CN101575384B - 纳米壳聚糖衍生物及制备方法和它的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种属于生物医学纳米材料技术领域的纳米壳聚糖衍生物及其制备方法，该衍生物的制备方法为将壳聚糖溶于稀酸后，与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，进行自聚接枝反应，得到带有活性环氧基团的中间体，该中间体与氨基取代苯硼酸进行开环加成反应制得最终的带有硼酸基活性官能团的纳米壳聚糖衍生物，颗粒大小为1-300nm。本发明还公开了该壳聚糖衍生物在富集和纯化糖基化多肽/蛋白方面的应用。所述壳聚糖衍生物具有很高的特异性，可用于生物样品中低丰度的糖基化多肽/蛋白的富集和纯化，可用于生物和医学领域，包括临床诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学纳米材料技术领域。具体而言，涉及纳米壳聚糖衍生物及制备方法和利用该纳米壳聚糖衍生物高选择性和特异性富集和纯化糖基化多肽/蛋白的方法。
背景技术
翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学中研究的热点课题。蛋白质的糖基化是最常见的、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，蛋白质的糖基化几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，新陈代谢，免疫应答，肿瘤发生等，一些糖基化蛋白质作为治疗疾病的相关靶或生物标识物用于癌症的早期检测和鉴定，如癌胚抗原用于检测直肠癌，乳腺癌，前列腺癌和肺癌；CA-125用于检测卵巣癌；专一性前列腺癌胚抗原用于检测前列腺癌；Her2/neu用于检测乳腺癌；等等，因此对糖基化蛋白质的分析和鉴定具有十分重要的作用。
蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性，即不同的糖链可连于同一位点以及在同一蛋白质上也可有不同的位点连接不同的糖链。糖基化的不均一性给糖蛋白质的分离分析带来了很大的困难：不同糖型的同一蛋白质会在电泳上呈现弥散的条带，导致信号分散，较低丰度的蛋白质得不到鉴定；造成糖蛋白质在色谱中不能良好的分离；目前，质谱技术已经发展成为鉴定糖基化蛋白的重要工具之一，质谱在鉴定糖基化蛋白时，仍面临巨大的挑战，其具体体现是：第一，糖基化蛋白在细胞内所有蛋白中为低丰度；第二，糖基化蛋白在质谱上表现为一簇分辨率很差的峰，得不到准确的分子量。鉴于此，当前国际上的主要研究策略是利用现有技术体系，分离富集糖蛋白质/糖肽，消除糖基化的不均一性及其对质谱的影响，质量标记糖基化位点，从而扬长避短，实现大规模高通量糖蛋白质及糖基化位点的鉴定。目前，常用的糖蛋白质分离富集技术有：凝集素亲和技术、肼化学富集法、亲水相互作用色谱法等。其中凝集素亲和技术对含甘露糖基和N-混多糖的糖蛋白具有较好的亲和作用，但是对二触角的N-多糖糖蛋白的亲和作用较弱，对三，四触角的N-多糖糖蛋白没有亲和作用；而肼化学富集法需一步氧化反应，从而增加了样品制备时间和样品的复杂性。最近开发的带有苯硼酸的硅材料，对含有N-糖基化和O-糖基化的糖蛋白都具有较好的富集作用，适用所有的含不同结构，不同大小和亲水性的糖蛋白，但是其专一性和灵敏性有待提高。
壳聚糖(Chitosan)又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，化学名为2-氨基-β-1，4-葡聚糖，它是甲壳素经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗肿瘤等优异性能，广泛应用于医药、食品、化工、环保等行业，素有万能多糖的美誉(R.Jayakumar et al.Carbohydrate Polymers 62(2005)142-158)。甲壳素在自然界分布非常广，是一种廉价易得的原料。未见带有活性硼酸基官能团的壳聚糖衍生物作为固载基质来富集和纯化糖基化多肽/蛋白的报道。
发明内容
本发明的目的是提供纳米壳聚糖衍生物。
本发明还提供上述纳米壳聚糖衍生物的制备方法。
本发明也提供上述纳米壳聚糖衍生物在富集和纯化糖基化多肽/蛋白方面的应用。
纳米壳聚糖衍生物，所述壳聚糖衍生物是壳聚糖与烯酸环氧丙酯发生自聚接枝反应的产物，再与氨基取代苯硼酸进行开环加成反应得到的，所述衍生物带有活性硼酸基官能团，颗粒大小为1-300nm，优选颗粒大小为20-100nm。
