한 효소를 코딩한다(Barrette-Ng 등의 문헌(2003)). 숙주 유기체의 유지 및 생존에 필수 불가결한 세린 프로테아제는 다수의 생물학적 과정에서 핵심 역할을 한다. 세린 프로테아제는 고전적으로 기질 특이성, 특히 P1의 잔기에 따라 분류된다: 트립신 유사(P1에서 Lys/Arg 선호), 키모트립신 유사(P1에서 Phe/Tyr/Leu과 같은 큰 소수성 잔기) 또는 엘라스타아제 유사(P1에서 Ala/Val과 같은 작은 소수성 잔기)(Tyndall 등의 문헌(2005)에 따라 수정됨). 세린 프로테아제는 중심 촉매 기구가 3개의 불변 잔기, 즉, 아스파르트산, 히스티딘 및 고유 반응성 세린으로 구성된 단백질분해 효소의 한 부류이며, 이에 따라 "촉매 삼합체(catalytic triad)"라는 명칭을 갖게 된다. Asp-His-Ser 삼합체는 적어도 4개의 상이한 구조 맥락에서 확인할 수 있다(Hedstrom, 2002). 세린 프로테아제의 이러한 4개의 클랜(clan)은 키모트립신, 서브틸리신, 카르복시펩티다아제 Y 및 Clp 프로테아제로 대표된다. 가장 상세하게 연구된 키모트립신 유사 클랜의 3가지 세린 프로테아제는 키모트립신, 트립신 및 엘라스타아제이다. 보다 최근에, Ser-His-Glu, Ser-Lys/His, His-Ser-His 및 N-말단 Ser를 포함하는 신규한 촉매 삼합체 및 이합체를 갖는 세린 프로테아제가 소화에서의 역할에 대해 발견되었다.
곤충의 내장 환경에서 발견되는 잘 연구된 소화 효소의 한 부류는 시스테인 프로테아제 부류이다. "시스테인 프로테아제"라는 용어는, 효소의 촉매 부위에 시스테인 잔기의 고도로 반응성인 티올기를 보유하는 프로테아제를 설명하기 위한 것으로 의도된다. 다수의 초식성 곤충과 식물 기생 선충이 적어도 부분적으로 단백질 소화를 위해 중장 시스테인 프로테아제에 의존한다는 증거가 있다. 이에는, 비제한적으로, 반시목(Hemiptera), 특히 호박노린재(아나사 트리스티스(Anasa tristis)); 풀색노린재(아크로스테르눔 힐라레(Acrosternum hilare)); 립토르투스 클라바투스(Riptortus clavatus); 및 현재까지 조사된 거의 모든 딱정벌레목, 특히, 콜로라도 감자 딱정벌레(렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata)); 세줄무늬 감자 딱정벌레(레마 트리리네아타(Lema trilineata)); 아스파라거스 딱정벌레(크리오세리스 아스파라기(Crioceris asparagi)); 멕시코 콩 딱정벌레(에필라크나 바리베스티스(epilachna varivestis)); 붉은 밀가루 딱정벌레(트리올리움 카스타네움(Triolium castaneum)); 가짜쌀도둑 딱정벌레(confused flour beetle)(트리볼리움 콘푸숨(Tribolium confusum)); 벼룩 딱정벌레(카에토크네마(Chaetocnema) 종, 할티카(Haltica) 종 및 에피트릭스(Epitrix) 종); 옥수수 뿌리벌레(디아브로티카(Diabrotica) 종); 동부콩바구미(칼로소브루쿠스 아쿨라투(Callosobruchus aculatue)); 목화바구미(안토노무스 그란디스(Antonomus grandis)); 쌀바구미(시토필루스 오리자(Sitophilus oryza)); 옥수수바구미(시토필루스 제아마이스(Sitophilus zeamais)); 곡물바구미(시토필루스 그라나리우스(Sitophilus granarius)); 이집트 알팔파 바구미(히페라 포스티카(Hypera postica)); 콩바구미(아칸토실리데스 옵텍투스(Acanthoseelides obtectus)); 가루좀벌레(lesser grain borer)(리조페르타 도미니카(Rhyzopertha dominica)); 황색밀웜(테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor)); 총채벌레목(Thysanoptera), 특히, 꽃노랑총채벌레(western flower thrip)(프란클리니 엘라 오시덴탈리스(Franklini ella occidentalis)); 쌍시목, 특히, 잎나방벌레 종(리리오미자 트리폴리(Liriomyza trifolii)); 식물 기생 선충, 특히 감자 낭포 선충(글로보데라(Globodera) 종), 비트 낭포 선충(헤테로데라 스카크티(Heterodera schachtii)) 및 뿌리혹 선충(멜로이도기네(Meloidogyne) 종)이 포함된다.
소화 효소의 또 다른 부류는 아스파르트산 프로테아제이다. "아스파르트산 프로테아제"라는 용어는, 효소의 촉매 부위에 2개의 고도로 반응성인 아스파르트산 잔기를 보유하고, 거의 모든 알려진 아스파르트산 프로테아제의 저분자량 저해제인 펩스타틴과의 특이적 저해를 특징을 하는 프로테아제를 설명하기 위한 것으로 의도된다. 다수의 초식성 곤충이, 부분적으로, 가장 흔히 시스테인 프로테아제와 함께 단백질 소화를 위해 중장 아스파르트산 프로테아제에 의존한다는 증거가 있다. 이에는, 비제한적으로, 반시목, 특히(로드니우스 프로릭수스(Rhodnius prolixus)) 및 빈대(시멕스(Cimex) 종) 및 피마티다에(Phymatidae), 노린재과(Pentatomidae), 긴노린재과(Lygaeidae) 및 물장군과(Belostomatidae)의 구성원; 딱정벌레목, 가뢰과(Meloidae), 잎벌레과(Chrysomelidae), 무당벌레과(Coccinelidae) 및 콩바구미과(Bruchidae)의 구성원, 머리대장하목(Cucujiformia) 계열에 속하는 모든 것, 특히, 콜로라도 감자 딱정벌레(렙티노타르사 데셈리네아타), 세줄무늬 감자 딱정벌레(레마 트리리네아타); 남부 및 서부 옥수수 뿌리벌레(디아브로티카 운데심푼크타타(Diabrotica undecimpunctata) 및 디아브로티카 비르기페라(D. virgifera)), 목화바구미(안토노무스 그란디스), 호박노린재(아나사 트리스티스); 벼룩 딱정벌레(필로트레타 크루시페라(Phyllotreta crucifera)), 브루키드 딱정벌레(bruchid beetle)(칼로소브루쿠스 마쿨라투스(Callosobruchus maculatus)), 멕시코 콩 딱정벌레(에필라크나 바리베스티스), 대두 잎나방벌레(오돈토타 호르니(Odontota horni)), 가장자리 물집 딱정벌레(margined blister beetle)(에피카우타 페스티페라(Epicauta pestifera)) 및 붉은 밀가루 딱정벌레(트리올리움 카스타네움); 쌍시목, 특히 집파리(무스카 도메스티카)가 포함된다. 문헌[Terra and Ferreira (1994) Comn. Biochem. Physiol. 109B: 1-62]; 문헌[Wolfson and Murdock (1990) J. Chem. Ecol. 16: 1089-1102] 참조.
개재 링커 펩타이드의 다른 예는 하기 참고문헌에서 확인할 수 있으며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다: 문헌[Heath et al. "Characterization of the protease processing sites in a multidomain proteinase inhibitor precursor from Nicotiana alata" European Journal of Biochemistry, 1995; 230: 250-257]에 개시된 바와 같은, 식물 발현된 세린 프로테이나아제 저해제 전구체는 6개의 동일한 링커 펩타이드에 의해 분리되는 5개의 동종 단백질 저해제를 함유하는 것으로 확인되었다. 문헌[Chang, H.C. et al. "De novo folding of GFP fusion proteins: high efficiency in eukaryotes but not in bacteria" Journal of Molecular Biology, 2005 Oct 21; 353(2): 397-409]에는 6개의 상이한 링커를 통한 녹색 형광 단백질의 접힘 거동 비교가 연구되어 있다. 문헌[Daskalova, S.M. et al. "Engineering of N. benthamiana L. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins" BMC Biotechnology, 2010 Aug 24; 10: 62]에서, 인간 GalNAc-T 패밀리의 이소형인, GalNAc-T2는 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 식물에서 발현 시 이의 국소화 및 기능성을 유지하는 것으로 나타났다. 스트로뮬(stromule)을 통해 이동하는 내인성 색소체 단백질의 능력은 문헌[Kwok, E.Y. et al. "GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and traffic between plastids" Journal of Experimental Botany, 2004 Mar; 55(397): 595-604. Epub 2004 Jan 30]에 나타나있다. 담배 모자이크 바이러스(TMV) 비리온의 표면을, 모기 데카펩타이드 호르몬, 트립신 조절 난소성 인자(TMOF: trypsin-modulating oostatic factor)로 조작하는 것에 대한 보고서는 문헌[Borovsky, D. et al. "Expression of Aedes trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide" Proc Natl Acad Sci, 2006 December 12; 103(50): 18963-18968]에 작성되어 있다. 이러한 참고문헌 등은 본원에 기재된 방법, 절차, 및 펩타이드, 단백질 및 뉴클레오타이드 복합체 및 작제물에 사용될 수 있는 개재 링커를 교시하고 개시한다.
DVP ORF 및 DVP 작제물
"DVP ORF"는 DVP, 및/또는 하나 이상의 안정화 단백질, 분비 신호 또는 표적 지시 신호, 예를 들어 ERSP 또는 STA를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 나타내며, 번역할 수 있는 능력을 갖는 ORF의 뉴클레오타이드로 정의된다. 따라서, "DVP ORF 다이어그램"은 다이어그램 또는 방정식 형태로 작성된 하나 이상의 DVP ORF의 조성을 나타낸다. 예를 들어, "DVP ORF 다이어그램"은 발현 ORF 내 함유된 DNA 분절에 대한 약어 또는 축약형 참조를 사용하여 작성될 수 있다. 따라서, 하나의 예에서, "DVP ORF 다이어그램"은 DNA 분절을 방정식 형태로, 각각, "ersp"(즉, ERSP 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열); "링커" 또는 "L"(즉, LINKER 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열); "sta"(즉, STA 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열) 및 "dvp"(즉, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열)로 도식화하는 방식으로, ERSP, LINKER, STA 및 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절을 설명할 수 있다. DVP ORF 다이어그램의 예는, "ersp-sta-(링커 i-dvp j)N" 또는 "ersp-(dvp j -링커 i ) N -sta" 및/또는 이들의 DNA 분절의 임의의 조합이다.
하기 방정식은 ERSP, STA, 링커 및 DVP를 인코딩하는 DVP ORF의 2개의 예를 설명한다:
ersp-sta-l-dvp 또는 ersp-dvp-l-sta
일부 구현예에서, 본원에 기재된 DVP 발현 오픈 리딩 프레임(ORF)은 식물이 mRNA를 발현할 수 있게 하는 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 이는 차례로 펩타이드로 번역되어 상기 단백질이 하나 이상의 해충을 저해 및/또는 사멸시키는 데 충분한 용량을 제공하는 정도로 발현되고, 적절하게 접히고/접히거나, 축적될 것이다. 하나의 구현예에서, 단백질 DVP ORF의 예는 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드(dvp), "ersp"(즉, ERSP 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열), "링커"(즉, LINKER 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열), "sta"(즉, STA 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있으며, 하기 방정식 형식으로 설명될 수 있다:
ersp-sta-(링커 i-dvp j)n 또는 ersp-(dvp j -링커 i ) n -sta
폴리뉴클레오타이드 방정식의 전술한 예시적인 구현예는 하기 단백질 복합체가 발현되게 할 것이다: ERSP-STA-(LINKERI-DVPJ)N(이는 각각의 구성요소를 분리하기 위한 대시(dash) 기호와 함께 4개의 가능한 펩타이드 구성요소를 함유함). ersp의 뉴클레오타이드 구성요소는 식물 소포체 트래피킹 신호 펩타이드(ERSP)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절이다. sta의 구성요소는 식물에서 발현되는 DVP의 축적을 돕는 번역 안정화 단백질(STA)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절이지만, 일부 구현예에서, DVP ORF에 sta를 포함시키는 것이 필요하지 않을 수 있다. 링커 i의 구성요소는 DVP를 ORF에 함유된 다른 구성요소 및 번역 안정화 단백질과 분리하기 위한 개재 링커 펩타이드(L 또는 LINKER)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절이다. 아래첨자 "i"는, 일부 구현예에서, 상이한 유형의 링커 펩타이드가 DVP ORF에 사용될 수 있음을 나타낸다. 구성요소 "dvp"는 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절(뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드 서열로도 알려짐)을 나타낸다. 아래첨자 "j"는, 상이한 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드가 DVP ORF에 포함될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드 서열은 아미노산 치환 또는 아미노산 결실이 있는 DVP를 인코딩할 수 있다. "(링커 i-dvp j)n"에 제시된 아래첨자 "n"은, 개재 링커 펩타이드 및 DVP를 인코딩하는 뉴클레오타이드의 구조가 동일한 DVP ORF의 동일한 오픈 리딩 프레임에서 "n"회 반복될 수 있음을 나타내며, 여기서 "n"은 1 내지 10의 임의의 정수일 수 있고; "n"은 1 내지 10일 수 있고, 구체적으로 "n"은 1, 2, 3, 4 또는 5일 수 있고, 일부 구현예에서 "n"은 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 반복부는 상이한 개재 링커(LINKER)와 상이한 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분절을 함유할 수 있다. 동일한 DVP ORF 내 반복부를 포함하는 상이한 폴리뉴클레오타이드 분절은 모두 동일한 번역 프레임 내에 있다. 일부 구현예에서, DVP ORF에 sta 폴리뉴클레오타이드를 포함시키는 것이 필요하지 않을 수 있다. 예를 들어, ersp 폴리뉴클레오타이드 서열은 링커 없이 DVP 변이형 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 직접 연결될 수 있다.
전술한 예시적인 방정식에서, 폴리펩타이드 "DVP"를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 "dvp"는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
전술한 예시적인 방정식에서, 폴리펩타이드 "DVP"를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 "dvp"는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 DVP, 예를 들어 서열번호 187 내지 191 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 언급된 방법 중 임의의 것 및/또는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여, 식물 또는 이의 식물 부분에, 본원에 기재된 바와 같은 DVP 또는 DVP-살충 단백질 중 임의의 하나 이상을 발현하도록 작동 가능한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 혼입할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 하기 DVP 작제물 배향 및/또는 배열을 갖는 DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능하다: ERSP-DVP; ERSP-(DVP)N; ERSP-DVP-L; ERSP-(DVP)N-L; ERSP-(DVP-L)N; ERSP-L-DVP; ERSP-L-(DVP)N; ERSP-(L-DVP)N; ERSP-STA-DVP; ERSP-STA-(DVP)N; ERSP-DVP-STA; ERSP-(DVP)N-STA; ERSP-(STA-DVP)N; ERSP-(DVP-STA)N; ERSP-L-DVP-STA; ERSP-L-STA-DVP; ERSP-L-(DVP-STA)N; ERSP-L-(STA-DVP)N; ERSP-L-(DVP)N-STA; ERSP-(L-DVP)N-STA; ERSP-(L-STA-DVP)N; ERSP-(L-DVP-STA)N; ERSP-(L-STA)N-DVP; ERSP-(L-DVP)N-STA; ERSP-STA-L-DVP; ERSP-STA-DVP-L; ERSP-STA-L-(DVP)N; ERSP-(STA-L)N-DVP; ERSP-STA-(L-DVP)N; ERSP-(STA-L-DVP)N; ERSP-STA-(DVP)N-L; ERSP-STA-(DVP-L)N; ERSP-(STA-DVP)N-L; ERSP-(STA-DVP-L)N; ERSP-DVP-L-STA; ERSP-DVP-STA-L; ERSP-(DVP)N-STA-L ERSP-(DVP-L)N-STA; ERSP-(DVP-STA)N-L; ERSP-(DVP-L-STA)N; 또는 ERSP-(DVP-STA-L)N(여기서, N은 1 내지 200 범위의 정수임).
본 개시내용은, 비제한적으로, 외떡잎 및 쌍떡잎 식물을 포함하는 임의의 식물 종의 형질전환에 사용될 수 있다. 유전자이식 접근법 또는 PEP가 특히 유용한 접근법일 수 있는 작물에는, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 알팔파, 목화, 토마토, 옥수수, 밀, 옥수수, 사탕옥수수, 자주개자리, 대두, 수수, 들판 완두콩, 아마인, 홍화, 유채, 유채씨유, 쌀, 대두, 보리, 해바라기, 나무(침엽수 및 낙엽수 포함), 꽃(상업적으로 및 온실에서 재배되는 것들 포함), 들판 루핀, 스위치그래스, 사탕수수, 감자, 토마토, 담배, 십자화과, 고추, 사탕무, 보리, 유채씨유, 브라시카 종, 호밀, 기장, 땅콩, 고구마, 카사야, 커피, 코코넛, 파인애플, 감귤나무, 코코아, 차, 바나나, 아보카도, 무화과, 구아바, 망고, 올리브, 파파야, 캐슈, 마카다미아, 아몬드, 오트, 채소, 관상용 식물 및 침엽수.
폴리뉴클레오타이드를 이용한 식물의 형질전환
일부 구현예에서, 상기 및 본원에 기재된 DVP ORF 및 DVP 작제물은 일시적으로 또는 안정적으로 식물에서 DVP를 발현시키기 위해 임의의 식물 발현 벡터에 클로닝될 수 있다.
일시적 식물 발현 시스템은 일부 구성요소의 필요성, 일부 구성요소의 코돈 최적화, 각 구성요소의 순서 최적화 등을 포함하여, 식물에서 일부 특정 DVP 발현을 위해 DVP ORF의 구조를 신속하게 최적화하는 데 사용될 수 있다. 일시적인 식물 발현 벡터는 종종 식물 바이러스 게놈에서 유도된다. 일시적인 식물 발현 벡터는 종종 식물 바이러스 게놈에서 유도된다. 식물 바이러스 벡터는 식물 바이러스의 감염 특성으로 인해 식물에서 빠르고 높은 수준의 외래 유전자 발현에 이점을 제공한다. 식물 바이러스 게놈의 전체 길이가 벡터로 사용될 수 있지만, 종종 바이러스 구성요소, 예를 들어 외피 단백질이 결실되고, 유전자이식 ORF가 그 자리에 서브클로닝된다. DVP ORF는 바이러스 벡터를 생성하기 위해 이러한 부위에 서브클로닝될 수 있다. 이러한 바이러스 벡터는, 예를 들어 식물 상처, 분무식 등을 통해 자체적으로 감염성이 되기 때문에 식물에 기계적으로 도입될 수 있다. 이는 또한, 바이러스 벡터를 뿌리혹병 박테리아, 아그로박테리움 투메파시엔스, 또는 모상근 박테리아, 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)의 T-DNA에 클로닝하는 방식으로 아그로감염을 통해 식물로 트랜스펙션될 수 있다. 이러한 벡터에서 DVP의 발현은 RNA 바이러스의 복제에 의해 제어되며, 복제를 위한 mRNA로의 바이러스 번역은 강력한 바이러스 프로모터, 예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스 유래 35S 프로모터에 의해 제어된다. DVP ORF를 갖는 바이러스 벡터는 통상적으로 대장균 균주와 아그로박테리움 균주 둘 모두에서 자체 복제될 수 있는 이원 벡터의 T-DNA 영역에 클로닝된다. 식물의 일시적 트랜스펙션은 식물 잎에 DVP 발현을 위한 바이러스 벡터를 함유하는 아그로박테리움 세포를 침윤시키는 방식으로 수행될 수 있다. 일시적으로 형질전환된 식물에서, 전사 후 유전자 침묵(PTGS)으로 인해 외래 단백질 발현이 단기간 내에 중단되는 것이 일반적이다. 때때로, PTGS 억제 단백질 유전자는 DVP ORF의 발현을 유도하는 동일한 유형의 바이러스 벡터를 이용하여 일시적으로 식물 내로 동시 형질전환될 필요가 있다. 이는 식물에서 DVP의 발현을 개선시키고 연장시킨다. 가장 흔히 사용되는 PTGS 억제 단백질은 토마토 덤불 위축 바이러스(TBSV: tomato bushy stunt virus)에서 발견되는 P19 단백질이다.
일부 구현예에서, 식물의 일시적 트랜스펙션은 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 용이하게 이용 가능한 벡터 중 어느 하나(상기 및 본원에 기재된 바 참조)와 재조합하는 방식으로 달성될 수 있으며, 마커 또는 신호(예를 들어, GFP 방출)를 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 일시적으로 트랜스펙션된 식물은 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 벡터에서 GFP-하이브리드 융합 단백질을 인코딩하는 DNA와 재조합하고, 상기 벡터를 표적화된 발현을 위해 디자인된 상이한 FECT 벡터를 사용하여 식물(예를 들어, 담배)로 트랜스펙션시키는 방식으로 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 APO(아포플라스트 국소화) 축적을 위한 pFECT 벡터; CYTO(세포질 국소화) 축적을 위한 pFECT 벡터; 또는 ER(소포체 국소화) 축적을 위한 ersp 함유 pFECT 벡터와 재조합될 수 있다.
예시적인 일시적 식물 형질전환 전략은, 고효율, 용이성 및 저비용으로 인해 식물 바이러스 벡터를 사용하는 아그로감염이다. 일부 구현예에서, 담배 모자이크 바이러스 과발현 시스템은 DVP를 이용하여 식물을 일시적으로 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 문헌[TRBO, Lindbo JA, Plant Physiology, 2007, V145: 1232-1240] 참조(상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
TRBO DNA 벡터는 바이러스 코팅 단백질을 인코딩하는 유전자 없이 담배 모자이크 바이러스 RNA의 발현을 유도하는 CaMV 35S 프로모터를 함유하는, 아그로감염을 위한 T-DNA 영역을 갖는다. 나아가, 이러한 시스템은 "무장 해제된" 바이러스 게놈을 사용하기 때문에, 바이러스 식물에서 식물로의 전달이 효과적으로 방지될 수 있다.
또 다른 구현예에서, FECT 바이러스 일시적 식물 발현 시스템은 DVP를 이용하여 식물을 일시적으로 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 문헌[Liu Z & Kearney CM, BMC Biotechnology, 2010, 10:88] 참조(상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). FECT 벡터는 바이러스 코팅 단백질을 인코딩하는 유전자 및 삼중 유전자 블록 없이 여우꼬리 모자이크 바이러스 RNA의 발현을 유도하는 CaMV 35S 프로모터를 함유하는, 아그로감염을 위한 T-DNA 영역을 함유한다. 나아가, 이러한 시스템은 "무장 해제된" 바이러스 게놈을 사용하기 때문에, 바이러스 식물에서 식물로의 전달이 효과적으로 방지될 수 있다. 도입된 이종 유전자를 효율적으로 발현하기 위해, FECT 발현 시스템은 도입된 T-DNA의 전사 후 유전자 침묵(PTGS)을 방지하기 위해 추가로 토마토 덤불 위축 바이러스 유래 RNA 침묵 억제 단백질인 P19를 공동 발현해야 한다(TRBO 발현 시스템은 P19의 공동 발현을 필요로 하지 않음).
일부 구현예에서, DVP ORF는 하기와 같이 설명될 수 있는 일련의 번역으로 융합된 구조 모티프를 인코딩하도록 디자인될 수 있다: N'-ERSP-STA-L-DVP-C'(여기서, "N'" 및 "C'"는, 각각, N-말단 및 C-말단 아미노산을 나타내고, ERSP 모티프는 보리 알파-아밀라아제 신호 펩타이드(BAAS)(서열번호 60)일 수 있고; 안정화 단백질(STA)은 GFP(서열번호 57)일 수 있고; 링커 펩타이드 "L"은 IGER(서열번호 54)일 수 있음). 일부 구현예에서, ersp-sta-l-dvp ORF는 제한 부위, 예를 들어 5'-말단에 있는 Pac I 제한 부위와 3'-말단에 있는 Avr II 제한 부위를 포함하도록 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, DVP ORF는 FECT 일시적 식물 발현 시스템(pFECT-DVP)을 위한 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 발현 벡터를 생성하기 위해 FECT 발현 벡터(pFECT)의 Pac I 및 Avr II 제한 부위에 클로닝될 수 있다. FECT 발현 시스템에서 발현을 최대화하기 위해, 일부 구현예는 공동 형질전환을 위해 생성된 RNA 침묵 억제 단백질 P19(pFECT-P19)를 발현하는 FECT 벡터를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 발현 벡터는, 예를 들어 일상적인 PCR 절차를 수행하고, 상기 기재된 DVP ORF의 3'-말단에 Not I 제한 부위를 부가한 후, DVP ORF를 TRBO 발현 벡터(pTRBO-DVP)의 Pac I 및 Not I 제한 부위에 클로닝하는 방식으로 TRBO 일시적 식물 발현 시스템에서의 사용을 위해 재조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주, 예를 들어 상업적으로 입수 가능한 GV3101 세포는, 하나 이상의 일시적 발현 시스템, 예를 들어 FECT 및 TRBO 발현 시스템을 사용하여 식물 조직(예를 들어, 담배잎)에서 DVP ORF의 일시적 발현을 위해 사용될 수 있다. 이러한 일시적 트랜스펙션 프로토콜의 예시적인 예시는 하기를 포함한다: GV3101의 밤새 배양을 사용하여 200 mL의 Luria-Bertani(LB) 배지를 접종할 수 있고; 세포를 OD600이 0.5 내지 0.8인 로그 단계까지 성장시킬 수 있고; 이어서, 세포를 4℃에서 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리하여 펠릿화할 수 있고; 이어서, 세포를 10 mL의 사전 냉각시킨 TE 완충액(Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0)으로 1회 세정한 후, 20 mL의 LB 배지에 재현탁시킬 수 있고; 이어서, GV3101 세포 현탁액을 1.5 mL 마이크로튜브에 250 μL 분획으로 분취할 수 있고; 이어서, 분취액을 액체 질소에서 급속 동결시키고 후속 형질전환을 위해 -80℃ 동결기에서 보관할 수 있다. 이어서, pFECT-DVP 및 pTRBO-DVP 벡터를 하기와 같이 동결-해동 방법을 사용하여 적격 GV3101 세포로 형질전환시킬 수 있다: 보관된 적격 GV3101 세포를 얼음 위해서 해동시키고, 1 μg 내지 5 μg의 순수한 DNA(pFECT-DVP 또는 pTRBO-DVP 벡터)와 혼합한다. 세포-DNA 혼합물을 얼음 위에서 5분 동안 유지시키고, 5분 동안 -80℃로 옮기고, 37℃ 수조에서 5분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 동결-해동 처리된 세포를 1 mL LB 배지에 희석하고, 실온에서 2시간 내지 4시간 동안 흔들 테이블 상에서 진탕시킨다. 이어서, 세포-DNA 혼합물 200 μL 분취액을 적절한 항생제(10 μg/mL 리팜피신, 25 μg/mL 겐타마이신 및 50 μg/mL 카나마이신이 pFECT-DVP 형질전환 및 pTRBO-DVP 형질전환 둘 모두에 사용될 수 있음)가 함유된 LB 한천 플레이트 상에 확산시키고, 28℃에서 2일 동안 인큐베이션한다. 이어서, 생성된 형질전환된 콜로니를 선택하고, 형질전환된 DNA 분석 및 형질전환된 GV3101 세포의 글리세롤 스톡 제조에 적절한 항생제가 함유된 LB 배지 6 mL 분취액에서 배양한다.
일부 구현예에서, 식물 조직, 예를 들어 담배잎의 일시적 형질전환은 3 mL 무바늘 시린지를 이용하여 잎 주사(leaf injection)를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 예시적인 예에서, 형질전환된 GV3101 세포를 (상기 기재된 바와 같은) 적절한 항생제가 함유된 LB 플레이트 상에 스트리킹하고, 28℃에서 2일 동안 인큐베이션한다. 형질전환된 GV3101 세포의 콜로니를 5 ml의 LB-MESA 배지(10 mM MES 및 20 μM 아세토시린곤이 보충된 LB 배지) 및 상기 기재된 동일한 항생제에 접종하고, 28℃에서 밤새 성장시킨다. 밤샘 배양물의 세포를 5000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 수집하고, 유도 배지(10 mM MES, 10 mM MgCl2, 100 μM 아세토시린곤)에 최종 OD600 1.0으로 재현탁시킨다. 이어서, 세포를 유도 배지에서 실온에서 2시간 내지 밤새 인큐베이션한 후, 담배잎의 일시적 형질전환을 준비한다. 처리된 세포를 3 mL 무바늘 시린지를 사용한 주사를 통해 니코티아나 벤타미아나 식물의 부착된 잎의 밑면에 침투시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 일시적 형질전환은 GV3101 세포의 한 집단을 pFECT-DVP 또는 pTRBO-DVP로 트랜스펙션시키고, 또 다른 집단을 pFECT-P19로 트랜스펙션시고, 2개의 세포 집단을 함께 동일한 양으로 혼합하여, 3 mL 시린지를 이용한 주사를 통해 담배잎에 침투시키는 방식으로 달성될 수 있다.
DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드의 안정한 통합이 또한 본 개시내용에 따라 가능하며, 예를 들어 DVP ORF는 또한 안정한 식물 형질전환 기술을 사용하여 식물 게놈에 통합될 수 있고, 이에 따라 DVP가 식물에서 안정적으로 발현되어, 형질전환된 식물을 대대로 보호할 수 있다. 식물의 안정한 형질전환을 위해, DVP 발현 벡터는 원형 또는 선형일 수 있다. DVP ORF, DVP 발현 카세트, 및/또는 안정한 식물 형질전환을 위해 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터는 당업자의 지식에 기반하고/하거나, Gene Designer 2.0(Atum Bio); VectorBuilder(Cyagen); SnapGene® viewer; GeneArtTM Plasmid 작제물ion Service(Thermo-Fisher Scientific); 및/또는 기타 상업적으로 입수 가능한 플라스미드 디자인 서비스와 같은 예측 벡터 디자인 도구를 사용하여 식물에서 최적 발현을 위해 신중하게 디자인되어야 한다. 문헌[Tolmachov, Designing plasmid vectors. Methods Mol Biol. 2009; 542:117-29] 참조. DVP의 발현은 통상적으로 유전자이식 식물의 일부 또는 모든 세포에서 전사를 촉진시키는 프로모터에 의해 제어된다. 프로모터는 강력한 식물 바이러스 프로모터, 예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 유래 구성적 35S 프로모터일 수 있고; 이는 또한 강력한 식물 프로모터, 예를 들어 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유래 히드로퍼옥시드 리아제 프로모터(pHPL); 대두 유래 글리신 맥스 폴리유비퀴틴(Gmubi: Glycine max polyubiquitin) 프로모터; 상이한 식물 종(쌀, 옥수수, 감자 등) 유래 유비퀴틴 프로모터 등일 수 있다. 식물 전사 종결인자는 종종 RNA 폴리머라아제와 mRNA의 전사를 중단시키기 위해 ORF의 종결 코돈 이후에 존재한다. DVP 발현을 평가하기 위해, 리포터 유전자가 DVP 발현 벡터, 예를 들어 GUS 염색 검정용 베타-글루코시다아제 유전자(GUS), UV 광 하에서의 녹색 형광 검출용 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자 등에 포함될 수 있다. 형질전환된 식물의 선별을 위해, 선별 마커 유전자가 통상적으로 DVP 발현 벡터에 포함된다. 일부 구현예에서, 마커 유전자 발현 산물은 특정 항생제, 예를 들어 카나마이신, 히그로마이신 등, 또는 특정 제초제, 예를 들어 글리포세이트(glyphosate) 등에 대해 내성이 있는 형질전환된 식물을 제공할 수 있다. 아그로감염 기술이 식물 형질전환에 적용되는 경우, T-DNA 부분을 식물로 수송하기 위해 T-DNA 좌측 경계 서열과 우측 경계 서열이 또한 DVP 발현 벡터에 포함된다.
작제된 DVP 발현 벡터는 다수의 트랜스펙션 기술을 사용하여 식물 세포 또는 조직으로 트랜스펙션될 수 있다. 아그로감염은 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 또는 아그로박테리움 리조게네스 균주를 사용하여 식물을 형질전환시키는 가장 대중적인 방법이다. 입자 충격(유전자총(Gene Gun 또는 Biolistics)으로도 불림) 기술 또한 식물 트랜스펙션의 가장 일반적인 방법이다. 다른 덜 일반적인 트랜스펙션 방법에는, 조직 전기천공, 탄화규소 위스커(silicon carbide whisker), DNA 직접 주입 등이 포함된다. 트랜스펙션 후, 트랜스펙션된 식물 세포 또는 조직을 식물 재생 배지에 위치시켜 성공적으로 트랜스펙션된 식물 세포 또는 조직을 유전자이식 식물로 재생시킨다.
형질전환된 식물의 평가는 DNA 수준, RNA 수준 및 단백질 수준에서 수행될 수 있다. 안정적으로 형질전환된 식물은 모든 이러한 수준에서 평가될 수 있으며, 일시적으로 형질전환된 식물은 통상적으로 단백질 수준만 평가된다. DVP ORF를 안정적으로 형질전환된 식물의 게놈에 통합시키는 것을 보장하기 위해, 안정적으로 형질전환된 식물 조직에서 게놈 DNA를 추출하고, PCR 또는 서던 블롯을 사용하여 분석할 수 있다. 안정적으로 형질전환된 식물에서 DVP의 발현은, 예를 들어 노던 블롯(northern blot) 또는 RT-PCR을 사용하여 형질전환된 식물 조직에서 추출된 총 mRNA를 분석하는 방식으로 RNA 수준에서 평가될 수 있다. 형질전환된 식물에서 DVP의 발현은 또한 직접 단백질 수준으로 평가될 수 있다. 형질전환된 식물에서 DVP의 발현을 평가하는 다수의 방법이 존재한다. 리포터 유전자가 DVP ORF에 포함되어 있는 경우, 리포터 유전자 검정이 수행될 수 있으며, 예를 들어, 일부 구현예에서, GUS 리포터 유전자 발현에 대한 GUS 염색 검정, GFP 리포터 유전자 발현에 대한 녹색 형관 검출 검정, 루시퍼라아제 리포터 유전자 발현에 대한 루시퍼라아제 검정 및/또는 다른 리포터 기술이 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플 내 총 단백질 수준을 평가하기 위하여, Bradford 검정을 사용하여 DVP의 발현을 직접 평가하기 위해 형질전환된 식물 조직에서 총 단백질을 추출할 수 있다.
