CN108276469A - 一种富集4-羟基壬烯醛hne修饰肽段的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属生化分析领域，涉及一种氟试剂衍生结合氟固相萃取FSPE)富集HNE修饰肽段的方法，其中，采用羟胺功能化含氟试剂对HNE肽段衍生，具有衍生效率高，反应时间短的特点，且衍生上含氟试剂后能提高HNE修饰肽段的离子化效率；氟固相萃取技术富集HNE修饰肽段具有选择性较高，时间短，除盐能力好等优点；经用于乳腺癌细胞系MCF‑7检测，结果显示共检测到655个HNE修饰位点,对应于644条修饰肽段，437个修饰蛋白。本氟试剂衍生结合氟固相萃取富集HNE修饰肽段的方法具有衍生效率高，反应时间短，操作简便、选择性较高、除盐能力好的特点。

Description

一种富集4-羟基壬烯醛HNE修饰肽段的方法
技术领域
本发明属于生化分析领域，涉及一种富集4-羟基壬烯醛(HNE)修饰肽段的新方法，尤其是一种氟试剂衍生结合氟固相萃取(fluorous solid-phase extraction,FSPE)富集HNE修饰肽段的方法。本发明方法将含羟胺功能化的含氟试剂衍生到HNE修饰肽段上，该衍生试剂能选择性地提高HNE修饰肽段的离子化效率，并且能利用氟固相萃取技术(FSPE)选择性地富集氟试剂衍生化的HNE修饰肽段。
技术背景
现有技术公开了4-羟基壬烯醛(HNE)是脂质过氧化反应主要的分解产物,能与一些亲核性物质如，巯基化合物、DNA、蛋白质和磷脂发生进一步反应,干扰细胞的正常功能活动,损伤细胞组分从而引发疾病。研究发现，HNE能与半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸发生加成反应，因此形成的修饰蛋白与心脏疾病如，动脉硬化和糖尿病综合征，和神经变性疾病如，阿尔茨海默病、帕金森综合征和脑局部缺血的发生和发展有关。由于HNE修饰蛋白是一类低丰度蛋白，而质谱分析的灵敏度有限，因此，选择一种合适的富集方法十分重要；研究者发明了各种富集方法，主要有含肼基团的固相材料和以生物素-亲合素为主的富集方法。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种富集4-羟基壬烯醛(HNE)修饰肽段的新方法，尤其是一种氟试剂衍生结合氟固相萃取(fluorous solid-phaseextraction,FSPE)富集HNE修饰肽段的方法。本方法比现有的富集HNE修饰肽段的方法，其氟试剂衍生与FSPE结合的方法更具有操作简便，快捷，选择性高，谱图解析方便等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富集4-羟基壬烯醛(HNE)修饰肽段的新方法，尤其是一种氟试剂衍生结合氟固相萃取(fluorous solid-phase extraction,FSPE)富集HNE修饰肽段的方法。本方法能选择性提高HNE修饰肽段的离子化效率，并能使带有含氟试剂的修饰肽段从复杂样本中富集出来。
本发明提供了氟试剂衍生和FSPE结合富集HNE修饰肽段方法，将含氟试剂衍生到HNE修饰肽段上，由于含氟试剂的强疏水性提高了HNE修饰肽段的离子化效率，然后利用FluoroFlashNuTips和含氟修饰肽段间的偶极-偶极相互作用从而使含氟基团的目标物从混合物中分离出来。与现有的富集HNE修饰肽段的方法相比，氟试剂衍生与FSPE结合的方法具有操作简便，快捷，选择性高，谱图解析方便等优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1.以ASH*LGLAR,RGPC*RAFI为标准HNE修饰肽段，考察含氟试剂的衍生效率(“*”表示HNE修饰)；
