CN111239407A

CN111239407A - 基于唾液特异糖蛋白糖链结构的肝纤维化筛查、评估的产品及应用

Info

Publication number: CN111239407A
Application number: CN202010059772.8A
Authority: CN
Inventors: 李铮; 于汉杰
Original assignee: Shenzhen Gedao Sugar Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Gedao Sugar Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2020-06-05

Abstract

本发明公开了基于唾液特异糖蛋白糖链结构的肝纤维化相关筛查、评估的产品及应用，针对唾液样本，提供了用于肝纤维化筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的产品，检测唾液样本中是否含有特定的18种N‑糖链之任一或任意组合。能够判断唾液样本主体是否为肝纤维化(HF)患者(而不是乙型肝炎患者)。相应的，起到特异性结合识别作用的凝集素为RCA120，能够单独作为识别唾液特异糖蛋白糖链结构的试剂用以制备相关医疗产品。

Description

基于唾液特异糖蛋白糖链结构的肝纤维化筛查、评估的产品及应用

技术领域

本发明涉及一种基于唾液特异糖蛋白的肝纤维化标志物的确定及其相关产品、应用。

背景技术

我国是慢性肝炎特别是乙型肝炎的高流行区，约有1.2亿人长期携带乙肝病毒，慢性肝炎患者大约有3000万。约有30万慢性肝炎患者发展为肝硬化和肝癌患者。研究发现，80％-90％的肝癌患者经历“慢性肝炎－肝纤维化-肝硬化－肝癌”的过程。肝纤维化(Hepatic Fibrosis，HF)是临床常见的慢性进行性肝病。肝纤维化是一种可逆的病理学过程，如果肝纤维化不加以干预会在一定的时间内发展为肝硬化。在我国由于乙肝病毒引起的慢性肝炎是引起肝纤维化的主要原因。病理组织学上慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎以门静脉区-中央静脉区的纤维间隔形成为特征。随着各种慢性肝病的进展，肝脏病理进程可从早期的肝纤维化，继而发展为以纤维组织环绕增生肝细胞团硬化结节为特征的肝硬化。目前，肝纤维化的诊断以医学影像学技术为主，对设备以及人员要求较高，不便做为实时监控肝纤维化进程的技术手段。因此，寻求非损伤性检查，进行肝纤维化的早期诊断，有助于提前介入，减缓肝硬化的发展进程，这是预防肝癌的关键。

唾液是人体的体液之一，由三个主要的腺体分泌。唾液中蛋白质的来源于唾液腺分泌以及血液通过被动扩散以及主动运输至唾液中。唾液是一种十分理想的检测材料，具有取材方便，对患者无侵入性，可多次取样等优点。近些年的研究表明，唾液蛋白能够反映生理机能，并在一些疾病(诸如干燥综合症，囊胞性纤维症以及肿瘤等)的无损检测方面具有广阔的应用前景。虽然唾液中的蛋白质与血清中的蛋白质种类有一定的重合，但是在血液循环中的生物标志物并非都适用于唾液的检测。并且同一蛋白在血清和唾液之间的丰度上也存在着明显的差异。因此，在实际应用上针对这两种生物检测材料在检测方法和检测靶标等方面不尽相同。

发明内容

关于肝纤维化(Hepatic Fibrosis,HF)的筛查、诊断以及评估等，发明人通过大量实验和分析，确定了以下结论：

一、RCA120识别的糖链(β-Gal/GalNAc,Galβ-1,3/4GlcNAc)在肝纤维化(HF)患者的唾液中的相对丰度低于乙型肝炎(HB)患者组(HB组77.12％，HF组65.63％)。

二、18种N-糖链(m/z.1581.485；1590.565；1622.555；1688.613；1704.608；1721.556；1812.689&1834.671；1883.566；1938.682；1949.71；2110.767；2732.951；2873.046；2920.036；2991.036；3074.11；3188.115；3577.258)仅存在于HF患者的唾液中，而未见于HB患者的唾液中。

根据以上结论，已经可得出以下应用方案：

第一方面，一种凝集素单独作为唾液特异糖蛋白糖链结构识别的试剂以构建相关产品的用途，所述凝集素为RCA120，用途为肝纤维化(HF)患者的筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估，所述相关产品为试剂盒、设备、可操作系统和/或它们的组合。

