CN105300783A - 一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属蛋白质分析领域，涉及一种利用氨氧基修饰的磁性纳米材料富集糖基化肽的新方法，其包括：首先对糖肽上的羟基进行高碘酸纳NaIO₄氧化使得羟基变为醛基，再将氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄ONH₂置于氧化后的糖肽溶液中，通过氨氧基基团和糖肽中糖链氧化后得到的醛基之间反应，将糖肽固定在磁性纳米材料上，随后将未和纳米材料反应的非糖肽清洗除去，最后再利用去糖链酶将捕获的糖肽从材料上解离下来，送入质谱分析糖基化肽。本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，可以实现糖基化肽的高灵敏、高选择性质谱分析。

Description

一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法

技术领域

本发明属蛋白质分析领域，涉及一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法，尤其是利用氨氧基修饰的磁性纳米材料富集糖基化肽并质谱分析的新方法。本发明方法能显著地提高糖基化肽的分析质谱选择性，并且具有步骤简单、操作方便、快速等特点。

背景技术

现有技术公开了蛋白质糖基化是生物体内组普遍存在的一种翻译后修饰，执行着重要的生物学功能。糖基化修饰在各种生命现象中都起着重要的作用，如参与细胞黏附及信号转导，影响蛋白质的分泌和稳定性，免疫及炎症反应以及影响蛋白质在细胞内的转送方向等。据研究报道，生物体内约有1/2以上的蛋白质会发生糖基化，高灵敏地鉴定生物体内的糖基化后修饰位点是实现其进一步研究的首要前提，然而，它们的研究都面临着类似的困难，首先，糖基化修饰的蛋白质种类虽然很多，但其丰度却通常较低，并且其酶解成肽段后占全部肽段的比例更低，通常只有2-5％左右的肽段带有糖基化修饰；第二，带有糖基化修饰的肽段在质谱中的离子化效率往往比非修饰肽段低，因而不易被质谱鉴定；第三，糖链本身的微观不均一性导致糖肽在质谱中的信号分散和减弱，更加难以被质谱高灵敏鉴定；第四，尽管目前已有基于肼腙反应糖基化肽固相富集方法，但所述的富集方法存在有如下缺陷：通常耗时较长，富集时间至少12小时以上，并且肼基团大多固定于树酯载体上，捕获糖肽后从溶液中的分离十分不易等等。因此，本申请的发明人拟提供一种反应更加特异和更加方便固液的分离的糖基化肽的固相富集方法，该方法将有利于实现高选择性和高灵敏度质谱鉴定，从而进一步促进糖蛋白质的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的存在的缺陷，提供一种步骤简单、操作方便、快速高效，实现糖基化肽选择性富集和高灵敏度质谱鉴定的新方法。

本发明提供了一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法，尤其是利用氨氧基修饰的磁性纳米材料富集糖基化肽并质谱分析的方法。本发明利用氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄ONH₂上的氨氧基基团和糖肽中糖链氧化后得到的醛基之间的反应，将糖肽固定在磁性纳米材料上,而非糖肽则被清洗除去,最后再利用去糖链酶将糖肽从材料上解离下来,从而实现磷酸化肽段的选择性富集并质谱分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1.对肽段样品进行NaIO4氧化；

2.对其中的糖基化肽段进行富集；

3.将糖基化肽从磁性纳米材上洗脱下来送入质谱分析。

具体的，本发明的一种固相富集糖基化肽段并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄ONH₂为吸附剂，实现糖基化肽的选择性富集；其包括步骤：

(1)对多肽样品进行高碘酸钠氧化，使糖肽上糖链中的羟基氧化成为醛基；

(2)加入Fe₃O₄ONH₂材料与多肽溶液充分混合；

(3)外加磁场，使得磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；

(4)用缓冲液清洗材料，清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；

(5)用碳酸氢铵缓冲液重新混匀材料，并在其中加入去糖链酶PNGaseF充分混合；

(6)外加磁场再次将材料从溶液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。

更具体的，本发明的方法中，采用氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄ONH₂为吸附剂，利用材料上的氨氧基基团和糖肽中糖链氧化后得到的醛基之间的反应，将糖肽固定在磁性纳米材料上，经外加磁场作用使得磁性材料与溶液分离，最终实现糖基化肽的富集和质谱分析；

