CN101747448B - 一种纳米壳聚糖衍生物,其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学纳米材料技术领域。具体而言，本发明提供一种纳米壳聚糖衍生物，其制备方法以及利用该纳米壳聚糖衍生物高选择性和特异性富集和纯化磷酸化多肽的方法。所述制备方法包括将壳聚糖溶于稀酸后，与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，进行自聚反应和接枝反应，从而得到带有活性环氧基团的纳米复合介质壳聚糖衍生物，此复合介质与亚胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸进行开环加成反应得到带有羧基活性官能团的纳米介质壳聚糖衍生物，再与Fe3+，Ti4+，Zr4+，Ga3+等过渡金属离子发生螯合作用而制得最终的纳米壳聚糖衍生物。所述纳米壳聚糖衍生物具有很高的特异性，可用于生物样品中低丰度的磷酸化多肽的富集和纯化，从而可用于生物和医学领域，包括临床诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学纳米材料技术领域。具体而言，本发明提供一种纳米壳聚糖衍生物，其制备方法以及利用该纳米壳聚糖衍生物高选择性和特异性富集和纯化磷酸化多肽的方法。
背景技术
翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学中研究的热点课题。蛋白质的磷酸化是最常见的、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，人类基因所编码的蛋白质中，约有30％的蛋白质可进行磷酸化，蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等，蛋白质磷酸化还是主要的信号传递方式。
蛋白质磷酸化分析的传统方法如放射性同位素标记，Edman降解，凝胶电泳和色谱分析等方法。这些方法操作繁琐，需要高超的实验技巧和较多的蛋白质，而且存在潜在的放射性危险。质谱技术已经发展成为鉴定磷酸化蛋白的重要工具之一。
质谱在鉴定磷酸化蛋白时，仍面临巨大的挑战，其具体体现是：第一，磷酸化蛋白在细胞内所有蛋白中为低丰度；第二，磷酸化多肽的负电性使其在质谱检测中难以质子化；第三，酶解产物中存在的大量非磷酸化肽的质谱信号通常会淹没磷酸化多肽的离子信号。因此，直接用质谱分析复杂蛋白酶解产物中的磷酸化多肽是非常困难的，一般要求将磷酸化多肽纯化后再用质谱分析。
磷酸化多肽的富集使用最多的是固定化金属亲和螯合色谱(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)。在这种技术中，一般采用将螯合剂亚胺基二乙酸键合在色谱基质上，然后利用螯合作用将Fe3+、Ga3+等金属离子固定在色谱基质上。由于磷酸化多肽中的磷酸基团与固定化的Fe3+等金属离子的相互作用而保留在色谱基质上获得分离。这种方法的缺点是特异性不强，一些酸性非磷酸化肽也会被富集起来，从而干扰对磷酸化肽的检测。虽然这种技术取得了很大的进展，但是用于大规模地富集磷酸化多肽仍需提高其选择性和有效性，解决的方法包含如下两方面：1)、优化富集磷酸化多肽的过程，包括：吸附，洗涤，和洗脱来选择性地富集磷酸化多肽。2)、优化进行IMAC的亲和基质，包括：选择不同的过渡金属，亲和官能团和固载基质。现已用的固载基质有琼酯糖，葡聚糖，硅胶和合成的聚合物衍生物如纤维素，聚(苯乙烯/二乙烯基苯基)，聚(羟基/甲基丙烯酸)等。壳聚糖(Chitosan)又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，化学名为2-氨基-β-1，4-葡聚糖，它是甲壳素经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗肿瘤等优异性能，广泛应用于医药、食品、化工、环保等行业，素有万能多糖的美誉(R.Jayakumar et al.CarbohydratePolymers 62(2005)142-158)。甲壳素在自然界分布非常广，是一种廉价易得的原料。但是未见用壳聚糖衍生物作为固载基质来富集和纯化磷酸化多肽的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳米壳聚糖衍生物，其制备方法，以及利用该纳米壳聚糖衍生物高选择性、特异性的富集和纯化磷酸化多肽的方法。