进一步地，所述相关产品还提示以下检测依据：

凝集素RCA120所识别的N-糖链中如果存在以下18种N-糖链之任一或任意组合，则表明唾液样本主体为肝纤维化(HF)患者，而不是乙型肝炎(HB)患者；

(1)m/z.1581.485(2.66％)；

(2)m/z.1590.565(1.83％)；

(3)m/z.1622.555(4.37％)；

(4)m/z.1688.613(2.63％)；

(5)m/z.1704.608(1.26％)；

(6)m/z.1721.556(13.79％)；

(7)m/z.1812.689&1834.671(3.48％)；

(8)m/z.1883.566(1.29％)；

(9)m/z.1938.682(4.51％)；

(10)1949.71(1.71％)；

(11)m/z.2110.767(1.56％)；

(12)m/z.2732.951(0.22％)；

(13)m/z.2873.046(0.26％)；

(14)m/z.2920.036(2.01％)；

(15)m/z.2991.036(0.17％)；

(16)m/z.3074.11(0.15％)；

(17)m/z.3188.115(0.27％)；

(18)m/z.3577.258(0.07％)。

这里，“提示检测依据”的具体形式不限，例如：随附的产品说明书中记载该检测依据；涉及到软件的，则还可由相应的算法体现该检测依据。

第二方面，特定糖链的识别单元在构建用于基于唾液样本作肝纤维化(HF)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的产品方面的用途，所述识别单元识别上述18种N-糖链之任一或任意组合。

这里，识别单元可以是可执行的软件代码模块，标识出是否存在上述18种N-糖链之任一或任意组合，进而可鉴别出唾液样本主体是否为肝纤维化(HF)患者；相应的，产品可以是与糖链分析设备(如质谱仪)连接的控制装置(例如，可使糖链分析设备按指令进行特定糖链的识别)、信息输出装置(例如，根据糖链分析设备输出带有标识的糖链清单)及其组合等。随着糖链识别技术的发展，识别单元也可能会出现其他具体形式。

第三方面，一种用于肝纤维化(HF)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的产品，针对唾液样本，该产品包括：

A、凝集素RCA120；

B、用于偶联凝集素RCA120的亲和富集固相载体；

C、用于从糖蛋白中分离出N-糖链的试剂和装置；

D、质谱仪，用于显示对应于各种N-糖链的m/z值；

E、用于根据质谱图识别前述18种N-糖链的标识、模块或处理器，以得出是否含有前述18种N-糖链之任一或任意组合的判定结果。

上述用于偶联凝集素RCA120的亲和富集固相载体可以选择Fe₃O₄磁性微粒、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、玻璃微球等。

第四方面，一种智能终端，包括处理器和程序存储器，所述程序存储器存储的某部分程序被处理器加载时执行以下步骤：

获取唾液样本中凝集素RCA120所识别的N-糖链信息；

判断其中是否存在前述18种N-糖链之任一或任意组合；

如果存在，输出表明唾液样本主体为肝纤维化患者的提示信息。

这里，智能终端可以与糖链分析设备(如质谱仪)通信，也可以连接移动存储介质等，以获取唾液样本中凝集素MAL-I所识别的N-糖链信息；判断环节也有可能与获取环节合并，即直接获取/判断唾液样本中是否存在前述18种N-糖链之任一或任意组合的信息。

第五方面，一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器加载时执行上述步骤。

采用本发明的方案，能够根据唾液样本，快速、准确地鉴别受试者是否为肝纤维化(HF)患者，而不是乙型肝炎(HB)患者。

附图说明

图1示意了肝纤维化的定义以及凝集素RCA120识别的糖链糖链(β-Gal/GalNAc,Galβ-1,3/4GlcNAc)在HF患者的唾液中的表达显著低于乙型肝炎(HB)患者。其中：(A)PCA分析显示了乙型肝炎患者(HB)和肝硬化患者(HC)存在一部分的重叠区，定义为肝纤维化(乙型肝炎患者中具有高概率转化为肝硬化患者)；(B)凝集素芯片对153例HB患者唾液样本以及172例HF患者唾液样本进行逐例检测，其中凝集素RCA120结果的散点图分析结果。(B)中，纵坐标表示凝集素芯片上该凝集素所对应的归一化荧光强度NFI，图中横线代表两端所示两组间的比较，星号的数量表征根据单因素方差分析得到的P-Value的数量级，通常规定为：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，所以***已表明差异极显著；HB：乙型肝炎患者；HF：肝纤维化患者。