所述步骤(1)中，在多肽样品中，加入10mM的NaIO₄与多肽的溶液在25－37摄氏度下避光混合1小时，使样品中的糖基化肽充分被氧化；再加入20mMNa₂SO₃混合10min终止氧化反应；最后冻干肽段备用；

所述步骤(2)中，在上述多肽样品中加入10mM乙酸铵作为缓冲液，使肽段浓度保持在10ng/μL-1000ng/μL；再加入Fe₃O₄ONH₂磁性纳米粒子，使纳米粒子浓度保持为1mg/mL-10mg/mL；二者在45℃-60℃反应1-4小时；

所述步骤(3)外加磁场，使得磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；

所述步骤(4)中，对步骤(3)中得到的下层固体相，用纯水，80％乙腈的水溶液，甲醇和50mMNH₄HCO₃清洗材料各1次，每次清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；

所述步骤(5)中，将(4)中收集的材料中用50mMNH₄HCO₃重新混匀材料，加入去糖链酶PNGaseF将糖肽从材料上解离下来，保持去糖链酶的量为每毫克多肽中加入PNGaseF0.5-1μL，加入后在37℃反应12-16小时；

所述步骤(6)中，外加磁场再次将材料从上清液中分离后，取上清液与有机基质含有α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)混合，进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱MALDI-TOF-MS分析；

本发明的一个实施例中，所述步骤(1)中的多肽样品浓度为10ng/μL～1000ng/μL，溶于10mM乙酸铵CH₃COONH₄缓冲液中；多肽样品被10mM的高碘酸钠NaIO₄避光氧化1小时，然后加入终浓度为20mM的亚硫酸钠Na₂SO₃混合10分钟以终止氧化反应；

本发明的一个实施例中，所述步骤(2)中的磁性纳米材料表面被氨氧基修饰；其中加入的Fe₃O₄ONH₂材料浓度为1mg/mL-10mg/mL；氨氧基修饰磁性纳米材料进行样品富集的温度是45-60摄氏度，样品富集的时间是1-4小时；

本发明的一个实施例中，所述的步骤(4)中用50μL－1mL纯水，80％乙腈水溶液，甲醇和50mM碳酸氢铵NH₄HCO₃水溶液顺序清洗材料各1次；

本发明的一个实施例中，所述的步骤(5)中用50μL-1mL50mMNH₄HCO₃水溶液重新混匀材料，按每毫克多肽中加入0.5-1μL去糖链酶PNGaseF并保持在37摄氏度混合12-16小时。

本发明方法中，由于氨氧基和醛基之间的反应特异性高、速度快,能显著地提高糖基化肽的分析质谱选择性，并且具有步骤简单、操作方便、快速等特点。

附图说明

图1为本富集方法的流程图。

图2为100ng/μL标准糖基化蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段的MALDI-TOF-MS谱图，MALDI-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(％Intensity)，横坐标为质荷比(m/z)；(a)是富集前，(b)从体积为100μL的样品溶液富集后得到的，上样量和富集前相同；*为非糖基化肽段的单电荷峰，#为糖基化肽，为去糖链后的糖基化肽，^为去糖链后糖基化肽的碎片；对比图(a)和图(b)可以看出，经过富集后，糖基化肽可以被选择性的富集下来。

图3为摩尔比为1:100的糖基化蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段和标准非糖蛋白质马心肌红蛋白Myo的酶解肽段的MALDI-TOF-MS谱图，MALDI-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100％Intensity)，横坐标为质荷比(m/z)；(a)是未富集得到的；(b)是经糖基化肽富集后得到的；*为非糖基化肽段的单电荷峰，#为糖基化肽，为去糖链后的糖基化肽，^为去糖链后糖基化肽的碎片；对比图(a)和图(b)可以看出，经过富集后，糖基化肽可以被选择性的富集下来，实现高灵敏质谱鉴定。

图4为100ng/μL级别的糖基化蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段混合物，经过不同时间富集得到的糖基化肽段质谱信噪比和富集时间的关系，图中可以看出，最快经过1小时富集后，糖基化肽即可被选择性的富集下来。