所述氨基取代苯硼酸为3-氨基苯硼酸、2-氨基苯硼酸或4-氨基苯硼酸。
所述烯酸环氧丙酯为C3-C8直链或支链烯酸环氧丙酯，优选甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)或丙烯酸环氧丙酯。
所述的纳米壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：
(1)将壳聚糖溶于含有0.1-20wt％酸的水溶液，再与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，加入引发剂后进行自聚接枝反应，其中，壳聚糖的含量为1.5-2.5wt％，甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯的含量为2-10wt％，反应温度为40-100℃，反应时间为0.5-4小时，得到中间体；
(2)将步骤1得到的中间体与氨基取代苯硼酸置于氯化钠和碳酸钠的水溶液中进行开环加成反应，其中，氨基取代苯硼酸的用量是中间体的1-5倍，且占反应体系的2-10wt％，反应温度为50-80℃，pH值为8-12，反应时间4-6小时，降至室温后，过滤，用水洗涤至中性，得到目标产物。
所述引发剂为偶氮二异丁腈，正丁基锂，过硫酸钾，硝酸铈铵，硫代碳酸-溴酸钾，二高碘酸铜酸钾，过硫酸氨或硫代硫酸钠中的一种或多种，其中，加入量为反应体系的1-5wt％。
所述酸为甲酸或乙酸。
以反应原料是壳聚糖、甲基丙烯酸环氧丙酯和3-氨基苯硼酸为例说明本发明的原理，其合成反应式为：
其中，1代表壳聚糖，GMA可以同壳聚糖上的C2氨基发生反应，也可以和C3或C6上的羟基发生反应，也可能与自身的活性官能团反应，GMA和壳聚糖经自聚接枝反应得到上述反应式中的中间体，该中间体带有活性环氧基团，然后该中间体再与3-氨基苯硼酸发生开环加成反应，从而得到带有硼酸基活性官能团的纳米壳聚糖衍生物2。
上述纳米壳聚糖衍生物在富集和纯化糖基化多肽/蛋白方面的应用，是将酶解后的待分析物或分析物溶于上样液中，将其加入到上述壳聚糖衍生物纳米材料中进行富集，用上样液将富集糖基化多肽的壳聚糖衍生物洗涤2-5次后再用水快速洗涤1-2次，得到的纳米壳聚糖衍生物，可直接用于MALDI-TOF-MS质谱分析或以洗脱溶液洗脱负载的糖基化多肽/蛋白。
所述上样液为含有50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸的0.5M氯化钠水溶液或50mM碳酸氢氨水溶液。
所述洗脱溶液为含有50％乙腈和2％三氟乙酸的水溶液。
本发明利用壳聚糖苯硼酸衍生物纳米材料富集和分离糖基化多肽/蛋白的方法可按本领域常规操作步骤进行，但是优化了富集糖基化多肽/蛋白的过程，包括吸附、洗涤和洗脱来选择性地富集糖基化多肽/蛋白。该方法具有较高的特异性，可用于生物样品中低丰度糖基化多肽/蛋白的纯化和富集。此外，本发明将所述纳米材料作为色谱填料，用于糖基化多肽/蛋白的富集和纯化，从而实现大规模的糖基化多肽/蛋白的分离提纯。
本发明的有益效果：本发明的壳聚糖苯硼酸衍生物纳米材料相对于现有材料而言，所选择材料廉价，易得，具有良好的生物相容性，性质稳定，颗粒大小为1-300nm，外比表面积大，具有很强的吸附能力，可制膜和填充于色谱柱中，富集糖基化多肽后可直接用于质谱分析，无需洗脱。另外，由于壳聚糖是天然阳离子多糖，糖基化蛋白含有糖基，根据相似相容原理和硼酸能与糖基形成酯键，以及所用材料的物理化学性能，因此该纳米壳聚糖苯硼酸衍生物能高选择性、特异性的富集和纯化糖基化多肽。再用质谱技术鉴定生物标识物或疾病相关靶。
附图说明
图1为纳米材料的红外吸收光谱图；
图2为壳聚糖衍生物纳米材料的扫描电镜图，由图可以看出，此纳米材料为球型，颗粒大小为40-60nm；
图3为辣根过氧化物酶酶解产物(浓度为2×10-8M)的MALDI-TOF质谱图，其中*为糖基化多肽；
图4为壳聚糖苯硼酸衍生物纳米材料对辣根过氧化物酶酶解产物中糖基化多肽的富集和纯化的MALDI-TOF质谱图，其中*为糖基化多肽；
图5为辣根过氧化物酶酶解产物(浓度为2×10-8M)与牛血清白蛋白的酶解产物以1∶8比例混合的MALDI-TOF质谱图，其中*为糖基化多肽；
图6为壳聚糖苯硼酸衍生物纳米材料对辣根过氧化物酶酶解产物(浓度为2×10-8M)与牛血清白蛋白的酶解产物以1∶8比例混合的混合物中糖基化多肽的富集和纯化的MALDI-TOF质谱图，其中*为糖基化多肽；