本发明提供一种纳米壳聚糖衍生物，其特征在于颗粒大小为1-300nm，优选为20-100nm，以及固载基质为壳聚糖。在一个实施方案中，该衍生物带有活性环氧基团(中间体1)，所述活性环氧基团选
自取代或未取代的丙烯酸环氧丙酯或取代或未取代的丙炔酸环氧丙酯，其中取代基为C1～C10直链或支链烷基，C1～C10直链或支链烷氧基，C1～C10直链或支链烯基，C1～C10直链或支链炔基，或卤素，优选选自甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯。在另一实施方案中，该衍生物带有活性羧基官能团(中间体2)，任选进一步与过渡金属离子络合，其中活性羧基官能团选自亚胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸，过渡金属离子选自Fe3+，Ti4+，Ni2+，Zr4+或Ga3+。
本发明还提供纳米壳聚糖衍生物的制备方法，包括下列步骤：(1)将壳聚糖溶于0.1％-20wt％稀酸水溶液，其中所述稀酸选自甲酸或乙酸，与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，进行自聚反应和接枝反应，得到带有活性环氧基团的壳聚糖衍生物，(2)接着与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸进行开环加成反应，得到带有羧基活性官能团的壳聚糖衍生物，(3)再与选自Fe3+，Ti4+，Zr4+，Ni2+或Ga3+的过渡金属离子发生螯合作用，制得所述纳米壳聚糖衍生物，其中自聚和接枝的反应温度为40-100℃，开环反应温度为50-80℃。在一个实施方案中，自聚和接枝的反应加入选自偶氮二异丁腈，正丁基锂，过硫酸钾，硝酸铈铵，硫代碳酸-溴酸钾，二高碘酸铜酸钾，或过硫酸氨和硫代硫酸钠的引发剂，其中引发剂加入量为反应单体重量的1-5％。在另一实施方案中，与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸发生开环加成反应时，pH值为8-12。在另一实施方案中，与过渡金属离子发生螯合作用时，Fe3+的浓度为10mM-100mM。
本发明还提供一种利用上述纳米壳聚糖衍生物富集和纯化磷酸化多肽的方法，包括将含有磷酸化多肽的混合物溶于上样液中，其中所述上样液为含有2，5-二羟基苯甲酸的乙腈和三氟乙酸的水溶液，再加入上述纳米壳聚糖衍生物进行富集，洗涤后得到选择性吸附有磷酸化多肽的纳米壳聚糖衍生物，并以高的pH溶液洗脱负载的磷酸化多肽，任选以氨水洗脱负载的磷酸化多肽。在一个实施方案中，选择适当的条件，用质谱技术直接测定和鉴定分析物。在另一实施方案中，将上述
纳米壳聚糖衍生物涂在芯片上进行微量的磷酸化多肽的富集和纯化。在另一实施方案中，将上述纳米壳聚糖衍生物填充入色谱柱中进行大规模的磷酸化多肽的富集和纯化。在另一实施方案中，分析物是血清、血浆、体液、组织或细胞裂解液的酶解产物。
本发明的纳米壳聚糖衍生物相对于传统的材料而言，所选择材料廉价，易得，具有良好的生物相容性，性质稳定，颗粒大小为1-300nm，外比表面积大，具有很强的吸附能力，可制膜和填充于色谱柱中。另外，由于壳聚糖是天然阳离子多糖，磷酸化多肽中的磷酸基团带负电荷，这有利于磷酸化多肽中的磷酸基团与固定化的Fe3+等金属离子和壳聚糖衍生物的相互作用而保留在纳米材料上以及被分离，且不利于一些酸性非磷酸化肽的富集，这样该纳米壳聚糖衍生物能高选择性、特异性的富集和纯化磷酸化多肽。再用质谱技术鉴定生物标识物或疾病相关靶。