图2为HB和HF患者唾液样本RCA120分离糖蛋白N-糖链结构质谱解析。

具体实施方式

如图1所示，前期的研究发现了乙型肝炎患者唾液糖蛋白糖型与肝硬化患者存在一个明显的重叠区，而处在重叠区部分的患者或者被认为是由慢性肝病诱导的肝纤维化患者或者已经处在肝硬化早期阶段的肝纤维化患者；进一步的分析发现RCA120识别的糖链(β-Gal/GalNAc,Galβ-1,3/4GlcNAc)的相对丰度在HB和HF两组间存在显著的差异。基于此，我们设计并完成了如下实验。

以下详细介绍本申请的相关验证实验及分析，发明人具体的研发过程不限于此。

一、研究方法：

利用一种四氧化三铁纳米磁粒表面偶联上凝集素RCA120制成凝集素磁性微粒复合物来富集各组唾液混合样本中的特定糖蛋白，利用PNGase F酶切法分离特定糖蛋白上的N-糖链，并由基质辅助激光电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization-Time of Flight-Mass Spectrum，MALDI-TOF-MS)对糖链进行质谱鉴定并对糖链结构进行推测，获得凝集素RCA120识别的HB患者和HF患者唾液特定糖蛋白糖链谱并对比分析差异，具体如下。

1.1、唾液样本的收集及预处理

本实验所采用的HB患者和HF患者唾液样本均严格经过西北大学、陕西省人民医院以及西安交通大学第二附属医院的伦理审批(Human Research Ethics Committees(HRECs))。所有捐赠唾液样本的志愿者连同协助采样指导的临床医师均对本研究工作知情、同意且高度配合，在均一的采样要求之下完成唾液样本的采集。其具体要求为：样本捐献者需无糖尿病，除肝部外其他的器官应无炎症以及肿瘤等慢性疾病，在采样时捐献者需确定在采集唾液前3小时内未进食并且24小时内未服用药物，然后用洁净无菌的生理盐水(0.9％NaCl)漱口三次，确保捐献者口腔卫生和无食物残渣的前提下，捐献者舌尖抵住上颚并于舌下收集自然分泌的唾液样本收集至2mL离心管，立即加入10μL蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail，Sigma-Aldrich,U.S.A)于冰浴暂存。在临床医师指导下共收集唾液样本178例：其中HB患者81例(HB，n＝81)，HF患者97例(HF，n＝97)，具体的样本信息如表1所示。

唾液采集12小时内，将唾液按1mL分装至离心管中，若有量少不足1mL者可加入1×PBS补足至1mL，10,000g×15min离心，小心吸取上清液，经微量核酸蛋白测定仪(Nano-drop)测定浓度后按1mg唾液蛋白10μL蛋白酶抑制剂的量加入蛋白酶抑制剂，随后按质量取每例唾液样本50μg进行混合。获得HB患者组(HB)和HF患者组(HF)唾液混合样本。利用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术，中国上海)测定混合样本浓度。

表1用于肝纤维化诊断的唾液样本信息

1.2、凝集素RCA120磁性微粒复合体的制备

取2mg环氧化修饰的Fe₃O₄磁性微粒至2mL离心管中，加入1mL无水乙醇，反复颠倒2min，置于磁性分离器上使磁粒充分吸附在离心管底面与侧面，倒去乙醇，如此重复5次，充分清洗磁性微粒。清洗后的磁性微粒用1mL的偶联缓冲液润洗，重复3遍后加入600μL0.5mg/mL凝集素RCA120溶液(RCA120溶解在偶联缓冲液中)，固定在摇床上室温震荡反应6h使充分偶联。偶联结束后将离心管置于磁性分离架上分离，除去液体后取下离心管加入1mL偶联缓冲液清洗RCA120-磁粒复合体，反复颠倒使其重新悬浮，充分悬浮后置于磁性分离架上分离，除去偶联缓冲液，重复清洗3次，以便充分除去未结合的凝集素RCA120，获得凝集素RCA120磁性微粒复合体。