일부 구현예에서, 분석용 HPLC 크로마토그래피 기술, 웨스턴 블롯 기술 또는 iELISA 검정을 채택하여 형질전환된 식물 조직으로부터 추출된 총 단백질 샘플에서 DVP를 정성적으로 또는 정량적으로 평가할 수 있다. DVP 발현은 또한 곤충 생물검정에서 형질전환된 식물 조직으로부터 추출된 총 단백질 샘플을 사용하여 평가될 수 있으며, 예를 들어, 일부 구현예에서, 형질전환된 식물 조직 또는 전체 형질전환된 식물 자체를 곤충 생물검정에 사용하여 DVP 발현 및 식물에 보호를 제공하는 이의 능력을 평가할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자 또는 이의 부분은, 하나 이상의 DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 상기 DVP는 적어도 아미노산 서열을 포함한다.
성공적인 형질전환 확인
이종 외래 DNA를 식물 세포에 도입한 후, 식물 게놈에서 이종 유전자의 형질전환 또는 통합은 통합된 유전자와 관련된 핵산, 단백질 및 대사산물의 분석과 같은 다양한 방법을 통해 확인된다.
PCR 분석은 토양으로의 이식 전 초기 단계에서 혼입된 유전자의 존재에 대해 형질전환된 세포, 조직 또는 싹을 스크리닝하는 신속한 방법이다(문헌[Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]). PCR은 관심 유전자 또는 아그로박테리움 벡터 배경 등에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 수행된다.
식물 형질전환은 게놈 DNA의 서던 블롯 분석으로 확인할 수 있다(상기 Sambrook 및 Russell의 문헌(2001)). 일반적으로, 총 DNA를 형질전환된 식물에서 추출하고, 적절한 제한 효소로 소화시키고, 아가로오스 겔에 분획화시키고, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막으로 옮긴다. 이어서, 표준 기술(상기 Sambrook 및 Russell의 문헌(2001))에 따라 식물 게놈으로 도입된 유전자의 통합을 확인하기 위해 막 또는 "블롯"을, 예를 들어 방사성표지된 32P 표적 DNA 단편으로 탐침한다.
노던 블롯 분석에서, RNA를 형질전환된 식물의 특정 조직에서 단리하고, 포름알데히드 아가로오스 겔에 분획화시키고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 표준 절차에 따라 나일론 필터 상에 블롯팅한다(상기 Sambrook 및 Russell의 문헌(2001)). 이어서, 당업계에 알려진 방법(상기 Sambrook 및 Russell의 문헌(2001))에 따라 필터를 DVP에서 유도된 방사성 프로브에 혼성화시키는 방식으로 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 RNA의 발현을 시험한다.
DVP 상에 존재하는 하나 이상의 에피토프에 결합하는 항체를 사용하여 표준 절차(상기 Sambrook 및 Russell의 문헌(2001))에 따라 DVP 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 존재를 확인하기 위해, 유전자이식 식물에 대해 웨스턴 블롯, 생화학적 검정 등을 수행할 수 있다.
식물 형질전환의 성공, 예를 들어 클로람페니콜, 아미노글리코시드 G418, 히그로마이신 등에 대한 내성을 결정하기 위해 다수의 마커가 개발되었다. 엽록체 대사에 관여하는 산물을 인코딩하는 다른 유전자가 또한 선별 마커로 사용될 수 있다. 예를 들어, 글리포세이트, 브로목시닐 또는 이미다졸리논과 같은 식물 제초제에 대한 내성을 제공하는 유전자가 특히 사용될 수 있다. 이러한 유전자는 보고되어 있다(문헌[Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314(브로목시닐 내성 니트릴라아제 유전자)]; 및 문헌[Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188(AHAS 이미다졸리논 내성 유전자)]. 추가로, 본원에 개시된 유전자는 박테리아, 효모 또는 식물 세포의 형질전환을 평가하기 위한 마커로서 유용하다. 식물, 식물 기관(예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 번식체, 배아 또는 이들의 자손에서 전이유전자의 존재를 검출하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 하나의 구현예에서, 전이유전자의 존재는 살충 활성을 시험하는 방식으로 검출된다.
DVP 및/또는 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 번식력이 있는 식물이 살충 활성에 대해 시험될 수 있으며, 최적 활성을 나타내는 식물이 추가 육종을 위해 선택될 수 있다. 해충 활성을 검정하기 위한 방법이 당업계에서 이용 가능하다. 일반적으로, 단백질을 혼합하여, 섭식 검정에 사용한다. 예를 들어, 문헌[Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293] 참조.
일부 구현예에서, 일시적 트랜스펙션 절차의 성공 평가는 리포터 유전자, 예를 들어 GFP의 발현에 기반하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, GFP는 FECT 및/또는 TRBO 벡터로 형질전환된 담배잎에서 UV 광 하에서 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 발현은 식물(예를 들어, 담배)에서 정량적으로 평가될 수 있다. 담배 식물에서 DVP 정량화를 예시하는 예시적인 절차는 하기와 같다: 1000 μL 피펫 팁의 큰 개구부를 이용하여 잎을 펀칭하여 형질전환된 잎 조직의 디스크 100 mg을 수집한다. 수집된 잎 조직을 5/32" 직경 스테인리스강 분쇄 볼이 있는 2 mL 마이크로튜브에 위치시키고, -80℃에서 1시간 동안 동결시킨 후, Troemner-Talboys 고속 균질기를 사용하여 균질화시킨다. 다음으로, 얼음 냉각시킨 TSP-SE1 추출 용액(인산소듐 용액 50 mM, 1:100 희석된 프로테아제 저해제 칵테일, EDTA 1 mM, DIECA 10 mM, PVPP 8%, pH 7.0) 750 μL를 튜브에 첨가하고, 볼텍싱한다. 이어서, 마이크로튜브를 실온에서 15분 동안 정치시키고, 16,000 g으로 4℃에서 15분 동안 원심분리하고; 생성된 상청액 100 μL를 취하여 바닥에 빈 수용 Costar 마이크로티터 플레이트가 있는 0.45 μm Millipore MultiScreen 필터 마이크로티터 플레이트의 사전 Sephadex G-50 패킹된 컬럼에 로딩한다. 이어서, 마이크로티터 플레이트를 800 g으로 4℃에서 2분 동안 원심분리한다. 본원에서 담배잎의 총 가용성 단백질 추출물(TSP 추출물)로 불리는 생성된 여과액을 정량적 분석을 위해 준비한다.
일부 구현예에서, TSP 추출물의 총 가용성 단백질 농도는 Pierce Coomassie Plus 단백질 검정을 사용하여 추정될 수 있다. 농도가 알려진 BSA 단백질 표준물을 사용하여 단백질 정량화 표준 곡선을 생성할 수 있다. 예를 들어, 각각의 TSP 추출물 2 μL를 Coomassie Plus 단백질 검정 키트의 발색 시약(CPPA reagent) 200 μL와 혼합하고, 10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 이어서, 제어 소프트웨어로 SoftMax Pro를 사용하고 SpectroMax-M2 플레이트 판독기를 사용하여 OD595를 판독하는 방식으로 발색 반응을 평가할 수 있다. 총 가용성 단백질의 농도는, 각각, FECT 및 TRBO를 통해 형질전환된 식물로부터의 TSP 추출물에서 약 0.788 ± 0.20 μg/μL 또는 약 0.533 ± 0.03 μg/μL일 수 있으며, 결과는 iELISA 검정을 위해 TSP에서 발현된 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 펩타이드의 백분율(%TSP)을 계산하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 간접적인 ELISA(iELISA) 검정을 사용하여 FECT 및/또는 TRBO 발현 시스템으로 일시적으로 형질전환된 담배잎에서 DVP 함량을 정량적으로 평가할 수 있다. DVP를 정량화하기 위해 iELISA를 사용하는 예시적인 예는 하기와 같다: 잎 TSP 추출물 5 μL를 Immulon 2HD 96웰 플레이트의 웰에서 CB2 용액(Immunochemistry Technologies) 95 μL로 희석하고, 필요에 따라 연속 희석을 수행하고; 이어서 추출물 샘플에서 얻은 잎 단백질로 실온에서 암실에서 3시간 동안 웰 벽을 코팅한 후, CB2 용액을 제거하고; 각각의 웰을 200 μL PBS(Gibco)로 2회 세척하고; 150 μL 차단 용액(5% 무지방 분유가 포함된 PBS 중 차단 BSA)을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하고; 차단 용액을 제거한 후, 웰을 PBS로 세척하고, DVP에 대한 1차 항체 100 μL(맞춤형 항체는 ProMab Biotechnologies, Inc.에서 상업적으로 입수 가능하거나; GenScript®이거나; 당업자에게 용이하게 이용할 수 있는 지식을 사용하여 형성함); 차단 용액 중에 1:250 희석으로 희석된 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하고; 1차 항체를 제거하고, 각각의 웰을 PBS로 4회 세척하고; HRP-접합된 2차 항체(즉, 차단 용액에서 1:1000 희석으로 사용되는 1차 항체를 생성하는 데 사용되는 숙주 종에 대한 항체) 100 μL를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하고; 2차 항체를 제거하고, 웰을 PBS 100 μL로 세척하고; 기질 용액(ABTS 퍼옥시다아제 기질 용액 A 및 용액 B의 1:1 혼합물, KPL)을 각각의 웰에 첨가하고, 충분한 발색이 명백해질 때까지 발색 반응을 진행시키고; 퍼옥시다제 중지 용액 100 μL를 각각의 웰에 첨가하여 반응을 중단시키고; 플레이트 내 각각의 반응 혼합물의 흡광도를 제어 소프트웨어로 SoftMax Pro를 사용하는 SpectroMax-M2 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm에서 판독하고; 순수한 DVP 샘플의 연속 희석된 알려진 농도를 iELISA 검정에서 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 처리하여 정량 분석을 위한 질량-흡광도 표준 곡선을 생성할 수 있다. 발현된 DVP는 iELISA에 의해 FECT 형질전환된 담배의 잎 TSP 추출물에서 약 3.09 ± 1.83 ng/μL로; TRBO 형질전환된 담배의 잎 TSP 추출물에서 약 3.56 ± 0.74 ng/μL로 검출될 수 있다. 대안적으로, 발현된 DVP는 FECT 형질전환된 식물의 경우 약 0.40% 총 가용성 단백질(%TSP) 및 TRBO 형질전환된 식물의 경우 약 0.67% TSP일 수 있다.
혼합물, 조성물 및 제형
본원에 사용된 "조성물"과 "제형"이라는 용어는 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 "v/v" 또는 "% v/v" 또는 "부피당 부피"는 용액의 부피 농도를 나타낸다("v/v"는 부피당 부피를 나타냄). 본원에서, v/v는 용액의 구성요소가 모두 액체인 경우에 사용될 수 있다. 예를 들어, 성분 X 50 mL가 물 50 mL로 희석되는 경우, 총 부피 100 mL 중에 성분 X가 50 mL 존재할 것이기 때문에; 이는 "성분 X 50% v/v"로 표시될 수 있다. 부피당 부피%(% v/v)는 하기와 같이 계산된다: (용질 부피(mL)/용액 부피(100 mL)); 예를 들어, % v/v = 용질의 mL/용액 100 mL.
본원에 사용된, "w/w" 또는 "% w/w" 또는 "중량당 중량"은 용액의 중량 농도, 즉, 중량 중 중량%를 나타낸다("w/w"는 중량당 중량을 나타냄). 본원에서, w/w는 용액 또는 혼합물 100 g 중 구성성분의 그램(g) 수를 나타낸다. 예를 들어, 성분 X 30 g과 물 70 g으로 이루어진 혼합물은 "성분 X 30% w/w"로 표시될 수 있다. 중량당 중량%(% w/w)는 하기와 같이 계산된다: (용질 중량(g)/용액 중량(g)) x 100; 또는 (용질 질량(g)/용액 질량(g)) x 100.
본원에 사용된, "w/v" 또는 "% w/v" 또는 "부피당 중량"은 용액의 질량 농도, 즉, 부피 중 중량%를 나타낸다("w/v"는 부피당 중량을 나타냄). 본원에서, w/v는 용액 100 mL 중 구성성분의 그램(g) 수를 나타낸다. 예를 들어, 성분 X 1 g이 총 부피 100 mL를 만드는 데 사용되는 경우, "성분 X 1% w/v 용액"이 만들어진다. 부피당 중량%(% w/v)는 하기와 같이 계산된다: (용질 질량(g)/용액 부피(mL)) x 100.
본원에 기재된 DVP 또는 DVP-살충 단백질(예를 들어, 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염)은 혼합물 및/또는 조성물을 생성하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 상기 혼합물 및/또는 조성물은 적어도 하나의 DVP로 이루어진다.
DVP를 발현하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드로 형질전환되고 본원에 기재된 조성물, 생성물, 폴리펩타이드 및/또는 식물 중 임의의 것을 사용하여, 해충, 이의 성장, 및/또는 이의 작용에 의해 유발되는 손상, 특히 식물에 대한 손상을 방제할 수 있다.
DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물, 예를 들어 농약 조성물은, 비제한적으로, 에어로졸 및/또는 에어로졸화된 제품, 예를 들어 스프레이, 훈증제, 분말, 분진 및/또는 가스; 종자 드레싱; 경구 제제(예를 들어, 곤충 먹이 등); DVP, DVP-살충 단백질, 및/또는 DVP ORF를 (일시적으로 및/또는 안정적으로) 발현 및/또는 생산하는 유전자이식 유기체, 예를 들어 식물 또는 동물을 포함할 수 있다.
조성물은 분말, 분진, 펠릿, 과립, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드, 용액 등으로 제형화될 수 있으며, 폴리펩타이드를 포함하는 세포 배양물의 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강 또는 농축과 같은 통상적인 수단을 통해 제조될 수 있다. 적어도 하나의 이러한 살충 폴리펩타이드를 함유하는 모든 이러한 조성물에, 폴리펩타이드는 약 1 중량% 내지 약 99 중량%의 농도로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 살충제 조성물은 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을, 목적하는 농업적으로 허용 가능한 담체와 제형화하는 방식으로 제조될 수 있다. 조성물은 투여 전 동결건조, 동결-건조, 건조와 같은 적절한 수단으로, 또는 수성 담체, 배지 또는 적합한 희석제, 예컨대 염수 및/또는 기타 완충액 중에 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 제형화된 조성물은 분진 또는 과립형 물질, 또는 오일(식물성 또는 광물성) 중 현탁액, 또는 물 또는 오일/물 에멀젼, 또는 수화제 형태이거나, 농업적 적용에 적합한 임의의 다른 담체 물질과 조합된 형태일 수 있다. 적합한 농업용 담체는 고체 또는 액체일 수 있으며, 이는 당업계에 널리 알려져 있다. 일부 구현예에서, 제형은 하나 이상의 고체 또는 액체 아쥬반트와 혼합되고, 예를 들어 통상적인 제형 기술을 사용하여 살충 조성물을 적합한 아쥬반트와 함께 균질하게 혼합, 블렌딩 및/또는 분쇄하는 다양한 수단을 통해 제조될 수 있다. 적합한 제형 및 적용 방법은 미국 특허 제6,468,523호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 조성물은 DVP와 부형제를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 DVP-살충 단백질과 부형제를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
분무 가능한 조성물
본 발명의 스프레이 제품의 예는 농업용 현장 분무 가능한 제형과, 주거 또는 상업용 공간의 내부 공간에 사용하기 위한 실내 스프레이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 잔류 스프레이 또는 공간 스프레이를 사용하여 실내 공간에서 곤충 해충을 감소시키거나 제거할 수 있다.
실내 표면 분무(SSI)는 벽, 창문, 바닥 및 천장과 같이 매개체가 존재하는 실내 표면에 가변적인 분무 가능한 부피의 살충제를 적용하는 기술이다. 가변적인 분무 가능한 부피의 주요 목표는 곤충 해충(예를 들어, 파리, 벼룩, 진드기 또는 모기 매개체)의 수명을 단축시켜, 질환 전파를 감소시키거나 방해하는 것이다. 이차적인 영향은 처리 영역 내 곤충 해충의 밀도를 감소시키는 것이다. SSI는 라임병(Lyme disease), 살모넬라, 치쿤군야 바이러스, 지카 바이러스 및 말라리아와 곤충 해충 매개 질환을 방제하는 방법에 사용될 수 있으며, 리슈만편모충증 및 샤가스병과 같이 곤충 매개체에 의해 운반되는 기생충의 관리에도 사용될 수 있다. 지카 바이러스, 치쿤군야 바이러스 및 말라리아를 보유하는 다수의 모기 매개체는 혈액을 섭취한 후 집안에 머무르는 인간과 관계가 있는 모기 매개체를 포함한다. 이러한 모기는 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 분무 가능한 조성물을 이용한 실내 표면 분무(SSI)를 통한 방제에 특히 취약하다. 명칭에서 알 수 있듯이, SSI는 잔류 살충제가 있는 집안의 벽과 다른 표면 상에 조성물을 적용하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 조성물은 이러한 표면과 접촉하게 되는 곤충 해충을 녹다운시킬 것이다. SSI는 사람들이 모기에 물리는 것을 직접적으로 방지하지 못한다. 오히려, 이는 통상적으로 피를 먹은 후의 곤충 해충이 분무된 표면 상에 머물게 되는 경우에 이를 방제한다. 따라서, SSI는 다른 사람에게 감염이 전파되는 것을 방지한다. 효과적이기 위해서, SSI는 해당 영역에 매우 높은 비율로 적용되어야 한다(통상적으로 40% 내지 80% 초과). 따라서, 양호한 잔류 효능과 허용 가능한 냄새를 갖는 본 발명에 따른 스프레이는, 통합된 곤충 해충 매개체 관리 또는 방제 용액의 구성 요소로서 특히 적합하다.
활성 DVP 또는 DVP-살충 단백질이 페인트로 벽 또는 천장과 같은 주거지의 표면에 결합되어야 하는 SSI와 대조적으로, 예를 들어 본 발명의 공간 스프레이 제품은 소정의 기간 동안 일정 부피의 공기를 통해 분포되도록 다수의 작은 살충 액적 생성에 의존한다. 이러한 액적이 표적 곤충 해충에 영향을 미치는 경우, 이는 곤충 해충을 방제하기에 효과적인 DVP 또는 DVP-살충 단백질의 녹다운 유효 용량을 전달한다. 공간 스프레이를 생성하는 전통적인 방법에는, 연막소독(thermal fogging)(이에 의해, 짙은 안개처럼 보이는, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 고밀도 구름이 생성됨)과 초미량살포법(ULV: Ultra Low Volume)(이에 의해, 냉각된 기계적인 에어로졸 생성 기계에 의해 액적이 생성됨)이 포함된다. 에어로졸 캔과 같은 즉시 사용 가능한 에어로졸이 사용될 수 있다.
넓은 영역을 한 번에 처리할 수 있기 때문에, 전술한 방법은 특정 영역에서 날아다니는 곤충 해충 집단을 신속하게 감소시키는 매우 효과적인 방법이다. 그리고, 적용 후 매우 제한된 잔류 활성이 존재하기 때문에, 충분한 효과를 얻기 위해서는 5일 내지 7일 간격으로 반복해야 한다. 이러한 방법은 곤충 해충 수의 신속한 감소가 필요한 전염병 상황에서 특히 효과적일 수 있다. 따라서, 이는 도시 뎅기열 방제 캠페인에 사용될 수 있다.
효과적인 공간 분무법은 일반적으로 하기 특정 원리에 따라 달라진다. 표적 곤충은 통상적으로 스프레이 구름을 통해 날아다닌다(또는 때때로 노출된 표면 상에 머무르는 동안 영향을 받음). 따라서, 스프레이 액적과 표적 곤충 사이의 접촉 효율이 중요하다. 이는, 스프레이 액적이 최적 기간 동안 공기 중에 남아있는 지와 스프레이 액적에 정확한 용량의 살충제가 포함되어 있는 지를 확인하는 방식으로 달성된다. 이러한 2가지 문제는 액적 크기를 최적화하는 방식으로 주로 해결된다. 액적이 너무 크면, 땅에 너무 빨리 떨어지며 적용 동안 마주치게 되는 초목 또는 다른 장애물을 관통하지 못한다(적용 유효 영역을 제한함). 이러한 큰 액적 중 하나가 개별 곤충에 영향을 미치는 경우, 이는 또한 개별 곤충당 고용량이 전달되기 때문에 "과잉치사"가 된다. 액적이 너무 작으면, 공기역학으로 인해 표적 곤충에 증착되지 못하거나(충돌 없음) 대류에 의해 대기로 상승할 수 있다. 공간 분무 적용의 경우 액적의 최적 크기는 체적 중간 직경(VMD: Volume Median Diameter)이 10 미크론 내지 25 미크론인 액적이다.
일부 구현예에서, 분무 가능한 조성물은 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 분무 가능한 조성물은 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
발포체
DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 본 발명의 활성 조성물은, 에어로졸화된 발포체 적용을 포함하는 에어로졸 기반 적용으로서 스프레이 제품으로 이용 가능할 수 있다. 가압된 캔은 에어로졸 형성을 위한 전형적인 수단이다. DVP 또는 DVP-살충 단백질과 호환 가능한 에어로졸 추진제가 사용된다. 바람직하게는, 액화 가스형 추진제가 사용된다.
적합한 추진제에는 압축 공기, 이산화탄소, 부탄 및 질소가 포함된다. 활성 화합물 조성물 중 추진제의 농도는 피리딘 조성물의 약 5 중량% 내지 약 40 중량%, 바람직하게는 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 조성물의 약 15 중량% 내지 약 30 중량%이다.
하나의 구현예에서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 제형은 또한 하나 이상의 발포제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 발포제에는 소듐 라우레스 설페이트, 코카미드 DEA 및 코카미도프로필 베타인이 포함된다. 바람직하게는, 소듐 라우레스 설페이트, 코카미드 DEA 및 코카미도프로필이 조합으로 사용된다. 활성 화합물 조성물 중 발포제(들)의 농도는 조성물의 약 10 중량% 내지 약 25 중량%, 더욱 바람직하게는 15 중량% 내지 20 중량%이다.
이러한 제형이 발포제를 함유하지 않는 에어로졸 적용에 사용되는 경우, 본 발명의 활성 조성물은 사용 직전 혼합할 필요 없이 사용될 수 있다. 하지만, 발포제를 함유하는 에어로졸 제형은 사용 직전 혼합(즉, 진탕)이 필요하다. 또한, 발포제를 함유하는 제형이 장기간 동안 사용되는 경우, 이는 사용 동안 주기적 간격으로 추가 혼합이 필요할 수 있다.
일부 구현예에서, 에어로졸화된 발포체는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 에어로졸화된 발포체는 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
연소 제형(burning formulation)
일부 구현예에서, 주거 지역은 또한, 상기 조성물을 함유하는 양초, 연기 코일(smoke coil) 또는 향 조각과 같은 연소 제형을 사용하는 방식으로 활성 DVP 또는 DVP-살충 단백질 조성물로 처리될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은, 예를 들어 전기적으로 또는 연소에 의해 가열 시 살충 조성물이 방출되는 "가열된" 공기 청정제와 같은 가정용 제품으로 제형화될 수 있다. DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 본 발명의 활성 화합물 조성물은, 에어로졸, 모기 코일, 및/또는 증발기 또는 분무기와 같은 스프레이 제품으로 이용 가능할 수 있다.
일부 구현예에서, 연소 제형은 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 연소 제형은 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
섬유 처리
일부 구현예에서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 살충 효과 조성물을 함유하는 섬유 및 의복을 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 중합체성 재료, 섬유, 실, 직물, 망사 또는 기재 중 DVP 또는 DVP-살충 단백질의 농도는, 예를 들어 0.05 중량% 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.2 중량% 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.4 중량% 내지 8 중량%, 특히 0.5 중량% 내지 5 중량%, 예컨대 1 중량% 내지 3 중량%의 비교적 넓은 농도 범위 내에서 달라질 수 있다.
유사하게, (표면 처리용이든, 섬유, 실, 망사, 직물의 코팅용이든) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 조성물의 농도는, 예를 들어 0.1 중량% 내지 70 중량%, 예컨대 0.5 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 40 중량%, 더욱 바람직하게는 5 중량% 내지 30 중량%, 특히 10 중량% 내지 20 중량%의 비교적 넓은 농도 범위 내에서 달라질 수 있다.
DVP 또는 DVP-살충 단백질의 농도는 녹다운 효능, 내구성 및 독성과 관련된 요건이 충족되도록 적용 분야에 따라 선택될 수 있다. 재료의 특성을 조정할 수도 있기 때문에, 이러한 방식으로 맞춤형 직물 섬유를 얻을 수 있다.
따라서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 유효량은 특정 사용 패턴, 방제에 가장 바람직한 곤충 해충, 및 DVP 또는 DVP-살충 단백질이 사용되는 환경에 따라 달라질 수 있다. 따라서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 유효량은 곤충 해충의 방제가 달성되기에 충분하다.
일부 구현예에서, 섬유 처리는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 섬유 처리는 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
표면 처리 조성물
일부 구현예에서, 본 개시내용은 건물 내부 벽, 바닥 및 천장의 코팅, 및 기재 또는 무생물 재료의 코팅을 위한, DVP와 부형제를 포함하는, 또는 DVP-살충 단백질과 부형제를 포함하는 조성물 또는 제형을 제공한다. DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 본 발명의 조성물은, 목적을 염두해 두고 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. DVP-살충 단백질과 부형제를 포함하는 조성물의 제제는 또한, 화합물의 표면 또는 다른 기재에의 결합을 용이하게 하는 결합제를 함유하도록 제형화될 수 있다. 결합에 유용한 작용제는 당업계에 알려져 있으며, 중합체 형태인 경향이 있다. 특정한 다공성 및/또는 결합 특성을 갖는 벽 표면에 적용되는 조성물에 적합한 결합제 유형은 섬유, 실, 직물 또는 망사와 비교하여 상이할 수 있기 때문에, 당업자는 알려진 교시에 기반하여, 목적하는 표면 및/또는 기재에 기반하여 적합한 결합제를 선택할 수 있다.
전형적인 결합제는 폴리비닐 알코올, 개질된 전분, 폴리비닐 아크릴레이트, 폴리아크릴, 폴리비닐 아세테이트 공중합체, 폴리우레탄 및 개질된 식물성 오일이다. 적합한 결합제는 매우 다양한 중합체 및 공중합체, 및 이들의 조합에서 유도된 라텍스 분산액을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에서 결합제로서 사용하기에 적합한 라텍스는, 공중합된 3개 이상의 상이한 단량체 종을 함유하는 중합체뿐 아니라, 실리콘 또는 폴리우레탄의 분산후 현탁액을 포함하여, 스티렌, 알킬 스티렌, 이소프렌, 부타디엔, 아크릴로니트릴, 저급 알킬 아크릴레이트, 비닐 클로라이드, 비닐리덴 클로라이드, 저급 카르복실산의 비닐 에스테르, 및 알파, 베타-에틸렌계 불포화 카르복실산의 중합체 및 공중합체를 포함한다. 활성 성분을 다른 표면에 결합시키기 위한 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 중합체가 또한 적합할 수 있다.
일부 구현예에서, 표면 처리 조성물은 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 표면 처리 조성물은 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
분산제
일부 예시적인 구현예에서, 본 개시내용에 따른 살충 제형은 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제, 희석제 또는 담체(예컨대, 물), 중합체성 결합제, 및/또는 분산제, 중합제, 유화제, 증점제, 알코올, 방향제, 또는 당업계에 알려진 분무 가능한 살충제의 제조에 사용되는 임의의 다른 불활성 부형제와 같은 추가 구성요소의 조합으로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 조성물은, 현탁액 또는 캡슐 현탁액과 같은 다수의 상이한 형태 또는 제형 유형으로 제조될 수 있다. 당업자는 특정 DVP 또는 DVP-살충 단백질의 특성, 이의 용도 및 또한 이의 적용 유형에 기반하여 관련 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법, 구현예 및 다른 양태에 사용되는 DVP 또는 DVP-살충 단백질은, 현탁액 또는 캡슐 현탁액 제형으로 캡슐화될 수 있다. 캡슐화된 DVP 또는 DVP-살충 단백질은 개선된 세척 견뢰도(wash-fastness), 및 또한 더 긴 활성 기간을 제공할 수 있다. 상기 제형은 유기 기반 또는 수성 기반, 바람직하게는 수성 기반일 수 있다.
일부 구현예에서, 분산제는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 분산제는 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
마이크로캡슐화
본 개시내용에 따른 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 마이크로캡슐화된 DVP 또는 DVP-살충 단백질은 당업계에 알려진 임의의 적합한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 재료를 마이크로캡슐화하는 다양한 공정들이 이전이 개발되었다. 이러한 공정은 3가지 범주로 나뉠 수 있다: 물리적 방법, 상 분리 및 계면 반응. 물리적 방법 범주에서, 마이크로캡슐 벽 재료와 코어 입자가 물리적으로 결합되고, 벽 재료가 코어 입자 주위를 흐르면서 마이크로캡슐이 형성된다. 상 분리 범주에서, 마이크로캡슐은, 벽 재료가 용해되고 코아세르베이션(coacervation)에 의해 연속상으로부터 물리적으로 분리되어 코어 입자 주위에 증착되는 비혼화성 연속상에 코어 재료를 유화 또는 분산시키는 방식으로 형성된다. 계면 반응 범주에서, 마이크로캡슐은 비혼화성 연속상에 코어 재료를 유화 또는 분산시켜 코어 입자의 표면에서 계면 중합 반응이 일어나게 하는 방식으로 형성된다. 마이크로캡슐에 존재하는 DVP 또는 DVP-살충 단백질의 농도는 마이크로캡슐의 0.1 중량% 내지 60 중량%로 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 마이크로캡슐화는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 마이크로캡슐화는 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양을 약 0.005 중량% 내지 약 99 중량% 범위로 함유할 수 있다.
키트, 제형, 분산제, 및 이들의 성분
본 개시내용에 따른 조성물(DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함함), 방법, 구현예 및 다른 양태에 사용되는 제형은, 모든 성분을 물과 함께 혼합하고, 선택적으로 적합한 혼합 및/또는 분산 골재를 사용하는 방식으로 형성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제형은 10℃ 내지 70℃, 바람직하게는 15℃ 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 40℃의 온도에서 형성된다. 일반적으로, (A), (B), (C) 및/또는 (D) 중 하나 이상을 포함하는 제형이 가능하며, 여기서 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염(살충제로서) (A); 고형 중합체 (B); 선택적 추가 첨가제 (D)를 사용하고; 이들을 수성 구성요소 (C) 중에 분산시킬 수 있다. 결합제가 본 발명의 조성물(DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함함)에 존재하는 경우, 이전에 별도로 준비한, 물 중 중합체성 결합제 (B)의 분산액뿐 아니라, 물 중 DVP 또는 DVP-살충 단백질 (A)의 수성 제형을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 별도의 제형은 각각의 제형에서 (A) 및/또는 (B)의 안정화를 위한 추가의 첨가제를 함유할 수 있으며, 상업적으로 입수 가능하다. 두 번째 공정 단계에서, 이러한 미가공 제형과 선택적으로 추가의 물(구성요소 (C))이 첨가된다. 또한, 예를 들어 (A) 및/또는 (B)의 사전 형성된 분산액을 사용하고, 이를 고형 (A) 및/또는 (B)와 혼합하는 것과 같이, 전술한 계획에 기반하여 상기 언급된 성분들을 조합하는 것도 가능하다. 중합체성 결합제 (B)의 분산액은 화학 제조업체에서 제조한 사전 제조된 분산액일 수 있다.
나아가, "수제(hand-made)" 분산액, 즉, 최종 사용자에 의해 소규모로 제조된 분산액을 사용하는 것 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 분산액은, 물 중에 약 20%의 결합제 (B) 혼합물을 제공하고, 혼합물을 90℃ 내지 100℃의 온도로 가열하고, 혼합물을 몇 시간 동안 집중적으로 교반하는 방식으로 제조될 수 있다. 최종 사용자가 본 발명에 따른 공정을 용이하게 사용할 수 있도록 최종 제품으로 제형을 제조하는 것도 가능하다. 물론, 유사하게, 최종 사용자가 추가의 물 (C)를 이용하여 용도에 맞는 목적하는 농도로 희석할 수 있는 농축물을 제조하는 것도 가능하다.
일 구현예에서, SSI 적용 또는 코팅 제형(DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함함)에 적합한 조성물(DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함함)은, 활성 성분과 담체, 예컨대 물을 함유하며, 또한 분산제, 습윤제, 동결 방지제, 증점제, 보존제, 유화제, 및 결합제 또는 스티커에서 선택되는 하나 이상의 보조 제형화제를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 예시적인 고체 제형은 일반적으로 목적하는 입자 크기로 밀링되며, 여기서 입자 크기 분포 d(0.5)는 일반적으로 3 μm 내지 20 μm, 바람직하게는 5 μm 내지 15 μm, 특히 7 μm 내지 12 μm이다.
