CN112067684A - 一种基于噻唑烷化学固相富集糖肽并质谱分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质分析领域,涉及一种基于噻唑烷化学固相富集糖肽并质谱分析的方法,包括:利用高碘酸纳将糖肽糖链部分的羟基氧化为醛基,将半胱氨酸修饰的磁性纳米材料置于氧化后的糖肽溶液中,通过磁性纳米材料表面的β‑氨基硫醇基团与氧化后糖肽的醛基之间形成噻唑烷衍生物,将糖肽固定在磁性纳米材料上,清洗除去未共价结合的非糖肽,最后利用去糖链酶将捕获的糖肽从磁性纳米材料上释放下来,并送入质谱分析。本发明方法步骤简单、操作方便,可实现糖肽的超快速、高特异、高灵敏质谱分析。
Description
技术领域
本发明属蛋白质分析技术领域,涉及一种基于噻唑烷化学固相富集并质谱分析糖肽的新方法,具体涉及利用半胱氨酸修饰的磁性纳米材料富集糖肽并质谱分析的新方法。本发明方法能显著缩短糖肽共价富集并质谱分析的时间,并且具有步骤简单、操作方便、温和高效等特点。
背景技术
现有技术公开了蛋白质糖基化是最重要、最为普遍的翻译后修饰之一,它参与了生物体内众多生理病理活动,是多种重大疾病诊断标志物研究的热点。目前质谱技术已成为糖蛋白质组研究的利器,实践显示,将低丰度糖肽从复杂体系中快速高效分离富集是质谱规模化解析糖蛋白质首要解决的问题。基于共价化学反应的糖肽富集方法因具有高选择性的优点而被广泛采用,然而,这些富集方法仍存在偶联时间过长、反应条件苛刻以及操作步骤繁琐的问题,导致复杂生物样本中糖基化位点鉴定周期长、灵敏度低且存在部分假阳性,等缺陷。基于现有技术的现状,本申请的发明人拟提供一种基于噻唑烷化学固相富集糖肽的新方法,该方法将有利于实现糖肽的超快速、高特异、高灵敏质谱分析,从而进一步促进糖蛋白质组研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的存在的不足与缺陷,提供一种步骤简单、操作方便、可实现糖肽超快速、高特异、高灵敏富集并质谱分析的新方法,具体涉及利用半胱氨酸修饰的磁性纳米材料富集糖肽并质谱分析的新方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
1.对糖肽样品进行氧化;
2.对糖肽样品进行固相富集;
3.将糖肽从固相材料上释放下来送入质谱分析。
具体的,本发明的方法中,采用半胱氨酸修饰的磁性纳米材料为固相,利用材料表面的β-氨基硫醇基团与氧化后糖肽的醛基之间形成噻唑烷衍生物,将糖肽固定在磁性纳米材料上,经外加磁场作用使得磁性纳米材料与溶液分离,最终实现糖肽的富集与质谱分析,其包括步骤:
1.在糖肽样品中加入10毫摩尔高碘酸钠,室温避光条件氧化1小时使糖肽上糖链中的羟基氧化成为醛基,再加入终浓度为20毫摩尔亚硫酸钠混旋10分钟终止氧化反应,最后将上述氧化后肽段冻干;
2.加入含50%乙腈和终浓度为5毫摩尔三(2-羧乙基)膦(TECP)的10毫摩尔乙酸铵缓冲液重溶上述肽段,再加入半胱氨酸修饰的磁性纳米材料,在50摄氏度孵育30分钟;
3.外加磁场,使得磁性纳米材料与溶液分离,并收集下层固相材料;
4.分别用400微升含50%乙腈10毫摩尔乙酸铵溶液、含50%乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液和含80%乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液顺序清洗材料各3次,每次收集固相材料;
5.用1毫升20毫摩尔碳酸氢铵水溶液重新混匀材料,并加入1微升去糖链酶PNGaseF,在37摄氏度反应过夜;
6.通过外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来,将上清液(含有去糖链的糖肽)冻干用水重溶后进行MALDI-TOF MS分析。
本发明与现有技术的基于共价化学的糖肽富集方法相比,具有如下的优点:
1)本发明方法中,将共价偶联时间显著缩短至30分钟,能提高糖肽富集并质谱分析的通量,并且偶联反应条件温和,无需额外添加还原剂和催化剂,能有效避免样品的丢失与破坏。
2)本发明的富集方法具有高选择性:在糖肽与非糖肽摩尔比为1:100的混合物中特异地捕获糖肽,高灵敏度:检测限低至近飞摩尔水平,以及良好的重复性:六次重复富集糖肽质谱峰信噪比的CV<26%。
3)半胱氨酸修饰的磁性纳米材料通过一步修饰商业化氨基磁球即即可制备得到,因此,本发明的富集方法便于在其它实验室推广。
附图说明
图1是本发明富集方法的流程示意图。
图2是浓度为200纳克每微升标准糖蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段的MALDI-TOF MS谱图,MALDI-TOF MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100%Intensity),横坐标为质荷比(m/z);其中,(a)是富集前直接分析,(b)是经半胱氨酸修饰的磁性纳米材料富集后;●为非糖肽段的峰,^为糖肽的峰,@、#、*为去糖链后的含不同糖基化位点的糖肽峰及其碎片;通过图(a)和图(b)对比可以得出,基于噻唑烷化学的超快速固相富集糖肽切实可行。
图3是标准糖蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段和标准非糖蛋白质马心肌红蛋白MYO酶解肽段混合溶液(摩尔比为1:100)的MALDI-TOF MS谱图,MALDI-TOF MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100%Intensity),横坐标为质荷比(m/z);其中,(a)是富集前直接分析,(b)是经半胱氨酸修饰的磁性纳米材料富集后;●为非糖肽段的峰,^为糖肽的峰,@、#、*为去糖链后的含不同糖基化位点的糖肽峰及其碎片;通过图(a)和图(b)对比可以得出,基于噻唑烷化学的糖肽富集具有良好的选择性。