2.以标准HNE修饰肽段(ASH*LGLAR,RGPC*RAFI)与肌红蛋白酶解肽段的混合物(摩尔比:1:10)为富集体系，用FSPE从中富集HNE修饰肽段，考察该方法的选择性；
3.以ASH**LGLAR,RGPC**RAFI作为氟试剂衍生化的HNE修饰肽段，饱和碳酸氢铵(2.6M)，饱和氯化钠(6.2M)，尿素(2M)为盐溶液，测试FSPE富集方法的耐盐性(“**”表示氟试剂衍生化的HNE修饰；
4.以乳腺癌细胞系MCF-7提取蛋白作为实际样品，测试FSPE用于实际样品分析的可行性。
更具体的，本发明提供了一种氟试剂衍生结合氟固相萃取(fluorous solid-phase extraction,FSPE)富集HNE修饰肽段的方法，其特征是，选用含氟试剂对HNE修饰肽段进行衍生，然后用氟固相萃取技术富集氟试剂衍生化的HNE修饰肽段，其步骤包括：
(1)在HNE修饰肽段样品中，加入含氟试剂与HNE修饰肽段溶液混合，反应结束后，冻干样品,
(2)预洗平衡FluoroFlashNuTips，溶解以上冻干的样品，用FluoroFlashNuTips反复吹打样品后，用洗脱液清洗FluoroFlashNuTips以完成对HNE修饰肽段的富集,
(3)进行MALDI质谱分析或LC-MS/MS分析。
本发明中，所述的用于HNE肽段与含氟试剂的衍生反应中，含氟试剂为含羟胺官能团的含氟分子，反应温度为37～50℃，反应时间30～240分钟，反应体系是50mM乙酸铵溶液,pH 4.3～7。最适宜条件反应温度为37℃，反应时间30分钟，反应体系是50mM乙酸铵溶液,pH4.3；
本发明中，所述的用于FSPE从肌红蛋白酶解肽段中富集HNE修饰肽段中，预洗溶液：50μL甲醇；平衡溶液：50μL的10mM乙酸铵溶液(甲醇/水：v/v 3:7)；上样溶液：样品溶在15μL的10mM乙酸铵溶液(甲醇/水：v/v 3:7)；清洗溶液：50μL的50mM碳酸氢铵溶液(甲醇/水：v/v 3:2)；洗脱溶液：10μL的甲醇；
本发明中，所述的用FSPE富集HNE修饰肽段中，包括，预洗：将FluoroFlashNuTips在预洗溶剂中反复吹5次左右；平衡：将FluoroFlashNuTips在平衡溶剂中反复吹打5次左右；上样：用FluoroFlashNuTips反复吹打样品20次左右；清洗：将FluoroFlashNuTips在清洗溶剂中反复吹打5次左右；洗脱：FluoroFlashNuTips在洗脱液中反复吹打5次左右。
本发明的氟试剂衍生结合氟固相萃取(fluorous solid-phase extraction,FSPE)富集HNE修饰肽段的方法，具有衍生效率高(约100％)，反应时间短(约30分钟)的特点，且衍生上含氟试剂后可提高HNE修饰肽段的离子化效率；氟固相萃取技术富集HNE修饰肽段具有选择性较高，时间短，除盐能力好等优点，经用于乳腺癌细胞系MCF-7中，检测到655个HNE修饰位点(589个H位点，59个C位点，4个K位点和3个R位点),对应于644条修饰肽段，437个修饰蛋白；本方法具有衍生效率高，反应时间短，操作简便、选择性较高、除盐能力好的特点。
本发明的优点有：
1.HNE修饰肽段与含氟试剂发生肟点击反应，衍生效率高(接近100％)，反应时间短(30分钟)。
2.含氟试剂与HNE修饰肽段衍生后，可以显著提高HNE修饰肽段在MALDI质谱分析时信噪比与信号强度。
3.氟试剂衍生与FSPE结合的方法能把HNE修饰肽段从肌红蛋白酶解肽段(摩尔比例：1:10)选择性地被富集出来，选择性较高。
4.FSPE能把氟试剂衍生化的HNE修饰肽段从盐溶液中富集出来。
附图说明
图1(a)含氟试剂与HNE修饰肽段的反应示意图，(b)FSFP富集HNE修饰肽段的流程图。
图2(a)ASH*LGLAR的MALDI质谱图和(b)该肽段与含氟试剂衍生后的MALDI质谱图；(c)RGPC*RAFI的MALDI质谱图和(d)该肽段与含氟试剂衍生后的MALDI质谱图；其中，“◆”代表脱水产物；数字1-4分别表示ASH*LGLAR,ASH**LGLAR,RGPC*RAFI,和RGPC**RAFI.“*”表示HNE修饰；“**”表示氟试剂衍生化的HNE修饰。