나아가, 상기 제형을 적어도 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 (A)을 포함하는 제1 구성요소와, 적어도 하나의 중합체성 결합제 (B)를 포함하는 제2 구성요소를 포함하는 키트로 최종 사용자에게 배송하는 것도 가능하다. 추가 첨가제 (D)는 키트의 제3 개별 구성요소일 수 있거나, 구성요소 (A) 및/또는 (B)와 미리 혼합되어 있을 수 있다. 최종 사용자는 키트의 구성요소에 단지 물 (C)를 첨가하고 혼합하는 방식으로 제형을 제조할 수 있다. 키트의 구성요소는 또한 물 중에 있는 제형일 수 있다. 물론, 구성요소 중 하나의 수성 제형을 다른 구성요소(들)의 건조 제형과 조합하는 것도 가능하다. 일례로서, 키트는 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 (A) 및 선택적으로 물 (C)를 포함하는 하나의 제형과, 적어도 하나의 중합체성 결합제 (B), 구성요소 (C)로서의 물 및 선택적으로 구성요소 (D)의 제2 별도의 제형으로 이루어질 수 있다.
구성요소 (A), (B), (C) 및 선택적으로 (D)의 농도는 코팅/처리에 사용되는 기술에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 (A)의 양은, 조성물의 중량을 기준으로, 50 중량% 이하, 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%, 예컨대 10 중량% 내지 40 중량%, 특히 15 중량% 내지 30 중량%일 수 있다. 중합체성 결합제 (B)의 양은, 조성물의 중량을 기준으로, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.5 중량% 내지 15 중량%, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 10 중량%, 특히 1 중량% 내지 5 중량% 범위일 수 있다. 존재하는 경우, 일반적으로, 추가 구성요소 (D)의 양은, 조성물의 중량을 기준으로, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.5 중량% 내지 15 중량%이다. 존재하는 경우, 안료 및/또는 염료 및/또는 항료의 적합한 양은, 조성물의 중량을 기준으로, 일반적으로 0.01 중량% 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 0.2 중량% 내지 2 중량%이다. 전형적인 즉시 사용 가능한 제형은 구성요소 (A), (B), 및 선택적으로 (D)를 0.1% 내지 40%, 바람직하게는 1% 내지 30%로 포함하고, 나머지 양은 물 (C)이다. 최종 사용자가 희석해야 할 농축물의 전형적인 농도는 구성요소 (A), (B), 및 선택적으로 (D)가 5% 내지 70%, 바람직하게는 10% 내지 60%를 차지할 수 있고, 나머지 양은 물 (C)일 수 있다.
예시적인 혼합물, 조성물, 생성물 및 유전자이식 유기체
본 개시내용은 하나 이상의 DVP 또는 하나 이상의 DVP-살충 단백질을 함유하는(또는 유전자이식 유기체의 경우, 이를 발현하거나 달리 생산하는) 혼합물, 조성물, 생성물 및 유전자이식 유기체를 고려한다.
일부 구현예에서, 예시적인 혼합물은 (1) DVP 또는 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 부형제)로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 혼합물은 (1) 하나 이상의 DVP 또는 하나 이상의 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 하나 이상의 부형제(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 부형제)로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 혼합물은 (1) 하나 이상의 DVP 또는 하나 이상의 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 하나 이상의 부형제(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 부형제)로 이루어지며, 여기서 전술한 (1) 또는 (2) 중 어느 하나는 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
DVP 또는 DVP-살충 단백질(본원에 기재된 바와 같음)을 이용하는 조성물, 혼합물, 생성물 및/또는 식물 중 임의의 것을 사용하여, 해충, 이의 성장, 및/또는 이의 작용에 의해 유발되는 손상, 특히 식물에 대한 손상을 방제할 수 있다.
DVP 또는 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 조성물은, 농약 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 농약 조성물은, 비제한적으로, 에어로졸 및/또는 에어로졸화된 제품(예를 들어 스프레이, 훈증제, 분말, 분진 및/또는 가스); 종자 드레싱; 경구 제제(예를 들어, 곤충 먹이 등); 또는 일시적으로 및/또는 안정적으로 DVP 또는 DVP-살충 단백질을 발현 및/또는 생산하는 유전자이식 유기체(예를 들어, 세포, 식물 또는 동물)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 활성 성분은 조성물의 형태로 적용될 수 있으며, 기타 비활성 화합물과 동시에 또는 연속적으로, 처리되는 작물 영역 또는 식물에 적용될 수 있다. 이러한 화합물은 비료, 제초제, 동결보호제, 계면활성제, 세제, 비누, 휴면 오일, 중합체, 및/또는 제형의 단일 적용 후 표적 영역의 장기간 투여를 가능하게 하는 지효성 또는 생분해성 담체 제형일 수 있다. 이러한 비활성 화합물 중 하나 이상은, 목적하는 경우, 제형 분야에서 통상적으로 이용되는 추가의 농업적으로 허용 가능한 담체, 계면활성제 또는 적용 촉진성 아쥬반트와 함께 제조될 수 있다. 적합한 담체와 아쥬반트는 고체 또는 액체일 수 있으며, 제형화 기술에 통상적으로 이용되는 물질, 예를 들어 천연 또는 재생 광물질, 용매, 분산제, 습윤제, 점착제, 결합제 또는 비료에 해당할 수 있다. 마찬가지로, 제형은 살충 제형의 표적 해충에 의해 섭식 또는 소화되도록 식용 "미끼"로 준비하거나 해충 "덫"으로 제조될 수 있다.
본 개시내용의 활성 성분, 또는 본 개시내용의 본원에 기재된 방법에 따라 생산된 DVP 또는 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제로 이루어진 본 개시내용의 농약 조성물을 적용하는 방법에는, 잎 적용, 종자 코팅 및 토양 적용이 포함된다. 일부 구현예에서, 적용 횟수와 적용 속도는 해당 해충에 의한 침입 강도에 따라 달라진다.
DVP 또는 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 조성물은 분말, 분진, 펠릿, 과립, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드, 용액 등으로 제형화될 수 있으며, 폴리펩타이드를 포함하는 세포 배양물의 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강 또는 농축과 같은 통상적인 수단을 통해 제조될 수 있다. 적어도 하나의 이러한 살충 폴리펩타이드를 함유하는 모든 이러한 조성물에, 폴리펩타이드는 약 1 중량% 내지 약 99 중량%의 농도로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, DVP 또는 DVP-살충 단백질(또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염)을 함유하는 조성물은, 본 발명의 방법에 의해 소정의 영역에서 사멸하거나 수가 감소할 수 있는 감수성 해충, 예를 들어 인시목 및/또는 딱정벌레목 해충에 의한 침입을 방지하기 위해 환경 영역에 예방적으로 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 해충은 살충 유효량의 폴리펩타이드를 섭취하거나 이와 접촉하게 된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 살충제 조성물은 DVP 또는 DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 형질전환된 박테리아, 효모 또는 다른 세포, 결정 및/또는 포자 현탁액, 또는 단리된 단백질 구성요소를, 목적하는 농업적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화하는 방식으로 제조될 수 있다. 조성물은 투여 전 동결건조, 동결-건조, 건조와 같은 적절한 수단으로, 또는 수성 담체, 배지 또는 적합한 희석제, 예컨대 염수 및/또는 기타 완충액 중에 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 제형화된 조성물은 분진 또는 과립형 물질, 또는 오일(식물성 또는 광물성) 중 현탁액, 또는 물 또는 오일/물 에멀젼, 또는 수화제 형태이거나, 농업적 적용에 적합한 임의의 다른 담체 물질과 조합된 형태일 수 있다. 적합한 농업용 담체는 고체 또는 액체일 수 있으며, 이는 당업계에 널리 알려져 있다. 일부 구현예에서, 제형은 하나 이상의 고체 또는 액체 아쥬반트와 혼합되고, 예를 들어 통상적인 제형 기술을 사용하여 살충 조성물을 적합한 아쥬반트와 함께 균질하게 혼합, 블렌딩 및/또는 분쇄하는 다양한 수단을 통해 제조될 수 있다. 적합한 제형 및 적용 방법은 미국 특허 제6,468,523호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
본 발명의 사용 방법
식물, 식물 부분 및 종자를 보호하는 방법
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법으로서, DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법으로서, DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 DVP는 본원에 기재된 바와 같은 DVP인 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법으로서, DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 서열번호 187 내지 191 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법으로서, DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 서열번호 187 내지 191 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법으로서, DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 2개 이상의 DVP의 동종중합체 또는 이종중합체를 추가로 포함하고, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법으로서, DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않은 링커에 의해 분리된 2개 이상의 DVP를 포함하는 융합된 단백질이고, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법으로서, DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 링커는 곤충의 내장 또는 혈림프 내부에서 절단 가능한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충을 방제하는 방법으로서, 게놈에 안정적으로 혼입된 발현 카세트를 포함하는 유전자이식 식물을 상기 곤충에게 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 안정적으로 혼입된 발현 카세트는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 농경학적 및/또는 비농경학적 적용으로 무척추동물 해충을 방제하는 방법으로서, 무척추동물 해충 또는 이의 환경, 식물 표면 또는 이의 부분을 포함하는 고체 표면을, 본 발명의 하나 이상의 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 생물학적 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 농경학적 및/또는 비농경학적 적용으로 무척추동물 해충을 방제하는 방법으로서, 무척추동물 해충 또는 이의 환경, 식물 표면 또는 이의 부분을 포함하는 고체 표면을, 본 발명의 적어도 하나의 DVP와 부형제를 포함하는 조성물의 생물학적 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
무척추동물 해충을 방제하는 방법
일부 구현예에서, 본 개시내용은 농경학적 및/또는 비농경학적 적용으로 무척추동물 해충을 방제하는 방법으로서, 무척추동물 해충 또는 이의 환경, 식물 표면 또는 이의 부분을 포함하는 고체 표면을, 본 발명의 적어도 하나의 DVP-살충 단백질과 부형제를 포함하는 조성물의 생물학적 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
(1) 본 발명의 적어도 하나의 DVP; 본 발명의 2개 이상의 DVP; DVP-살충 단백질; 2개 이상의 DVP-살충 단백질; 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 적합한 조성물의 예에는, 액체 용액, 에멀젼, 분말, 과립, 나노입자, 마이크로입자 또는 이들의 조합의 형태로 전달되는 비활성 성분으로 제형화된 상기 조성물이 포함된다.
일부 구현예에서, 무척추동물 해충으로부터 농작물을 보호하기 위해서 본 발명의 화합물, 혼합물 또는 조성물과의 접촉을 달성하기 위해, 화합물 또는 조성물은 전형적으로 파종 전 작물의 종자에, 작물 식물의 경엽(예를 들어, 잎, 줄기, 꽃, 과실)에, 또는 작물이 식재되기 전 또는 후 토양 또는 다른 성장 매체에 적용된다.
접촉 방법의 하나의 구현예는 분무를 이용한 것이다. 대안적으로, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 과립형 조성물이 식물 경엽 또는 토양에 적용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한, 액체 제형의 토양 관주(soil drench), 토양에 대한 과립 제형, 육모 상자 처리 또는 이식물의 침지로 적용되는 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물과 식물을 접촉시키는 방식으로 식물 흡수를 통해 효과적으로 전달될 수 있다. 주목할 점은, 토양 관주 액체 제형 형태의 본 개시내용의 조성물이다. 또한 주목할 점은, 무척추동물 해충 또는 이의 환경을 DVP 또는 DVP-살충 단백질의 생물학적 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 무척추동물 해충을 방제하는 방법이다. 추가로 주목할 점은, 일부 예시적인 구현예에서, 예시적인 방법은 토양 환경을 고려하고, 조성물이 토양 관주 제형으로 토양에 적용된다는 점이다. 추가로 주목할 점은, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 침입 장소에의 국소 적용으로도 효과적이라는 점이다. 다른 접촉 방법에는, 직접 및 잔류 스프레이, 공중 스프레이, 겔, 종자 코팅, 마이크로캡슐화, 전신 흡수, 미끼, 귀표, 볼루스, 분무기, 훈증제, 에어로졸, 분진 및 다수의 기타 수단을 통한 본 발명의 화합물 또는 조성물의 적용이 포함된다. 접촉 방법의 하나의 구현예는 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함하는 형태적으로 안정한 비료 과립, 스틱 또는 정제이다. 본 발명의 화합물은 또한 무척추동물 방제 장치(예를 들어, 곤충 그물, 의류에의 적용, 캔들 제형에의 적용 등)를 제작하기 위한 재료에 함침될 수 있다.
일부 구현예에서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 또한 무척추동물 해충으로부터 종자를 보호하기 위한 종자 처리에 유용하다. 본 개시내용 및 청구범위의 맥락에서, 종자 처리는 전형적으로 본 발명의 조성물로 제형화된 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 생물학적 유효량을 종자와 접촉시키는 것을 의미한다. 이러한 종자 처리는 무척추동물 토양 해충으로부터 토양을 보호하고, 일반적으로 발아 종자로부터 발달하는 묘목의 토양과 접촉하고 있는 뿌리 및 다른 식물을 보호할 수 있다. 종자 처리는 또한 발달하는 식물 내에서 DVP 또는 DVP-살충 단백질의 전위에 의해 경엽 보호를 제공할 수 있다. 종자 처리는 특수 형질이 발현되도록 유전적으로 형질전환된 식물이 발아하게 되는 종자를 포함하여 모든 유형의 종자에 적용될 수 있다. 또한, DVP 또는 DVP-살충 단백질은 식물 또는 이의 부분, 예를 들어 이미 형질전환된 식물 세포 또는 식물 종자, 예를 들어 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는 글리포세이트 아세틸트랜스퍼라아제와 같은 제초제 내성을 발현하는 것들로 형질전환될 수 있다.
종자 처리의 하나의 방법은 종자를 파종하기 전 종자에, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염(즉, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 부형제를 포함하는 제형화된 조성물 또는 혼합물로서)을 분무하거나 살포하는 방식이다. 종차 저리용으로 제형화된 조성물은 일반적으로 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, 필름 형성제 또는 접착제로 이루어진다. 따라서, 전형적으로, 본 개시내용의 종자 코팅 조성물은 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 생물학적 유효량과, 필름 형성제 또는 접착제로 이루어진다. 종자는 유동성 현탁액 농축물을 직접 종자의 텀블링 베드에 분무한 후, 종자를 건조시키는 방식으로 코팅될 수 있다. 대안적으로, 수화제, 용액, 유현탁액, 유화성 농축물 및 수중 에멀젼과 같은 다른 제형 유형이 종자에 분무될 수 있다. 이러한 공정은 종자에 필름 코팅을 적용하는 데 특히 유용하다. 다양한 코팅 기계 및 공정이 당업자에게 이용 가능하다. 적합한 공정은 문헌[P. Kosters et al., Seed Treatment: Progress and Prospects, 1994 BCPC Monograph No. 57] 및 상기 문헌에 열거된 참고문헌에 열거된 것들을 포함하며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
처리된 종자는 전형적으로 DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을, 종자 100 kg당 약 0.01 g 내지 1 kg 범위(즉, 처리 전 종자의 약 0.00001 중량% 내지 1 중량%)의 양으로 포함한다. 종자 처리용으로 제형화된 유동성 현탁액은 전형적으로 활성 성분 약 0.5% 내지 약 70%, 필름 형성 접착제 약 0.5% 내지 약 30%, 분산제 약 0.5% 내지 약 20%, 증점제 0% 내지 약 5%, 안료 및/또는 염료 0% 내지 약 5%, 소포제 0% 내지 약 2%, 보존제 0% 내지 약 1%, 및 휘발성 액체 희석제 0% 내지 약 75%를 포함한다.
조성물의 사용 방법
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충을 방제하기 위해 (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물을 사용하는 방법으로서, 여기서 DVP는 본원에 기재된 DVP, 예를 들어 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 DVP 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되고, 상기 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 방법은 혼합물을 제조하는 단계, 이어서 상기 혼합물을 곤충의 서식지에 적용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충을 방제하기 위해 (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물을 사용하는 방법으로서, 여기서 곤충은 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 방법을 제공한다: 아케마 스핑크스 나방(Achema Sphinx Moth)(박각시벌레)(유모르파 아케몬(Eumorpha achemon)); 알파파 모충(Alfalfa Caterpillar)(콜리아스 유리테메(Colias eurytheme)); 아몬드 나방(Almond Moth)(카우드라 카우텔라(Caudra cautella)); 아모르비아 나방(Amorbia Moth)(아모르비아 후메로사나(Amorbia humerosana)); 거염벌레(Armyworm)(스포도프테라 종, 예를 들어 엑시구아(exigua), 프루기페르다(frugiperda), 리토랄리스(littoralis), 슈달레티아 우니푼크타(Pseudaletia unipuncta)); 아티초크 플럼 나방(Artichoke Plume Moth)(플라티프틸리아 카르두이닥틸라(Platyptilia carduidactyla)); 아잘레아 모충(Azalea Caterpillar)(다타나 마조르(Datana major)); 도롱이벌레(Bagworm)(티리도프테릭스 에페메라에포르미스(Thyridopteryx ephemeraeformis)); 바나나 나방(Banana Moth)(히페르콤페 스크리보니아(Hypercompe scribonia)); 바나나 팔랑나비(Banana Skipper)(에리오노타 트락스(Erionota thrax)); 블랙헤드 싹벌레(Blackheaded Budworm)(아클레리스 글로베라나(Acleris gloverana)); 캘리포니아 오크나무벌레(California Oakworm)(프리가니디아 칼리포르니카(Phryganidia californica)); 봄 자벌레(Spring Cankerworm)(팔레아크리타 메리카타(Paleacrita merriccata)); 체리 과일벌레(Cherry Fruitworm)(그라폴리타 파카르디(Grapholita packardi)); 중국 표식 나방(China Mark Moth)(님풀라 스타그나타(Nymphula stagnata)); 감귤류 야도충(Citrus Cutworm)(자일로미게스 쿠리알리스(Xylomyges curialis)); 코들링나방(Codling Moth)(시디아 포모넬라(Cydia pomonella)); 크랜베리 과일벌레(Cranberry Fruitworm)(아크로바시스 바시니(Acrobasis vaccinii)); 십자줄무늬 양배추벌레(Cross-striped Cabbageworm)(에베르게스티스 리모살리스(Evergestis rimosalis)); 야도충(Cutworm)(녹투이드(Noctuid) 종, 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon)); 더글라스 전나무 독나방(Douglas Fir Tussock Moth)(오르기아 슈도츄가타(Orgyia pseudotsugata)); 엘로 나방(Ello Moth)(박각시벌레(Hornworm))(에리니스 엘로(Erinnyis ello)); 느릅나무 자벌레(Elm Spanworm)(에노모스 서브시그나리아(Ennomos subsignaria)); 유럽 포도덩굴 나방(European Grapevine Moth)(로베시아 보트라나(Lobesia botrana)); 유럽 팔랑나비(European Skipper)(티멜리쿠스 리네올라(Thymelicus lineola)); 에섹스 팔랑나비(Essex Skipper); 가을 웹웜(Fall Webworm)(멜리소푸스 라티페레아누스(Melissopus latiferreanus)); 필버트 잎말이나방(Filbert Leafroller)(아르킵스 로사누스(Archips rosanus)); 과일나무 잎말이나방(Fruittree Leafroller)(아르킵스 아르기로스필리아(Archips argyrospilia)); 포도열매 나방(Grape Berry Moth)(파랄로베시아 비테아나(Paralobesia viteana)); 포도 잎말이나방(Grape Leafroller)(플라티노타 스툴타나(Platynota stultana)); 포도잎 스켈레토나이저(Grapeleaf Skeletonizer)(하리시나 아메리카나(Harrisina americana))(땅에서만); 녹색 클로버벌레(Green Cloverworm)(플라티페나 스카브라(Dryocampa rubicunda)); 녹색줄무늬 메이플벌레(Greenstriped Mapleworm)(드리오캄파 루비쿤다(Dryocampa rubicunda)); 군모소스-바트라케드라 코모사에(Gummosos-Batrachedra comosae)(호드게스(Hodges)); 집시 나방(Gypsy Moth)(리만트리아 디스파르(Lymantria dispar)); 독미나리 자벌레(Hemlock Looper)(람브디나 피셀라리아(Lambdina fiscellaria)); 박각시벌레(만두카(Manduca) 종); 배추흰나비 유충(Imported Cabbageworm)(피에리스 라파에(Pieris rapae)); 이오 나방(Io Moth)(아우토메리스 이오(Automeris io)); 잭 파인 싹벌레(Jack Pine Budworm)(코리스토네우라 피누스(Choristoneura pinus)); 밝은갈색 사과 나방(Light Brown Apple Moth)(에피피아스 포스트비타나(Epiphyas postvittana)); 멜론벌레(Melonworm)(디아파니아 히알리나타(Diaphania hyalinata)); 미모사 웹웜(Mimosa Webworm)(호마다울라 아니소센트라(Homadaula anisocentra)); 부등변줄무늬 잎말이나방(Obliquebanded Leafroller)(코리스토네우라 로사세아나(Choristoneura rosaceana)); 협죽도 나방(Oleander Moth)(신토메이다 에필라이스(Syntomeida epilais)); 잡식성 잎말이나방(Omnivorous Leafroller)(플라이노타 스툴타나(Playnota stultana)); 잡식성 자벌레(Omnivorous Looper)(사불로데스 아에그로타타(Sabulodes aegrotata)); 오렌지독(Orangedog)(파필리오 크레스폰테스(Papilio cresphontes)); 오렌지 토르트릭스(Orange Tortrix)(아르기로타에니아 시트라나(Argyrotaenia citrana)); 동양 과일 나방(Oriental Fruit Moth)(그라폴리타 몰레스타(Grapholita molesta)); 복숭아 가지 천공충(Peach Twig Borer)(아나르시아 리네아텔라(Anarsia lineatella)); 소나무 나비(Pine Butterfly)(네오파시아 메나피아(Neophasia menapia)); 꼬투리벌레(Podworm); 붉은줄무늬 잎말이나방(Redbanded Leafroller)(아르기로타에니아 벨루티나나(Argyrotaenia velutinana)); 붉은혹 모충(Redhumped Caterpillar)(스키주라 콘시나(Schizura concinna)); 린드웜 복합체(Rindworm Complex); 안장모양 모충(Saddleback Caterpillar)(시비네 스티물레아(Sibine stimulea)); 안장 돌출형 모충(Saddle Prominent Caterpillar)(헤테로캄파 구티비타(Heterocampa guttivitta)); 염습지 모충(Saltmarsh Caterpillar)(에스티그메네 아크레아(Estigmene acrea)); 소드 웹웜(Sod Webworm)(크람부스(Crambus) 종); 자벌레(Spanworm)(에노모스 서브시그나리아(Ennomos subsignaria)); 가을 황충(Fall Cankerworm)(알소필라 포메타리아(Alsophila pometaria)); 가문비나무 싹벌레(Spruce Budworm)(코리스토네우라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana)); 텐트 모충(Tent Caterpillar)(각종 라시오캄프과); 테클라-테클라 바실리데스(Thecla-Thecla Basilides)(게이르(Geyr))(테클라 바실리데스(Thecla basilides)); 담배 박각시벌레(Tobacco Hornworm)(만두카 섹스타(Manduca sexta)); 담배 나방(Tobacco Moth)(에페스티아 엘루텔라(Ephestia elutella)); 술이달린 사과 싹나방(Tufted Apple Budmoth)(플라티노타 이다에우살리스(Platynota idaeusalis)); 가지 천공충(Twig Borer)(아나르시아 리네아텔라(Anarsia lineatella)); 무늬 야도충(Variegated Cutworm)(페리드로마 사우시아(Peridroma saucia)); 무늬 잎말이나방(Variegated Leafroller)(플라티노타 플라베다나(Platynota flavedana)); 벨벳콩 모충(Velvetbean Caterpillar)(안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis)); 호두 모충(Walnut Caterpillar)(다타나 인테게리마(Datana integerrima)); 웹웜(히판트리아 쿠네아(Hyphantria cunea)); 서양 독나방(Western Tussock Moth)(오르기아 베투스타(Orgyia vetusta)); 남부 옥수수대 천공충(Southern Cornstalk Borer)(디아트라에아 크람비도이데스(Diatraea crambidoides)); 옥수수 귀벌레(Corn Earworm); 고구마 바구미(Sweet potato weevil); 고추 바구미(Pepper weevil); 감귤류 뿌리 바구미(Citrus root weevil); 딸기 뿌리 바구미(Strawberry root weevil); 피칸 바구미(Pecan weevil); 필버트 바구미(Filbert weevil); 벼물 바구미(Ricewater weevil); 알팔파 바구미(Alfalfa weevil); 클로버 바구미(Clover weevil); 차나무좀(Tea shot-hole borer); 뿌리 바구미(Root weevil); 사탕수수 딱정벌레(Sugarcane beetle); 커피열매 천공충(Coffee berry borer); 새포아풀 바구미(Annual blue grass weevil)(리스트로노투스 마쿨리콜리스(Listronotus maculicollis)); 아시아 정원 딱정벌레(Asiatic garden beetle)(말라데라 카스타네아(Maladera castanea)); 유럽 풍뎅이(European chafer)(리조트로쿠스 마잘리스(Rhizotroqus majalis)); 녹색 풍뎅이(Green June beetle)(코티니스 니티다(Cotinis nitida)); 일본 딱정벌레(Japanese beetle)(포필리아 자포니카(Popillia japonica)); 5월 또는 6월 딱정벌레(May or June beetle)(필로파가(Phyllophaga) 종); 북부 마스크 풍뎅이(Northern masked chafer)(시클로세팔라 보레알리스(Cyclocephala borealis)); 동양 딱정벌레(Oriental beetle)(아노말라 오리엔탈리스(Anomala orientalis)); 남부 마스크 풍뎅이(Southern masked chafer)(시클로세팔라 루리다(Cyclocephala lurida)); 바구미(Billbug)(쿠르쿨리오노이데아(Curculionoidea)); 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti); 부세올라 푸스카(Busseola fusca); 킬로 수프레살리스(Chilo suppressalis); 쿨렉스 피피엔스(Culex pipiens); 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스(Culex quinquefasciatus); 디아브로티카 비르기페라(Diabrotica virgifera); 디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis); 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera); 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea); 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens); 렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata); 오스트리니아 푸르나칼리스(Ostrinia furnacalis); 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis); 펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella); 플로디아 인테르푼크텔라(Plodia interpunctella); 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella); 슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens); 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua); 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda); 스포도프테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis); 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni); 및/또는 잔토갈레루카 루테올라(Xanthogaleruca luteola).
일부 구현예에서, 본 발명은 곤충으로부터 식물을 보호하는 방법으로서, 하나 이상의 DVP 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 식물을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 본원에 기재된 DVP, 예를 들어 살충성 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리펩타이드(DVP) 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되고, 상기 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 혼합물을 해충의 서식지, 또는 해충의 공격을 받기 쉬운 식물 또는 동물에 적용하는 것인 방법을 제공한다: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T이고; 여기서 X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거됨).
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 DVP는 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법으로서, (1) DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과, (2) 부형제를 포함하는 혼합물의 살충 유효량을 해충의 서식지에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 해충은 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 방법을 제공한다: 아케마 스핑크스 나방(박각시벌레)(유모르파 아케몬); 알파파 모충(콜리아스 유리테메); 아몬드 나방(카우드라 카우텔라); 아모르비아 나방(아모르비아 후메로사나); 거염벌레(스포도프테라 종, 예를 들어 엑시구아, 프루기페르다, 리토랄리스, 슈달레티아 우니푼크타); 아티초크 플럼 나방(플라티프틸리아 카르두이닥틸라); 아잘레아 모충(다타나 마조르); 도롱이벌레(티리도프테릭스 에페메라에포르미스); 바나나 나방(히페르콤페 스크리보니아); 바나나 팔랑나비(에리오노타 트락스); 블랙헤드 싹벌레(아클레리스 글로베라나); 캘리포니아 오크나무벌레(프리가니디아 칼리포르니카); 봄 자벌레(팔레아크리타 메리카타); 체리 과일벌레(그라폴리타 파카르디); 중국 표식 나방(님풀라 스타그나타); 감귤류 야도충(자일로미게스 쿠리알리스); 코들링나방(시디아 포모넬라); 크랜베리 과일벌레(아크로바시스 바시니); 십자줄무늬 양배추벌레(에베르게스티스 리모살리스); 야도충(녹투이드 종, 아그로티스 입실론); 더글라스 전나무 독나방(오르기아 슈도츄가타); 엘로 나방(박각시벌레)(에리니스 엘로); 느릅나무 자벌레(에노모스 서브시그나리아); 유럽 포도덩굴 나방(로베시아 보트라나); 유럽 팔랑나비(티멜리쿠스 리네올라)(에섹스 팔랑나비); 가을 웹웜(멜리소푸스 라티페레아누스); 필버트 잎말이나방(아르킵스 로사누스); 과일나무 잎말이나방(아르킵스 아르기로스필리아); 포도열매 나방(파랄로베시아 비테아나); 포도 잎말이나방(플라티노타 스툴타나); 포도잎 스켈레토나이저(하리시나 아메리카나)(땅에서만); 녹색 클로버벌레(플라티페나 스카브라); 녹색줄무늬 메이플벌레(드리오캄파 루비쿤다); 군모소스-바트라케드라; 코모사에(호드게스); 집시 나방(리만트리아 디스파르); 독미나리 자벌레(람브디나 피셀라리아); 박각시벌레(만두카 종); 배추흰나비 유충(피에리스 라파에); 이오 나방(아우토메리스 이오); 잭 파인 싹벌레(코리스토네우라 피누스); 밝은갈색 사과 나방(에피피아스 포스트비타나); 멜론벌레(디아파니아 히알리나타); 미모사 웹웜(호마다울라 아니소센트라); 부등변줄무늬 잎말이나방(코리스토네우라 로사세아나); 협죽도 나방(신토메이다 에필라이스); 잡식성 잎말이나방(플라이노타 스툴타나); 잡식성 자벌레(사불로데스 아에그로타타); 오렌지독(파필리오 크레스폰테스); 오렌지 토르트릭스(아르기로타에니아 시트라나); 동양 과일 나방(그라폴리타 몰레스타); 복숭아 가지 천공충(아나르시아 리네아텔라); 소나무 나비(네오파시아 메나피아); 꼬투리벌레; 붉은줄무늬 잎말이나방(아르기로타에니아 벨루티나나); 붉은혹 모충(스키주라 콘시나); 린드웜 복합체; 안장모양 모충(시비네 스티물레아); 안장 돌출형 모충(헤테로캄파 구티비타); 염습지 모충(에스티그메네 아크레아); 소드 웹웜(크람부스 종); 자벌레(에노모스 서브시그나리아); 가을 황충(알소필라 포메타리아); 가문비나무 싹벌레(코리스토네우라 푸미페라나); 텐트 모충(각종 라시오캄프과); 테클라-테클라 바실리데스(게이르)(테클라 바실리데스); 담배 박각시벌레(만두카 섹스타); 담배 나방(에페스티아 엘루텔라); 술이달린 사과 싹나방(플라티노타 이다에우살리스); 가지 천공충(아나르시아 리네아텔라); 무늬 야도충(페리드로마 사우시아); 무늬 잎말이나방(플라티노타 플라베다나); 벨벳콩 모충(안티카르시아 겜마탈리스); 호두 모충(다타나 인테게리마); 웹웜(히판트리아 쿠네아); 서양 독나방(오르기아 베투스타); 남부 옥수수대 천공충(디아트라에아 크람비도이데스); 옥수수 귀벌레; 고구마 바구미; 고추 바구미; 감귤류 뿌리 바구미; 딸기 뿌리 바구미; 피칸 바구미; 필버트 바구미; 벼물 바구미; 알팔파 바구미; 클로버 바구미; 차나무좀; 뿌리 바구미; 사탕수수 딱정벌레; 커피열매 천공충; 새포아풀 바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 아시아 정원 딱정벌레(말라데라 카스타네아); 유럽 풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색 풍뎅이(코티니스 니티다); 일본 딱정벌레(포필리아 자포니카); 5월 또는 6월 딱정벌레(필로파가 종); 북부 마스크 풍뎅이(시클로세팔라 보레알리스); 동양 딱정벌레(아노말라 오리엔탈리스); 남부 마스크 풍뎅이(시클로세팔라 루리다); 바구미(쿠르쿨리오노이데아); 아에데스 아에깁티; 부세올라 푸스카; 킬로 수프레살리스; 쿨렉스 피피엔스; 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트라에아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌라리스; 펙티노포라 고시피엘라; 플로디아 인테르푼크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 니; 및/또는 잔토갈레루카 루테올라.
작물 및 해충
이러한 방법에 의해 방제될 수 있는 특정 작물 해충 및 곤충에는 하기가 포함된다: 바퀴목(Dictyoptera)(바퀴벌레); 흰개미목(Isoptera)(흰개미); 메뚜기목(Orthoptera)(로커스트(locust), 그래스호퍼(grasshopper) 및 귀뚜라미); 쌍시목(집파리, 모기, 체체파리, 각다귀 및 초파리); 막시목(Hymenoptera)(개미, 말벌, 꿀벌, 잎벌(saw-fly), 맵시벌(ichneumon fly) 및 혹벌(gall-wasp)); 이목(Anoplura)(흡혈이(biting and sucking lice)); 벼룩목(Siphonaptera)(벼룩); 및 반시목(벌레 및 진딧물)뿐 아니라, 진드기목(진드기 및 응애)과 같은 거미류, 및 이러한 유기체 각각에 서식하는 기생충.
"해충"에는, 비제한적으로, 곤충, 진균, 박테리아, 선충, 응애, 진드기 등이 포함된다.
곤충 해충에는, 비제한적으로, 딱정벌레목, 쌍시목, 막시목, 인시목, 털이목(Mallophaga), 동시아목(Homoptera), 반시목, 메뚜기목, 총채벌레목, 집게벌레목(Dermaptera), 흰개미목, 이목, 벼룩목, 날도래목(Trichoptera) 등에서 선택되는 곤충이 포함된다. 더욱 특히, 곤충 해충에는, 딱정벌레목, 인시목 및 쌍시목이 포함된다.