本发明利用壳聚糖衍生物纳米材料富集和分离磷酸化多肽的方法可按本领域常规操作步骤进行，但是优化了富集磷酸化多肽的过程，包括吸附、洗涤和洗脱来选择性地富集磷酸化多肽。该方法具有很高的特异性，可用于生物样品中低丰度磷酸化多肽的纯化和富集。此外，本发明将所述纳米材料作为色谱填料，用于磷酸化多肽的富集和纯化，从而实现大规模的磷酸化多肽的分离提纯。
本发明具体操作步骤如下：
(1).壳聚糖与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯进行自聚反应得到的聚合物进行接枝反应；
(2).与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸进行开环加成反应；
上述壳聚糖衍生物与一定浓度的Fe3+，Ti4+，Ni2+，Zr4+，Ga3+等金属离子发生螯合作用，使金属离子固定在纳米材料的表面。
(3).在不同的吸附和洗脱条件下，将磷酸化多肽特异性的吸附结合在上述纳米材料上；将含有磷酸化多肽的混合物溶于上样液中，其中上样液为含有2，5-二羟基苯甲酸(DHB)的乙腈和三氟乙酸的水溶液，其中的DHB和三氟乙酸的浓度依据样品的复杂程度而不同，分别为0.1mg/mL-100mg/mL和0.1％-5％。
(4).用质谱直接测定上述纳米材料所吸附磷酸化多肽谱图或将特异性的吸附结合磷酸化多肽从上述纳米材料中洗脱下来，再进行进一步的分离和质谱的鉴定。
上述步骤(1)中，反应介质为稀酸水溶液，壳聚糖的含量为1.5％-2.5％，甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯的含量为2％-10％，控制反应温度为40-100℃，自聚接枝反应时间为0.5-4小时为宜。在反应过程中要加入引发剂引发反应，采用的引发剂为偶氮二异丁腈，正丁基锂或过硫酸氨和硫代硫酸钠，引发剂加入量以反应单体重的1-5％。与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸发生开环加成反应的反应介质为水溶液，pH值为8-12，反应温度为50-80℃。
下面通过实施例结合附图对本发明进一步说明。
附图说明
图1为纳米壳聚糖衍生物的合成线路图。
图2为纳米材料的红外吸收光谱图，其中1为原料壳聚糖，2为壳聚糖-GMA环氧纳米材料，3为壳聚糖-GMA-IDA纳米材料，4为壳聚糖-GMA-IDA-Fe(III)纳米材料。
图3为壳聚糖衍生物纳米材料的透射电镜图，其中3A和3B分别为壳聚糖-GMA环氧纳米材料和壳聚糖-GMA-IDA纳米材料的负染透射电镜图，3C为壳聚糖-GMA-IDA-Fe(III)纳米材料的透射电镜图。由图可以看出，此纳米材料为球型，外表与金属铁离子结合。
图4为壳聚糖衍生物纳米材料对β-酪蛋白酶解产物中磷酸化多肽的富集和纯化的MALDI质谱图，其中*为磷酸化多肽，#为脱去磷酸基团的多肽。
图5为六种蛋白酶解产物混合物的MALDI质谱图。
图6为壳聚糖衍生物纳米材料对六种蛋白酶解产物中磷酸化多肽的富集和纯化的MALDI质谱图，其中*为磷酸化多肽，#为脱去磷酸基团的多肽。
图7为壳聚糖衍生物纳米材料对β-酪蛋白酶解产物中的磷酸化多肽富集后用nano-LC-ESI-MS/MS鉴定分子量为830.85双电荷峰磷酸化多肽的序列图。
实施例1：壳聚糖-GMA环氧介质(chitosan-GMA)的制备
在装有搅拌器，温度计和冷凝管的100mL三口烧瓶中，将0.5克的壳聚糖(青岛海汇生物有限公司)溶于30mL含有稀乙酸(2wt％)的水溶液中，加入0.5mL的甲基丙烯酸环氧丙酯，搅拌，再加入0.035克过硫酸铵和0.035克硫代硫酸钠，升温至50℃，反应2小时，停止反应，降至室温后，离心去上清液，再用水洗涤，得到固体物。