1.3、凝集素RCA120识别的糖蛋白的分离

首先，使用结合缓冲液清洗凝集素磁性微粒复合物3次，每次3min。将唾液蛋白用结合缓冲液补足体积至500μL，混匀后加入到凝集素磁性微粒复合物中，颠倒混匀，放入摇床中25℃震荡孵育3h。孵育完成后，磁场分离，弃上清，使用清洗缓冲液清洗磁性微粒5次，每次3min。清洗完成后，磁场分离，弃上清，向磁性微粒中加入400μL清洗缓冲液，颠倒混匀后放入摇床，25℃震荡洗脱1h。磁场分离，收集上清，重复上步一次，将两次收集的上清混合，BCA测定洗脱的蛋白浓度。

1.4、N-糖链的分离

(1)取经RCA120-磁性微粒复合体分离的糖蛋白400μg，加入8倍体积的9M Urea/1MNH₄HCO₃溶液，混匀后37℃震荡反应1h，变性糖蛋白；

(2)向蛋白溶液中加入5％体积的100mM DTT溶液母液，使DTT终浓度为5mM，混匀后室温静置1h，还原蛋白中的二硫键；

(3)将蛋白溶液先冷却至室温，向蛋白溶液中加入5％体积的200mM IAM溶液母液，使IAM终浓度为10mM，室温、避光摇动中反应30min；

(4)将蛋白溶液转入10K超滤离心管中，10000g室温离心15min，弃滤出液，向管中加入400μL 40mM NH₄HCO₃溶液，吹打混匀，重复上步5次。补足体积至500μL，加入3μL PNGaseF糖苷酶，混匀后放入37℃摇床中震荡孵育过夜，酶切糖蛋白上的N-聚糖；

(5)10000g离心10min，收集滤出液。再向管中加200μL超纯水，混匀后再次离心收集滤出液，将两次滤出液混合，并用冷冻干燥仪干燥。

1.5、糖链的脱盐纯化

(1)预清洗：将Hypercarb SPE柱(50mg)取出，向柱中依次加入3mL 1M NaOH溶液，3mL超纯水，3mL 30％乙酸，3mL超纯水；

(2)平衡：向柱中依次加入3mL 50％ACN/0.1％TFA，3mL 5％ACN/0.1％TFA溶液；

(3)上样：向冻干的N-聚糖中加入500μL 0.1％TFA，涡旋振荡。将溶解后的N-聚糖加入到柱中，收集滤出液，再次上样，重复上样3次；

(4)清洗：向柱中依次加入3mL超纯水，3mL 5％ACN/0.1％TFA；

(5)洗脱：向柱中加入400μL 50％ACN/0.1％TFA，收集滤出液，重复一次，将两次收集的滤出液合并，使用冷冻干燥仪冻干。

1.6、N-聚糖质谱解析

(1)向冻干的N-聚糖加入20μL糖链溶液，吹打至糖链完全溶解，涡旋后离心；

(2)取2μL溶解后的糖链，使用移液器点样于MTP Anchorchip 384点的靶板上，真空抽干，再次取2μL点在靶板的原位置，真空抽干；

(3)取1μL 20mg/ml的DHB基质溶液点在结晶的糖链样品上，待真空抽干；

(4)将靶板上机，以反射阳性离子模式鉴定多糖。

1.7、质谱数据分析

使用flexAnalysis软件打开质谱原始数据，以信噪比(SNR)大于6，选取m/z 1000-4000范围的质谱峰，将选取的质谱数据转入Glycowork beach软件，分析标准为：选择前体离子分子量，电荷状态，前体离子容忍度为1，碎片离子容忍度为0.5，无化学衍生化，无还原端修饰。绘制二级碎片和一级质谱结果。

单个糖链的相对丰度计算方法：将所有糖链的信号值相加作为分母(N)，用单个糖链的信号值(n)除以N，即n/N为单个糖链相对丰度。

二、研究结果：

通过MALDI-TOF-MS共鉴定到86种信号峰(SNR大于6)，能解析到糖链结构的信号峰有60种，其中有54种RCA120识别的N-糖链峰，如表2所示。在HB和HF组中分别鉴定到了37和24种RCA120识别的N-糖链峰，其相对丰度之和分别为77.12％和65.63％。