살충성 폴리펩타이드를 이용한 처리에 적합한 농업, 가정 및/또는 의학적/수의학적 중요성이 있는 곤충에는, 비제한적으로, 하기 강 및 목의 구성원이 포함된다:
딱정벌레목에는 아목(suborder)인 식육아목(Adephaga)과 다식아목(Polyphaga)이 포함된다. 식육아목에는 상과(superfamily)인 딱정벌레상과(Caraboidea)와 물맴이상과(Gyrinoidea)가 포함된다. 다식아목에는 물땡땡이상과(Hydrophiloidea), 반날개상과(Staphylinoidea), 병대벌레상과(Cantharoidea), 개미붙이상과(Cleroidea), 방아벌레상과(Elateroidea), 다스킬루스상과(Dascilloidea), 여울벌레상과(Dryopoidea), 둥근가시벌레상과(Byrrhoidea), 머리대장상과(Cucujoidea), 가뢰상과(Meloidea), 꽃벼룩과(Mordelloidea), 거저리상과(Tenebrionoidea), 개나무좀상과(Bostrichoidea), 풍뎅이상과(Scarabaeoidea), 하늘소상과(Cerambycoidea), 잎벌레상과(Chrysomeloidea) 및 바구미상과(Curculionoidea)가 포함된다. 딱정벌레상과에는 길앞잡이과(Cicindelidae), 딱정벌레과(Carabidae) 및 물방개과(Dytiscidae)가 포함된다. 물맴이상과에는 물맴이과(Gyrinidae)가 포함된다. 물땡땡이상과에는 물땡땡이과(Hydrophilidae)가 포함된다. 반날개상과에는 송장벌레과(Silphidae)와 반날개과(Staphylinidae)가 포함된다. 병대벌레상과에는 병대벌레과(Cantharidae)와 반딧불이과(Lampyridae)과 포함된다. 개미붙이상과에는 개미붙이과(Cleridae)와 수시렁이과(Dermestidae)가 포함된다. 방아벌레상과에는 방아벌레과(Elateridae)와 비단벌레과(Buprestidae)가 포함된다. 머리대장상과에는 무당벌레과(Coccinellidae)가 포함된다. 가뢰상과에는 가뢰과가 포함된다. 거저리상과에는 거저리과(Tenebrionidae)가 포함된다. 풍뎅이상과에는 사슴벌레붙이과(Passalidae)와 풍뎅이과(Scarabaeidae)가 포함된다. 하늘소상과에는 하늘소과(Cerambycidae)가 포함된다. 잎벌레상과에는 잎벌레과가 포함된다. 바구미상과에는 바구미과(Curculionidae)와 나무좀과(Scolytidae)가 포함된다.
딱정벌레목의 예에는, 비제한적으로, 미국콩바구미(아칸토셀리데스 옵텍투스(Acanthoscelides obtectus)), 잎벌레(leaf beetle)(아겔라스티카 알니(Agelastica alni)), 대유동방아벌레(click beetle)(아그리오테스 리네아투스(Agriotes lineatus), 아그리오테스 옵스쿠루스(Agriotes obscurus), 아그리오테스 비콜로르(Agriotes bicolor)), 곡류 해충(grain beetle)(아하스베루스 아드베나(Ahasverus advena)), 여름 샤퍼(summer schafer)(암피말론 솔스티티알리스(Amphimallon solstitialis)), 마누 좀벌레(furniture beetle)(아노비움 푼크타툼(Anobium punctatum), 안토노무스(Anthonomus) 종)(바구미), 피그미 만골드 딱정벌레(Pygmy mangold beetle)(아토마리아 리네아리스(Atomaria linearis)), 카펫 딱정벌레(안트레누스(Anthrenus) 종, 아타게누스(Attagenus) 종), 동부콩바구미(칼로소브루쿠스 마쿨라테스(Callosobruchus maculates)), 튀긴 과일 딱정벌레(fried fruit beetle)(카르포필루스 헤미프테루스(Carpophilus hemipterus)), 양배추 꼬투리 바구미(세우토린쿠스 아시밀리스(Ceutorhynchus assimilis)), 레이프 윈터 줄기 바구미(rape winter stem weevil)(세우토린쿠스 피시타르시스(Ceutorhynchus picitarsis)), 청동방아벌레(wireworm)(코노데루스 베스페르티누스(Conoderus vespertinus) 및 코노데루스 팔리(Conoderus falli)), 바나나 바구미(코스모폴리테스 소르디두스(Cosmopolites sordidus)), 뉴질랜드 딱정벌레 유충(코스텔리트라 제알란디카), 6월 딱정벌레(코티니스 니티다), 해바라기 줄기 바구미(실린드로콥투루스 아드스페르수스(Cylindrocopturus adspersus)), 라더 딱정벌레(larder beetle)(데르메스테스 라르다리우스(Dermestes lardarius)), 옥수수 뿌리벌레(디아브로티카 비르기페라, 디아브로티카 비르기페라 비르기페라 및 디아브로티카 바르베리(Diabrotica barberi)), 멕시코 콩 딱정벌레(에필라크나 바리베스티스), 올드 하우스 천공충(old house borer)(힐로트로페스 바줄루스(Hylotropes bajulus)), 자주개자리 바구미(히페라 포스티카), 샤이니 거미 딱정벌레(shiny spider beetle)(기비움 프실로이데스(Gibbium psylloides)), 담배 딱정벌레(라시오데르마 세리코르네(Lasioderma serricorne)), 콜로라도 감자 딱정벌레(렙티노타르사 데셈리네아타), 릭투스 딱정벌레(Lyctus beetle)(릭투스 종), 꽃가루 딱정벌레(멜리게테스 아에네우스(Meligethes aeneus)), 일반 콕샤퍼(common cockshafer)(멜롤론타 멜롤론타(Melolontha melolontha)), 미국 거미 딱정벌레(메지움 아메리카눔(Mezium americanum)), 금빛 거미 딱정벌레(닙투스 홀로레우쿠스(Niptus hololeucus)), 곡식 딱정벌레(오리자에필루스 수리나멘시스(Oryzaephilus surinamensis) 및 오리자에필루스 메르카토르(Oryzaephilus mercator)), 블랙 바인 바구미(black vine weevil)(오티오린쿠스 술카투스(Otiorhynchus sulcatus)), 머스타드 딱정벌레(파에돈 코클레아리아에(Phaedon cochleariae)), 십자화과 벼룩 딱정벌레(필로트레타 크루시페라에), 줄무늬 벼룩 딱정벌레(필로트레타 스트리올라타(Phyllotreta striolata)), 양배추 줄기 벼룩 딱정벌레(프실로이데스 크리소세팔라, 프티누스(Psylliodes chrysocephala, Ptinus) 종)(거미 딱정벌레), 가루좀벌레(리조페르타 도미니카(Rhizopertha dominica)), 완두콩 및 콩 바구미(시토나 리네아투스(Sitona lineatus)), 쌀 및 곡물 딱정벌레(시토필루스 오리자에(Sitophilus oryzae) 및 시토필루스 그라나리에스(Sitophilus granaries)), 붉은 해바라기씨 바구미(red sunflower seed weevil)(스미크로닉스 풀부스(Smicronyx fulvus)), 약국 딱정벌레(drugstore beetle)(스테고비움 파니세움(Stegobium paniceum)), 황색 밀웜 딱정벌레(테네브리오 몰리토르), 밀가루 딱정벌레(트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum) 및 트리볼리움 콘푸숨(Tribolium confusum)), 창고 및 캐비넷 딱정벌레(트로고데르마(Trogoderma)종) 및 해바라기 딱정벌레(지고그라마 엑스클라마티오니스(Zygogramma exclamationis))가 포함된다.
집게벌레목(집게벌레)의 예에는, 비제한적으로, 유럽 집게벌레(포르피쿨라 아우리쿨라리아(Forficula auricularia)) 및 줄무늬 집게벌레(라비두라 리파리아(Labidura riparia))가 포함된다.
딕본테라( Dictvontera )의 예에는, 비제한적으로, 동양 바퀴벌레(블라타 오리엔탈리스(Blatta orientalis)), 독일 바퀴벌레(블라텔라 게르마니카(Blatella germanica)), 마데이라 바퀴벌레(Madeira cockroach)(류코파에아 마데라에(Leucophaea maderae)), 미국 바퀴벌레(페리플라네타 아메리카나(Periplaneta americana)) 및 먹바퀴(smokybrown cockroach)(페리플라네타 풀리기노사(Periplaneta fuliginosa))가 포함된다.
디플로노다( Diplonoda )의 예에는, 비제한적으로, 점무늬 뱀 노래기(spotted snake millipede)(블라니울루스 구툴라투스(Blaniulus guttulatus)), 납작등 노래기(flat-back millipede)(브라키데스무스 수페루스(Brachydesmus superus)), 온실 노래기(옥시두스 그라실리스(Oxidus gracilis))가 포함된다.
쌍시목에는 아목인 긴뿔파리아목(Nematocera), 단각목(Brachycera) 및 집파리하목(Cyclorrhapha)이 포함된다. 긴뿔파리아목에는 각다구과(Tipulidae), 나방파리과(Psychodidae), 모기과(Culicidae), 등에모기과(Ceratopogonidae), 모기붙이과(Chironomidae), 먹파리과(Simuliidae), 털파리과(Bibionidae) 및 혹파리과(Cecidomyiidae)가 포함된다. 단각목에는 동애등애과(Stratiomyidae), 등에과(Tabanidae), 좀파리매과(Therevidae), 파리매과(Asilidae), 마이디다에(Mydidae), 재니등에과(Bombyliidae) 및 장다리파리과(Dolichopodidae)가 포함된다. 집파리하목에는 분과인 분열이마무리집단(Aschiza)과 분열이마무리집단이 포함된다. 분열이마무리집단에는 벼룩파리과(Phoridae), 꽃등에과(Syrphidae) 및 벌붙이파리과(Conopidae)가 포함된다. 분열이마무리집단에는 무판아류(Acalyptratae)와 유판아류(Calyptratae)가 포함된다. 무판아류에는 느시과(Otitidae), 과실파리과(Tephritidae), 굴파리과(Agromyzidae) 및 초파리과(Drosophilidae)가 포함된다. 유판아류에는 이파리과(Hippoboscidae), 쇠파리과(Oestridae), 기생파리과(Tachinidae), 꽃파리과(Anthomyiidae), 집파리과(Muscidae), 검정파리과(Calliphoridae) 및 쉬파리과(Sarcophagidae)가 포함된다.
쌍시목의 예에는, 비제한적으로, 집파리(무스카 도메스티카), 아프리카 툼부 파리(African tumbu fly)(코르딜로비아 안트로포파가(Cordylobia anthropophaga)), 등에모기(biting midge)(쿨리코이데스(Culicoides) 종), 벌이(bee louse)(브라울라(Braula) 종), 비트 파리(페고미아 베타에(Pegomyia betae)), 먹파리(크네피아(Cnephia) 종, 유시물리움(Eusimulium) 종, 시물리움(Simulium) 종), 말파리(bot fly)(쿠테레브라(Cuterebra) 종, 가스트로필루스(Gastrophilus) 종, 오에스트루스(Oestrus) 종), 각다귀(티풀라(Tipula) 종), 눈각다귀(히펠라테스 종), 오물 번식 파리(filth-breeding fly)(칼리포라(Calliphora) 종, 파니아(Fannia) 종, 헤르메티아(Hermetia) 종, 루실리아(Lucilia) 종, 무스카(Musca) 종, 무시나(Muscina) 종, 파에니시아(Phaenicia) 종, 포르미아(Phormia) 종), 쉬파리(사르코파가(Sarcophaga) 종, 월파흐티아(Wohlfahrtia) 종); 플릿 파리(flit fly)(오시넬라 프리트(Oscinella frit)), 과실파리(다쿠스(Dacus) 종, 트로소필라(Drosophila) 종), 헤드 앤 캐논 파리(head and canon fly)(히드로테아(Hydrotea) 종), 헤시안 파리(hessian fly)(마에티올라 데스트룩토르(Mayetiola destructor)), 뿔 및 버팔로 파리(horn and buffalo fly)(하에마토비아(Haematobia) 종), 말 및 사슴 파리(크리솝스(Chrysops) 종, 하에마토포타(Haematopota) 종, 타바누스(Tabanus) 종), 양파리(louse fly)(리포프테나(Lipoptena) 종, 린키아(Lynchia) 종 및 슈도린키아(Pseudolynchia) 종), 지중해광대파리(medfly)(세라티투스(Ceratitus) 종), 모기(아에데스 종, 아노펠레스 종, 쿨렉스 종, 프소로포라(Psorophora) 종), 모래파리(플레보토무스 종, 루트조미아(Lutzomyia) 종), 천공충 파리(screw-worm fly)(크티소미아 베찌아나(Chtysomya bezziana) 및 코클리오미아 호미니보락스(Cochliomyia hominivorax)), 양에 기생하는 날개 없는 흡혈파리(sheep ked)(멜로파구스(Melophagus) 종); 침파리(stable fly)(스토목시스(Stomoxys) 종), 체체파리(글로시나 종), 쇠파리(히포데르마(Hypoderma) 종)가 포함된다.
흰개미목(흰개미)에는, 비제한적으로, 수확흰개미과(Hodotermitidae), 건재흰개미과(Kalotermitidae), 원시흰개미과(Mastotermitidae), 일본흰개미(Rhinotermitidae), 세리테르미티다에(Serritermitidae), 고등흰개미과(Termitidae) 및 습재흰개미(Termopsidae)가 포함된다.
노린재목( Heteroptera )의 예에는, 비제한적으로, 빈대(시멕스 렉툴라리우스(Cimex lectularius)), 목화 해충(cotton stainer)(디스데르쿠스 인테르메디우스(Dysdercus intermedius)), 선 해충(Sunn pest)(유리가스테르 인테그리셉스(Eurygaster integriceps)), 장님노린재(tarnished plant bug)(리구스 리네올라리스(Lygus lineolaris)), 풀색노린재(네자라 안테나타(Nezara antennata)), 남부 풀색노린재(네자라 비리둘라(Nezara viridula)) 및 트리아토미드 벌레(triatomid bug)(판스트로길루스 메기스투스(Panstrogylus megistus), 로드니우스 에쿠아도리엔시스(Rhodnius ecuadoriensis), 로드니우스 팔레스칸스(Rhodnius pallescans), 로드니우스 프로릭수스, 로드니우스 로부스투스(Rhodnius robustus), 트리아토마 디미디아타(Triatoma dimidiata), 트리아토마 인페스탄스(Triatoma infestans) 및 트리아토마 소르디다(Triatoma sordida))가 포함된다.
동시아목의 예에는, 비제한적으로, 캘리포니아 유리깍지벌레(California red scale)(아오니디엘라 아우란티(Aonidiella aurantii)), 검정콩 진딧물(아피스 파바에(Aphis fabae)), 목화 또는 멜론 진딧물(아피스 고시피(Aphis gossypii)), 초록사과 진딧물(아피스 포미(Aphis pomi)), 감귤류 가시 가루이(citrus spiny whitefly)(알레우로칸투스 스피니페루스(Aleurocanthus spiniferus)), 협죽도 깍지벌레(아스피디오투스 헤데라에(Aspidiotus hederae)), 고구마 가루이(베메시아 타바시(Bemesia tabaci)), 양배추 진딧물(브레비코리네 브라시카에(Brevicoryne brassicae)), 배 프실라(pear psylla)(카코프실라 피리콜라(Cacopsylla pyricola)), 커런트 진딧물(크립토미주스 리비스(Cryptomyzus ribis)), 포도 필록세라(grape phylloxera)(닥툴로스파이라 비티폴리아에(Daktulosphaira vitifoliae)), 감귤류 프실라(디아포리나 시트리), 감자 매미충(potato leafhopper)(엠포아스카 파바에(Empoasca fabae)), 콩 매미충(엠포아스카 솔라나(Empoasca solana)), 포도나무 매미충(엠포아스카 비티스(Empoasca vitis)), 솜진디(woolly aphid)(에리오소마 라니게룸(Eriosoma lanigerum)), 유럽 과실 깍지벌레(European fruit scale)(유레카니움 코르니(Eulecanium corni)), 복숭아가루진딧물(mealy plum aphid)(히알로프테루스 아룬디니스(Hyalopterus arundinis)), 애멸구(small brown planthopper)(라오델팍스 스트리아텔루스(Laodelphax striatellus)), 감자 진딧물(마크로시품 유포르비아에(Macrosiphum euphorbiae)), 복숭아혹진딧물(green peach aphid)(미주스 페르시카에), 끝동매미충(green rice leafhopper)(네포테틱스 신티셉스(Nephotettix cinticeps)), 벼멸구(brown planthopper)(닐라파르바타 루겐스), 충영형성 진딧물(gall-forming aphid)(펨피구스(Pemphigus) 종), 홉 진딧물(포로돈 후물리(Phorodon humuli)), 벚나무 진딧물(bird-cherry aphid)(로팔로시품 파디(Rhopalosiphum padi)), 검은 깍지벌레(black scale)(사이세티아 올레아에(Saissetia oleae)), 녹색진디(greenbug)(스키자피스 그라미눔(Schizaphis graminum)), 곡식 진딧물(시토비온 아베나에(Sitobion avenae)) 및 온실 가루이(트리알레우로데스 바포라리오룸(Trialeurodes vaporariorum))가 포함된다.
등각목( Isopoda )의 예에는, 비제한적으로, 일반 공벌레(common pillbug)(아르마딜리디움 불가레) 및 일반 쥐며느리(woodlouse)(오니스쿠스 아셀루스(Oniscus asellus))가 포함된다.
인시목에는, 호랑나비과(Papilionidae), 흰나비과(Pieridae), 부전나비과(Lycaenidae), 네발나비과(Nymphalidae), 왕나비과(Danaidae), 잎눈나비과(Satyridae), 팔랑나비과(Hesperiidae), 박각시과(Sphingidae), 산누에나방과(Saturniidae), 자나방과(Geometridae), 불나방과(Arctiidae), 밤나방과(Noctuidae), 독나방과(Lymantriidae), 유리나방과(Sesiidae) 및 곡식좀나방과(Tineidae)가 포함된다.
인시목의 예에는, 비제한적으로, 아독소피에스 오라나(여름 과실 토르트릭스 나방(summer fruit tortrix moth)), 아그로티스 입솔론(Agrotis ipsolon)(검거세미밤나방(black cutworm)), 아르킵스 포다나(Archips podana)(과실나무 토르트릭스 나방(fruit tree tortrix moth)), 부쿨라트릭스 피리보렐라(Bucculatrix pyrivorella)(배 잎나방벌레), 부쿨라트릭스 투르베리엘라(Bucculatrix thurberiella)(목화잎 천공충), 부팔루스 피니아리우스(Bupalus piniarius)(소나무 자벌레), 카르포캅사 포모넬라(Carpocapsa pomonella)(코들링나방), 킬로 수프레살리스(줄무늬 쌀 천공충), 코리스토네우라 푸미페라나(동양 가문비나무 싹벌레), 코킬리스 호스페스(Cochylis hospes)(줄무늬 해바라기 나방(banded sunflower moth)), 디아트라에아 그란디오셀라(Diatraea grandiosella)(남부 옥수수 천공충), 에알스 인술라나(Earls insulana)(이집트 목화다래벌레(Egyptian bollworm)), 유페스티아 쿠에니엘라(Euphestia kuehniella)(지중해 밀가루 나방(Mediterranean flour moth)), 유포에실리아 암비구엘라(Eupoecilia ambiguella)(유럽포도열매 나방), 유프록티스 크리소로에아(갈색꼬리나방(brown-tail moth)), 유프록티스 서브플라바(Euproctis subflava)(동양 독나방), 갈레리아 멜로넬라(꿀벌부채명나방(greater wax moth)), 헬리코베르파 아르미게라(목화다래벌레), 헬리코베르파 제아(목화다래벌레), 헬리오티스 비레센스(담배 싹벌레), 호프만노필라 슈도프레텔라(Hofmannophila pseudopretella)(갈색 집나방(brown house moth)), 호메오소마 엘렉텔룸(Homeosoma electellum)(해바라기 나방), 호모나 마그나니마(Homona magnanima)(동양 차나무 토르트릭스 나방(oriental tea tree tortrix moth)), 리토콜레티스 블란카르델라(Lithocolletis blancardella)(점무늬 텐티폼 잎말이나방(spotted tentiform leafminer)), 리만트리아 디스파르(집시 나방), 말라코소마 뉴스트리아(텐트 모충), 마메스트라 브라시카에(양배추 거염벌레), 마메스트라 콘피구라타(베르타 거염벌레(Bertha armyworm)), 박각시벌레(만두카 섹스타 및 마누두카 퀸쿠에마쿨라타(Manuduca quinquemaculata)), 오페로프테라 브루마타(겨울 나방), 오스트리니아 누빌라리스(유럽 옥수수 천공충), 파놀리스 플라메아(소나무 판도라솔나방(pine beauty moth)), 펙티노포라 고시피엘라(분홍 목화다래벌레), 필로크니스티스 시트렐라(Phyllocnistis citrella)(감귤류 잎나방벌레), 피에리스 브라시카에(양배추 하얀나비), 플루텔라 자일로스텔라(배추좀나방), 라키플루시아 니(대두 자벌레), 스필로소마 비르기니카(Spilosoma virginica)(노란 곰 나방(yellow bear moth)), 스포도프테라 엑시구아(파밤나방), 스포도프테라 프루기페르다(가을 거염벌레), 스포도프테라 리토랄리스(목화다래벌레), 스포도프테라 리투라(일반 야도충), 스포도프테라 프라에피카(Spodoptera praefica)(노란줄무늬 거염벌레), 실렙타 데로가타(Sylepta derogata)(목화명나방(cotton leaf roller)), 티네올라 비셀리엘라(웨빙 옷좀나방(webbing clothes moth)), 티네올라 펠리오넬라(Tineola pellionella)(케이스 메이킹 옷좀나방(case-making clothes moth)), 토르트릭스 비리다나(Tortrix viridana)(유럽 참나무 잎말이나방(European oak leafroller)), 트리코플루시아 니(양배추 자벌레) 및 이포노메우타 파델라(Yponomeuta padella)(작은 에르민 나방(small ermine moth))가 포함된다.
메뚜기목의 예에는, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 일반 귀뚜라미(아케타 도메스티쿠스(Acheta domesticus)), 나무 메뚜기(아나크리디움(Anacridium) 종), 이동 매뚜기(migratory locust)(로쿠스타 미그라토리아(Locusta migratoria)), 2줄무늬 매뚜기(twostriped grasshopper)(멜라노플루스 비비타투스(Melanoplus bivittatus)), 디퍼렌셜 메뚜기(differential grasshopper)(멜라노플루스 디페렌티알리스(Melanoplus dfferentialis)), 붉은다리 메뚜기(redlegged grasshopper)(멜라노플루스 페무루브룸(Melanoplus femurrubrum)), 이동 매뚜기(멜라노플루스 산구이니페스), 북부 두더지 귀뚜라미(northern mole cricket)(네오쿠르틸라 헥사덱틸라(Neocurtilla hexadectyla)), 붉은 메뚜기(red locust)(노마다크리스 셉템파시아타(Nomadacris septemfasciata)), 짧은날개 두더지 귀뚜라미(shortwinged mole cricket)(스캅테리스쿠스 아브레비아투스(Scapteriscus abbreviatus)), 남부 두더지 귀뚜라미(스캅테리스쿠스 보렐리(Scapteriscus borellii)), 황갈색 두더지 귀뚜라미(tawny mole cricket)(스캅테리스쿠스 비시누스(Scapteriscus vicinus)) 및 사막 메뚜기(desert locust)(스키스토세르카 그레가리아(Schistocerca gregaria))가 포함된다.
이목의 예에는, 비제한적으로, 소 무는 이(cattle biting louse)(보비콜라 보비스(Bovicola bovis)), 무는 이(biting lice)(다말리니아(Damalinia) 종), 고양이 이(cat louse)(펠리콜라 수브로스트라타(Felicola subrostrata)), 짧은코 소 이(shortnosed cattle louse)(하에마토피누스 엘로이스테르누스(Haematopinus eloysternus)), 꼬리-스위치 이(tail-switch louse)(하에마토피누스 쿠아드리페리우수스(Haematopinus quadriperiussus)), 호그 이(hog louse)(하에마토피누스 수이스(Haematopinus suis)), 얼굴 이(face louse)(리노그나투스 오빌루스(Linognathus ovillus)), 발 이(foot louse)(리노그나투스 페달리스(Linognathus pedalis)), 개 흡혈이(dog sucking louse)(리노그나투스 세토수스(Linognathus setosus)), 긴코 소 이(long-nosed cattle louse)(리노그나투스 비툴리(Linognathus vituli)), 닭 몸이(chicken body louse)(메나칸투스 스트라미네우스(Menacanthus stramineus)), 조류 깃이(poultry shaft louse)(메노폰 갈리나에(Menopon gallinae)), 인간 몸이(human body louse)(페디쿨루스 후마누스(Pediculus humanus)), 사면발이(pubic louse)(프티루스 푸비스(Phthirus pubis)), 작은 푸른소 이(little blue cattle louse)(솔레노포테스 카필라투스(Solenopotes capillatus)) 및 개 무는 이(dog biting louse)(트리코덱테스 카니스(Trichodectes canis))가 포함된다.
다듬이벌레목( Psocoptera )의 예에는, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 책벌레(booklice)(리포셀리스 보스트리코필라(Liposcelis bostrychophila), 리포셀리스 데콜로르(Liposcelis decolor), 리포셀리스 엔토모필라(Liposcelis entomophila) 및 트로기움 풀사토리움(Trogium pulsatorium))이 포함된다. 벼룩목의 예에는, 비제한적으로, 새 벼룩(세라토필루스 갈리나에(Ceratophyllus gallinae)), 개 벼룩(크테노세팔리데스 카니스(Ctenocephalides canis)), 고양이 벼룩(크테노세팔리데스 펠스(Ctenocephalides fells)), 인간 벼룩(풀렉스 이리탄스(Pulex irritans)) 및 동양 쥐 벼룩(제노프실라 케오피스(Xenopsylla cheopis))이 포함된다.
애지네목( Symphyla )의 예에는, 비제한적으로, 정원 애지네(garden symphylan)(스쿠티게렐라 이마쿨라테(Scutigerella immaculate))가 포함된다.
좀목( Thysanura )의 예에는, 비제한적으로, 회색 좀(gray silverfish)(크테놀레피스마 론기카우다타(Ctenolepisma longicaudata)), 4줄 좀(four-lined silverfish)(크테놀레피스마 쿠아드리세리아타(Ctenolepisma quadriseriata)), 일반 좀(레피스마 사카리나(Lepisma saccharina)) 및 얼룩좀(firebrat)(테노비아 도메스티카(Thennobia domestica))가 포함된다.
총채벌레목의 예에는, 비제한적으로, 담배 총채벌레(프란클리니엘라 푸스카(Frankliniella fusca)), 꽃 총채벌레(프란클리니엘라 인톤사(Frankliniella intonsa)), 꽃노랑총채벌레(프란클리니엘라 오시덴탈리스(Frankliniella occidentalis)), 목화싹 총채벌레(cotton bud thrip)(프란클리니엘라 스츌트제이(Frankliniella schultzei)), 줄무늬 온실 총채벌레(banded greenhouse thrip)(헤르시노트립스 페모랄리스(Hercinothrips femoralis)), 대두 총채벌레(네오히다토트립스 바리아빌리스(Neohydatothrips variabilis)), 켈리 감귤류 총채벌레(Kelly's citrus thrip)(페조트립스 켈리아누스(Pezothrips kellyanus)), 아보카도 총채벌레(스시르토트립스 페르세아에(Scirtothrips perseae)), 멜론 총채벌레(트립스 팔미(Thrips palmi)) 및 양파 총채벌레(트립스 타바시(Thrips tabaci))가 포함된다.
선충의 예에는, 비제한적으로, 기생 선충, 예컨대 헤테로데라 종, 멜로이도기네 종 및 글로보데라 종을 포함하는 뿌리혹, 낭포 및 병변 선충; 특히, 비제한적으로, 하기를 포함하는 낭포 선충의 구성원이 포함된다: 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines)(대두 낭포 선충); 헤테로데라 스카크티(비트 낭포 선충); 헤테로데라 아베나에(Heterodera avenae)(곡물 낭포 선충); 및 글로보데라 로스토키엔시스(Globodera rostochiensis) 및 글로보데라 파일리다(Globodera pailida)(감자 낭포 선충). 병변 선충에는, 비제한적으로, 프라틸렌쿠스(Pratylenchus) 종이 포함된다.
본 발명에 대해 감수성이 있는 다른 곤충 종에는, 공중 및 동물 건강 문제를 야기하는 절지동물 해충, 예를 들어 모기, 예를 들어 아에데스, 아노펠레스 및 쿨렉스 속의 모기, 진드기, 벼룩 및 파리 등이 포함된다.
하나의 구현예에서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 이용하여 체외기생충을 처리할 수 있다. 체외기생충에는, 비제한적으로, 벼룩, 진드기, 옴(mange), 응애, 모기, 성가시고 무는 파리, 이, 및 전술한 체외기생충 중 하나 이상을 포함하는 조합이 포함된다. "벼룩"이라는 용어에는, 벼룩목의 기생 벼룩의 보통 또는 우연 종, 및 특히 크테노세팔리데스 종, 특히, 크테노세팔리데스 펠스 및 크테노세팔리데스 카니스, 쥐 벼룩(제노프실라 케오피스) 및 인간 벼룩(풀렉스 이리탄스)이 포함된다.