图3(a)为ASH*LGLAR与ASH**LGLAR等摩尔比混合的MALDI质谱图，(b)为RGPC*RAFI与RGPC**RAFI等摩尔比混合的MALDI质谱图；其中，“◆”表示脱水产物；数字1-4分别表示ASH*LGLAR,ASH**LGLAR,RGPC*RAFI和RGPC**RAFI.“*”表示HNE修饰，“**”表示氟试剂衍生化的HNE修饰。
图4(a)为ASH*LGLAR,RGPC*RAFI与肌红蛋白酶解肽段以摩尔比例(1:10)混合和(b)用氟试剂衍生和FSFP富集后的MALDI质谱图；其中，数字1-4表示ASH*LGLAR,RGPC*RAFI,ASH**LGLAR和RGPC**RAFI；“◆”表示肌红蛋白酶解肽段.“*”表示HNE修饰；“**”表示氟试剂衍生化的HNE修饰。
图5饱和碳酸氢铵(2.6M)溶液中的ASH**LGLAR,RGPC**RAFI样品(a)未富集直接分析与(b)FSPE富集除盐后的MALDI-TOF质谱图；饱和氯化钠(6.2M)溶液中的ASH**LGLAR,RGPC**RAFI样品(c)未富集直接分析与(d)FSPE富集除盐后的MALDI-TOF质谱图；以及 2M尿素溶液中ASH**LGLAR,RGPC**RAFI样品(e)未富集直接分析与(f)FSPE富集除盐后的MALDI-TOF质谱图。数字1和2分别表示ASH**LGLAR和RGPC**RAFI.“**”表示氟试剂衍生化的HNE修饰.
具体实施方式
实施例1 考察氟试剂的衍生效率
1μL HNE修饰肽段(3μg/μL ASH*LGLAR，3μg/μL RGPC*RAFI)分别与2μL的含氟试剂(3.5μg/μL)溶在15μL的溶液(50mM乙酸铵溶液,pH 4.3)，在37℃条件下反应30分钟，反应前与反应后进行MALDI质谱分析，HNE修饰肽段几乎完全转化成氟试剂衍生化的HNE修饰肽段,结果如图2所示。
实施例2 考察含氟试剂衍生后提高HNE肽段的信号能力
取两份1μL ASH*LGLAR(3μg/μL)分别溶在15μL的50mM乙酸铵溶液中(pH 4.3)。一份加入2μL的含氟试剂(3.5μg/μL)，另一份加入2μL的反应溶液(不包含氟试剂)使与前者体积保持一致；两份样品都在37℃下反应30分钟。两个样品分别取5μL然后混合，取0.5μL点靶进行MALDI质谱分析，氟试剂衍生化的HNE修饰肽段的信噪比相对于HNE修饰肽段的信噪比提高了22倍,结果如图3(a)所示，同样的RGPC*RAFI重复上述实验，在部分HNE修饰肽段脱水之后,氟试剂衍生化的HNE修饰肽段的信噪比仍比HNE修饰肽段的信噪比提高了2倍,结果如图3(b)所示。
实施例3 考察FSPE方法的选择性
取标准肽段ASH*LGLAR,RGPC*RAFI和肌红蛋白酶解肽段分别按摩尔1：10混合，进行MALDI质谱分析，HNE修饰肽段与肌红蛋白酶解肽段同时被检测到,结果如图4(a)所示，按实施例1条件与含氟试剂衍生后冻干，把样品溶于15μL的10mM乙酸铵溶液中(甲醇/水：v/v3:7)。首先用50μL的甲醇预洗FluoroFlashNuTips，其次用50μL的10mM乙酸铵溶液(甲醇/水：v/v 3:7)吹打FluoroFlashNuTips 5次左右达到平衡FluoroFlashNuTips的目的，然后用FluoroFlashNuTips吹打样品20次左右，使样品结合到FluoroFlashNuTips上，接着用50μL的50mM碳酸氢铵溶液(甲醇/水v/v 3:2)清洗枪头5次左右，以达到冲洗掉肌红蛋白酶解肽段吸附目旳，最后用10μL甲醇洗脱，只有目标肽段能被检测到,且信噪比得到了一定的提高,结果如图4(b)所示。
实施例4 考察耐盐性