图7为壳聚糖衍生物苯硼酸纳米材料对人血清中糖基化多肽和糖基化蛋白的富集的质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图对本发明给予进一步的说明。
实施例1-6为壳聚糖-GMA-苯硼酸的制备方法，实施例7-9为利用本发明的衍生物富集和纯化糖基化多肽/蛋白的方法。
实施例1：壳聚糖-GMA-苯硼酸的制备
1)壳聚糖-GMA环氧中间体的制备(chitosan-GMA)
在装有搅拌器，温度计和冷凝管的100mL三口烧瓶中，将0.5克的壳聚糖(青岛海汇生物有限公司，脱乙酰度91％)溶于30mL含有乙酸2wt％的水溶液中，加入0.5mL的甲基丙烯酸环氧丙酯，搅拌，再加入0.035克过硫酸铵和0.035克硫代硫酸钠，升温至50℃，反应2小时，停止反应，降至室温后，离心去上清液，再用水洗涤，得到固体物。
2)壳聚糖-GMA-苯硼酸的制备(chitosan-GMA-APB)
在装有搅拌器，温度计和冷凝管的100mL三口烧瓶中，装入步骤1制备的固体物，加入0.5克的3-氨基苯硼酸，0.25克氯化钠和20mL浓度为2N的碳酸钠溶液，升温到60℃，反应5小时，停止反应，降至室温后，过滤，用水洗涤至中性，得到固体物。
由图2壳聚糖-GMA-苯硼酸介质的扫描电镜图可以看出，此材料为球型，大小为40-60nm；图1的红外波谱特征峰为：3421.9，2934.1，1730.7，1641.3，1603.7，1572.2，1436.2，1370.2，1339.0，1261.3，1158.3，1065.2，900.8，788.5，749.1，708.5；其中1339.0，1261.3，708.5的特征吸收峰归属于硼酸的吸收峰。元素分析结果为C 50.425％，H 6.618％，N 3.704％。
实施例2：与实施例1的方法相同，其中原料丙烯酸环氧丙酯替代甲基丙烯酸环氧丙酯。
实施例3-4：与实施例1的方法相同，除了其中的引发剂分别为偶氮二异丁腈和正丁基锂之外。
实施例5-6：与实施例1的方法相同，除了其中的氨基取代苯硼酸分别为2-氨基苯硼酸和4-氨基苯硼酸之外。
实施例7：糖基化多肽的富集
1).样品溶液的制备：25μg辣根过氧化物酶(Sigma)加入10μL含8M尿素，乙二胺四乙酸(EDTA)和10mM磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，在室温振动1小时，再加入40μL 50mM的碳酸氢氨溶液中(pH8.2)，按照与胰蛋白酶的质量比为(40∶1)的比例加入胰蛋白酶进行酶解反应，酶解温度控制在37℃，过夜反应，加入2％三氟乙酸(TFA)终止反应。获得的蛋白酶解溶液储存在-80℃冰箱中备用。牛血清白蛋白酶解方法同上，反应时间为14小时。
2).糖基化多肽的富集和MALDI-TOF质谱分析：将2μL 1×10-6mM的辣根过氧化物酶酶解溶液溶于100μL上样液中，其中，上样液为含50mM碳酸氢氨水溶液，加入到装有约0.5mg按实施例1制备的壳聚糖苯硼酸衍生物纳米材料的EP管中。在25℃，振速为1000rpm下，振动30分钟，离心去上清液，用50mM碳酸氢氨水溶液洗涤三次，再用去离子水快速洗涤一次即可用于质谱分析。吸取0.8μL上述富集有糖基化多肽材料的混浊液点在靶板上，再与含1％TFA和50％乙腈的CHCA(10mg/mL)基质溶液混合，用枪头抽吸几次，放干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图，同时进行未经本发明的纳米材料富集的糖基化多肽的对照实验，所有的MALDI-TOF质谱分析是在岛津的AXIMA-CFP plus(KRATOS Analytical，Shimadzu Group Company)飞行时间质谱仪上完成，N2脉冲激光的波长为337.1nm，实验中所得数据都在线性正离子模式中进行，质谱分子量的校正采用外标法，所用标准物为IIBradykinin(fragment 1-7)(M/z 757.3997)，血管紧张素肽(Angiotensin II，M/z 1046.5423)，[Glu1]-Fibrinopeptide B(M/z 1570.6852)和ACTH(fragment 18-39)(M/z 2465.1989)。所得谱图再用内标法进行校正，所用内标为m/z2533.30和4986.20。
图3是0.5μL 2×10-8mM的辣根过氧化物酶酶解所得多肽的质谱图，以CHCA作基质，由图可知，谱图中主要为非糖基化多肽，只能观察到3个糖基化多肽。图4是用所述纳米材料对其进行富集后所得质谱图，谱图中主要为糖基化多肽，说明此纳米材料能特异的和高效的富集和纯化低丰度的糖基化多肽，分析结果见下表1。