본 발명은 주요 작물의 곤충 해충을 방제, 저해 및/또는 사멸시키는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 일부 구현예에서, 주요 작물과 해당 곤충 해충에는, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 옥수수: 오스트리니아 누빌라리스, 유럽 옥수수 천공충; 아그로티스 입실론, 검거세미밤나방; 헬리코베르파 제아, 옥수수 귀벌레; 스포도프테라 프루기페르다, 가을 거염벌레; 디아트라에아 그란디오셀라, 남부 옥수수 천공충; 엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus), 명충나방 유충(lesser cornstalk borer); 디아트라에아 사카랄리스, 사탕수수 천공충; 디아브로티카 비르기페라, 서양 옥수수 뿌리벌레; 디아브로티카 론기코르니스 바르베리(Diabrotica longicornis barberi), 북부 옥수수 뿌리벌레; 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi), 남부 옥수수 뿌리벌레; 멜라노투스(Melanotus) 종, 청동방아벌레; 시클로세팔라 보레알리스, 북부 마스크 풍뎅이(굼벵이); 시클로세팔라 이마쿨라타(Cyclocephala immaculata), 남부 마스크 풍뎅이(굼벵이); 포필리아 자포니카, 일본 딱정벌레; 카에토크네마 풀리카리아(Chaetocnema pulicariapulicaria), 옥수수 벼룩 딱정벌레; 스페노포러스 마이디스(Sphenophorus maidis), 옥수수 바구미; 로팔로시품 마이디스(Rhopalosiphum maidis), 옥수수잎 진딧물; 아누라피스 마이디라디시스(Anuraphis maidiradicis), 옥수수뿌리 진딧물; 블리수스 류코프테루스 류코프테루스(Blissus leucopterus leucopterus), 긴노린재(chinch bug); 멜라노플루스 페무루브룸, 붉은다리 메뚜기; 멜라노플루스 산구이니페스, 이동 메뚜기; 힐레미아 플라투라(Hylemya platura), 옥수수씨 구더기(seedcorn maggot); 아그로미자 파르비코르니스(Agromyza parvicornis), 옥수수 반점 잎나방벌레(corn blot leafminer); 아나포트립스 옵스크루루스(Anaphothrips obscrurus), 잔디 총채벌레; 솔레놉시스 멜레스타(Solenopsis milesta), 도둑개미(thief ant); 테트라니쿠스 우르티카에, 점박이응애(twospotted spider mite); 수수: 킬로 파르텔루스(Chilo partellus), 수수 천공충; 스포도프테라 프루기페르다, 가을 거염벌레; 헬리코베르파 제아, 옥수수 귀벌레; 엘라스모팔푸스 리그노셀루스, 명충나방 유충; 펠티아 서브테라네아(Feltia subterranea), 낟알 야도충; 필로파가 크리니타(Phyllophaga crinita), 굼벵이; 엘로데스(Eleodes), 코노데루스 및 아에올루스(Aeolus) 종, 청동방아벌레; 오울레마 멜라노푸스(Oulema melanopus), 곡식 잎벌레; 카에토크네마 풀리카리아(Chaetocnema pulicaria), 옥수수 벼룩 딱정벌레; 스페노포러스 마이디스, 옥수수 바구미; 로팔로시품 마이디스, 옥수수잎 진딧물; 시파 플라바(Sipha flava), 노란 사탕수수 진딧물; 블리수스 류코프테루스 류코프테루스, 긴노린재; 콘타리니아 소르기콜라(Contarinia sorghicola), 수수 깔다구; 테트라니쿠스 신나바리누스, 카민잎응애; 테트라니쿠스 우르티카에, 점박이응애; 밀: 슈달레티아 우니푼크타타(Pseudaletia unipunctata), 거염벌레; 스포도프테라 프루기페르다, 가을 거염벌레; 엘라스모팔푸스 리그노셀루스, 명충나방 유충; 아그로티스 오르토고니아(Agrotis orthogonia), 서양 야도충; 엘라스모팔푸스 리그노셀루스, 명충나방 유충; 오울레마 멜라노푸스, 곡식 잎벌레; 히페라 푼크타타(Hypera punctata), 클로버잎 바구미; 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디, 남부 옥수수 뿌리벌레; 러시아 밀 진딧물; 스키자피스 그라미눔(Schizaphis graminum), 녹색진디; 마크로시품 아베나에(Macrosiphum avenae), 보리수염진딧물(English grain aphid); 멜라노플루스 페무루브룸, 붉은다리 메뚜기; 멜라노플루스 디페렌티알리스, 디퍼렌셜 메뚜기; 멜라노플루스 산구이니페스, 이동 메뚜기; 마에티올라 데스트룩토르, 헤시안 파리; 시토디플로시스 모셀라나(Sitodiplosis mosellana), 밀 깔다구; 메로미자 아메리카나(Meromyza americana), 밀줄기굴파리(wheat stem maggot); 힐레미아 코아르크타타(Hylemya coarctata), 밀줄기꽃파리(wheat bulb fly); 프란클리니엘라 푸스카, 담배 총채벌레; 세푸스 신크투스(Cephus cinctus), 밀줄기잎벌(wheat stem sawfly); 아세리아 툴리파에(Aceria tulipae), 밀 컬 응애(wheat curl mite); 해바라기: 술레이마 헬리안타나(Suleima helianthana), 해바라기 싹 나방; 호모에오소마 엘렉텔룸(Homoeosoma electellum), 해바라기 나방; 지고그라마 엑스클라마티오니스, 해바라기 딱정벌레; 보티루스 기보수스(Bothyrus gibbosus), 당근 딱정벌레; 네올라시오프테라 무르트펠드티아나(Neolasioptera murtfeldtiana), 해바라기씨 깔다구; 목화: 헬리오티스 비레센스, 목화 싹벌레; 헬리코베르파 제아, 목화다래벌레; 스포도프테라 엑시구아, 파밤나방; 펙티노포라 고시피엘라, 분홍 목화다래벌레; 안토노무스 그란디스, 목화바구미; 아피스 고시피, 목화 진딧물; 슈다토모셀리스 세리아투스(Pseudatomoscelis seriatus), 목화 벼룩잎벌레; 트리알레우로데스 아부틸로네아(Trialeurodes abutilonea), 줄무늬 날개 가루이; 리구스 리네올라리스, 장님노린재; 멜라노플루스 페무루브룸, 붉은다리 메뚜기; 멜라노플루스 디페렌티알리스, 디퍼렌셜 메뚜기; 트립스 타바시, 양파 총채벌레; 프란클리니엘라 푸스카, 담배 총채벌레; 테트라니쿠스 신나바리누스, 카민잎응애; 테트라니쿠스 우르티카에, 점박이응애; 쌀: 디아트라에아 사카랄리스, 사탕수수 천공충; 스포도프테라 프루기페르다, 가을 거염벌레; 헬리코베르파 제아, 옥수수 귀벌레; 콜라스피스 브루네아(Colaspis brunnea), 포도 콜라스피스(grape colaspis); 리소롭트루스 오리조필루스(Lissorhoptrus oryzophilus), 벼물바구미; 시토필루스 오리자에, 쌀바구미; 네포테틱스 니그로픽투스(Nephotettix nigropictus), 쌀 매미충; 블리수스 류코프테루스, 긴노린재; 아크로스테르눔 힐라레, 풀색노린재; 대두: 슈도플루시아 인클루덴스, 대두 자벌레; 안티카르시아 겜마탈리스, 벨벳콩 애벌레; 플라티페나 스카브라, 녹색클로버 벌레; 오스트리니아 누빌라리스, 유럽 옥수수 천공충; 아그로티스 입실론, 검거세미밤나방; 스포도프테라 엑시구아, 파밤나방; 헬리오티스 비레센스, 목화 싹벌레; 헬리코베르파 제아, 목화다래벌레; 에필라크나 바리베스티스, 멕시코 콩 딱정벌레; 미주스 페르시카에, 복숭아혹진딧물; 엠포아스카 파바에, 감자 매미충; 아크로스테르눔 힐라레, 풀색노린재; 멜라노플루스 페무루브룸, 붉은다리 메뚜기; 멜라노플루스 디페렌티알리스, 디퍼렌셜 메뚜기; 힐레미아 플라투라, 옥수수씨 구더기; 세리코트립스 바리아빌리스(Sericothrips variabilis), 대두 총채벌레; 트립스 타바시, 양파 총채벌레; 테트라니쿠스 투르케스타니(Tetranychus turkestani), 딸기 잎응애; 테트라니쿠스 우르티카에, 점박이응애; 보리: 오스트리니아 누빌라리스, 유럽 옥수수 천공충; 아그로티스 입실론, 검거세미밤나방; 스키자피스 그라미눔, 녹색진디; 블리수스 류코프테루스 류코프테루스, 긴노린재; 아크로스테르눔 힐라레, 풀색노린재; 유스키스투스 세르부스(Euschistus servus), 갈색 방귀벌레(brown stink bug); 델리아 플라투라(Delia platura), 옥수수씨 구더기; 마에티올라 데스트룩토르, 헤시안 파리; 페트로비아 라텐스(Petrobia latens), 갈색 밀 응애; 유채: 브레비코리네 브라시카에, 양배추 진딧물; 필로트레타 크루시페라에, 벼룩 딱정벌레; 마메스트라 콘피구라타, 베르타 거염벌레; 플루텔라 자일로스텔라, 배추좀나방; 델리아 아종, 뿌리 구더기.
일부 구현예에서, DVP, DVP-살충 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 이용하여 전술한 곤충 중 임의의 하나 이상을 처리할 수 있다.
본 발명에 감수성이 있는 곤충에는, 비제한적으로, 하기와 같은 과가 포함된다: 바퀴목(Blattaria), 딱정벌레목, 톡토기목(Collembola), 쌍시목, 극구흡충목(Echinostomida), 반시목, 막시목, 흰개미목, 인시목, 풀잠자리목(Neuroptera), 메뚜기목, 원충목(Rhabditida), 벼룩목(Siphonoptera) 및 총채벌레목. 속 종은 하기와 같이 표시된다: 악테비아 페니카(Actebia fennica), 아그로티스 입실론, 아그로티스 세게툼, 안티카르시아 겜마탈리스, 아르기로타에니아 시트라나, 아르토게이아 라파에, 봄빅스 모리, 부세올라 푸스카, 카시레우스 마르샬(Cacyreus marshall), 킬로 수프레살리스, 코리스토네우라 푸미페라나, 코리스토네우라 오시덴탈리스, 코리스토네우라 피누스 피누스, 코리스토네우라 로사세나, 크나팔로크로시스 메디날리스, 코노포모르파 크라메렐라(Conopomorpha cramerella), 크테놉수에스티스 오블리쿠아나(Ctenopsuestis obliquana), 시디아 포모넬라, 다나우스 플렉시푸스(Danaus plexippus), 디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharallis), 디아트라에아 그란디오셀라, 에아리아스 비텔라(Earias vittella), 엘라스몰팔푸스 리그노셀리우스(Elasmolpalpus lignoselius), 엘다나 사카리나(Eldana saccharina), 에페스티아 쿠에니엘라(Ephestia kuehniella), 에피노티아 아포레마, 에피피아스 포스트비타나, 갈레리아 멜로넬라, 속 - 종, 헬리코베르파 제아, 헬리코베르파 푼크티게라(H. punctigera), 헬리코베르파 아르미게라, 헬리오티스 비레센스, 히판트리아 쿠네아, 람브디나 피셀라리아, 레구미니보라 글리시니보렐라(Leguminivora glycinivorella), 로베시아 보트라나, 리만트리아 디스파르, 말라코소마 디스트리아, 마메스트라 브라시카에, 마메스트라 콘피구라타, 만두카 섹스타, 마라스미아 파트날리스(Marasmia patnalis), 마루카 비트라타, 오르기아 류코스티그마, 오스트리니아 누빌라리스, 오스트리니아 푸르나칼리스, 판데미스 피루사나(Pandemis pyrusana), 펙티노포라 고시피엘라, 페리류코프테라 코페엘라(Perileucoptera coffeella), 프토리마에아 오페르쿨렐라, 피아노토르트릭스 옥토(Pianotortrix octo), 피아티노타 스툴타나(Piatynota stultana), 피에리스 브라시카에, 플로디아 인테르푼크탈라, 플루텔라 자일로스텔라, 슈도플루시아 인클루덴스, 라키플루시아 누, 스시로포파가 인세르툴라스(Sciropophaga incertulas), 세사미아 칼라미스티스(Sesamia calamistis), 스필로소마 비르기니카, 스포도프테라 엑시구아, 스포도프테라 프루기페르다, 스포도프테라 리토랄리스, 스포도프테라 엑셈프타, 스포도프테라 리투라, 테시아 솔라니보라, 타우메토포에아 피티오캄파(Thaumetopoea pityocampa), 트리코플루시아 니, 위세아나 세르비나타, 위세아나 코풀라리스(Wiseana copularis), 위세아나 조코사(Wiseana jocosa), 블라타리아 블라텔라(Blattaria blattella), 콜렘볼라 제닐라(Collembola xenylla), 콜렘볼라 폴소미아(Collembola folsomia), 폴소미아 칸디다(Folsomia candida), 에키노스토미다 파시올라(Echinostomida fasciola), 헤미프테라 온코펠트루스(Hemiptera oncopeltrus), 헤미프테라 베미시아(Hemiptera bemisia), 헤미프테라 마크로시품(Hemiptera macrosiphum), 헤미프테라 로팔로시품(Hemiptera rhopalosiphum), 헤미프테라 미주스(Hemiptera myzus), 히메노프테라 디프리온(Hymenoptera diprion), 히메노프테라 아피스(Hymenoptera apis), 히메노프테라 마크로센트루스(Hymenoptera Macrocentrus), 히메노프테라 메테오루스(Hymenoptera Meteorus), 히메노프테라 나소니아(Hymenoptera Nasonia), 히메노프테라 솔레놉시스(Hymenoptera Solenopsis), 이소포다 포르셀리오(Isopoda porcellio), 이소프테라 레티쿨리테르메스(Isoptera reticulitermes), 오르토프테라 아크타(Orthoptera Achta), 프로스티그마타 테트라니쿠스(Prostigmata tetranychus), 라비티다 아크로벨로이데스(Rhabitida acrobeloides), 라비티다 카에노랍디티스(Rhabitida caenorhabditis), 라비티다 디스톨라브렐루스(Rhabitida distolabrellus), 라비티다 파나그렐루스(Rhabitida panagrellus), 라비티다 프리스티온쿠스(Rhabitida pristionchus), 라비티다 프라틸렌쿠스(Rhabitida pratylenchus), 라비티다 안실로스토마(Rhabitida ancylostoma), 라비티다 니포스트론길루스(Rhabitida nippostrongylus), 라비티다 파나그렐루스(Rhabitida panagrellus), 라비티다 하에몬쿠스(Rhabitida haemonchus), 라비티다 멜로이도기네(Rhabitida meloidogyne) 및 시포나프테라 크테노팔리데스(Siphonaptera ctenocephalides).
본 개시내용은, 비제한적으로, 외떡잎 및 쌍떡잎 식물을 포함하는 임의의 식물 종의 형질전환에 사용될 수 있는 식물 형질전환 방법을 제공한다. 유전자이식 접근법이 특히 유용한 접근법일 수 있는 작물에는, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 알팔파, 목화, 토마토, 옥수수, 밀, 옥수수, 사탕옥수수, 자주개자리, 대두, 수수, 들판 완두콩, 아마인, 홍화, 유채, 유채씨유, 쌀, 대두, 보리, 해바라기, 나무(침엽수 및 낙엽수 포함), 꽃(상업적으로 및 온실에서 재배되는 것들 포함), 들판 루핀, 스위치그래스, 사탕수수, 감자, 토마토, 담배, 십자화과, 고추, 사탕무, 보리, 유채씨유, 브라시카 종, 호밀, 기장, 땅콩, 고구마, 카사야, 커피, 코코넛, 파인애플, 감귤나무, 코코아, 차, 바나나, 아보카도, 무화과, 구아바, 망고, 올리브, 파파야, 캐슈, 마카다미아, 아몬드, 오트, 채소, 관상용 식물 및 침엽수.
본 개시내용은, 비제한적으로, 외떡잎 및 쌍떡잎 식물을 포함하는 임의의 식물 종의 형질전환에 사용될 수 있는 식물 형질전환 방법을 제공한다. 유전자이식 접근법 또는 식물 혼입 보호제(PIP)가 특히 유용한 접근법일 수 있는 작물에는, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 알팔파, 목화, 토마토, 옥수수, 밀, 옥수수, 사탕옥수수, 자주개자리, 대두, 수수, 들판 완두콩, 아마인, 홍화, 유채, 유채씨유, 쌀, 대두, 보리, 해바라기, 나무(침엽수 및 낙엽수 포함), 꽃(상업적으로 및 온실에서 재배되는 것들 포함), 들판 루핀, 스위치그래스, 사탕수수, 감자, 토마토, 담배, 십자화과, 고추, 사탕무, 보리, 유채씨유, 브라시카 종, 호밀, 기장, 땅콩, 고구마, 카사야, 커피, 코코넛, 파인애플, 감귤나무, 코코아, 차, 바나나, 아보카도, 무화과, 구아바, 망고, 올리브, 파파야, 캐슈, 마카다미아, 아몬드, 오트, 채소, 관상용 식물 및 침엽수.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물, 조합물 및/또는 방법은 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 곤충 및/또는 해충의 서식지에 적용될 수 있다: 자벌레; 잡식성 잎말이나방; 박각시벌레; 배추흰나비 유충; 배추좀나방; 녹색 클로버벌레; 웹웜; 염습지 모충; 거염벌레; 야도충; 십자줄무늬 양배추벌레; 꼬투리벌레; 벨벳콩 모충; 대두 자벌레; 토마토 과실벌레; 벨벳콩 야도충; 멜론벌레; 린드웜 복합체; 과일나무 잎말이나방; 감귤류 야도충; 헬리오티스; 오렌지독; 감귤류 야도충; 붉은혹 모충; 텐트 모충; 가을 웹웜; 호두 모충; 녹색자벌레; 집시 나방; 얼룩덜룩 잎말이나방; 붉은줄무늬 잎말이나방; 술이달린 사과 싹나방; 동양 과일 나방; 필버트 잎말이나방; 부등변줄무늬 잎말이나방; 코들링나방; 가지 천공충; 포도잎 스켈레토나이저; 포도 잎말이나방; 아케마 스핑크스 나방(박각시벌레); 오렌지 토르트릭스; 담배 싹벌레; 포도열매 나방; 자벌레; 알파파 모충; 목화다래벌레; 헤드 나방; 아모르비아 나방; 잡식성 자벌레; 엘로 나방(박각시벌레); 이오 나방; 협죽도 나방; 아잘레아 모충; 박각시벌레; 잎말이나방; 바나나 팔랑나비; 바트라케드라 코모사에(호드게스); 테클라 나방; 아티초크 플럼 나방; 멋쟁이나비(Thistle Butterfly); 도롱이벌레; 봄 및 가을 황충; 느릅나무 자벌레; 캘리포니아 오크나무벌레; 소나무 나비; 가문비나무 싹벌레; 안장 돌출형 모충; 더글라스 전나무 독나방; 서양 독나방; 블랙헤드 싹벌레; 미모사 웹웜; 잭 파인 싹벌레; 안장모양 모충; 녹색줄무늬 메이플벌레; 또는 독미나리 자벌레.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물, 조합물 및/또는 방법은 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 곤충 및/또는 해충의 서식지에 적용될 수 있다: 아케마 스핑크스 나방(박각시벌레)(유모르파 아케몬); 알파파 모충(콜리아스 유리테메); 아몬드 나방(카우드라 카우텔라); 아모르비아 나방(아모르비아 후메로사나); 거염벌레(스포도프테라 종, 예를 들어 엑시구아, 프루기페르다, 리토랄리스, 슈달레티아 우니푼크타); 아티초크 플럼 나방(플라티프틸리아 카르두이닥틸라); 아잘레아 모충(다타나 마조르); 도롱이벌레(티리도프테릭스 에페메라에포르미스); 바나나 나방(히페르콤페 스크리보니아); 바나나 팔랑나비(에리오노타 트락스); 블랙헤드 싹벌레(아클레리스 글로베라나); 캘리포니아 오크나무벌레(프리가니디아 칼리포르니카); 봄 자벌레(팔레아크리타 메리카타); 체리 과일벌레(그라폴리타 파카르디); 중국 표식 나방(님풀라 스타그나타); 감귤류 야도충(자일로미게스 쿠리알리스); 코들링나방(시디아 포모넬라); 크랜베리 과일벌레(아크로바시스 바시니); 십자줄무늬 양배추벌레(에베르게스티스 리모살리스); 야도충(녹투이드 종, 아그로티스 입실론); 더글라스 전나무 독나방(오르기아 슈도츄가타); 엘로 나방(박각시벌레)(에리니스 엘로); 느릅나무 자벌레(에노모스 서브시그나리아); 유럽 포도덩굴 나방(로베시아 보트라나); 유럽 팔랑나비(티멜리쿠스 리네올라)(에섹스 팔랑나비); 가을 웹웜(멜리소푸스 라티페레아누스); 필버트 잎말이나방(아르킵스 로사누스); 과일나무 잎말이나방(아르킵스 아르기로스필리아); 포도열매 나방(파랄로베시아 비테아나); 포도 잎말이나방(플라티노타 스툴타나); 포도잎 스켈레토나이저(하리시나 아메리카나)(땅에서만); 녹색 클로버벌레(플라티페나 스카브라); 녹색줄무늬 메이플벌레(드리오캄파 루비쿤다); 군모소스-바트라케드라; 코모사에(호드게스); 집시 나방(리만트리아 디스파르); 독미나리 자벌레(람브디나 피셀라리아); 박각시벌레(만두카 종); 배추흰나비 유충(피에리스 라파에); 이오 나방(아우토메리스 이오); 잭 파인 싹벌레(코리스토네우라 피누스); 밝은갈색 사과 나방(에피피아스 포스트비타나); 멜론벌레(디아파니아 히알리나타); 미모사 웹웜(호마다울라 아니소센트라); 부등변줄무늬 잎말이나방(코리스토네우라 로사세아나); 협죽도 나방(신토메이다 에필라이스); 잡식성 잎말이나방(플라이노타 스툴타나); 잡식성 자벌레(사불로데스 아에그로타타); 오렌지독(파필리오 크레스폰테스); 오렌지 토르트릭스(아르기로타에니아 시트라나); 동양 과일 나방(그라폴리타 몰레스타); 복숭아 가지 천공충(아나르시아 리네아텔라); 소나무 나비(네오파시아 메나피아); 꼬투리벌레(헬리오베르파 제아); 붉은줄무늬 잎말이나방(아르기로타에니아 벨루티나나); 붉은혹 모충(스키주라 콘시나); 린드웜 복합체(각종 레피도프테라); 안장모양 모충(시비네 스티물레아); 안장 돌출형 모충(헤테로캄파 구티비타); 염습지 모충(에스티그메네 아크레아); 소드 웹웜(크람부스 종); 자벌레(에노모스 서브시그나리아); 가을 황충(알소필라 포메타리아); 가문비나무 싹벌레(코리스토네우라 푸미페라나); 텐트 모충(각종 라시오캄프과); 테클라-테클라 바실리데스(게이르)(테클라 바실리데스); 담배 박각시벌레(만두카 섹스타); 담배 나방(에페스티아 엘루텔라); 술이달린 사과 싹나방(플라티노타 이다에우살리스); 가지 천공충(아나르시아 리네아텔라); 무늬 야도충(페리드로마 사우시아); 무늬 잎말이나방(플라티노타 플라베다나); 벨벳콩 모충(안티카르시아 겜마탈리스); 호두 모충(다타나 인테게리마); 웹웜(히판트리아 쿠네아); 서양 독나방(오르기아 베투스타); 남부 옥수수대 천공충(디아트라에아 크람비도이데스); 옥수수 귀벌레; 고구마 바구미; 고추 바구미; 감귤류 뿌리 바구미; 딸기 뿌리 바구미; 피칸 바구미; 필버트 바구미; 벼물 바구미; 알팔파 바구미; 클로버 바구미; 차나무좀; 뿌리 바구미; 사탕수수 딱정벌레; 커피열매 천공충; 새포아풀 바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 아시아 정원 딱정벌레(말라데라 카스타네아); 유럽 풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색 풍뎅이(코티니스 니티다); 일본 딱정벌레(포필리아 자포니카); 5월 또는 6월 딱정벌레(필로파가 종); 북부 마스크 풍뎅이(시클로세팔라 보레알리스); 동양 딱정벌레(아노말라 오리엔탈리스); 남부 마스크 풍뎅이(시클로세팔라 루리다); 바구미(쿠르쿨리오노이데아); 아에데스 아에깁티; 부세올라 푸스카; 킬로 수프레살리스; 쿨렉스 피피엔스; 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트라에아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌라리스; 펙티노포라 고시피엘라; 플로디아 인테르푼크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 니; 및/또는 잔토갈레루카 루테올라.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물, 조합물 및/또는 방법은 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 성체 딱정벌레의 서식지에 적용될 수 있다: 아시아 정원 딱정벌레(말라데라 카스타네아); 금색 점박이 참나무 천공충(Gold spotted oak borer)(아그릴루스 콕살리스 아우로구타투스(Agrilus coxalis auroguttatus)); 녹색 풍뎅이(코티니스 니티다); 일본 딱정벌레(포필리아 자포니카); 5월 또는 6월 딱정벌레(필로파가 종); 동양 딱정벌레(아노말라 오리엔탈리스); 및/또는 솝베리(Soap berry) 천공충(아그릴루스 프리오누루스(Agrilus prionurus)).
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물, 조합물 및/또는 방법은 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 유충(일년생 굼벵이)인 곤충 및/또는 해충의 서식지에 적용될 수 있다: 새포아풀 바구미(리스트로노투스 마쿨리콜리스); 아시아 정원 딱정벌레(말라데라 카스타네아); 유럽 풍뎅이(리조트로쿠스 마잘리스); 녹색 풍뎅이(코티니스 니티다); 일본 딱정벌레(포필리아 자포니카); 5월 또는 6월 딱정벌레(필로파가 종); 북부 마스크 풍뎅이(시클로세팔라 보레알리스); 동양 딱정벌레(아노말라 오리엔탈리스); 남부 마스크 풍뎅이(시클로세팔라 루리다); 및 바구미(쿠르쿨리오노이데아).
시스틴 매듭 구조
시스테인 풍부 단백질(CRP)은, 일부 구현예에서, 시스테인 잔기 사이에 디설파이드 결합을 형성하도록 작동 가능한, 시스테인 잔기가 풍부한 펩타이드이다. 일부 구현예에서, CRP는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 시스테인 아미노산을 함유한다. 그리고, 일부 구현예에서, CRP에 존재하는 시스테인 잔기는 3개 이상의 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 디설파이드 결합은 살충 펩타이드의 폴딩, 3차원 구조 및 활성에 기여한다.
CRP는, 이의 시스테인-시스테인 디설파이드 결합으로 인해, 환경에 노출될 때 주목할 만한 안정성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, CRP는 살충 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CRP는 시스테인 풍부 살충 단백질(CRIP)일 수 있다. 그리고, 일부 구현예에서, 시스테인-시스테인 디설파이드 결합과 이로부터 형성된 3차원 구조는 이러한 단백질의 살충 특성에서 중요한 역할을 한다.
일부 구현예에서, CRP에 존재하는 3개의 디설파이드 결합은 시스틴 매듭(CK) 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 가질 수 있다. 시스틴 매듭(CK) 모티프는 (시스테인 분자 쌍 사이에 형성된) 적어도 3개의 디설파이드 브릿지 또는 결합을 함유하는 단백질 구조 모티프이다. 시스틴 매듭은 2개의 디설파이드 결합과 이들을 연결하는 백본 분절로 구성되어 구조에 내부 고리를 형성하며, 이는 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되어 서로 맞물린 십자 형태의 감싸진 구조를 형성하여 로탁산 하위구조를 형성한다.
일부 구현예에서, 3개의 디설파이드 결합은 하기 CK 모티프 중 하나를 생성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖는다: 저해제 시스틴 매듭(ICK) 모티프; 성장인자 시스틴 매듭(GFCK) 모티프 또는 고리형 시스틴 매듭(CCK) 모티프.
그리고, 저해제 시스틴 매듭(ICK) 또는 "knottin"은 적어도 3개의 디설파이드 결합을 함유하는 단백질 구조 모티프이다. 결합 사이의 펩타이드 서브유닛과 함께, 2개의 디설파이드(각각, 제1 시스테인과 제4 시스테인을 연결하고, 제2 시스테인과 제5 시스테인을 연결함)는 제3 디설파이드 결합(서열에서 제3 시스테인과 제6 시스테인을 연결함)이 통과하는 루프를 형성하여, 매듭을 형성한다. 이러한 모티프는 거미류와 연체 동물 유래의 독소와 같은 무척추동물 독소에서 일반적이다. 이러한 모티프는 식물에서 발견되는 일부 저해제 단백질에서도 발견된다.
ICK 모티프를 포함하는 단백질은 적어도 3개의 디설파이드 브릿지를 갖는 적어도 6개의 반-시스틴 코어 아미노산을 갖는 16개 내지 60개 아미노산 길이일 수 있으며, 여기서 3개의 디설파이드 브릿지는 공유결합이고, 6개의 반-시스틴 잔기 중 공유 디설파이드 결합은 N-말단 아미노산에서 출발한 6개의 코어 반-시스틴 아미노산의 제1(CI) 반-시스틴과 제4(CIV) 반-시스틴, 제2(CII) 반-시스틴과 제5(CV) 반-시스틴, 및 제3(CIII) 반-시스틴과 제6(CVI) 반-시스틴 사이에 있다. 일반적으로, 이러한 유형의 단백질은, 통상적으로 모티프의 제4 코어 반-시스틴과 제6 코어 반-시스틴 사이에 위치하는 잔기로 구성된 베타-헤어핀 2차 구조를 포함하며, 여기서 헤어핀은 모티프의 3개의 디설파이드 결합에 의해 제공되는 구조적 가교 결합에 의해 안정화된다. 추가의 시스테인/시스틴 또는 반-시스틴 아미노산이 저해제 시스틴 매듭 모티프 내에 존재할 수 있다는 점에 유의해야 한다.
고리형 시스틴 매듭(CCK) 또는 시클로타이드(cyclotide)는 ICK와 유사하지만, CCK 펩타이드는 고리화된다. CCK는 하기와 같은 두 가지 주요 구조 서브패밀리로 나뉜다: 둘 중 덜 일반적이며, 국소적인 180° 백본 뒤틀림을 유도하는 루프 5에 시스-프롤린을 함유하는 Moebius 시클로타이드와, 이러한 특징을 갖지 않는 또 다른 서브패밀리인 팔찌형 시클로타이드. 트립신 저해제 시클로타이드는 서열 변이와 천연 활성에 기반하여 이의 고유한 패밀리로 분류된다. 트립신 저해제 시클로타이드는 다른 시클로타이드보다 knottin 또는 저해제 시스틴 매듭으로 알려진 스쿼시(squash) 식물 유래의 비고리형 트립신 저해제 패밀리에 더 상동이다. 여기서, "고리형" 또는 "고리화된"은 유리 아미노 및 카르복시 말단 없이 아미노산 잔기 또는 이의 유사체의 서열을 포함하는 분자를 나타낸다. 일부 구현예에서, 고리화된 펩타이드는 아미드(펩타이드) 결합을 통한 펩타이드 내 모든 아미노산 사이의 연결을 포함하지만, 다른 화학적 링커도 가능하다.
성장인자 시스틴 매듭(GFCK)은 마찬가지로 ICK 펩타이드에 유사한 모티프를 갖지만, 이의 토폴로지는 CI과 CIV 사이의 결합이 (각각, CII 시스테인과 CV 시스테인 사이와, CIII 시스테인과 CVI 시스테인 사이에 형성된) 루프를 통과하도록 이루어진다.
결합 제거에 의한 화학식 (II)의 CK 구조에의 도달
본 발명은 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 재조합 CRP를 조작하는 방법을 고려하고 교시한다:
Figure pct00010
화학식 (II)
(식 중, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며; 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이고; NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이며; 여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음); 여기서 상기 재조합 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 변형시키는 방식으로 생성되며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않고; 여기서 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형되며; 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고; 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타냄.
일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 CRIP는, 7개 이상의 시스테인 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드(여기서, 폴리펩타이드는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않음)에서 하나 이상의 시스테인 아미노산 잔기를 제거하는 공정에 따라 생성된다.
일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 시스테인 아미노산 잔기를 제거하면, 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 디설파이드 결합이 제거된다.
일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 시스테인 아미노산 잔기를 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고, 하기 효과가 발생한다: 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 폴리펩타이드에 비해, 예를 들어 재조합 단백질 발현 시스템에서 재조합 CRP의 발현이 증가됨.
당업자에게 알려진 펩타이드 수율을 측정하는 다양한 방법이 존재한다. 일부 구현예에서, 펩타이드 수율은 "정규화된 펩타이드 수율"일 수 있으며, 이는 펩타이드 수율이 측정되는 시점에서 상응하는 세포 밀도로 나눈 조건화된 배지의 펩타이드 수율을 의미한다. 펩타이드 수율은 부피 단위로 생성된 펩타이드의 질량, 예를 들어 리터당 mg 또는 mg/L, 또는 HPLC 크로마토그래프에서 생성된 펩타이드의 UV 흡광도 피크 면적, 예를 들어 mAu.sec.로 표시될 수 있다. 세포 밀도는 600 nm 파장(OD600)에서의 배양물의 가시광선 흡광도로 표시될 수 있다. "OD"는 광학 밀도를 나타낸다. 전형적으로, OD는 분광광도계를 사용하여 측정된다. 세포 집단의 시간 경과에 따른 성장을 측정할 때, OD600이 UV 분광광도법보다 선호되는 데; 이는 600 nm 파장에서는, 세포가 너무 강한 UV 광 하에 있을 때와 같이 손상되지 않기 때문이다. "OD660nm" 또는 "OD660nm"는 660 나노미터(nm)에서의 광학 밀도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 단백질을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 화학식 (II)에 따른 CK 구조는 시스테인과 디설파이드 결합 토폴로지의 입체배치를 나타내며, 여기서 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 단백질은 공유된 구조적 유사성을 갖는다. 여기서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조는 3개의 디설파이드 결합에 의해 연결된 6개의 시스테인 잔기를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 디설파이드 결합은 시스테인 CI과 CIV; CII와 CV; 및 CIII과 CVI 사이를 연결한다.
일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 100% 초과이거나 이보다 큰 발현 수준의 증가를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 CRP는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고, 여기서 디설파이드 결합 토폴로지는 하기 시스틴 매듭 모티프 중 하나를 형성한다: 저해제 시스틴 매듭(ICK) 모티프; 성장인자 시스틴 매듭(GFCK) 모티프 또는 고리형 시스틴 매듭(CCK) 모티프.
일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 CRP는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고, 여기서 디설파이드 결합 토폴로지는 ICK 모티프를 형성한다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP이며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않는다.
따라서, 일부 구현예에서, 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합이 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이기 때문에, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및/또는 제3 디설파이드 결합이 아닌 임의의 추가의 디설파이드 결합이다. 즉, 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및/또는 제3 디설파이드 결합이 아니고/아니거나, 연결 백본 분절과 함께 구조에 내부 고리를 형성하는 2개의 디설파이드 결합 중 하나가 아닌 추가의 디설파이드 결합이 존재하고/하거나, 이러한 고리에 연결되어 서로 맞물린 십자 형태의 감싸진 구조를 형성하여 로탁산 하위구조를 형성하는 제3 디설파이드 결합이 존재하는 경우, 이러한 추가의 디설파이드 결합은 비-CK 디설파이드 결합이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않음)는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되며, 여기서 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타낸다.
일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP의 발현 수준의 증가는, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 0.6%, 적어도 약 0.7%, 적어도 약 0.8%, 적어도 약 0.9%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.25%, 적어도 약 1.5%, 적어도 약 1.75%, 적어도 약 2%, 적어도 약 2.25%, 적어도 약 2.5%, 적어도 약 2.75%, 적어도 약 3%, 적어도 약 3.25%, 적어도 약 3.5%, 적어도 약 3.75%, 적어도 약 4%, 적어도 약 4.25%, 적어도 약 4.5%, 적어도 약 4.75%, 적어도 약 5%, 적어도 약 5.25%, 적어도 약 5.5%, 적어도 약 5.75%, 적어도 약 6%, 적어도 약 6.25%, 적어도 약 6.5%, 적어도 약 6.75%, 적어도 약 7%, 적어도 약 7.25%, 적어도 약 7.5%, 적어도 약 7.75%, 적어도 약 8%, 적어도 약 8.25%, 적어도 약 8.5%, 적어도 약 8.75%, 적어도 약 9%, 적어도 약 9.25%, 적어도 약 9.5%, 적어도 약 9.75%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 적어도 약 30%, 적어도 약 31%, 적어도 약 32%, 적어도 약 33%, 적어도 약 34%, 적어도 약 35%, 적어도 약 36%, 적어도 약 37%, 적어도 약 38%, 적어도 약 39%, 적어도 약 40%, 적어도 약 41%, 적어도 약 42%, 적어도 약 43%, 적어도 약 44%, 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100% 또는 100% 초과 범위의 재조합 CRP의 발현 증가일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP의 발현 수준의 증가는, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준의 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%, 510%, 520%, 530%, 540%, 550%, 560%, 570%, 580%, 590%, 600%, 610%, 620%, 630%, 640%, 650%, 660%, 670%, 680%, 690%, 700%, 710%, 720%, 730%, 740%, 750%, 760%, 770%, 780%, 790%, 800%, 810%, 820%, 830%, 840%, 850%, 860%, 870%, 880%, 890%, 900%, 910%, 920%, 930%, 940%, 950%, 960%, 970%, 980%, 990% 내지 약 1000% 또는 그 이상 범위의 증가일 수 있다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형된다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP는 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체이다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP는 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP는 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 재조합 CRP는 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 CRP는 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하는 재조합 CRP를 생산하는 방법
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 포함하는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 생산하는 방법으로서,
Figure pct00011
화학식 (II)
(식 중, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며; 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이고; NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이며; 여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음); (a) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 제공하는 단계(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않음)와, (b) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형 가능한 CRP를 변형시키는 단계(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고; 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타냄)를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 디설파이드 결합 토폴로지를 갖는 재조합 CRP를 제공하며, 여기서 디설파이드 결합 토폴로지는 하기 시스틴 매듭 모티프 중 하나를 형성한다: 저해제 시스틴 매듭(ICK) 모티프; 성장인자 시스틴 매듭(GFCK) 모티프 또는 고리형 시스틴 매듭(CCK) 모티프.