结构特征：图3A是壳聚糖-GMA环氧介质负染透射电镜图，由图可以看出，此材料为球型，大小为20-100nm；其红外波谱(图2.2)特征峰为：3410.2，2927.2，1730.7，1639.8，1452.3，1259.8，1157.9，1076.9，905.7，846.0，752.4；元素分析结果为C 48.69％，H 7.05％，N 2.51％。壳聚糖的红外波谱(图2.1)特征峰为：3446.5，2925.2，1652.4，1608.2，1510.9，1454.6，1419.6，1380.9，1300.5，1248.6，1155.5，1085.8，1036.6，832.2，666.0，575.8，元素分析结果为C 39.99％，H 7.23％，N 7.19％。
实施例2：壳聚糖-GMA-IDA羧酸介质(chitosan-GMA-IDA)的的制备
在装有搅拌器，温度计和冷凝管的100mL三口烧瓶中，装入实施例1制备的复合介质，加入0.5克的亚胺基二乙酸钠，0.25克氯化钠和
20mL浓度为2N的碳酸钠溶液，升温到60℃，反应5小时，停止反应，降至室温后，过滤，用水洗涤至中性，得到固体物。
结构特征：图3B壳聚糖-GMA-IDA羧酸介质的负染透射电镜图，由图可以看出，此材料为球型，大小为20-100nm；其红外波谱(图2.3)特征峰为：3437.9，2929.8，1929.5，1640.1，1607.3，1452.1，1387.3，1253.4，1154.4，1072.1，908.5，842.1，754.6；元素分析结果为C46.89％，H7.19％，N2.46％。
实施例3：制备固定过渡金属离子的壳聚糖-GMA-IDA-Fe(III)(chitosan-GMA-IDA-Fe(III))
将实施例2制备的壳聚糖-GMA-IDA装入烧杯中，加入20mL浓度为100mM三氯化铁溶液，搅拌，室温反应2小时，过滤，用水洗涤，烘干，碾磨得固体粉末。
结构特征：图3C是壳聚糖-GMA-IDA-Fe(III)的透射电镜图，由图可以看出，该纳米材料的颗粒大小为20-100nm，表面与金属铁离子结合；用电感耦合等离子体发射光谱仪测定铁的含量为15.52mg/g(三次平均值)。其红外波谱(图2.4)特征峰为：3424.0，2927.2，1728.8，1635.0，1510.4，1454.5，1384.7，1249.7，1158.1，1073.1，908.9，834.4，753.0。元素分析为：C43.87％，H6.93％，N2.33％。
实施例4：磷酸化多肽的富集
(1).样品溶液的制备：1mgβ-酪蛋白(Sigma，纯度为90％)溶于1mL50mM的碳酸氢氨溶液中(pH8.2)，按照与胰蛋白酶的质量比为(40:1)的比例加入胰蛋白酶进行酶解反应，反应时间为6小时，酶解温度控制在37℃，加入2％三氟乙酸(TFA)终止反应。获得的蛋白酶解溶液储存在-80℃冰箱中备用。其他的蛋白牛血清蛋白、卵清蛋白、细胞色素C、血红蛋白、胰蛋白酶原的酶解方法同上，反应时间为14小时。
(2).磷酸化多肽的富集和MALDI分析：将2μL 2*10-6mM的β-酪蛋白酶解溶液溶于198μL上样液中，其中上样液为含有3μL1mg/ml的DHB的50％乙腈和0.25％三氟乙酸的水溶液，加入约0.5mg上述纳米材料中。在30℃，振速为1500rpm下，振动20分钟，离心去上清液，用含DHB的上样液洗涤一或二次，再用50％乙腈的水溶液洗涤一次，加入5μL 50％乙腈的水溶液用于质谱分析。吸取0.8μL上述富集有磷酸化多肽材料的混浊液点在靶板上，再与含1％H3PO4和50％乙腈的DHB(20mg/mL)基质溶液混合，用枪头抽吸几次，放干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图。所有的MALDI-TOF质谱分析是在岛津的AXIMA-CFP plus(KRATOS Analytical，Shimadzu Group Company)飞行时间质谱仪上完成，N2脉冲激光的波长为337.1nm，实验中所得数据都在线性正离子模式中进行，质谱分子量的校正采用外标法，所用标准物为II Bradykinin(fragment1-7)(M/z 757.3997)，血管紧张素肽(Angiotensin II，M/z 1046.5423)，[Glu1]-Fibrinopeptide B(M/z1570.6852)和ACTH(fragment 18-39)(M/z 2465.1989)。所得谱图再用内标法进行校正，所用内标为m/z1031.34，2061.83和3122.27