表2.两组样本中分离出的N-糖链

*附注：蓝色(深色)正方形：N-乙酰葡糖胺；蓝色圆形：葡萄糖；红色三角形：岩藻糖；绿色(深色)圆形：甘露糖；黄色(浅色)圆形：半乳糖；黄色(浅色)正方形：N-乙酰半乳糖胺；紫色(深色)菱形：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)；白色(浅色)菱形：N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)/:代表在样本中没有检测到对应的糖链。

其中18种N-糖链仅存在于HF组的唾液样本中。具体如下(括号中为相对丰度)：

(1)m/z.1581.485(2.66％)；

(2)m/z.1590.565(1.83％)；

(3)m/z.1622.555(4.37％)；

(4)m/z.1688.613(2.63％)；

(5)m/z.1704.608(1.26％)；

(6)m/z.1721.556(13.79％)；

(7)m/z.1812.689&1834.671(3.48％)；

(8)m/z.1883.566(1.29％)；

(9)m/z.1938.682(4.51％)；

(10)1949.71(1.71％)；

(11)m/z.2110.767(1.56％)；

(12)m/z.2732.951(0.22％)；

(13)m/z.2873.046(0.26％)；

(14)m/z.2920.036(2.01％)；

(15)m/z.2991.036(0.17％)；

(16)m/z.3074.11(0.15％)；

(17)m/z.3188.115(0.27％)；

(18)m/z.3577.258(0.07％)。

所以，最后可以得出：针对唾液样本进行检测，只需测定其是否含有这的18种N-糖链之任一或任意组合，即可作出肝纤维化的筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的结果。

Claims

1.一种凝集素单独作为唾液特异糖蛋白糖链结构识别的试剂以制备相关产品的用途，其特征在于：所述凝集素为RCA120，用途为肝纤维化(HF)患者的筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估；所述相关产品为试剂盒、设备、可操作系统和/或它们的组合。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述相关产品还提示以下检测依据：

如果唾液样本中存在凝集素RCA120所识别糖链中的以下18种N-糖链之任一或任意组合，则表明唾液样本主体为肝纤维化(HF)患者，而不是乙型肝炎(HB)患者；

(1)m/z.1581.485；

(2)m/z.1590.565；

(3)m/z.1622.555；

(4)m/z.1688.613；

(5)m/z.1704.608；

(6)m/z.1721.556；

(7)m/z.1812.689&1834.671；

(8)m/z.1883.566；

(9)m/z.1938.682；

(10)1949.71；

(11)m/z.2110.767；

(12)m/z.2732.951；

(13)m/z.2873.046；

(14)m/z.2920.036；

(15)m/z.2991.036；

(16)m/z.3074.11；

(17)m/z.3188.115；

(18)m/z.3577.258。

3.特定糖链的识别单元在构建用于基于唾液样本作肝纤维化(HF)患者的筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的产品方面的用途，其特征在于：所述识别单元识别权利要求2中所述的18种N-糖链之任一或任意组合。

4.一种用于肝纤维化(HF)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的产品，针对唾液样本，其特征在于，该产品包括：

A、凝集素RCA120；

B、用于偶联凝集素RCA120的亲和富集固相载体；

C、用于分离出N-糖链的试剂和装置；

D、质谱仪，用于显示对应于各种N-糖链的m/z值；

E、用于根据质谱图识别权利要求2中所述的18种N-糖链之任一或任意组合的标识、模块或处理器，以得出是否含有该18种N-糖链之任一或任意组合的判定结果。

5.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述用于偶联凝集素RCA120的亲和富集固相载体为Fe₃O₄磁性微粒、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶或玻璃微球。

6.一种智能终端，包括处理器和程序存储器，其特征在于：所述程序存储器存储的某部分程序被处理器加载时执行以下步骤：

获取唾液样本中凝集素RCA120所识别的N-糖链信息；

判断其中是否含有权利要求2中所述的18种N-糖链之任一或任意组合；

如果存在，输出表明唾液样本主体为肝纤维化(HF)患者，而不是乙型肝炎(HB)患者的提示信息。

7.一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，其特征在于：所述计算机程序被处理器加载时执行以下步骤：

获取唾液样本中凝集素RCA120所识别的N-糖链信息；

判断其中是否存在权利要求2中所述的18种N-糖链之任一或任意组合；

如果存在，输出表明唾液样本主体为肝纤维化(HF)患者、而不是乙型肝炎(HB)患者的提示信息。