일부 구현예에서, 상기 방법은 디설파이드 결합 토폴로지를 갖는 재조합 CRP를 제공하며, 여기서 디설파이드 결합 토폴로지는 ICK 모티프를 형성한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP인 변형 가능한 CRP를 제공하며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않는다. 따라서, 일부 구현예에서, 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합이 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이기 때문에, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및/또는 제3 디설파이드 결합이 아닌 임의의 추가의 디설파이드 결합이다. 즉, 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및/또는 제3 디설파이드 결합이 아니고/아니거나, 연결 백본 분절과 함께 구조에 내부 고리를 형성하는 2개의 디설파이드 결합 중 하나가 아닌 추가의 디설파이드 결합이 존재하고/하거나, 이러한 고리에 연결되어 서로 맞물린 십자 형태의 감싸진 구조를 형성하여 로탁산 하위구조를 형성하는 제3 디설파이드 결합이 존재하는 경우, 이러한 추가의 디설파이드 결합은 비-CK 디설파이드 결합이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 제공하며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않으며, 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되며, 여기서 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타낸다.
일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP의 발현 수준의 증가는, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 0.6%, 적어도 약 0.7%, 적어도 약 0.8%, 적어도 약 0.9%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.25%, 적어도 약 1.5%, 적어도 약 1.75%, 적어도 약 2%, 적어도 약 2.25%, 적어도 약 2.5%, 적어도 약 2.75%, 적어도 약 3%, 적어도 약 3.25%, 적어도 약 3.5%, 적어도 약 3.75%, 적어도 약 4%, 적어도 약 4.25%, 적어도 약 4.5%, 적어도 약 4.75%, 적어도 약 5%, 적어도 약 5.25%, 적어도 약 5.5%, 적어도 약 5.75%, 적어도 약 6%, 적어도 약 6.25%, 적어도 약 6.5%, 적어도 약 6.75%, 적어도 약 7%, 적어도 약 7.25%, 적어도 약 7.5%, 적어도 약 7.75%, 적어도 약 8%, 적어도 약 8.25%, 적어도 약 8.5%, 적어도 약 8.75%, 적어도 약 9%, 적어도 약 9.25%, 적어도 약 9.5%, 적어도 약 9.75%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 적어도 약 30%, 적어도 약 31%, 적어도 약 32%, 적어도 약 33%, 적어도 약 34%, 적어도 약 35%, 적어도 약 36%, 적어도 약 37%, 적어도 약 38%, 적어도 약 39%, 적어도 약 40%, 적어도 약 41%, 적어도 약 42%, 적어도 약 43%, 적어도 약 44%, 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100% 또는 100% 초과 범위의 재조합 CRP의 발현 증가일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP의 발현 수준의 증가는, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준의 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%, 510%, 520%, 530%, 540%, 550%, 560%, 570%, 580%, 590%, 600%, 610%, 620%, 630%, 640%, 650%, 660%, 670%, 680%, 690%, 700%, 710%, 720%, 730%, 740%, 750%, 760%, 770%, 780%, 790%, 800%, 810%, 820%, 830%, 840%, 850%, 860%, 870%, 880%, 890%, 900%, 910%, 920%, 930%, 940%, 950%, 960%, 970%, 980%, 990% 내지 약 1000% 또는 그 이상 범위의 증가일 수 있다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형된다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP는 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체이다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP를 제공하는 방법 단계는 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제공하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 CRP를 생성하는 단계는, 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 CRP를 생성한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 시스틴 매듭 모티프 중 하나를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖는 재조합 CRP를 생성한다: 저해제 시스틴 매듭(ICK) 모티프; 성장인자 시스틴 매듭(GFCK) 모티프 또는 고리형 시스틴 매듭(CCK) 모티프.
일부 구현예에서, 상기 방법은 ICK 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖는 재조합 CRP를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 변형 가능한 CRP를 제공하며, 여기서 변형 가능한 CRP는 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변형 가능한 CRP를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 변형 가능한 CRP를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 CRP를 생성한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 재조합 CRP를 생성한다.
재조합 CRP의 수율을 증가시키는 방법
일부 구현예에서, 본 발명은 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)의 수율을 증가시키는 방법으로서, (a) 하기 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 갖는 재조합 CRP를 생성하는 단계를 포함하며,
Figure pct00012
화학식 (II)
(식 중, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며; 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이고; NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이며; 여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음); 여기서 상기 재조합 CRP는 하기 공정 (b) 및 (c)에 따라 생성되는 방법을 제공한다: (b) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 제공하는 단계(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않음); 및 (c) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형 가능한 CRP를 변형시키는 단계(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고; 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타냄).
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 디설파이드 결합 토폴로지를 갖는 재조합 CRP를 제공하며, 여기서 디설파이드 결합 토폴로지는 하기 시스틴 매듭 모티프 중 하나를 형성한다: 저해제 시스틴 매듭(ICK) 모티프; 성장인자 시스틴 매듭(GFCK) 모티프 또는 고리형 시스틴 매듭(CCK) 모티프.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 디설파이드 결합 토폴로지를 갖는 재조합 CRP를 제공하며, 여기서 디설파이드 결합 토폴로지는 ICK 모티프를 형성한다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP인 변형 가능한 CRP를 제공하며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않는다. 따라서, 일부 구현예에서, 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합이 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이기 때문에, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및/또는 제3 디설파이드 결합이 아닌 임의의 추가의 디설파이드 결합이다. 즉, 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및/또는 제3 디설파이드 결합이 아니고/아니거나, 연결 백본 분절과 함께 구조에 내부 고리를 형성하는 2개의 디설파이드 결합 중 하나가 아닌 추가의 디설파이드 결합이 존재하고/하거나, 이러한 고리에 연결되어 서로 맞물린 십자 형태의 감싸진 구조를 형성하여 로탁산 하위구조를 형성하는 제3 디설파이드 결합이 존재하는 경우, 이러한 추가의 디설파이드 결합은 비-CK 디설파이드 결합이다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 제공하며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않으며, 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되며, 여기서 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 단백질 수율 또는 단백질 발현 수준에 비해 증가된 단백질 수율 또는 단백질 발현 수준을 나타낸다.
일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP의 발현 수준의 증가는, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 0.6%, 적어도 약 0.7%, 적어도 약 0.8%, 적어도 약 0.9%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.25%, 적어도 약 1.5%, 적어도 약 1.75%, 적어도 약 2%, 적어도 약 2.25%, 적어도 약 2.5%, 적어도 약 2.75%, 적어도 약 3%, 적어도 약 3.25%, 적어도 약 3.5%, 적어도 약 3.75%, 적어도 약 4%, 적어도 약 4.25%, 적어도 약 4.5%, 적어도 약 4.75%, 적어도 약 5%, 적어도 약 5.25%, 적어도 약 5.5%, 적어도 약 5.75%, 적어도 약 6%, 적어도 약 6.25%, 적어도 약 6.5%, 적어도 약 6.75%, 적어도 약 7%, 적어도 약 7.25%, 적어도 약 7.5%, 적어도 약 7.75%, 적어도 약 8%, 적어도 약 8.25%, 적어도 약 8.5%, 적어도 약 8.75%, 적어도 약 9%, 적어도 약 9.25%, 적어도 약 9.5%, 적어도 약 9.75%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 적어도 약 30%, 적어도 약 31%, 적어도 약 32%, 적어도 약 33%, 적어도 약 34%, 적어도 약 35%, 적어도 약 36%, 적어도 약 37%, 적어도 약 38%, 적어도 약 39%, 적어도 약 40%, 적어도 약 41%, 적어도 약 42%, 적어도 약 43%, 적어도 약 44%, 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100% 또는 100% 초과 범위의 재조합 CRP의 발현 증가일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP의 발현 수준 수율의 증가는, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준의 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%, 510%, 520%, 530%, 540%, 550%, 560%, 570%, 580%, 590%, 600%, 610%, 620%, 630%, 640%, 650%, 660%, 670%, 680%, 690%, 700%, 710%, 720%, 730%, 740%, 750%, 760%, 770%, 780%, 790%, 800%, 810%, 820%, 830%, 840%, 850%, 860%, 870%, 880%, 890%, 900%, 910%, 920%, 930%, 940%, 950%, 960%, 970%, 980%, 990% 내지 약 1000% 또는 그 이상 범위의 증가일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형되는 변형 가능한 CRP를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체인 변형 가능한 CRP를 제공한다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP를 제공하는 수율을 증가시키는 방법 단계는 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제공하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 재조합 CRP를 생성하며, 여기서 상기 재조합 CRP는 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 하기 시스틴 매듭 모티프 중 하나를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖는 재조합 CRP를 생성한다: 저해제 시스틴 매듭(ICK) 모티프; 성장인자 시스틴 매듭(GFCK) 모티프 또는 고리형 시스틴 매듭(CCK) 모티프.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 ICK 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖는 재조합 CRP를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 변형 가능한 CRP를 제공하며, 여기서 변형 가능한 CRP는 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체이다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변형 가능한 CRP를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 변형 가능한 CRP를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 CRP를 생성한다.
일부 구현예에서, 상기 수율을 증가시키는 방법은 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 재조합 CRP를 생성한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 재조합 CRP로서,
Figure pct00013
화학식 (II)
(식 중, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며; 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이고; NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이며; 여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음); 여기서 상기 재조합 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 공정에 따라 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체를 변형시키는 방식으로 생성되며; 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고; 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타내는 재조합 CRP를 제공한다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형된다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP는 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체이다.
일부 구현예에서, 변형 가능한 CRP는 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 CRP는 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 시스틴 매듭 구조 구현예
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 본 발명의 화학식 (II)에 따른 CK 구조가 아닌 시스테인 및/또는 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 7개 이상의 시스테인 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 4개 이상의 디설파이드 결합을 가질 수 있다.
여기서, 본 발명자들은, 화학식 (II)의 CK 구조에 도달하기 위해 변형 가능한 CRP에서 유도되는 재조합 CRP와, 이와 관련된 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 1개의 시스테인 잔기의 제거를 포함하도록 변형된 7개의 시스테인 잔기를 갖는 변형 가능한 CRP를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 1개의 시스테인 잔기를 제거하면, 화학식 (II)의 CK 구조를 갖는 폴리펩타이드가 생성된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 2개의 시스테인 잔기의 제거를 포함하도록 변형된 8개의 시스테인 잔기를 갖는 변형 가능한 CRP를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 2개의 시스테인 잔기를 제거하면, 화학식 (II)의 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 3개의 시스테인 잔기의 제거를 포함하도록 변형된 9개의 시스테인 잔기를 갖는 변형 가능한 CRP를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 3개의 시스테인 잔기를 제거하면, 화학식 (II)의 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 4개의 시스테인 잔기의 제거를 포함하도록 변형된 10개의 시스테인 잔기를 갖는 변형 가능한 CRP를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 4개의 시스테인 잔기를 제거하면, 화학식 (II)의 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 4개 이상의 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 변형 가능한 CRP는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 디설파이드 결합을 제거하여 3개의 디설파이드 결합을 갖도록 변형되었다.
일부 구현예에서, 본 발명의 변형 가능한 CRP는 7개 이상의 시스테인 아미노산 잔기를 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 시스테인 아미노산 잔기를 제거하는 방식으로 변형될 수 있으며; 여기서 변형 가능한 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않고, 폴리펩타이드에서 하나 이상의 시스테인 아미노산 잔기를 제거하면, 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합이 제거된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 4개의 디설파이드 결합을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 하나의 디설파이드 결합이 제거되어 시스테인 잔기 CI과 CIV; CII 와 CV; 및 CIII과 CVI 사이에 디설파이드 결합이 형성되는 화학식 (II)의 CK 구조, 예를 들어 1-4, 2-5, 3-6 디설파이드 결합 연결성을 갖는 시스틴 매듭이 생성된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 8개의 시스테인을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 2개의 시스테인이 제거되어 시스테인 잔기 CI과 CIV; CII 와 CV; 및 CIII과 CVI 사이에 디설파이드 결합이 형성되는 화학식 (II)의 CK 구조, 예를 들어 1-4, 2-5, 3-6 디설파이드 결합 연결성을 갖는 시스틴 매듭이 생성된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는 방법을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 상기 방법은 하나 이상의 시스테인을 제거하는 방식으로 일어나고, 상기 방법은 하기 단계 (a) 내지 (c) 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다: (a) 변형 가능한 CRP의 3-D 구조를 얻고/얻거나 생성하는 단계; (b) 변형 가능한 CRP의 3-D 구조에 기반하여 하나 이상의 시스테인 제거를 위한 하나 이상의 부위를 예측하는 단계; 및 (c) 예측된 부위 중 하나 이상에서 하나 이상의 시스테인을 제거하는 방식으로 변형 가능한 CRP를 변형시키는 단계로서, 여기서 상기 하나 이상의 시스테인의 제거가 적어도 하나의 비-CK 디설파이드 결합의 제거를 가능하게 하는 단계.
일부 구현예에서, 본 발명은 천연의 단일 유전자 산물이며 하나 이상의 시스테인 잔기의 제거에 의해 돌연변이된 폴리펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 상기 시스테인 잔기의 제거는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합의 제거를 가능하게 하며, 이는 상기 제거된 시스테인을 함유하지 않는 변형 가능한 CRP에 비해 재조합 CRP의 발현을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭 구조를 포함하는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다:
Figure pct00014
(II)
(식 중, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며; 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이고; NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이며; 여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음); 여기서 상기 재조합 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 변형시키는 방식으로 생성되며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않고; 여기서 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형되며; 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고; 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타내고; 여기서 NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE 펩타이드 서브유닛 각각의 아미노산 서열은, NE는 AKDGDVEGPAG이고; L1은 KKYDVE이고; L2는 DSGE이고; L3은 존재하지 않고; L4는 QKQYLWYKWRPLD이고; L5는 RGLKSGFFSSKFV이고; CE는 RDV인 아미노산 서열 그룹과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가짐.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRGLKSGFFSSKFVCRDV(서열번호 5)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRGLKSGFFSSKFVCRDV(서열번호 5)의 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AICTGADRPCAAACPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(서열번호 199)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AICTGADRPCAAACPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(서열번호 199)의 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AICTGADRPCAAAAPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(서열번호 201)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AICTGADRPCAAAAPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(서열번호 201)의 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, GSCNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNAIGGGASKTCGY(서열번호 197)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, GSCNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNAIGGGASKTCGY(서열번호 197)의 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRGLKSGFFSSKFVCRDV(서열번호 5)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRGLKSGFFSSKFVCRDV(서열번호 5)의 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AICTGADRPCAAACPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(서열번호 199)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AICTGADRPCAAACPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(서열번호 199)의 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AICTGADRPCAAAAPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(서열번호 201)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, AICTGADRPCAAAAPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP(서열번호 201)의 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, GSCNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNAIGGGASKTCGY(서열번호 197)의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한, 적어도 55% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 81% 동일한, 적어도 82% 동일한, 적어도 83% 동일한, 적어도 84% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 86% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 88% 동일한, 적어도 89% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한, 적어도 99.6% 동일한, 적어도 99.7% 동일한, 적어도 99.8% 동일한, 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 포함하고, GSCNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNAIGGGASKTCGY(서열번호 197)의 아미노산 서열을 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
실시예
본 명세서의 실시예는 본 발명을 제한하려는 의도가 아니고, 본 발명을 제한하고자 사용되어서도 안 되며; 이는 단지 본 발명을 예시하기 위해서 제공된다. 발현 배수에 대한 하기 범주는 다음과 같다: 감소 = < 0.9; 유사 = 0.9 내지 1.1; 약간 증가 = 1.1 내지 2.9; 증가 = 3.0 내지 10.0; 및 고도로 증가 = > 10. 활성 배수에 대한 하기 범주는 다음과 같다: 감소 = > 1.5; 및 유사 = 0.7 내지 1.4.
실시예 1. 효모 형질전환
효모 형질전환
야생형 Dc1a를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 소정의 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드와, 알파 교배인자 분비 신호의 서열을 함유하는 개별 ORF를 작제하였다. 이어서, 이러한 ORF를 pKlac1 벡터(카탈로그 번호 N3740; New England Biolabs®; 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723)에 삽입하였다. pKlac1 벡터는 클루이베로마이세스 락티스 PLAC4-PBI 프로모터 (1), 클루이베로마이세스 락티스 α-교배인자(α-MF) 분비 도메인(분비 발현용)을 인코딩하는 DNA, 다중 클로닝 부위(MCS), 클루이베로마이세스 락티스 LAC4 전사 종결인자(TT), 및 효모 ADH2 프로모터(PADH2)에서 발현된 진균 아세트아미다아제 선별 마커 유전자(amdS)를 함유한다. 또한, 대장균에서 pKLAC1의 증식을 위해 대장균 복제 기점(ORI)과 암피실린 내성 유전자(ApR)가 존재한다.
이어서, 생성된 벡터, 즉, pKlac1-WT-Dc1a와 다양한 pKlac1-DVP 벡터를 선형화시키고, LAC4 유전자좌에서 클루이베로마이세스 락티스 숙주 게놈으로의 선형화된 벡터의 다수의 카피의 안정적 통합을 위해 전기천공적격 클루이베로마이세스 락티스 숙주 세포로 형질전환시켰다.
이어서, 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스를 유일한 질소 공급원으로서 아세트아미드가 함유된 선별 한천배지 상에 플레이팅하여, 발현 카세트의 다수의 삽입물을 함유하는 균주와 이의 아세트아미다아제 선별을 확인하였다.
실시예 2. 수율 분석
수율 분석
이어서, WT Dc1a 콜로니와 DVP 콜로니를 2% 소르비톨과 0.2% 옥수수 침지액이 함유된 최소 배지에서 23.5℃에서 6일 동안 배양하였다. Chromololith C18 컬럼(EMD) 상에서의 HPLC 분리와 15%-35% 아세토니트릴의 용리 구배로 폴딩된 WT Dc1a와 DVP의 발현을 평가하였다. 폴딩 및 미스폴딩된 WT Dc1a와 DVP의 피크를 정량화하고, 대조군과 비교하였다(최소 n=4). 야생형 Dc1a는 크로마토그램 상에서 가시적인 폴딩된 피크를 나타내지 않았기 때문에, 생성된 총 Dc1a는 SDS-PAGE Coomassie 염색을 환원시키는 방식으로 추정하였으며, 폴딩된 Dc1a와 미스폴딩된 Dc1a의 비는 이온 교환 크로마토그래피 후 다양한 Dc1a 종을 정량화하는 방식으로 추정하였다.
실시예 3. 이온 교환 크로마토그래피
이온 교환 크로마토그래피
SP-Sephadex C-25(GE Healthcare)를 사용하여 양이온 교환으로 WT Dc1a와 DVP를 정제하였다. 수지를 30 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.0) 중에 평형화시켰다. Dc1a가 함유된 소비된 상청액을 pH가 3.0 미만인 비드에 직접 적용하였다. 비드를 세척하고, 하기 (1) 내지 (4)의 2배 내지 3배 컬럼 부피(CV)로 단계적으로 용리하였다: (1) 30 mM 소듐 아세테이트, pH 4.0, (2) 30 mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), pH 6.0, (3) 30 mM MES, pH 6.0, 100 mM 염화소듐, 및 (4) 30 mM MES, pH 6.0, 200 mM 염화소듐.
순 양전하를 증가시키는 돌연변이를 함유하지 않았던 야생형 Dc1a와 DVP의 경우, 폴딩된 WT Dc1a와 DVP는 용리 완충액 (3)에서 급격한 피크로 용리되었고, Dc1a의 미스폴딩된 버전은 완충액 (4)의 더 높은 염 농도에서 용리되었다. Dc1a의 전체 전하를 증가시키는 돌연변이는 예상대로 더 높은 염 농도에서 용리되었다. 폴딩된 Dc1a를 함유하는 분획을 풀링하고, 물에 반복적으로 투석하여 염과 완충액을 제거하였다. 정제된 물질은 -80℃에서 활성 손실 없이 무기한 보관할 수 있거나, 4℃에서 활성 손실 없이 6개월 초과로 보관할 수 있다.
실시예 4. HPLC 표준 곡선
HPLC 표준 곡선
WT Dc1a 1 mg 내지 2 mg을 Chromolith C18 컬럼(EMD) 상에서 HPLC 분획을 사용하여 >99% 순도로 추가로 정제하였다. 동결건조 후, 흡광 계수(ε) 16180 M-1cm-1를 사용하여 A280 흡광도로 Dc1a를 정량화하였다. 5 μg 내지 100 μg의 농도 범위를 사용하여 HPLC 표준 곡선을 설정하고, 기울기를 사용하여 미지 샘플을 정량화하였다. 도 1 및 도 2.
간략하게, HPLC 표준 곡선을 하기와 같이 수행하였다: 물 중 정제된 Dc1a의 일련의 희석액을 Chromolith C18 컬럼(4.6 x 100 mm)에 주입하고, 2 mL/분의 유속 및 18%-36% 아세토니트릴의 구배로 8분에 걸쳐 용리하였다. 6개 샘플의 Dc1a 피크 면적을 농도에 대해 플롯팅하고, 선형 관계의 기울기를 사용하여 미지 샘플의 농도를 정량화하였다. 흡광도 단위 1 높이에 이른 샘플은 HPLC 검출기의 선형 범위를 벗어난 것으로 가정하여 계산에서 제외시켰다.
실시예 5. 잔기 Cys41 및 Cys51에서 제4 디설파이드 결합의 제거
잔기 Cys41 및 Cys51에서 제4 디설파이드 결합의 제거
Dc1a의 잔기 Cys41과 Cys51(즉, 제4 디설파이드가 연결하는 잔기)에서의 돌연변이가 활성에 영향을 미치지 않고 발현을 증가시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 각각의 시스테인에 대해 집중 돌연변이 스캔을 수행하였다. 여기서, 야생형 아미노산 서열 시스테인 잔기를 유사하게 작은 아미노산으로 대체하는 것은 펩타이드 활성에 무시할만한 영향을 미칠 것이라는 가설을 세웠다. Dc1a의 야생형 시스테인을 알라닌, 트레오닌, 세린 또는 발린으로 돌연변이시키는 방식으로 집중 돌연변이 스캔을 수행하였다. 집중 돌연변이 스캔의 결과는, 모든 돌연변이가 전반적인 발현과 Dc1a의 적절한 폴딩을 개선시켰음을 나타냈다. 표 2.
Dc1a의 집중 돌연변이 분석의 결과는, 돌연변이체 "T/A"(또는 "C41T/C51A")가 발현과 활성의 최상의 조합을 나타냈음을 보여주었기 때문에, C41T/C51A 변이체를 후속 실험에서 수행된 알라닌 스캔을 위한 배경으로 사용하였다.
Figure pct00015
실시예 6. Dc1a의 알라닌 스캔
Dc1a의 알라닌 스캔
어떠한 잔기가 증가된 발현 및/또는 활성의 원인이 될 수 있는지를 결정하기 위해, C41T/C51A DVP에 대해 알라닌 스캔을 수행하였다.
모든 위치에 단일 알라닌 점 돌연변이를 디자인하는 방식으로 Dc1a의 알라닌 스캔을 수행하였다. 디자인된 작제물은 Twist Biosciences(https://www.twistbioscience.com/; 681 Gateway Blvd South San Francisco, CA 94080)에서 합성하고 클로닝하였다. 다음으로, 4개 내지 8개의 형질전환체를 2% 소르비톨과 0.2% 옥수수 침지액이 함유된 최소 배지에서 23.5℃에서 6일 동안 배양하고, HPLC 정량화로 이의 발현을 평가하였다. 발현을 평균내고 대조군(C41T/C51A)에 대해 정규화하고, 개선된 발현을 나타낸 돌연변이체를 집파리에 대한 생체활성에 대해 평가하였다.
알라닌 스캔은, 몇몇 잔기의 돌연변이가 발현의 관찰 가능한 발현 증가를 유도했음을 보여주었다. 회색으로 강조표시된 표 3 참조. 이러한 위치를 돌연변이유발 스크리닝을 이용하여 발현, 폴딩 및 활성에 대해 추가로 분석하였다.
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 7. 잔기 A10, W31, Y32, K33 및 P36의 돌연변이유발 스캔
잔기 A10, W31, Y32, K33 및 P36의 돌연변이유발 스캔
발현 및/또는 활성에 영향을 미치는 추가 위치를 추가로 설명하기 위해, 잔기 A10, W31, Y32, K33 및 P36의 돌연변이유발 스캔을 수행하였다.
돌연변이체는 Twist Biosciences(https://www.twistbioscience.com/; 681 Gateway Blvd South San Francisco, CA 94080)에서 합성하고 클로닝하였다. 여기서, 4개 내지 8개의 형질전환체를 2% 소르비톨과 0.2% 옥수수 침지액이 함유된 최소 배지에서 23.5℃에서 6일 동안 배양하고, HPLC 정량화로 이의 발현을 평가하였다. 발현을 평균내고 대조군(C41T/C51A)에 대해 정규화하고, 개선된 발현을 나타낸 돌연변이체를 집파리에 대한 생체활성에 대해 평가하였다.
돌연변이유발 스캔의 결과는 하기 표 4에 제시되어 있다. 위치 W31은 알라닌으로 돌연변이된 경우 활성이 감소되었지만, 페닐알라닌으로 대체된 경우에는 활성 손실 없이 수율의 증가를 나타냈다. 위치 Y32는 알라닌으로 돌연변이된 경우 유사한 수율 증가와 활성 감소를 나타냈지만, 세린으로 돌연변이된 경우에는 양호한 활성과 증가된 발현을 나타냈다. P36의 알라닌으로의 돌연변이가 다른 돌연변이보다 우수하였다. 각각의 돌연변이를 함께 조합한 경우(W31F, Y32S, P36A), 변형되지 않은 버전에 비해 69% 발현 증가를 나타냈다. 도 3.
Figure pct00018
Figure pct00019
실시예 8. 잔기 V17, D20 및 S21의 돌연변이유발 스캔
잔기 V17, D20 및 S21의 돌연변이유발 스캔
발현 및/또는 활성에 영향을 미치는 추가 위치를 추가로 설명하기 위해, 잔기 V17, D20 및 S21의 돌연변이유발 스캔을 수행하였다. 돌연변이체는 상기 기재된 바와 같이 합성하고 클로닝하였다.
돌연변이유발 스캔의 결과는 하기 표 5에 제시되어 있다. 위치 D20은 활성 손실 없이 양호한 발현을 나타냈으며; 흥미롭게도, 알라닌만 해당 위치에서 야생형 잔기보다 우수한 활성을 나타냈다. 위치 V17 또는 L42에서 D20A와 다른 변이를 조합한 경우 발현이 감소되었다. 위치 S21은 알라닌으로 돌연변이된 경우 발현의 증가를 나타냈지만, 활성은 감소되었다. S21의 다른 돌연변이는 동일한 증가된 발현을 나타내지 않았기 때문에, 더 이상 추적하지 않았다.
Figure pct00020
실시예 9. 위치 D38의 평가
위치 D38의 평가
발현 및/또는 활성에 영향을 미치는 추가 위치를 추가로 설명하기 위해, 잔기 D38의 돌연변이유발 스캔을 수행하였다.
알라닌으로 돌연변이된 경우 큰 발현 증가를 나타냈기 때문에, 위치 D38을 돌연변이 스캐닝으로 스크리닝하였다. 이어서, 발현에 대한 돌연변이체의 최적의 조합을 확인하기 위해, D38A를 이전에 확인된 W31F, Y32S 및 P36A로 이루어진 최적화된 돌연변이체 포함 유무 하에, L42 또는 V52 돌연변이체와의 조합뿐 아니라, D20A와의 조합으로 평가하였다. 돌연변이체는 상기 기재된 방법에 따라 합성하고 클로닝하였다. 발현을 평균내고 대조군(C41T/C51A)에 대해 정규화하고, 개선된 발현을 나타낸 돌연변이체를 집파리에 대한 생체활성에 대해 평가하였다.
돌연변이유발 스캔의 결과는 하기 표 6에 제시되어 있다. 위치 D38A는 활성 손실 없이 발현의 큰 증가를 나타냈으며, HPLC 상의 Dc1a 피크의 수는 감소하였다. 도 4 및 도 5 참조. 다른 돌연변이체는 유사한 특징의 조합을 나타내지 않았다. 다음으로, L42 및 V52 돌연변이체를 D38A와 함께 평가하였다. D38A와 조합된 경우 V52 돌연변이체는 발현을 감소시켰지만, 몇몇 L42 돌연변이체는 발현을 증가시켰으며, 여기서 L42V가 가장 강력한 결과를 나타냈다.
Figure pct00021
실시예 10. 시스테인 돌연변이체의 추가 최적화
시스테인 돌연변이체의 추가 최적화
위치 41 및 51의 시스테인 잔기(즉, 제4 디설파이드 결합에 대한 연결성을 제공하는 잔기)의 재최적화(re-optimization)를 D38A DVP에서 수행하였다. 이전 실험에서 제거된 제4 디설파이드 근처의 2개의 추가 돌연변이가 최적인 것으로 확인되었기 때문에(즉, D38A와 L42V), D38A가 존재하는 경우 이러한 위치에서 돌연변이체의 최상의 가능한 조합을 찾기 위해 C41과 C51의 돌연변이를 재최적화하였다. 돌연변이체는 상기 기재된 방법에 따라 합성하고 클로닝하였다.
재최적화 결과는 하기 표 7에 제시되어 있다. D38A의 재최적화 스캔의 결과에 기반하여, D38A와 L42V를 조합하기 위한 디설파이드 돌연변이체의 최상의 세트로 C41S/C51S를 선택하였다. 도 5 및 도 6.
Figure pct00022
결과적으로, 개별 및 조합된 돌연변이를 헤드-투-헤드(head-to-head) 검정으로 발현과 활성에 대해 비교하였다. 본원에서 탐색된 4개 돌연변이의 조합, 즉, C41S/C51S/D38A/L42V를 갖고, "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSVKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 53)의 아미노산 서열을 갖는 DVP는, 집파리 생체활성의 손실 없이 WT에 비해 발현을 거의 200배 증가시켰다. 도 6.
실시예 11. 집파리 주사
집파리 주사
14 mg 내지 20 mg 무게의 성체 집파리(무스카 도메스티카)를 CO2를 사용하여 마취시키고, WT Dc1a와 하기 DVP들을 포함하는 0.5 μL를 흉곽내 주사하였다: (1) C41T/C51A; (2) C41T/C51A/D38A; 및 (3) C41S/C51S/D38A/L42V. 결과는 도 7에 제시되어 있다.
24시간에서의 퍼센트 녹다운(즉, 걸을 수 없음)(24시간에서의 녹다운%)에 대해 파리를 평가하는 방식으로 용량 반응 곡선을 생성하였다. CO2 제어 하에서, 파리는 몇 분 후 걸을 수 있는 능력을 되찾았고, 그 직후 날 수 있는 능력을 되찾았다. 중간 수준의 Dc1a가 투여된 파리는 서 있고 걸을 수 있는 능력을 되찾았지만; 이러한 파리는 날 수 있는 능력을 되찾지는 못했다. 주사 15분 내지 30분 후, 파리는 강직성 마비의 짧은 에피소드가 산재된 이완성 마비를 나타내기 시작했고, 1시간 후 강도가 절정에 이르러 서 있을 수 없게 되었다. 24시간에 여전히 마비 상태였지만 사멸하지 않은 파리는 이완성 마비를 나타냈고, 탈수로 인한 사멸이 발생한 주사 후 최대 72시간까지 회복되지 않았다. 도 7.
도 7에 제시된 바와 같이, DVP C41T/C51A/D38A와 C41S/C51S/D38A/L42V는 WT-Dc1a와 비교할 때 우수한 녹다운 능력을 나타냈다. 24시간에서 50% 녹다운을 달성하기 위해, C41T/C51A/D38A는 11.3 pmol/g의 용량이 필요했고, C41S/C51S/D38A/L42V는 13.5 pmol/g의 용량이 필요했으며; 대안적으로 WT-Dc1a는 15.6 pmol/g의 용량이 필요했다.
실시예 12. 옥수수 귀벌레(CEW) 주사
옥수수 귀벌레(CEW) 주사
CEW에 주사된 DVP를 평가하는 검정을 하기와 같이 수행하였다: 옥수수 귀벌레(헬리코베르파 제아) 유충의 제4령충에 주사하였다. 헬리코베르파 제아의 알을 구입하여(Benzon, Carlisle, PA), General Purpose Lepidoptera Diet(Frontier Agricultural Science, Newark, DE) 상에서 제4령충까지 사육하였다. 주사 전, pmol/g 용량을 계산하기 위해 유충의 무게를 쟀다. 주사 부피는 1 μL였고, 핸드 어플리케이터(Burkard, Rickmansworth, Herts, England)에서 30게이지 니들과 유리 시린지를 이용하여 수행하였다. 주사 후, 유충을 General Purpose Lepidoptera Diet가 있는 새로운 인클로저(enclosure)에 위치시키고, 주사 24시간 후 이들의 상태(사멸률, 준치사 효과 및 거동)를 평가하였다.
여기서, 야생형 Dc1a와, C41T/C51A/D38A(서열번호 29) 및 C41S/C51S/D38A/L42V(서열번호 53)를 CEW에 주사하고, 24시간에 녹다운%를 평가하였다.