(3).分析结果：由图4可见有26个磷酸化多肽峰。β-酪蛋白酶解产物中的磷酸化多肽被所用纳米材料捕获，而非磷酸化多肽被洗脱，由于所用的β-酪蛋白纯度为90％，其中含有α-S1-酪蛋白，α-S2-酪蛋白和富酪蛋白，其酶解产物中的磷酸化多肽，也被此纳米富集，其中分子量为1190.5和1270.4的峰来自富酪蛋白，其他分析结果见下表一，说明此纳米材料能特异的和高效的富集和纯化低丰度的磷酸化多肽。
实施例5：特异性富集和纯化磷酸化多肽
(1).样品的制备和分析：将2μL 2pmol的磷酸化蛋白(β-酪蛋白和卵清蛋白)与非磷酸化蛋白(牛血清蛋白，细胞色素C，血红蛋白，胰蛋白酶原)的酶解多肽混合液溶于198μL的上样液中，其中上样液为含有10μL 1mg/ml的DHB的50％乙腈和0.5％三氟乙酸的水溶液，
加入约0.5mg上述纳米材料中。在30℃，振速为1500rpm下，振动20分钟，离心去上清液，用含DHB的上样液洗涤二次，再用50％乙腈的水溶液洗涤一次。吸取0.8μL上述富集有磷酸化多肽材料的混浊液点在靶板上，再与含1％H3PO4的DHB(20mg/mL)基质溶液混合，用枪头抽吸几次，放干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图4。
(2).分析结果：图5是0.5μL 2pmol的上述六种蛋白的多肽混合液与0.5μL的含1％H3PO4的DHB(20mg/mL)基质溶液点在靶板上所得质谱图，由图可知，没有一个磷酸化多肽被检出，全为非磷酸化多肽。图6是用纳米壳聚糖衍生物富集和纯化后所得的质谱图，有22个磷酸化多肽被检出，而非磷酸化多肽被洗脱，分析结果见下表一，说明此纳米材料能特异的和高效的富集和纯化低丰度的磷酸化多肽。
表一：检测到的磷酸化多肽序号、氨基酸序列、磷酸化数位点数及理论分子量(其中磷酸化位置以下划线表示，β-C表示β-酪蛋白，α-S1和α-S2表示α-S酪蛋白，Ov表示卵清蛋白)
| 序号 | [M+H]+ | 磷酸化位点数 | 氨基酸序列 |
| 1c | 1031.34 | 1 | FQSEEQQQTEDELQDK(β-C)(SEQ ID NO：1) |
| 2 | 1411.50 | 2 | EQLSTSEENSK(α-S2)(SEQ ID NO：2) |
| 3 | 1466.61 | 1 | TVDMESTEVFTK(α-S2)(SEQ ID NO：3) |
| 4 | 1539.70 | 2 | EQLSTSEENSKK(α-S2)(SEQ ID NO：4) |
| 5a | 1561.70 | 2 | EQLSTSEENSKK(α-S2)(SEQ ID NO：5) |
| 6c | 1561.63 | 1 | FQSEEQQQTEDELQDK(β-C)(SEQ ID NO：6) |
| 7c | 1588.33 | 4 | RELEELNVPGEIVESLSSSEESITR(β-C)(SEQID NO：7) |
| 8 | 1594.70 | 1 | TVDMESTEVFTKK(α-S2)(SEQ ID NO：8) |
| 9 | 1660.79 | 1 | VPQLEIVPNSAEER(α-S1)(SEQ ID NO：9) |
| 10 | 1927.69 | 2 | DIGSESTEDQAMEDIK(α-S1)(SEQ ID NO：10) |
| 11 | 1951.95 | 1 | YKVPQLEIVPNSAEER(α-S1)(SEQ ID NO：11) |
| 12 | 2061.83 | 1 | FQSEEQQQTEDELQDK(β-C)(SEQ ID NO：12) |
| 13b | 2115.77 | 1 | FQSEEQQQTEDELQDK(β-C)(SEQ ID NO：13) |
| 14 | 2088.89 | 1 | EVVGSAEAGVDAASVSEEFR(Ov)(SEQ IDNO：14) |