实施例8：除上样液为含有50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)的0.5M氯化钠水溶液之外，其他部分同实施例7。
实施例9：特异性富集和纯化糖基化多肽
样品的制备和分析：将2μL 2pmol的糖基化蛋白辣根过氧化物酶酶解产物与非糖基化蛋白牛血清白蛋白的酶解产物以1∶8比例混合，混合液溶于50mM碳酸氢氨溶液中，使总体积为200μL，加入到装有约0.5mg按实施例1制备的壳聚糖苯硼酸衍生物纳米材料的EP管中。在25℃，振速为1000rpm下，振动30分钟，离心去上清液，用50mM碳酸氢氨水溶液洗涤三次，再用去离子水快速洗涤一次即可用于质谱分析，同时进行未经本发明纳米材料处理的对照实验，吸取0.8μL上述富集有糖基化多肽材料的混浊液点在靶板上，再与含1％TFA和50％乙腈的CHCA(10mg/mL)基质溶液或20mg/mLDHB基质(溶于1％TFA和50％乙腈)混合，用枪头抽吸几次，放干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图。
图5是0.5μL 2×10-8mM的辣根过氧化物酶酶解产物与牛血清白蛋白酶解产物所得多肽以1∶8的比例混合所得质谱图，由图可见，只检测到三个很弱的糖基化多肽峰，大部分是非糖基化多肽峰；图6是用纳米壳聚糖衍生物富集和纯化后所得的质谱图，三个糖基化多肽被所用纳米材料捕获，而大部分非糖基化多肽被洗脱，分析结果见下表1，说明此纳米材料能特异的和高效的富集和纯化低丰度的磷酸化多肽。
实施例10：除上样液为含有50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)的0.5M氯化钠水溶液之外，其他部分同实施例9。
实施例11：血清中的糖基化多肽/蛋白特异的富集和MALDI-TOF-MS分析
(1).血清的处理：在100μL血清中加入900μL的50mM碳酸氢氨水溶液；
(2).将200μL按上述处理的血清液加入到装有0.5mg按实施例1制备的壳聚糖苯硼酸衍生物纳米材料的EP管中，在室温下，转动混旋1小时，转速为1200rpm，离心去上清液，用50mM碳酸氢氨水溶液洗涤两次，再用水洗涤一次，离心，去上清液；
(3).将0.8μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)基质(浓度为10mg/mL的50％乙腈和1％三氟乙酸的水溶液)点在靶板上，再与上述结合有糖基化多肽/蛋白的亲和介质纳米材料的悬浮液0.8μL混合，用枪头抽吸几次，自然晾干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图。
由图7可见，此亲和介质纳米材料能大量选择性富集血清中分子量在1kDa-10kDa的糖基化多肽和蛋白质，这是传统的二维凝胶电泳无法检出的范围。
实施例12：除上样液为含有50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)的0.5M氯化钠水溶液之外，其他部分同实施例11。
表1检测到的糖基化多肽序号、氨基酸序列、糖基化数位点数及理论分子量
| 序号 | [M+H] | 糖基化位点数 | 氨基酸序列 |
| 1 | 2533.3 | 1 | SFANSTQTFFNAFVEAMDR(295-313) |
| 2 | 3193.2 | 1 | SFANSTQTFFNAFVEAMDR(295-313) |
| 3 | 3209.2 | 1 | SFANSTQTFFNAFVEAMDR(295-313) |
| 4 | 3223.2 | 1 | SFANSTQTFFNAFVEAMDR(295-313) |
| 5 | 3355.5 | 1 | SFANSTQTFFNAFVEAMDR(295-313) |
| 6 | 3322.9 | 1 | QLTPTFYDNSCPNVSNIVR(31-49) |
| 7 | 3673.5 | 1 | GLIQSDQELFSSPNATDTIPLVR(272-294) |
| 8 | 3896.1 | 1 | LHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFR(69-92) |
| 9 | 3733.3 | 1 | LHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFR(69-92) |