도 8에 제시된 바와 같이, 시스테인 제거 돌연변이체의 주사는 CEW 사멸율을 수십배 감소시켰다. C41A/C51A 돌연변이체가 2500 pmol/g의 고용량에서 활성을 나타내지 않았기 때문에, 활성의 손실은 시스틴 결합 위치(C41와 C51)에 국소화된 것으로 나타났다. 집파리와 CEW의 녹다운을 비교한 표가 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00023
실시예 13. CEW 살충 활성을 개선시키는 돌연변이
CEW 살충 활성을 개선시키는 돌연변이
CEW 활성의 회복에 대해 스크리닝하기 위해 Dc1a의 돌연변이를 제작하였다. 여기서, 돌연변이체는 상기 기재된 방법에 따라 합성하고 클로닝하였다. 간략하게, 4개의 형질전환체를 2% 소르비톨과 0.2% 옥수수 침지액이 함유된 최소 배지에서 23.5℃에서 6일 동안 배양하였다. 상청액을 조합하고, 분자량 컷오프가 3000 Da인 원심분리 여과 카세트(Pall)를 사용하여 10배 농축시켰다. 이어서, 농축액을 옥수수 귀벌레(헬리코베르파 제아)에 주사하였다.
옥수수 귀벌레(CEW) 유충의 제4령충에 주사하였다. 헬리코베르파 제아의 알을 구입하여(Benzon Research, 7 Kuhn Dr, Carlisle, PA, 17015), General Purpose Lepidoptera Diet(Frontier Agricultural Science, Newark, DE) 상에서 제4령충까지 사육하였다. 주사 전, pmol/g 용량을 계산하기 위해 유충의 무게를 쟀다. 주사 부피는 1 μL였고, 핸드 어플리케이터(Burkard, Rickmansworth, Herts, England)에서 30게이지 니들과 유리 시린지를 이용하여 수행하였다. 주사 부위는 제일 뒷쪽 앞다리 중 하나의 바닥 근처였다. 주사 후, 유충을 General Purpose Lepidoptera Diet가 있는 새로운 인클로저(enclosure)에 위치시키고, 주사 24시간 후 이들의 상태(사멸률, 준치사 효과 및 거동)를 평가하였다.
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
특징분석 후, 위치 C41의 발린 또는 메티오닌은 WT와 유사한 높은 활성을 나타냈지만, 발린은 수율을 감소시켰다. D20의 티로신으로의 돌연변이는 또한 돌연변이체가 C41T/C51A인 경우에도 WT와 유사한 활성을 회복할 수 있었다.
실시예 14. 식물에서 DVP-살충 단백질의 발현
식물에서 DVP-살충 단백질의 발현
식물, 식물 조직, 식물 세포, 식물 종자 또는 이의 부분에서 DVP-살충 단백질의 발현을 평가하였다. 여기서, DVP-살충 단백질의 클로닝과 발현은 FECT로 지칭되는 담배 일시적 발현 시스템 기술을 사용하여 수행하였다(문헌[Liu Z & Kearney CM, BMC Biotechnology, 2010, 10:88], 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
간략하게, FECT 벡터는 바이러스 코팅 단백질을 인코딩하는 유전자 및 삼중 유전자 블록 없이 여우꼬리 모자이크 바이러스 RNA의 발현을 유도하는 CaMV 35S 프로모터를 함유하는, 아그로감염을 위한 T-DNA 영역을 함유한다. 코팅 단백질과 삼중 블록 대신, 높은 수준의 일시적 바이러스 발현을 위해 DVP ORF가 Pac I 부위를 따라 N'에서 C'로 서브클로닝되는 것을 가능하게 하는 한 쌍의 서브클로닝 부위(Pac I 및 Avr II)가 존재한다. 이러한 "무장 해제된" 바이러스 게놈은 식물간 전파를 방지한다. DVP를 발현하기 위해 서브클로닝된 FECT 벡터에 더하여, 도입된 T-DNA의 전사 후 유전자 침묵(PTGS)을 방지하기 위해 토마토 덤불 위축 바이러스 유래의 RNA 침묵 억제 단백질인 P19를 인코딩하는 제2 FECT 벡터를 공동 발현시켰다. 일시적 식물 발현 시스템을 함유하는 아그로박테리움을 하기 기재되는 바와 같이 담배잎(니코티아나 벤타미아나)에 주사하였다.
여기서 시험된 DVP-살충 단백질은 하기 구성요소를 포함하였다: 소포체 신호 펩타이드(ERSP); 유비퀴틴 단량체; 개재 링커 펩타이드 및 히스티딘 태그.
사용된 ERSP 모티프는 하기 아미노산 서열(N'에서 C'로; 1개 문자 코드)을 갖는 24개 아미노산 펩타이드인 보리 알파-아밀라아제 신호 펩타이드(BAAS)였다: MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG(서열번호 60).
사용된 제아 메이스 유비퀴틴 단량체는 하기 아미노산 서열(N'에서 C'로; 1개 문자 코드)을 갖는 75개 아미노산 펩타이드였다: QIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLADYNIQKESTLHLVLRLRGG(서열번호 183)(NCBI 수탁번호 XP_020404049.1)
DVP-살충 단백질에 사용된 DVP ORF를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드는 하기 표 11에서 확인할 수 있다.
사용된 개재 연결 펩타이드는 하기 아미노산 서열(N'에서 C'로; 1개 문자 코드)을 가졌다: ALKFLV(서열번호 184) 또는 IGER(서열번호 54).
사용된 히스티딘 태그는 하기 아미노산 서열(N'에서 C'로; 1개 문자 코드)을 가졌다: HHHHHH(서열번호 185).
따라서, 본 실시예에 사용된 예시적인 DVP-살충 단백질은 하기 요소와 배향을 갖는 작제물을 갖는다:
ERSP-UBI-L-DVP-HIS
DVP-살충 단백질에 대한 전체 아미노산 서열은 하기와 같다:
MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASGQIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLADYNIQKESTLHLVLRLRGGALKFLVAKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLDCRCLKSGFFSSKCVCRDVHHHHHH(서열번호 186)
DVP-살충 단백질의 일반적인 개략도는 도 9에 제시되어 있다. 여기서, 전술한 작제물은 하기 정의되는 바와 같은 구성요소를 갖는다: "ERSP"는 소포체 신호 펩타이드를 나타내고; "UBI"는 유비퀴틴 단량체를 나타내고; "DVP"는 뮤-디구에톡신-Dc1a 독소 또는 DVP를 나타내고; "L"은 개재 링커 펩타이드를 나타내고; "HIS"는 히스티딘 태그를 나타냄.
다음으로, DVP-살충 단백질을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드, 즉, 하기 ORF를 갖는 DNA: "BAAS:UBI:L:DVP:HIS" 또는 "baas-ubi-l-dvp-his"(여기서, BAAS는 ERSP이고; UBI는 유비퀴틴이고; L은 연결 펩타이드임)를, FECT 발현 벡터의 Pac I 및 Avr II 제한 부위에 클로닝하여 일시적 벡터를 생성하였다. 이어서, 이러한 일시적 벡터를 하기와 같은 동결-해동 방법을 사용하여 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101 세포로 형질전환시켰다: 보관된 구성요소 GV3101 세포를 얼음 위에서 해동시킨 후, 순수한 일시적 벡터 DNA 1 μg 내지 5 μg과 혼합하였다. 세포-DNA 혼합물을 얼음 위에서 5분 동안 유지시키고, 5분 동안 -80℃로 옮기고, 혼합물을 37℃ 수조에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 동결-해동 처리된 세포를 1 mL LB 배지에 희석하고, 실온에서 2시간 내지 4시간 동안 흔들 테이블 상에서 진탕시켰다. 이어서, 세포-LB 혼합물을 5,000 rcf로 2분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화한 후, LB 상청액 800 μL를 제거하였다. 이어서, 세포를 나머지 액체에 재현탁시키고, 형질전환된 세포-LB 혼합물 전체 부피(대략 200 μL)를 적절한 항생제(10 μg/mL 리팜피신, 25 μg/mL 겐타마이신 및 50 μg/mL 카나마이신)가 함유된 LB 한천 플레이트 상에 확산시키고, 28℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 생성된 형질전환된 콜로니를 선택하고, 형질전환된 DNA 분석 및 형질전환된 GV3101 세포의 글리세롤 스톡 생성에 필요한 적절한 항생제가 함유된 LB 배지 6 mL 분취액에서 배양하였다.
이어서, 형질전환된 GV3101 세포를 이전에 생성된 글리세롤 스톡으로부터의 적절한 항생제(상기 기재된 바와 같음)가 함유된 LB 플레이트 상에 스트리킹하고, 28℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 형질전환된 GV3101 세포의 콜로니를 사용하여 LB-MESA 배지(10 mM MES 및 20 μM 아세토시린곤이 보충된 LB 배지) 5 mL, 및 상기 기재된 동일한 항생제를 접종하였다. 이어서, 콜로니를 28℃에서 밤새 성장시킨 후; 5000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고, 유도 배지(10 mM MES, 10 mM MgCl2, 100 μM 아세토시린곤)에 최종 OD600 1.0으로 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 유도 배지에서 실온에서 2시간 내지 밤새 인큐베이션하였다. 이 시점에서, 세포는 담배잎의 일시적 형질전환을 위한 준비가 되었다.
FECT가 P19 발현과 관심 유전자 발현의 혼합을 사용하기 때문에, pFECT-P19 형질전환된 GV3101 세포에 대한 세포 배양물과 관심 유전자 배양물을 식물 잎에 주사하기 전 담배잎의 침윤을 위해 동량으로 함께 혼합하였다. 처리된 세포를 3 mL 무바늘 시린지를 사용한 주사를 통해 니코티아나 벤타미아나 식물의 부착된 잎의 밑면에 침윤시켰다. 침윤 6일 내지 8일 후 담배잎에서의 단백질 발현을 평가하였다.
수동 추출 기술을 사용하여 담배에서 전장 DVP-살충 단백질을 정제하였다. 30 mm 직경 펀치를 이용하여 침윤된 영역에서 잎 조직을 얻고, 말아서, 2개의 5/32 인치 직경 스테인리스 강 분쇄 볼이 있는 2 mL 원추형 바닥 튜브 내부에 배치하고, 액체 질소 중에 동결시켰다. 이어서, Troemner-Talboys High Throughput Homogenizer를 사용하여 샘플을 균질화하였다. 다음으로, 얼음 냉각시킨 가용성 단백질(TSP) 추출 용액(인산소듐 용액 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7.0) 750 μL를 튜브에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 이어서, 마이크로튜브를 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 4℃에서 16,000 x g로 15분 동안 원심분리하였다. 다음으로, 생성된 상청액 100 μL를 취하여, 바닥에 빈 수용 Costar 마이크로티터 플레이트가 있는 0.45 μm Millipore MultiScreen 필터 마이크로티터 플레이트의 사전 Sephadex G-50 패킹된 컬럼에 로딩하였다. 이어서, 마이크로티터 플레이트를 4℃에서 800 g로 2분 동안 원심분리하였다. 담배잎의 생성된 여과액(이후 "총 가용성 단백질 추출물" 또는 "TSP 추출물")이 다운스트림 분석을 위한 준비가 되었다.
이어서, 샘플을 표준 웨스턴 블롯팅 기술을 사용하여 분석하였다. 단백질 샘플 10 μL를 Invitrogen 2X SDS 로딩 버퍼 9 μL 및 Novex 10X 환원제 2 μL와 혼합하고, 샘플을 85℃에서 5분 동안 가열하여 단백질 겔을 위한 샘플을 준비하였다. 이어서, 샘플을 Novex Precast, 상단 탱크에 0.1% 소듐 티오글리콜레이트가 함유된 1x Invitrogen Tricine 러닝 완충액(running buffer) 중 16% Tricine 겔 및 Invitrogen SeeBlue Plus 2 MWM에 로딩하고 실행하였다. 겔을 150 V에서 75분 동안 실행하였다. 이어서, 겔을 iBLOT 시스템에서 7분 전송 프로그램을 사용하여 Novel PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 이동이 완료되면, 블롯 멤브레인을 용기로 옮기고, 실온에서 온건하게 진탕시키면서 완충액 A(Quality Biological's 10x TBS로 제조한 1x TBS(0.25 M 트리스 염기, 1.37 M NaCl, 0.03 M KCl, pH 7.4))로 5분 동안 세척하였다. 이어서, 완충액 B(1% BSA가 함유된 완충액 A)를 사용하여 1시간 동안 차단 단계를 수행하였다. 이어서, 블롯을 완충액 C(0.05% Tween 20가 함유된 완충액 B)로 5분 동안 3회 세척하였다. 이어서, 1시간 동안 완충액 C 중에 Maine Biotech Anti-His 항체를 1:10000으로 희석하였다. 이어서, 블롯을 완충액 C로 각각 5분 동안 3회 세척하였다. 이어서, 1시간 동안 완충액 C 중에 BioRad 염소 항-마우스 AP 접합된 항체(2차 항체)를 1:3000으로 희석하였다. 이어서, 블롯을 완충액 C로 각각 5분 동안 2회 세척하고, 완충액 A로 5분 동안 1회 세척하였다. 이어서, 블롯을 BioRad AP 전개액을 이용하여 전개시키고, 물로 세척하여 중단시켰다.
도 10은, 식물 발현 Dc1a와 돌연변이체의 His-Tag 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 각각의 웰은 변성 단백질 겔 조건 하에서 실행되고 표준 웨스턴 블롯 기술을 이용하여 가시화된 미정제 식물 추출물을 나타낸다. 웨스턴 블롯에서 시험된 샘플의 약식 명칭이 발현에 대한 등급 시스템과 함께 이미지 위에 열거되어 있다. 기호 (-)는 블롯 상에 검출된 단백질이 없음을 나타내고, 단백질이 검출되는 경우 기호 (+) 내지 (+++)는 육안 검사로 검출된 상대적 양을 나타낸다. "LADDER"로 표시된 레인은 분자량 마커를 나타낸다. 레인 "PLANT NEG"는 음성 대조군(즉, 담배 단백질 추출물을 발현하는 GFP)을 나타낸다. "M#"로 표지된 레인은 평가된 DVP-살충 단백질에 대한 약식 명칭을 나타내며, 이는 하기 표에서 확인할 수 있다. 레인 "WT"는 WT 뮤-디구에톡신-Dc1a 단백질을 갖는 DVP-살충 단백질을 나타낸다.
Figure pct00027
실시예 15. 식물 발현 단백질을 이용한 집파리 주사 검정
식물 발현 단백질을 이용한 집파리 주사 검정
집파리에 상기 기재된 식물 추출 공정에 따라 얻은 TSP 추출물을 주사하였다. 주사 전, CO2를 이용하여 성체 집파리(무스카 도메스티카)를 고정시키고, 주사를 위해 무게(12 mg 내지 20 mg)를 기준으로 집파리를 선택하였다. 1 cc 시린지 및 30게이지 니들이 장착된 마이크로어플리케이터를 사용하여 파리당 0.5 μL의 소정의 처리물(음성 대조군 또는 비자연 발생 뮤-디구에톡신-Dc1a 살충 단백질)을 등쪽 흉부의 체벽을 통해 집파리에 주사하였다. 주사된 집파리를 습한 여과지가 있고 뚜껑에 호흡 구멍이 있는 폐쇄된 용기에 위치시키고, 주사 2시간 후 영향을 받은 점수를 기준으로 평가하였다. 영향을 받은 점수에는 녹다운과 사멸률이 포함된다.
집파리 주사 검정 결과는 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00028
실시예 16. 고수율 DVP
서열번호 47에 대한 점 돌연변이가 개선된 발현을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 C41S, C51S 및 D38A의 아미노산 치환을 갖는 DVP, 즉, "AKDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWYKWRPLACRSLKSGFFSSKSVCRDV"(C41S/C51S/D38A; 서열번호 47)를 추가로 평가하였다. 이러한 C41S/C51S/D38A DVP 배경에, 하기 추가 돌연변이를 생성하였다: L42I; K2L; Y32S; K2L + Y32S; D38T; D38S; 및 D38M.
폴리뉴클레오타이드 작제물을 상기 기재된 바와 같이 합성하고, 클로닝하고, 발현시키고, 수율을 C41S/C51S/D38A DVP(서열번호 47)의 평균 수율에 대해 정규화하였다. 하기 표에 제시된 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 작제물을 생성하였다.
Figure pct00029
표 13의 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 작제물을 상기 기재된 바와 같이(실시예 1 참조) pKlac1 벡터(카탈로그 번호 N3740; New England Biolabs®; 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723)에 삽입하였다. 이어서, 생성된 벡터를 선형화시키고, LAC4 유전자좌에서 클루이베로마이세스 락티스 숙주 게놈으로의 선형화된 벡터의 다수의 카피의 안정적 통합을 위해 전기천공적격 클루이베로마이세스 락티스 숙주 세포로 형질전환시켰다. 이어서, 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스를 유일한 질소 공급원으로서 아세트아미드가 함유된 선별 한천배지 상에 플레이팅하여, 발현 카세트의 다수의 삽입물을 함유하는 균주와 이의 아세트아미다아제 선별을 확인하였다.
이어서, 콜로니를 2% 소르비톨과 0.2% 옥수수 침지액이 함유된 최소 배지에서 23.5℃에서 6일 동안 배양하였다. Chromololith C18 컬럼(EMD) 상에서의 HPLC 분리와 15%-35% 아세토니트릴의 용리 구배로 DVP의 발현을 평가하였다. WT ApsIII 1 mg 내지 2 mg을 Chromolith C18 컬럼(EMD) 상에서 HPLC 분획을 사용하여 >99% 순도로 추가로 정제하였다. 동결건조 후, 흡광 계수(ε) 16180 M-1cm-1를 사용하여 A280 흡광도로 WT ApsIII을 정량화하였다. 5 μg 내지 100 μg의 농도 범위를 사용하여 HPLC 표준 곡선을 설정하고, 기울기를 사용하여 미지 샘플을 정량화하였다.
서열번호 210 내지 219의 DVP의 수율을 서열번호 47의 DVP의 수율과 비교하였다. rpHPLC 피크 면적에 기반하여 수율을 결정한 후, 총 통합 유전자 카피에 대해 정규화하였다. 유전자 카피 측정치를 결정하기 위해, 효모 gDNA 추출 키트(ThermoFisherScientific)를 사용하여 gDNA를 추출하고, 델타 델타 Ct(ΔΔCt) 방법을 사용하여 qPCR 분석으로 카피 수를 결정하였다. 피크 면적을 C41S/C51S/D38A DVP 배경(서열번호 47)에 대해 정규화하였다.
도 11에 제시된 바와 같이, C41S/C51S/D38A DVP 배경에 대한 추가 돌연변이, 즉, L42I; K2L; Y32S; K2L + Y32S; D38T; 및 D38S는 모두 C41S/C51S/D38A DVP 배경(서열번호 47) 대조군에 비해 개선된 수율을 나타냈다.
실시예 17. 고수율 DVP를 개선시키는 돌연변이
실시예 16에서 식별된 DVP를 추가로 평가하였다. 여기서, 하기 DVP (1) 및 (2)를 야생형 Dc1a(서열번호 2)와 비교하였다: (1) "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLDCRCIKSGFFSSKCVCRDV"(서열번호 217)의 아미노산 서열을 갖는 K2L/Y32S/L42I DVP; 및 (2) "ALDGDVEGPAGCKKYDVECDSGECCQKQYLWSKWRPLACRSIKSGFFSSKSVCRDV"(서열번호 218)의 아미노산 서열을 갖는 K2L/Y32S/D38A/L42I/C41S/C51S DVP.
상기 DVP는 실시예 16에 기재된 방법에 따라 합성하고 클로닝하였다. 실시예 16에 기재된 바와 같이 rpHPLC로 발현을 결정하였다. 피크 면적을 야생형 Dc1a(서열번호 2)에 대해 정규화하였다. 하기 표는 DVP의 요약과 이의 발현의 개선 배수를 제공한다.
Figure pct00030
도 12 및 표 14에 제시된 바와 같이, 돌연변이 K2L, Y32S 및 L42I의 조합(서열번호 217)은 야생형 Dc1a와 비교하여 수율을 극적으로 개선시켰다(19배 개선). 나아가, 디설파이드 결합 결실(즉, C41S/C41S)을 포함하는 C41S/C51S/D38A DVP 배경 돌연변이체에서 K2L, Y32S 및 L42I 돌연변이를 조합한 경우 발현이 훨씬 더 증가하였다(63배 개선). 도 12.
실시예 18. 시스틴 매듭 구조: 개요
시스틴 매듭 구조
본 발명은 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 재조합 CRP를 조작하는 방법을 고려하고 교시한다:
Figure pct00031
화학식 (II)
(식 중, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며; 여기서 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되며; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이고; NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이며; 여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음); 여기서 상기 재조합 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 변형시키는 방식으로 생성되며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않고; 여기서 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형되며; 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고; 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타냄.
도 13은, 시스틴 매듭(CK) 구조를 갖는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 설명하는 화학식 (II)를 나타내는 개략도를 도시한 것이다. 여기서, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기를 나타내며; 시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결된다(디설파이드 결합은 시스테인 잔기를 연결하는 선으로 표시됨). 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고; 여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이다. NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 각각 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이다. 일부 구현예에서, NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않는다.
실시예 19. 화학식 (II)의 CK 구조: ApsIII에의 도달
단백질 뮤-시르타우톡신(cyrtautoxin)-As1a("ApsIII" 또는 "Aps-3"로도 알려짐)는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖도록 변형된 변형 가능한 CRP이다. ApsIII은 문짝 거미(trap-door spider), 아포마스투스 슈린게리(Apomastus schlingeri)에서 발견된 살충 단백질이다. "CNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNCIGGGCSKTCGY"(서열번호 193, NCBI 수탁번호 P49268.1)의 아미노산 서열을 갖는 예시적인 야생형 ApsIII 단백질이 본원에 제공된다.
야생형 ApsIII 단백질은 1번 내지 15번; 8번 내지 19번; 14번 내지 35번; 및 26번 내지 31번 위치에 4개의 디설파이드 결합을 갖는다. 1번 내지 15번; 8번 내지 19번; 14번 내지 35번 위치의 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고, 26번 내지 31번 위치에 걸쳐 있는 디설파이드 결합은 비-CK 디설파이드 결합, 즉, 시스틴 매듭 모티프을 생성하는 데 참여하지 않는 디설파이드 결합을 나타낸다. 따라서, 26번 내지 31번 위치에 걸쳐 있는 비-CK 디설파이드 결합을 제거하여 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 ApsIII을 생성하였다.
폴리뉴클레오타이드 작제물을 상기 기재된 바와 같이 합성하고, 클로닝하고, 발현시키고, 수율을 야생형 ApsIII의 평균에 대해 정규화하였다. 결과는, 여분의 비-코어 ICK 디설파이드가 제거될 때 수율이 거의 50% 개선되었음을 보여주었다.
간략하게, 하기 작제물을 생성하였다: 재조합 야생형 ApsIII(서열번호 195)을 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드(서열번호 194) 및 ApsIII dCys 돌연변이체(서열번호 197)를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드(서열번호 196). 여기서, ApsIII dCys 돌연변이체는 서열번호 193에 제시된 WT ApsIII 서열에 비해 C26A 및 C31A 돌연변이를 갖는다. C26A 및 C31A 돌연변이는 제4 디설파이드 결합을 제거한다.
이러한 폴리뉴클레오타이드 작제물을 상기 기재된 바와 같이(실시예 1 참조) pKlac1 벡터(카탈로그 번호 N3740; New England Biolabs®; 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723)에 삽입하였다. 이어서, 생성된 벡터를 선형화시키고, LAC4 유전자좌에서 클루이베로마이세스 락티스 숙주 게놈으로의 선형화된 벡터의 다수의 카피의 안정적 통합을 위해 전기천공적격 클루이베로마이세스 락티스 숙주 세포로 형질전환시켰다. 이어서, 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스를 유일한 질소 공급원으로서 아세트아미드가 함유된 선별 한천배지 상에 플레이팅하여, 발현 카세트의 다수의 삽입물을 함유하는 균주와 이의 아세트아미다아제 선별을 확인하였다.
이어서, 콜로니를 2% 소르비톨과 0.2% 옥수수 침지액이 함유된 최소 배지에서 23.5℃에서 6일 동안 배양하였다. Chromololith C18 컬럼(EMD) 상에서의 HPLC 분리와 15%-35% 아세토니트릴의 용리 구배로 WT ApsIII 및 ApsIII dCys의 발현을 평가하였다. WT ApsIII 1 mg 내지 2 mg을 Chromolith C18 컬럼(EMD) 상에서 HPLC 분획을 사용하여 >99% 순도로 추가로 정제하였다. 동결건조 후, 흡광 계수(ε) 16180 M-1cm-1를 사용하여 A280 흡광도로 WT ApsIII을 정량화하였다. 5 μg 내지 100 μg의 농도 범위를 사용하여 HPLC 표준 곡선을 설정하고, 기울기를 사용하여 미지 샘플을 정량화하였다.
rpHPLC 피크 면적에 기반하여 WT ApsIII 및 ApsIII dCys(각각 n = 8)의 수율을 결정한 후, 총 통합 유전자 카피에 대해 정규화하였다. 유전자 카피 측정치를 결정하기 위해, 효모 gDNA 추출 키트(ThermoFisherScientific)를 사용하여 gDNA를 추출하고, 델타 델타 Ct(ΔΔCt) 방법을 사용하여 qPCR 분석으로 카피 수를 결정하였다. Graphpad Prism ver. 9.2.0을 사용하여 상대 수율을 보여주는 바이올린 플롯을 생성하였다. 도 14. 결과는, 여분의 비-CK 디설파이드가 제거될 때 수율이 50.2% 개선되었음을 보여주었다.
실시예 20. 화학식 (II)의 CK 구조: κ-ACTX 펩타이드에의 도달
변형 가능한 CRP인 카파-ACTX 펩타이드("카파-ACTX" 또는 "κ-ACTX"로도 알려짐)를 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖도록 변형하였다.
카파-ACTX는 아트라시나에 아과에 속하는 호주 깔대기 그물 거미에서 단리된 살충성 저해제 시스틴 매듭(ICK) 펩타이드 패밀리의 구성원이다. 하나의 이러한 거미는 하드로니케 베르수타라는 학명을 가진 호주 블루마운틴 깔대기 그물 거미로 알려져 있다. "AICTGADRPCAACCPCCPGTSCKAESNGVSYCRKDEP"(서열번호 198)(UniProtKB/Swiss-Prot 번호 P82228.1)의 아미노산 서열을 갖는 예시적인 야생형 카파-ACTX 펩타이드가 본원에 제공된다.
야생형 카파-ACTX 단백질은 3번 내지 17번; 10번 내지 22번; 13번 내지 14번; 및 16번 내지 32번 위치에 4개의 디설파이드 결합을 갖는다. 3번 내지 17번; 10번 내지 22번; 및 16번 내지 32번 위치의 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프을 형성하는 디설파이드 결합이며, 이러한 디설파이드 결합 토폴로지는 ICK를 형성한다. 13번 내지 14번 위치의 디설파이드 결합은 비-CK 디설파이드 결합, 즉, 시스틴 매듭 모티프(즉, ICK)를 생성하는 데 참여하지 않는 디설파이드 결합을 나타낸다. 따라서, 13번 내지 14번 위치에 걸쳐 있는 비-CK 디설파이드 결합을 제거하여 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 카파-ACTX을 생성하였다.
카파-ACTX ORF를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 작제물은 Twist Biosciences(https://www.twistbioscience.com; 681 Gateway Blvd South San Francisco, CA 94080)에서 합성하고 클로닝하였다. 카파-ACTX ORF는 하기 단백질을 인코딩하였다: WT 카파-ACTX(서열번호 198); C13A 돌연변이를 갖는 카파-ACTX 돌연변이체(서열번호 199); C14A 돌연변이를 갖는 카파-ACTX 돌연변이체(서열번호 200); 및 C13A 및 C14A 돌연변이를 갖는 카파-ACTX 돌연변이체(서열번호 201).
작제물을 코돈 최적화하고, 클루이베로마이세스 락티스 알파 교배인자 프리/프로 서열(αMF)과의 융합체로 합성하고, pKlac1(카탈로그 번호 N3740; New England Biolabs®; 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723)의 NotI 및 HindIII 제한 부위에 결찰시켰다. pKlac1 벡터는 클루이베로마이세스 락티스 PLAC4-PBI 프로모터 (1), 클루이베로마이세스 락티스 α-교배인자(α-MF) 분비 도메인(분비 발현용)을 인코딩하는 DNA, 다중 클로닝 부위(MCS), 클루이베로마이세스 락티스 LAC4 전사 종결인자(TT), 및 효모 ADH2 프로모터(PADH2)에서 발현된 진균 아세트아미다아제 선별 마커 유전자(amdS)를 함유한다. 또한, 대장균에서 pKLAC1의 증식을 위해 대장균 복제 기점(ORI)과 암피실린 내성 유전자(ApR)가 존재한다.
벡터를 SacII로 소화시켜 선형화시키고 박테리아 Ori 및 선별 마커를 제거한 후, 전기천공적격 클루이베로마이세스 락티스 세포에 전기천공하였다. 이어서, 콜로니를 2% 소르비톨과 0.2% 옥수수 침지액이 함유된 최소 배지에서 23.5℃에서 6일 동안 배양하였다. 다중 유전자 카피 형질전환체를 유일한 질소 공급원으로 아세트아미드를 함유하는 선별 플레이트에서 선별하였다.
상기 기재된 HPLC 절차에서 결정된 피크 면적(mAU)을 기준으로 수율을 비교하였다. 간략하게, 단백질을 발현하는 클론을 Chromolith C18 컬럼(4.6 x 100 mm) 상에서 HPLC로 평가하고, 2 mL/분의 유속으로 5분에 걸쳐 5%-30% 아세토니트릴 구배로 용리하였다.
하기 표는 화학식 (II)에 따른 CK 구조에 도달하기 위해 카파-ACTX에서 인접한 디설파이드 결합을 제거한 결과를 보여준다.