| 15 | 2432.08 | 1 | IEKFQSEEQQQTEDELQDK(β-C)(SEQ IDNO：15) |
| 16 | 2555.86 | 1 | FQSEEQQQTEDELQDKIHPF(β-C)(SEQ IDNO：16) |
| 17 | 2747.10 | 4 | NTMEHVSSSEESIISQETYKQ(α-S2)(SEQ IDNO：17) |
| 18 | 2966.16 | 4 | ELEELNVPGEIVESLSSSEESITR(β-C)(SEQID NO：18) |
| 19 | 3008.08 | 4 | NANEEEYSIGSSSEESAEVATEEVK(α-S2)(SEQ ID NO：19) |
| 20 | 3024.43 | 3 | RELEELNVPGEIVESLSSSEESITR(β-C)(SEQID NO：20) |
| 21 | 3042.49 | 3 | RELEELNVPGEIVESLSSSEESITR(3-C)(SEQID NO：21) |
| 22 | 3122.27 | 4 | RELEELNVPGEIVESLSSSEESITR(β-C)(SEQID NO：22) |
| 23 | 3132.20 | 4 | KNTMEHVSSSEESIISQETYKQEK(α-S2)(SEQ ID NO：23) |
| 24b | 3175.80 | 4 | RELEELNVPGEIVESLSSSEESITR(β-C)(SEQID NO：24) |
| 25 | 3229.37 | 5 | QMEAESISSSEEIVPNSVEQKHIQK(α-S1)(SEQ ID NO：25) |
a磷酸化多肽为[M+Na]+；b磷酸化多肽为[M+Fe]+，Fe单同位
素分子量为53.94；c为双电荷峰。
实施例6：磷酸化多肽的富集及质谱分析(nano-LC-ESI-MS/MS)
将10μL 2*10-6mM的β-酪蛋白酶解溶于190μL上样液中，其中上样液为含有DHB的50％乙腈和0.5％三氟乙酸的水溶液，加入约1.5mg上述纳米材料中。在在30℃，振速为1500rpm下，振动20分钟，离心去上清液，用含DHB的上样液洗涤二次，再用50％乙腈的水溶液洗涤一次。加入100μL12.5％NH4OH洗脱负载的磷酸化多肽，洗脱两次，将洗脱液浓缩干燥，加入5μL的0.1％三氟乙酸的水溶液，取1.4μL进行nano-LC-ESI-MS/MS(Q-TOF-MS)，对分析的肽断进行检索并鉴定之。所有的nano-LC-ESI-MS/MS是在沃特斯公司的毛细管液相色谱仪(Capillary liquid chromatography system；Waters)及四极杆飞行时间质谱仪(Q-TOF Ultima Global mass spectrometer；Waters)上进行CapLC-ESI-MS/MS全自动分析。自动进样系统装备一个C18脱盐预柱(5mm×350μm)和一个C18毛细管柱(100mm×75μm)进行梯度洗脱。毛细管电压为3.5KV，碰撞气为氩气，源温150℃，锥孔电压50V，TOF加速电压9.1kV，进样流速为200～300nL/min进行正离子的MS/MS测定。用200fmol/uL[Glu1]-Fibrinopeptide B的M S/MS质谱进行外标校正，分子质量误差为±0.1 Dalton。测定后的数据经ProteinLynx 2.0(Waters)软件处理，生成pk1文件，通过Mascot(http://www.matrixscience.com)检索Swissprot数据库进行蛋白质鉴定。图7是鉴定分子量为830.85双电荷峰的多肽序列实施例图。
实施例7：与实施例1的方法相同，除了其中的自聚原料为丙烯酸环氧丙酯之外。
实施例8-9：与实施例1的方法相同，除了其中的引发剂分别为偶氮二异丁腈或正丁基锂之外。
实施例10：与实施例3的方法相同，除了其中的过渡金属离子为Ga3+之外。
序列表
<110>北京大学
<120>一种纳米壳聚糖衍生物，其制备方法，以及利用该纳米壳聚糖衍生物富集和纯化磷酸化多肽的方法