取1μL氟试剂衍生化的HNE修饰肽段(3μg/μL ASH**LGLAR，3μg/μL RGPC**RAFI)和饱和碳酸氢铵(2.6M),饱和氯化钠(6.2M),尿素(2M)混合后进行MALDI质谱分析，目标肽段的信噪比很低或检测不到,结果如图5a，5c，5e所示；用FSPE富集后，取0.5μL点靶进行MALDI质谱分析，能检测到较高信噪比的目标肽段,结果如图5b，5d，5f。
实施例5
提取MCF-7细胞蛋白后，在提出的蛋白中加入100μM HNE在50mM磷酸缓冲溶液(pH7.4)中37℃反应4小时。然后向样品溶液中加入二硫苏糖醇(DTT)，使终浓度为10mM，置于37℃恒温、振荡反应60分钟，进行蛋白二硫键的还原；反应完成后，向溶液中加入碘乙酰胺(IAA)，使其终浓度为30mM，室温、避光条件下孵育30分钟，实现巯基的烷基化，DTT与IAA及变性剂通过超滤步骤除去，随后向样品中加入胰蛋白酶，此过程持续12小时。冻干样品后，溶于反应溶液(50mM乙酸铵溶液,pH 4.3)，加入3mM含氟试剂，在37℃条件下反应30分钟，用FSPE方法富集，冻干，然后进行LC-MS/MS检测，共有655个HNE修饰位点(589个H位点，59个C位点，4个K位点和3个R位点)在644条修饰肽段，437个修饰蛋白中被检测到。

Claims (5)

1.一种富集4-羟基壬烯醛HNE修饰肽段的方法，其特征是，采用含氟试剂对4-羟基壬烯醛HNE修饰肽段进行衍生后，用氟固相萃取技术富集氟试剂衍生化的4-羟基壬烯醛HNE修饰肽段，其步骤包括：
(1)在4-羟基壬烯醛HNE修饰肽段样品中，加入含氟试剂与4-羟基壬烯醛HNE修饰肽段溶液混合，反应结束后，冻干样品,
(2)预洗平衡FluoroFlashNuTips，溶解所述的冻干样品，用FluoroFlashNuTips反复吹打样品后，用洗脱液清洗FluoroFlashNuTips完成对4-羟基壬烯醛HNE修饰肽段的富集,
(3)进行MALDI质谱分析或LC-MS/MS分析。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，用于4-羟基壬烯醛HNE肽段与含氟试剂的衍生反应中，含氟试剂为含羟胺官能团的含氟分子，反应温度为37～50℃，反应时间30～240分钟，反应体系为50mM乙酸铵溶液,pH 4.3～7。
3.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用于4-羟基壬烯醛HNE肽段与含氟试剂的衍生反应中，反应温度为37℃，反应时间30分钟，反应体系是50mM乙酸铵溶液,pH 4.3。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，用于FSPE从肌红蛋白酶解肽段中富集4-羟基壬烯醛HNE修饰肽段中，预洗溶液包括：50μL甲醇；平衡溶液：50μL的10mM乙酸铵溶液，其中甲醇/水：v/v 3:7；上样溶液：样品溶在15μL的10mM乙酸铵溶液，其中甲醇/水：v/v 3:7；清洗溶液：50μL的50mM碳酸氢铵溶液，其中甲醇/水：v/v 3:2；洗脱溶液：10μL的甲醇。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，用FSPE富集4-羟基壬烯醛HNE修饰肽段中包括，预洗：将FluoroFlashNuTips在预洗溶剂中反复吹5次左右；平衡：将FluoroFlashNuTips在平衡溶剂中反复吹打5次左右；上样：用FluoroFlashNuTips反复吹打样品20次左右；清洗：将FluoroFlashNuTips在清洗溶剂中反复吹打5次；洗脱：FluoroFlashNuTips在洗脱液中反复吹打5次。
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