Figure pct00032
상기 표 14에 제시된 바와 같이, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖도록 카파-ACTX를 변형시키면 수율이 증가하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Vestaron Corporation <120> MU-DIGUETOXIN-DC1A VARIANT POLYPEPTIDES FOR PEST CONTROL <130> 225312-497884 <150> U.S. Provisional Application No. 63/084,339 <151> 2020-09-28 <160> 249 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 94 <212> PRT <213> Diguetia canities <400> 1 Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala Val Tyr 1 5 10 15 Ala Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp Ile Met Leu Asp Ser 20 25 30 Pro Ala Asp Met Glu Arg Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala 35 40 45 Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln 50 55 60 Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu 65 70 75 80 Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val 85 90 <210> 2 <211> 56 <212> PRT <213> Diguetia canities <400> 2 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 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sequence <220> <223> C41S/ C51T/ D38A (S/T + D38A) DVP <400> 45 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 Ser Lys Thr Val Cys Arg Asp Val 50 55 <210> 46 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51T/ D38A (T/T + D38A) DVP <400> 46 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 Ser Lys Thr Val Cys Arg Asp Val 50 55 <210> 47 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C41S/ C51S/ D38A (S/S + D38A) DVP <400> 47 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe 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ccgacatgga aagagcgaag 120 gacggtgacg tggaagggcc tgcgggctgc aagaaatacg acgtagagtg cgacagtgga 180 gagtgctgcc agaagcagta cctgtggtac aagtggcgac ccctggattg ccgatgccta 240 aagagcggtt tcttcagcag caagtgcgtt tgcagagacg tg 282 <210> 73 <211> 168 <212> DNA <213> Diguetia canities <400> 73 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168 <210> 74 <211> 168 <212> DNA <213> Diguetia canities <400> 74 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168 <210> 75 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Disulfide deletion <400> 75 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 ggcttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tttgtttgta gagatgtt 168 <210> 76 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Disulfide deletion <400> 76 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 ggcttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tttgtttgta gagatgtt 168 <210> 77 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A DVP <400> 77 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 78 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41A/ C51A (A/A) DVP <400> 78 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 gcattgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 79 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41S/ C51A (S/A) DVP <400> 79 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 80 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41V/ C51A (V/A) DVP <400> 80 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 gttttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 81 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41A/ C51T (A/T) DVP <400> 81 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 gcattgaaat ctggtttctt ctcttctaaa actgtttgta gagatgtt 168 <210> 82 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41A/ C51S (A/S) DVP <400> 82 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 gcattgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 83 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41A/ C51V (A/V) DVP <400> 83 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 gcattgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gttgtttgta gagatgtt 168 <210> 84 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51S DVP <400> 84 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 85 <211> 169 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41S/ C51S DVP <400> 85 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 agtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tcagtttgta gagatgttt 169 <210> 86 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ V17A DVP <400> 86 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgc tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 87 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D20A DVP <400> 87 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 88 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ S21A DVP <400> 88 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 gctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 89 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ W31A DVP <400> 89 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg gcttataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 90 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ Y32A DVP <400> 90 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tgggctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 91 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ P36A DVP <400> 91 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagagcttt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 92 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D38A DVP <400> 92 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta 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gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 actgttaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 107 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D38A/ L42S DVP <400> 107 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 acttctaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 108 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D38A/ L42E DVP <400> 108 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 actgaaaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 109 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D38A/ L42Q DVP <400> 109 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 actcaaaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 110 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D38A/ D20A DVP <400> 110 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 111 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D20A/ Y32S DVP <400> 111 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 112 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D38A/ Y32S DVP <400> 112 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 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ttcttcaaaa aatgtttgca gggatgtt 168 <210> 160 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51Q/ D38A/ L42V DVP <400> 160 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa caagtttgca gggatgtt 168 <210> 161 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51E/ D38A/ L42V DVP <400> 161 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gaagtttgca gggatgtt 168 <210> 162 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51V/ D38A/ L42V DVP <400> 162 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gtcgtttgca gggatgtt 168 <210> 163 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> 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agaatgtgac 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 atggtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa atggtttgca gggatgtt 168 <210> 167 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41K/ C51E/ D38A/ L42V DVP <400> 167 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 aaagtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gaagtttgca gggatgtt 168 <210> 168 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41E/ C51K/ D38A/ L42V DVP <400> 168 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgac 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 gaagtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa aaagtttgca gggatgtt 168 <210> 169 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D20V/ D38A/ L42V DVP <400> 169 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgtc 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168 <210> 170 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D20G/ D38A/ L42V DVP <400> 170 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtggc 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168 <210> 171 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D20K/ D38A/ L42V DVP <400> 171 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtaaa 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168 <210> 172 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D20E/ D38A/ L42V DVP <400> 172 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtgaa 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168 <210> 173 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D20L/ D38A/ L42V DVP <400> 173 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgttta 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168 <210> 174 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D20N/ D38A/ L42V DVP <400> 174 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgtaat 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168 <210> 175 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D20Y/ D38A/ L42V DVP <400> 175 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agaatgttat 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168 <210> 176 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ S21G/ D38A/ L42V 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60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168 <210> 180 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ E18D/ D38A/ L42V DVP <400> 180 gccaaagacg gagacgtaga aggcccagca ggttgtaaga aatatgacgt agactgtgac 60 tcgggggagt gttgtcagaa gcaatacctt tggtacaaat ggagaccatt ggcttgtcgt 120 actgtgaaga gtggattctt ttcttcaaaa gctgtttgca gggatgtt 168 <210> 181 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C41V/ C51T/ D38A/ L42V DVP <400> 181 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Val Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 Ser Lys Thr Val Cys Arg Asp Val 50 55 <210> 182 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C41N/ C51A DVP <400> 182 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys 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sequence <220> <223> C41T/ C51A/ R54A DVP <400> 205 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 Ser Lys Ala Val Cys Ala Asp Val 50 55 <210> 206 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ Y32A DVP <400> 206 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ala 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 Ser Lys Ala Val Cys Arg Asp Val 50 55 <210> 207 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ P36A DVP <400> 207 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr 20 25 30 Lys Trp Arg Ala Leu Asp Cys Arg Thr Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 Ser Lys Ala Val 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C51S DVP <400> 216 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Met Cys Arg Ser Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val 50 55 <210> 217 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> K2L/ Y32S/ L42I DVP <400> 217 Ala Leu Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ser 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Ile Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val 50 55 <210> 218 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> K2L/ Y32S/ D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP <400> 218 Ala Leu Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Ser 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Ile Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val 50 55 <210> 219 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> K2L/ D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP <400> 219 Ala Leu Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Asp 1 5 10 15 Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Gln Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr 20 25 30 Lys Trp Arg Pro Leu Ala Cys Arg Ser Ile Lys Ser Gly Phe Phe Ser 35 40 45 Ser Lys Ser Val Cys Arg Asp Val 50 55 <210> 220 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP <400> 220 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 tctattaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 221 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> K2L/ D38A/ C41S/ C51S DVP <400> 221 gctttggatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 222 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Y32S/ D38A/ C41S/ C51S DVP <400> 222 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 223 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> K2L/ Y32S/ D38A/ C41S/ C51S DVP <400> 223 gctttggatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 224 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> D38T/ C41S/ C51S DVP <400> 224 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt gacttgtaga 120 tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 225 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> D38S/ C41S/ C51S DVP <400> 225 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt gtcttgtaga 120 tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 226 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> D38M/ C41S/ C51S DVP <400> 226 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt gatgtgtaga 120 tctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 227 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> K2L/ Y32S/ L42I DVP <400> 227 gctttggatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120 tgtattaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168 <210> 228 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> K2L/ Y32S/ D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP <400> 228 gctttggatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 tctattaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 229 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> K2L/ D38A/ L42I/ C41S/ C51S DVP <400> 229 gctttggatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 tctattaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 230 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41V/ C51T/ D38A/ L42V DVP <400> 230 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 gttttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa actgtttgta gagatgtt 168 <210> 231 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41N/ C51A DVP <400> 231 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 aatttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 232 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Y32S/ P36A DVP <400> 232 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagagcttt ggattgtaga 120 tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168 <210> 233 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Y32K/ P36A DVP <400> 233 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggaaaaaat ggagagcttt ggattgtaga 120 tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168 <210> 234 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Y32H/ P36A DVP <400> 234 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggcataaat ggagagcttt ggattgtaga 120 tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168 <210> 235 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> W31F/ Y32S DVP <400> 235 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg ttctctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120 tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168 <210> 236 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> W31F/ Y32S/ P36A DVP <400> 236 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg ttctctaaat ggagagcttt ggattgtaga 120 tgtttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa tgtgtttgta gagatgtt 168 <210> 237 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Y32H/ P36A/ C41A/ C51A DVP <400> 237 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggcataaat ggagagcttt ggattgtaga 120 gctttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 238 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ Y29A DVP <400> 238 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaagctttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 239 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ G45A DVP <400> 239 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctgctttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 240 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ F47A DVP <400> 240 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttcgc ttcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 241 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ R54A DVP <400> 241 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgtg ctgatgtt 168 <210> 242 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ Y32A DVP <400> 242 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tgggctaaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 243 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ P36A DVP <400> 243 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagagcttt ggattgtaga 120 actttgaaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 244 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> C41T/ C51A/ D38A/ L42H DVP <400> 244 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgct 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtataaat ggagaccatt ggattgtaga 120 actcataaat ctggtttctt ctcttctaaa gctgtttgta gagatgtt 168 <210> 245 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Y32S/ D38A/ C41S/ L42I/ C51S DVP <400> 245 gctaaagatg gtgatgttga aggtccagct ggttgtaaaa aatatgatgt tgaatgtgat 60 tctggtgaat gttgtcaaaa acaatatttg tggtctaaat ggagaccatt ggcttgtaga 120 tctattaaat ctggtttctt ctcttctaaa tctgtttgta gagatgtt 168 <210> 246 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Kluyveromyces lactis alpha mating factor pre-pro secretion leader <400> 246 Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Pro Arg 85 90 95 Gly Thr Val Asp Gly Ala Pro Ala Ala Ala 100 105 <210> 247 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Alpha-MF peptide <400> 247 Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Lys Lys Arg Glu Ala Asp Ala Ser Pro Trp Ser Trp Ile Thr 85 90 95 Leu Arg Pro Gly Gln Pro Ile Phe Lys Arg Glu Ala Asn Ala Asp Ala 100 105 110 Asn Ala Glu Ala Ser Pro Trp Ser Trp Ile Thr Leu Arg Pro Gly Gln 115 120 125 Pro Ile Phe Lys Arg Glu Ala Asn Ala Asp Ala Asn Ala Asp Ala Ser 130 135 140 Pro Trp Ser Trp Ile Thr Leu Arg Pro Gly Gln Pro Ile Phe Lys Arg 145 150 155 160 Glu Ala Asn Pro Glu Ala Glu Ala Asp Ala Lys Pro Ser Ala Trp Ser 165 170 175 Trp Ile Thr Leu Arg Pro Gly Gln Pro Ile Phe 180 185 <210> 248 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mf(alpha)1/Mf(alpha)2 <400> 248 Met Lys Phe Ser Thr Ile Phe Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Thr Lys Arg Glu Ala Asp Ala Ser Pro Trp Ser Trp Ile Thr 85 90 95 Leu Arg Pro Gly Gln Pro Ile Phe Lys Arg Glu Ala Asn Ala Asp Ala 100 105 110 Asn Ala Asp Ala Ser Pro Trp Ser Trp Ile Thr Leu Arg Pro Gly Gln 115 120 125 Pro Ile Phe Lys Arg Glu Ala Ser Ala Glu Ala Glu Ala Asp Ala Lys 130 135 140 Pro Ser Ala Trp Ser Trp Ile Thr Leu Arg Pro Gly Gln Pro Ile Phe 145 150 155 160 <210> 249 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mating factor alpha precursor N-terminus <400> 249 Met Arg Leu Ser Ala Val Phe Val Ser Ala Ile Ala Leu Leu Ser Thr 1 5 10 15 Val Ile Ala Ala Pro Ile Thr Glu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Ser Ile 20 25 30 Lys Val Pro Ser Glu Ala Ile Leu Gly Phe Leu Asp Leu Thr Ala Asp 35 40 45 Asp Asp Val Gly Leu Val Lys Ile Asn Asn Gly Thr His Ser Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Tyr Ala Asn Glu Thr 65 70 75 80 Ile Leu Ser Lys Arg Glu Ala Ser Ala Glu Ala Asp Pro Trp Lys Glu 85 90 95 Ala Ser Pro Glu Ala Glu Ala Glu Ala Asp Pro Trp Lys Trp Leu Ser 100 105 110 Phe Arg Val Gly Gln Pro Ile Tyr Lys Arg Glu Ala Ser Pro Glu Ala 115 120 125 Glu Ala Asp Pro Trp Lys Trp Leu Ser Phe Arg Ile Gly Gln Pro Ile 130 135 140 Tyr 145

Claims (100)

  1. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP: diguetoxin variant polypeptide)로서, 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
  2. 제1항에 있어서, X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거되는, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제1항에 있어서, 2개 이상의 DVP의 동종중합체 또는 이종중합체일 수 있으며, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이한, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제1항에 있어서, 절단 가능하거나 절단 가능하지 않은 링커에 의해 분리되는 2개 이상의 DVP를 포함하는 융합된 단백질이며, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있는, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  8. 제7항에 있어서, 절단 가능한 링커가 곤충의 내장 또는 혈림프 내부에서 절단 가능한, DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 DVP 또는 이들의 조합과, 부형제를 포함하는 조성물.
  10. DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 DVP가 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
  11. 제10항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 DVP를 인코딩하고, 여기서 X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거되는, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열.
  12. 제10항에 있어서, 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열.
  13. 제12항에 있어서, 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열.
  14. 제13항에 있어서, 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열.
  15. DVP를 생산하는 방법으로서,
    (a) DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계(상기 DVP는 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함함: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임));
    (b) 상기 벡터를 효모 세포에 도입하는 단계; 및
    (c) DVP의 발현 및 성장 배지로의 분비를 가능하게 하도록 작동 가능한 조건 하의 성장 배지에서 효모 세포를 성장시키는 단계.
  16. 제15항에 있어서, X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, DVP가 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, DVP가 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, DVP가 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  20. 제15항에 있어서, DVP가 2개 이상의 DVP의 동종중합체 또는 이종중합체일 수 있으며, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이한, 방법.
  21. 제15항에 있어서, DVP가 절단 가능하거나 절단 가능하지 않은 링커에 의해 분리되는 2개 이상의 DVP를 포함하는 융합된 단백질이며, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이할 수 있는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 절단 가능한 링커가 곤충의 내장 또는 혈림프 내부에서 절단 가능한, 방법.
  23. 제15항에 있어서, 벡터가 알파-MF 신호를 포함하는 플라스미드인, 방법.
  24. 제15항에 있어서, 벡터가 효모 세포로 형질전환되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 한세눌라(Hansenula), 야로위아(Yarrowia) 또는 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속의 임의의 종에서 선택되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 효모 세포가 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 효모 세포가 클루이베로마이세스 락티스인, 방법.
  28. 제15항에 있어서, DVP가 성장 배지로 분비되는, 방법.
  29. 제15항에 있어서, DVP의 발현이 효모 배양 배지 1리터당 적어도 70 mg/L, 적어도 80 mg/L, 적어도 90 mg/L, 적어도 100 mg/L, 적어도 110 mg/L, 적어도 120 mg/L, 적어도 130 mg/L, 적어도 140 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 160 mg/L, 적어도 170 mg/L, 적어도 180 mg/L, 적어도 190 mg/L, 적어도 200 mg/L, 적어도 500 mg/L, 적어도 750 mg/L, 적어도 1,000 mg/L, 적어도 1,250 mg/L, 적어도 1,500 mg/L, 적어도 1,750 mg/L, 적어도 2,000 mg/L, 적어도 2,500 mg/L, 적어도 3,000 mg/L, 적어도 3,500 mg/L, 적어도 4,000 mg/L, 적어도 4,500 mg/L, 적어도 5,000 mg/L, 적어도 5,500 mg/L, 적어도 6,000 mg/L, 적어도 6,500 mg/L, 적어도 7,000 mg/L, 적어도 7,500 mg/L, 적어도 8,000 mg/L, 적어도 8,500 mg/L, 적어도 9,000 mg/L, 적어도 9,500 mg/L, 적어도 10,000 mg/L, 적어도 11,000 mg/L, 적어도 12,000 mg/L, 적어도 12,500 mg/L, 적어도 13,000 mg/L, 적어도 14,000 mg/L, 적어도 15,000 mg/L, 적어도 16,000 mg/L, 적어도 17,000 mg/L, 적어도 17,500 mg/L, 적어도 18,000 mg/L, 적어도 19,000 mg/L, 적어도 20,000 mg/L, 적어도 25,000 mg/L, 적어도 30,000 mg/L, 적어도 40,000 mg/L, 적어도 50,000 mg/L, 적어도 60,000 mg/L, 적어도 70,000 mg/L, 적어도 80,000 mg/L, 적어도 90,000 mg/L 또는 적어도 100,000 mg/L의 수율로 DVP를 제공하는, 방법.
  30. 제15항에 있어서, 배지에서 DVP의 발현이 배지에서 단일 DVP의 발현을 유도하는, 방법.
  31. 제15항에 있어서, 배지에서 DVP의 발현이 배지에서 2개 이상의 DVP 폴리펩타이드를 포함하는 DVP 중합체의 발현을 유도하는, 방법.
  32. 제15항에 있어서, 벡터가 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하며, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 것인, 방법.
  33. 제15항에 있어서, 벡터가 2개 또는 3개의 발현 카세트를 포함하며, 각각의 발현 카세트는 제1 발현 카세트의 DVP 또는 상이한 발현 카세트의 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 것인, 방법.
  34. 제15항에 있어서, 발현 카세트가 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 것인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 발현 카세트가 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 것인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 발현 카세트가 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 것인, 방법.
  37. 제9항의 조성물의 살충 유효량을 해충의 서식지, 또는 해충의 공격을 받기 쉬운 식물 또는 동물에 적용하는 단계를 포함하는, 해충을 퇴치, 방제 또는 저해하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 해충이 하기로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법: 아케마 스핑크스 나방(Achema Sphinx Moth)(박각시벌레)(유모르파 아케몬(Eumorpha achemon)); 알파파 모충(Alfalfa Caterpillar)(콜리아스 유리테메(Colias eurytheme)); 아몬드 나방(Almond Moth)(카우드라 카우텔라(Caudra cautella)); 아모르비아 나방(Amorbia Moth)(아모르비아 후메로사나(Amorbia humerosana)); 거염벌레(Armyworm)(스포도프테라 종, 예를 들어 엑시구아(exigua), 프루기페르다(frugiperda), 리토랄리스(littoralis), 슈달레티아 우니푼크타(Pseudaletia unipuncta)); 아티초크 플럼 나방(Artichoke Plume Moth)(플라티프틸리아 카르두이닥틸라(Platyptilia carduidactyla)); 아잘레아 모충(Azalea Caterpillar)(다타나 마조르(Datana major)); 도롱이벌레(Bagworm)(티리도프테릭스 에페메라에포르미스(Thyridopteryx ephemeraeformis)); 바나나 나방(Banana Moth)(히페르콤페 스크리보니아(Hypercompe scribonia)); 바나나 팔랑나비(Banana Skipper)(에리오노타 트락스(Erionota thrax)); 블랙헤드 싹벌레(Blackheaded Budworm)(아클레리스 글로베라나(Acleris gloverana)); 캘리포니아 오크나무벌레(California Oakworm)(프리가니디아 칼리포르니카(Phryganidia californica)); 봄 자벌레(Spring Cankerworm)(팔레아크리타 메리카타(Paleacrita merriccata)); 체리 과일벌레(Cherry Fruitworm)(그라폴리타 파카르디(Grapholita packardi)); 중국 표식 나방(China Mark Moth)(님풀라 스타그나타(Nymphula stagnata)); 감귤류 야도충(Citrus Cutworm)(자일로미게스 쿠리알리스(Xylomyges curialis)); 코들링나방(Codling Moth)(시디아 포모넬라(Cydia pomonella)); 크랜베리 과일벌레(Cranberry Fruitworm)(아크로바시스 바시니(Acrobasis vaccinii)); 십자줄무늬 양배추벌레(Cross-striped Cabbageworm)(에베르게스티스 리모살리스(Evergestis rimosalis)); 야도충(Cutworm)(녹투이드(Noctuid) 종, 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon)); 더글라스 전나무 독나방(Douglas Fir Tussock Moth)(오르기아 슈도츄가타(Orgyia pseudotsugata)); 엘로 나방(Ello Moth)(박각시벌레(Hornworm))(에리니스 엘로(Erinnyis ello)); 느릅나무 자벌레(Elm Spanworm)(에노모스 서브시그나리아(Ennomos subsignaria)); 유럽 포도덩굴 나방(European Grapevine Moth)(로베시아 보트라나(Lobesia botrana)); 유럽 팔랑나비(European Skipper)(티멜리쿠스 리네올라(Thymelicus lineola)); 에섹스 팔랑나비(Essex Skipper); 가을 웹웜(Fall Webworm)(멜리소푸스 라티페레아누스(Melissopus latiferreanus)); 필버트 잎말이나방(Filbert Leafroller)(아르킵스 로사누스(Archips rosanus)); 과일나무 잎말이나방(Fruittree Leafroller)(아르킵스 아르기로스필리아(Archips argyrospilia)); 포도열매 나방(Grape Berry Moth)(파랄로베시아 비테아나(Paralobesia viteana)); 포도 잎말이나방(Grape Leafroller)(플라티노타 스툴타나(Platynota stultana)); 포도잎 스켈레토나이저(Grapeleaf Skeletonizer)(하리시나 아메리카나(Harrisina americana)); 녹색 클로버벌레(Green Cloverworm)(플라티페나 스카브라(Plathypena scabra)); 녹색줄무늬 메이플벌레(Greenstriped Mapleworm)(드리오캄파 루비쿤다(Dryocampa rubicunda)); 군모소스-바트라케드라 코모사에(Gummosos-Batrachedra comosae)(호드게스(Hodges)); 집시 나방(Gypsy Moth)(리만트리아 디스파르(Lymantria dispar)); 독미나리 자벌레(Hemlock Looper)(람브디나 피셀라리아(Lambdina fiscellaria)); 박각시벌레(만두카(Manduca) 종); 배추흰나비 유충(Imported Cabbageworm)(피에리스 라파에(Pieris rapae)); 이오 나방(Io Moth)(아우토메리스 이오(Automeris io)); 잭 파인 싹벌레(Jack Pine Budworm)(코리스토네우라 피누스(Choristoneura pinus)); 밝은갈색 사과 나방(Light Brown Apple Moth)(에피피아스 포스트비타나(Epiphyas postvittana)); 멜론벌레(Melonworm)(디아파니아 히알리나타(Diaphania hyalinata)); 미모사 웹웜(Mimosa Webworm)(호마다울라 아니소센트라(Homadaula anisocentra)); 부등변줄무늬 잎말이나방(Obliquebanded Leafroller)(코리스토네우라 로사세아나(Choristoneura rosaceana)); 협죽도 나방(Oleander Moth)(신토메이다 에필라이스(Syntomeida epilais)); 잡식성 잎말이나방(Omnivorous Leafroller)(플라이노타 스툴타나(Playnota stultana)); 잡식성 자벌레(Omnivorous Looper)(사불로데스 아에그로타타(Sabulodes aegrotata)); 오렌지독(Orangedog)(파필리오 크레스폰테스(Papilio cresphontes)); 오렌지 토르트릭스(Orange Tortrix)(아르기로타에니아 시트라나(Argyrotaenia citrana)); 동양 과일 나방(Oriental Fruit Moth)(그라폴리타 몰레스타(Grapholita molesta)); 복숭아 가지 천공충(Peach Twig Borer)(아나르시아 리네아텔라(Anarsia lineatella)); 소나무 나비(Pine Butterfly)(네오파시아 메나피아(Neophasia menapia)); 꼬투리벌레(Podworm); 붉은줄무늬 잎말이나방(Redbanded Leafroller)(아르기로타에니아 벨루티나나(Argyrotaenia velutinana)); 붉은혹 모충(Redhumped Caterpillar)(스키주라 콘시나(Schizura concinna)); 린드웜 복합체(Rindworm Complex)(각종 레피도프테라); 안장모양 모충(Saddleback Caterpillar)(시비네 스티물레아(Sibine stimulea)); 안장 돌출형 모충(Saddle Prominent Caterpillar)(헤테로캄파 구티비타(Heterocampa guttivitta)); 염습지 모충(Saltmarsh Caterpillar)(에스티그메네 아크레아(Estigmene acrea)); 소드 웹웜(Sod Webworm)(크람부스(Crambus) 종); 자벌레(Spanworm)(에노모스 서브시그나리아(Ennomos subsignaria)); 가을 황충(Fall Cankerworm)(알소필라 포메타리아(Alsophila pometaria)); 가문비나무 싹벌레(Spruce Budworm)(코리스토네우라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana)); 텐트 모충(Tent Caterpillar)(각종 라시오캄프과); 테클라-테클라 바실리데스(Thecla-Thecla Basilides)(게이르(Geyr))(테클라 바실리데스(Thecla basilides)); 담배 박각시벌레(Tobacco Hornworm)(만두카 섹스타(Manduca sexta)); 담배 나방(Tobacco Moth)(에페스티아 엘루텔라(Ephestia elutella)); 술이달린 사과 싹나방(Tufted Apple Budmoth)(플라티노타 이다에우살리스(Platynota idaeusalis)); 가지 천공충(Twig Borer)(아나르시아 리네아텔라(Anarsia lineatella)); 무늬 야도충(Variegated Cutworm)(페리드로마 사우시아(Peridroma saucia)); 무늬 잎말이나방(Variegated Leafroller)(플라티노타 플라베다나(Platynota flavedana)); 벨벳콩 모충(Velvetbean Caterpillar)(안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis)); 호두 모충(Walnut Caterpillar)(다타나 인테게리마(Datana integerrima)); 웹웜(히판트리아 쿠네아(Hyphantria cunea)); 서양 독나방(Western Tussock Moth)(오르기아 베투스타(Orgyia vetusta)); 남부 옥수수대 천공충(Southern Cornstalk Borer)(디아트라에아 크람비도이데스(Diatraea crambidoides)); 옥수수 귀벌레(Corn Earworm); 고구마 바구미(Sweet potato weevil); 고추 바구미(Pepper weevil); 감귤류 뿌리 바구미(Citrus root weevil); 딸기 뿌리 바구미(Strawberry root weevil); 피칸 바구미(Pecan weevil); 필버트 바구미(Filbert weevil); 벼물 바구미(Ricewater weevil); 알팔파 바구미(Alfalfa weevil); 클로버 바구미(Clover weevil); 차나무좀(Tea shot-hole borer); 뿌리 바구미(Root weevil); 사탕수수 딱정벌레(Sugarcane beetle); 커피열매 천공충(Coffee berry borer); 새포아풀 바구미(Annual blue grass weevil)(리스트로노투스 마쿨리콜리스(Listronotus maculicollis)); 아시아 정원 딱정벌레(Asiatic garden beetle)(말라데라 카스타네아(Maladera castanea)); 유럽 풍뎅이(European chafer)(리조트로쿠스 마잘리스(Rhizotroqus majalis)); 녹색 풍뎅이(Green June beetle)(코티니스 니티다(Cotinis nitida)); 일본 딱정벌레(Japanese beetle)(포필리아 자포니카(Popillia japonica)); 5월 또는 6월 딱정벌레(May or June beetle)(필로파가(Phyllophaga) 종); 북부 마스크 풍뎅이(Northern masked chafer)(시클로세팔라 보레알리스(Cyclocephala borealis)); 동양 딱정벌레(Oriental beetle)(아노말라 오리엔탈리스(Anomala orientalis)); 남부 마스크 풍뎅이(Southern masked chafer)(시클로세팔라 루리다(Cyclocephala lurida)); 바구미(Billbug)(쿠르쿨리오노이데아(Curculionoidea)); 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti); 부세올라 푸스카(Busseola fusca); 킬로 수프레살리스(Chilo suppressalis); 쿨렉스 피피엔스(Culex pipiens); 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스(Culex quinquefasciatus); 디아브로티카 비르기페라(Diabrotica virgifera); 디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis); 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera); 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea); 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens); 렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata); 오스트리니아 푸르나칼리스(Ostrinia furnacalis); 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis); 펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella); 플로디아 인테르푼크텔라(Plodia interpunctella); 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella); 슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens); 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua); 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda); 스포도프테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis); 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni); 및 잔토갈레루카 루테올라(Xanthogaleruca luteola).
  39. 제38항에 있어서, 해충이 하기로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법: 아에데스 아에깁티; 부세올라 푸스카; 킬로 수프레살리스; 쿨렉스 피피엔스; 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스; 디아브로티카 비르기페라; 디아트라에아 사카랄리스; 헬리코베르파 아르미게라; 헬리코베르파 제아; 헬리오티스 비레센스; 렙티노타르사 데셈리네아타; 오스트리니아 푸르나칼리스; 오스트리니아 누빌라리스; 펙티노포라 고시피엘라; 플로디아 인테르푼크텔라; 플루텔라 자일로스텔라; 슈도플루시아 인클루덴스; 스포도프테라 엑시구아; 스포도프테라 프루기페르다; 스포도프테라 리토랄리스; 트리코플루시아 니; 및 잔토갈레루카 루테올라.
  40. 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 것인, 벡터.
  42. 제41항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 것인, 벡터.
  43. 하기 (a)를 포함하는 효모 세포:
    (a) 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP를 인코딩하도록 작동 가능한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
  44. 제43항에 있어서, X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거되는, 효모 세포.
  45. 제43항에 있어서, DVP가 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 효모 세포.
  46. 제45항에 있어서, DVP가 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 효모 세포.
  47. 제46항에 있어서, DVP가 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 효모 세포.
  48. 제43항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스, 피키아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 스키조사카로마이세스 속의 임의의 종에서 선택되는, 효모 세포.
  49. 제48항에 있어서, 효모 세포가 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비시아에 및 피키아 파스토리스로 이루어지는 군에서 선택되는, 효모 세포.
  50. 제49항에 있어서, 효모 세포가 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스인, 효모 세포.
  51. 하기 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK: cystine knot) 구조를 포함하는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP):
    Figure pct00033

    화학식 (II)
    (여기서, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며;
    시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되고;
    여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고;
    제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이며;
    NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이고;
    여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 조합은 선택적으로 존재하지 않음);
    여기서 상기 재조합 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 변형시키는 방식으로 생성되며, 여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않고;
    여기서 변형 가능한 CRP는 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 방식으로 변형되고;
    여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고;
    여기서 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타냄.
  52. 제51항에 있어서, 디설파이드 결합 토폴로지가 하기 시스틴 매듭 모티프 중 하나를 형성하는, 재조합 CRP: 저해제 시스틴 매듭(ICK: inhibitor cystine knot) 모티프; 성장인자 시스틴 매듭(GFCK: growth factor cystine knot) 모티프 또는 고리형 시스틴 매듭(CCK: cyclic cystine knot) 모티프.
  53. 제52항에 있어서, 디설파이드 결합 토폴로지가 ICK 모티프를 형성하는, 재조합 CRP.
  54. 제51항에 있어서, 변형 가능한 CRP가 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체인, 재조합 CRP.
  55. 제54항에 있어서, 변형 가능한 CRP가 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 CRP.
  56. 제55항에 있어서, 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 CRP.
  57. 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 포함하는 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)을 생산하는 방법으로서,
    Figure pct00034

    화학식 (II)
    (여기서, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며;
    시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되고;
    여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고;
    제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이며;
    NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이고;
    여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 조합은 선택적으로 존재하지 않음);
    하기 단계 (a) 및 (b)를 포함하는, CRP를 생산하는 방법:
    (a) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 제공하는 단계(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않음); 및
    (b) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 단계
    (여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고;
    여기서 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타냄).
  58. 제57항에 있어서, 디설파이드 결합 토폴로지가 하기 시스틴 매듭 모티프 중 하나를 형성하는, 방법: 저해제 시스틴 매듭(ICK) 모티프; 성장인자 시스틴 매듭(GFCK) 모티프 또는 고리형 시스틴 매듭(CCK) 모티프.
  59. 제58항에 있어서, 디설파이드 결합 토폴로지가 ICK 모티프를 형성하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 변형 가능한 CRP가 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체인, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 변형 가능한 CRP가 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 재조합 CRP가 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  63. 재조합 시스테인 풍부 단백질(CRP)의 수율을 증가시키는 방법으로서,
    (a) 하기 화학식 (II)에 따른 시스틴 매듭(CK) 구조를 갖는 재조합 CRP를 생성하는 단계를 포함하며,
    Figure pct00035

    화학식 (II)
    (여기서, CI 내지 CVI은 시스테인 잔기이며;
    시스테인 잔기 CI과 CIV는 제1 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CII와 CV는 제2 디설파이드 결합에 의해 연결되고; CIII과 CVI은 제3 디설파이드 결합에 의해 연결되고;
    여기서 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 디설파이드 결합 토폴로지를 갖고;
    제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 및 제3 디설파이드 결합은 시스틴 매듭 모티프를 형성하는 유일한 디설파이드 결합이며;
    NE, L1, L2, L3, L4, L5 및 CE는 길이가 1개 내지 13개 아미노산 잔기인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서브유닛이고;
    여기서 NE, L3, CE 또는 이들의 임의의 조합은 선택적으로 존재하지 않음);
    여기서 상기 재조합 CRP는 하기 공정에 따라 생성되는, CRP의 수율을 증가시키는 방법:
    (b) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP를 제공하는 단계(여기서, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 제1 디설파이드 결합, 제2 디설파이드 결합 또는 제3 디설파이드 결합이 아니고, 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합은 CK 모티프를 형성하지 않음); 및
    (c) 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하는 단계
    (여기서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 갖는 변형 가능한 CRP에서 하나 이상의 비-CK 디설파이드 결합을 제거하면, 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP가 생성되고;
    여기서 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖는 재조합 CRP는 화학식 (II)에 따른 CK 구조를 갖지 않는 변형 가능한 CRP의 발현 수준에 비해 증가된 발현 수준을 나타냄).
  64. 제63항에 있어서, 디설파이드 결합 토폴로지가 하기 시스틴 매듭 모티프 중 하나를 형성하는, 방법: 저해제 시스틴 매듭(ICK) 모티프; 성장인자 시스틴 매듭(GFCK) 모티프 또는 고리형 시스틴 매듭(CCK) 모티프.
  65. 제64항에 있어서, 디설파이드 결합 토폴로지가 ICK 모티프를 형성하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 변형 가능한 CRP가 야생형 μ-DGTX-Dc1a; DVP; 카파-ACTX, ApsIII, 또는 이의 변이체인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 변형 가능한 CRP가 서열번호 1, 2, 193, 195 또는 198 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 재조합 CRP가 서열번호 6 내지 14, 197, 199 또는 201 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  69. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  70. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  71. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  72. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  73. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  74. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  75. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  76. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  77. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  78. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  79. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  80. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 213, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  81. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  82. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  83. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 217에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  84. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 217에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  85. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 218에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  86. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 218에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  87. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  88. 하나 이상의 곤충 종에 대해 살충 활성을 갖는 디구에톡신 변이형 폴리펩타이드(DVP)로서, 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  89. 알파 교배인자(알파-MF) 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 DVP를 포함하는 융합 단백질로서, 여기서 상기 하나 이상의 DVP 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 하기 화학식 (I)에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질: A-X1-D-G-D-V-E-G-P-A-G-C-K-K-Y-D-X2-E-C-X3-X4-G-E-C-C-Q-K-Q-Y-L-X5-X6-K-W-R-X7-L-X8-C-R-X9-X10-K-S-G-F-F-S-S-K-X11-X12-C-R-D-V(여기서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 디구에톡신의 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, X1은 K 또는 L이고; X2는 V, A 또는 E이고; X3은 D, Y 또는 A이고; X4는 S 또는 A이고; X5는 W, A, F이고; X6은 Y, A, S, H 또는 K이고; X7은 P 또는 A이고; X8은 D, A, K, S, T 또는 M이고; X9는 C, G, T, A, S, M 또는 V이고; X10은 L, A, N, V, S, E, I 또는 Q이고; X11은 C, F, A, T, S, M 또는 V이고; X12는 V, A 또는 T임).
  90. 제89항에 있어서, X9가 G, T, A, S, M 또는 V이거나, X11이 F, A, T, S, M 또는 V인 경우, 디설파이드 결합이 제거되는, 융합 단백질.
  91. 제89항에 있어서, 하나 이상의 DVP가 서열번호 6 내지 43, 45 내지 51, 53, 128, 130, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 202 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  92. 제91항에 있어서, 하나 이상의 DVP가 서열번호 6 내지 11, 15, 16, 20 내지 22, 24 내지 26, 29, 35, 45 내지 48, 53, 128, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 207, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  93. 제92항에 있어서, 하나 이상의 DVP가 서열번호 47, 53, 136, 139, 140, 144, 146, 147, 187 내지 191, 210 내지 215, 또는 217 내지 219 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  94. 제89항에 있어서, 하나 이상의 DVP가 2개 이상의 DVP의 동종중합체 또는 이종중합체일 수 있으며, 여기서 각각의 DVP의 아미노산 서열은 동일하거나 상이한, 융합 단백질.
  95. 제89항에 있어서, 하나 이상의 DVP, 알파-MF 또는 이들의 조합이 절단 가능한 링커 또는 절단 가능하지 않은 링커에 의해 분리되어 있는, 융합 단백질.
  96. 제95항에 있어서, 절단 가능한 링커가 곤충의 내장 또는 혈림프 내부에서 절단 가능한, 융합 단백질.
  97. 제89항에 있어서, 알파-MF 펩타이드가 효모 종에서 유도된 알파-MF 펩타이드인, 융합 단백질.
  98. 제97항에 있어서, 효모 종이 사카로마이세스, 피키아, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 야로위아 또는 스키조사카로마이세스 속의 임의의 종에서 선택되는, 융합 단백질.
  99. 제98항에 있어서, 효모 종이 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비시아에 및 피키아 파스토리스로 이루어지는 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  100. 제99항에 있어서, 효모 종이 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스인, 융합 단백질.
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