<130>SPI085226-00
<160>25
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>12
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<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>12
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Claims (15)
1.一种纳米壳聚糖衍生物，其特征在于颗粒大小为1-300nm，以及固载基质为壳聚糖，其中该衍生物带有活性环氧基团，带有活性羧基官能团，以及进一步与过渡金属离子络合。
2.权利要求1的纳米壳聚糖衍生物，其中颗粒大小为20-100nm。
3.权利要求1的纳米壳聚糖衍生物，其中活性环氧基团选自取代或未取代的丙烯酸环氧丙酯或取代或未取代的丙炔酸环氧丙酯，其中取代基为C1～C10直链或支链烷基，C1～C10直链或支链烷氧基，C1～C10直链或支链烯基，C1～C10直链或支链炔基，或卤素。
4.权利要求3的纳米壳聚糖衍生物，其中活性环氧基团选自甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯。
5.权利要求1的纳米壳聚糖衍生物，其中活性羧基官能团选自亚胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸。
6.权利要求1的纳米壳聚糖衍生物，其中过渡金属离子选自Fe3+，Ti4+，Ni2+，Zr4+或Ga3+。
7.权利要求1-6任一项的纳米壳聚糖衍生物的制备方法，包括下列步骤：(1)将壳聚糖溶于0.1％-20wt％稀酸水溶液，与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，进行自聚反应和接枝反应，得到带有活性环氧基团的壳聚糖衍生物，(2)接着与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸进行开环加成反应，得到带有羧基活性官能团的壳聚糖衍生物，(3)再与选自Fe3+，Ti4+，Zr4+，Ni2+或Ga3+的过渡金属离子发生螯合作用，制得所述纳米壳聚糖衍生物，其中自聚和接枝的反应温度为40-100℃，开环反应温度为50-80℃。
8.权利要求7的制备方法，其特征在于自聚和接枝的反应加入选自偶氮二异丁腈，正丁基锂，过硫酸钾，硝酸铈铵，硫代碳酸-溴酸钾，二高碘酸铜酸钾，或过硫酸氨和硫代硫酸钠的引发剂。
9.权利要求8的制备方法，其中引发剂加入量为反应单体重量的1-5％。
10.权利要求7的制备方法，其特征在于与亚胺基二乙酸钠或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸发生开环加成反应时，pH值为8-12。
11.权利要求7的制备方法，其特征在于与过渡金属离子发生螯合作用时，Fe3+的浓度为10mM-100mM。
12.一种利用权利要求1-6任一项的纳米壳聚糖衍生物富集和纯化磷酸化多肽的方法，包括将含有磷酸化多肽的混合物溶于上样液中，其中所述上样液为含有2，5-二羟基苯甲酸的乙腈和三氟乙酸的水溶液，再加入所述纳米壳聚糖衍生物进行富集，洗涤后得到选择性吸附有磷酸化多肽的纳米壳聚糖衍生物，并以高的pH溶液洗脱负载的磷酸化多肽，任选以氨水洗脱负载的磷酸化多肽。
13.权利要求12的富集和纯化磷酸化多肽的方法，其特征是选择适当的条件，用质谱技术直接测定和鉴定分析物。
14.权利要求12的富集和纯化磷酸化多肽的方法，其特征是将上述纳米壳聚糖衍生物涂在芯片上进行微量的磷酸化多肽的富集和纯化。
15.权利要求12的富集和纯化磷酸化多肽的方法，其特征是将上述纳米壳聚糖衍生物填充入色谱柱中进行大规模的磷酸化多肽的富集和纯化。
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