| 10 | 3749.8 | 1 | LHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFR(69-92) |
| 11 | 3764.2 | 1 | LHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFR(69-92) |
| 12 | 4058.4 | 1 | LHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFR(69-92) |
| 13 | 4223.9 | 1 | QLTPTFYDNSCPNVSNIVR，AAVESACPR(31-49，115-123) |
| 14 | 4986.3 | 2 | LYNFSNTGLPDPTLNTTYLQTLR(214-236) |
| 15 | 4824.2 | 2 | LYNFSNTGLPDPTLNTTYLQTLR(214-236) |
| 16 | 4840.1 | 2 | LYNFSNTGLPDPTLNTTYLQTLR(214-236) |
| 17 | 4855.1 | 2 | LYNFSNTGLPDPTLNTTYLQTLR(214-236) |
其中，糖基化位置以下划线表示。
Claims (9)
1.纳米壳聚糖衍生物，其特征在于，所述壳聚糖衍生物是壳聚糖与C3-C8直链或支链烯酸环氧丙酯发生自聚接枝反应的产物，再与氨基取代苯硼酸进行开环加成反应得到的，所述壳聚糖衍生物带有活性硼酸基官能团，颗粒大小为1-300nm。
2.根据权利要求1所述的纳米壳聚糖衍生物，其特征在于，所述氨基取代苯硼酸为3-氨基苯硼酸、2-氨基苯硼酸或4-氨基苯硼酸。
3.根据权利要求1所述的纳米壳聚糖衍生物，其特征在于，所述烯酸环氧丙酯为甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯。
4.权利要求1所述的纳米壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)将壳聚糖溶于含有0.1-20wt％酸的水溶液，再与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，加入引发剂后进行自聚接枝反应，在反应体系中，壳聚糖的含量为1.5-2.5wt％，甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯的含量为2-10wt％，反应温度为40-100℃，反应时间为0.5-4小时，得到中间体；
(2)将步骤1得到的中间体与氨基取代苯硼酸置于氯化钠和碳酸钠的水溶液中进行开环加成反应，其中，氨基取代苯硼酸的用量是中间体的1-5倍，且占反应体系的2-10wt％，反应温度为50-80℃，pH值为8-12，反应时间4-6小时，降至室温后，过滤，用水洗涤至中性，得到目标产物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂为偶氮二异丁腈，正丁基锂，过硫酸钾，硝酸铈铵，硫代碳酸-溴酸钾，二高碘酸铜酸钾，过硫酸氨或硫代硫酸钠中的一种或多种，其中，加入量为反应体系的1-5wt％。
6.根据权利要求5所述的纳米壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于，所述酸为甲酸或乙酸。
7.纳米壳聚糖衍生物在富集和纯化糖基化多肽/蛋白方面的应用，其特征在于，将酶解后的待分析物溶于上样液中，将其加入到权利要求1所述的纳米壳聚糖衍生物纳米材料中进行富集，用上样液将富集糖基化多肽的壳聚糖衍生物洗涤2-5次后再用水快速洗涤1-2次，得到的纳米壳聚糖衍生物，可直接用于MALDI-TOF-MS质谱分析或以洗脱溶液洗脱负载的糖基化多肽/蛋白。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述上样液为含有50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸的0.5M氯化钠水溶液或50mM碳酸氢氨水溶液。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述洗脱溶液为含有50％乙腈和2％三氟乙酸的水溶液。
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