图4是初始浓度为20纳克每微升的标准糖蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段经半胱氨酸修饰的磁性纳米材料富集后的MALDI-TOF MS谱图,MALDI-TOF MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100%Intensity),横坐标为质荷比(m/z);#为去糖链后的含不同糖基化位点的糖肽峰及其碎片;从图中显示出,基于噻唑烷化学的糖肽富集具有较好的检测灵敏度(近飞摩尔水平)。
具体实施方式
实施例1基于噻唑烷化学固相富集糖肽并质谱分析的糖肽超快速富集可行性考察
配制100微升100纳克每微升的标准糖蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段溶液,用10毫摩尔高碘酸钠在室温避光条件氧化1小时后,加入终浓度为20毫摩尔亚硫酸钠混旋10分钟终止氧化反应,将上述氧化后肽段冻干;加入含50%乙腈和终浓度为5毫摩尔三(2-羧乙基)膦(TECP)的10毫摩尔乙酸铵缓冲液重溶上述肽段,再加入半胱氨酸修饰的磁性纳米材料,在50摄氏度孵育30分钟后通过外加磁场作用将磁性纳米材料从溶液中分离出来,弃除上清液;然后取400微升含50%乙腈10毫摩尔乙酸铵溶液、含50%乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液和含80%乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液顺序清洗材料各3次,每次收集固相材料;最后再用1毫升20毫摩尔碳酸氢铵水溶液重新混匀材料,并加入1微升去糖链酶PNGaseF,在37摄氏度反应过夜后,通过外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来,将上清液(含有去糖链的糖肽)冻干用水重溶后进行MALDI-TOF MS分析,谱图如图2所示,结果表明,基于噻唑烷化学的糖肽超快速富集切实可行。
实施例2基于噻唑烷化学固相富集糖肽并质谱分析的糖肽富集选择性考察
配制标准糖蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段和标准非糖蛋白质马心肌红蛋白MYO的酶解肽段混合溶液(摩尔比为1:100),用10毫摩尔高碘酸钠在室温避光条件氧化1小时后,加入终浓度为20毫摩尔亚硫酸钠混旋10分钟终止氧化反应,将上述氧化后肽段冻干;加入含50%乙腈和终浓度为5毫摩尔三(2-羧乙基)膦(TECP)的10毫摩尔乙酸铵缓冲液重溶上述肽段,再加入半胱氨酸修饰的磁性纳米材料,在50摄氏度孵育30分钟后通过外加磁场作用将磁性纳米材料从溶液中分离出来,弃除上清液;然后取400微升含50%乙腈10毫摩尔乙酸铵溶液、含50%乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液和含80%乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液顺序清洗材料各3次,每次收集固相材料;最后再用1毫升20毫摩尔碳酸氢铵水溶液重新混匀材料,并加入1微升去糖链酶PNGase F,在37摄氏度反应过夜后,通过外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来,将上清液(含有去糖链的糖肽)冻干用水重溶后进行MALDI-TOF MS分析,谱图如图3所示,结果表明,基于噻唑烷化学的糖肽富集具有良好的选择性。
实施例3基于噻唑烷化学固相富集糖肽并质谱分析的糖肽富集检出限考察
配制100微升20纳克每微升的标准糖蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段溶液,用10毫摩尔高碘酸钠在室温避光条件氧化1小时后,加入终浓度为20毫摩尔亚硫酸钠混旋10分钟终止氧化反应,将上述氧化后肽段冻干;加入含50%乙腈和终浓度为5毫摩尔三(2-羧乙基)膦(TECP)的10毫摩尔乙酸铵缓冲液重溶上述肽段,再加入半胱氨酸修饰的磁性纳米材料,在50摄氏度孵育30分钟后通过外加磁场作用将磁性纳米材料从溶液中分离出来,弃除上清液;然后取400微升含50%乙腈10毫摩尔乙酸铵溶液、含50%乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液和含80%乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液顺序清洗材料各3次,每次收集固相材料;最后再用1毫升20毫摩尔碳酸氢铵水溶液重新混匀材料,并加入1微升去糖链酶PNGase F,在37摄氏度反应过夜后,通过外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来,将上清液(含有去糖链的糖肽)冻干用水重溶后进行MALDI-TOF MS分析,谱图如图4所示,结果表明,基于噻唑烷化学的糖肽富集具有较好的检测灵敏度。
Claims (5)
1.一种基于噻唑烷化学固相富集并质谱分析糖肽的方法,其特征是,利用半胱氨酸修饰的磁性纳米材料富集糖肽,实现糖肽的超快速、高特异、高灵敏质谱分析,其步包括骤:
1)对糖肽样品进行氧化;
2)对糖肽样品进行固相富集;
3)将糖肽从固相材料上释放下来送入质谱分析。
2.按权利要求1所述的方法,其特征是,所述步骤(2)中,肽段重溶溶液为含50%乙腈和终浓度为5毫摩尔三(2-羧乙基)膦(TECP)的10毫摩尔乙酸铵缓冲液。
3.按权利要求1所述的方法,其特征是,所述步骤(2)中,磁性纳米材料表面被半胱氨酸所修饰。
4.按权利要求1所述的方法,其特征是,所述步骤(2)中,半胱氨酸修饰的磁性纳米材料进行样品偶联的温度是50摄氏度,偶联时间是30分钟。
5.按权利要求1所述的方法,其特征是,所述步骤(2)中,分别用400微升含50%乙腈10毫摩尔乙酸铵溶液、含50%乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液和含80%乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液顺序清洗材料各3次。
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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CN201910503816.9A Pending CN112067684A (zh) | 2019-06-11 | 2019-06-11 | 一种基于噻唑烷化学固相富集糖肽并质谱分析的方法 |
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CN (1) | CN112067684A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030162185A1 (en) * | 1999-12-07 | 2003-08-28 | Oleg Melnyk | Products comprising a support to which nucleic acids are fixed and their use as dna chips |
FR2889700A1 (fr) * | 2005-08-11 | 2007-02-16 | Synthinnove Lab | Marqueurs, leur procede de fabrication et leurs applications |
CN103364494A (zh) * | 2012-03-31 | 2013-10-23 | 复旦大学 | 一种对血清糖肽组高选择性富集的方法 |
CN105300783A (zh) * | 2014-07-13 | 2016-02-03 | 复旦大学 | 一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法 |
-
2019
- 2019-06-11 CN CN201910503816.9A patent/CN112067684A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030162185A1 (en) * | 1999-12-07 | 2003-08-28 | Oleg Melnyk | Products comprising a support to which nucleic acids are fixed and their use as dna chips |
FR2889700A1 (fr) * | 2005-08-11 | 2007-02-16 | Synthinnove Lab | Marqueurs, leur procede de fabrication et leurs applications |
CN103364494A (zh) * | 2012-03-31 | 2013-10-23 | 复旦大学 | 一种对血清糖肽组高选择性富集的方法 |
CN105300783A (zh) * | 2014-07-13 | 2016-02-03 | 复旦大学 | 一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
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JOHN D. WADE等: ""Use of thiazolidine-mediated ligation for site specific biotinylation of mouse EGF for biosensor immobilisation"", 《LETTERS IN PEPTIDE SCIENCE》, vol. 8, pages 211 - 220 * |
KIM HYUN-JI等: ""Simple derivatization of aldehydes with d-cysteine and their determination in beverages by liquid chromatography–tandem mass spectrometry"", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》, vol. 702, pages 225 - 232 * |
包慧敏等: ""糖蛋白质组学中基于化学反应的富集方法研究进展"", 《色谱》, vol. 34, no. 12, pages 1145 - 1153 * |
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