具体实施方式

下面的实例是对本发明提出的一种固相糖基化肽段并质谱分析方法的进一步说明。

实施例1

氨氧基修饰磁性纳米材料对糖基化肽选择性富集能力的实验

配制100μL100ng/μL级别的糖基化蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段混合物，用10mMNaIO4在室温避光条件氧化1小时后，以20mM的亚硫酸钠Na₂SO₃混合10分钟以终止氧化反应，再将上述氧化后的肽段冻干待用；以10mM乙酸铵CH₃COONH₄缓冲液重溶上述肽段，并在样品中加入氨氧基修饰磁性纳米材料，在45-60摄氏度孵育4小时后在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来；弃除上清液，然后取50μL－1mL纯水，80％乙腈水溶液，甲醇和50mM碳酸氢铵NH₄HCO₃水溶液顺序清洗材料各1次，每次收集固相材料；再用50μL-1mL50mMNH₄HCO₃水溶液重新混匀材料，按每毫克多肽中加入0.5-1μL去糖链酶PNGaseF并保持在37摄氏度混合12-16小时；在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，取上清液(最终的含有去糖链的糖基化化肽段的溶液)1μL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液，干燥结晶后进行MALDI-TOF-MS分析，结果如图2所示。

实施例2

氨氧基修饰磁性纳米材料对糖基化肽选择性富集能力的实验

配制100μL20fmol/μL级别的糖基化蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段和2pmol/μL级别的标准非糖蛋白质马心肌红蛋白Myo的酶解肽段混合物，用10mMNaIO4在室温避光条件氧化1小时后，以20mM的亚硫酸钠Na₂SO₃混合10分钟以终止氧化反应，再将上述氧化后的肽段冻干待用；以10mM乙酸铵CH₃COONH₄缓冲液重溶上述肽段，并在样品中加入氨氧基修饰磁性纳米材料，在45-60摄氏度孵育4小时后在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来；弃除上清液，然后取50μL－1mL纯水，80％乙腈水溶液，甲醇和50mM碳酸氢铵NH₄HCO₃水溶液顺序清洗材料各1次，每次收集固相材料；再用50μL-1mL50mMNH₄HCO₃水溶液重新混匀材料，按每毫克多肽中加入0.5-1μL去糖链酶PNGaseF并保持在37摄氏度混合12-16小时；在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，取上清液(最终的含有去糖链的糖基化化肽段的溶液)1μL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液，干燥结晶后进行MALDI-TOF-MS分析，结果如图3所示。

实施例3

氨氧基修饰磁性纳米材料对糖基化肽快速富集能力的实验

配制400μL100ng/μL级别的糖基化蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段混合物，用10mMNaIO4在室温避光条件氧化1-4小时后(每间隔1小时为一组样品)，以20mM的亚硫酸钠Na₂SO₃混合10分钟以终止氧化反应，再将上述氧化后的肽段冻干待用；以10mM乙酸铵CH₃COONH₄缓冲液重溶上述肽段并分为等体积的4组，在4组样品中分别加入氨氧基修饰磁性纳米材料，在45-60摄氏度孵育1，2，3，4小时(每组样品对应一个孵育时间)后在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来；弃除上清液，然后取50μL－1mL纯水，80％乙腈水溶液，甲醇和50mM碳酸氢铵NH₄HCO₃水溶液顺序清洗材料各1次，每次收集固相材料；再用50μL-1mL50mMNH₄HCO₃水溶液重新混匀材料，按每毫克多肽中加入0.5-1μL去糖链酶PNGaseF并保持在37摄氏度混合12-16小时；在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，取上清液(最终的含有去糖链的糖基化化肽段的溶液)1μL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液，干燥结晶后进行MALDI-TOF-MS分析；捕获到的糖肽的信噪比和富集时间的关系如图4所示。

Claims (8)

1.一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄ONH₂为吸附剂，实现糖基化肽的选择性富集；其包括步骤：

(1)对多肽样品进行高碘酸钠氧化，使糖肽上糖链中的羟基氧化成为醛基；

(2)加入Fe₃O₄ONH₂材料与多肽溶液充分混合；

(3)外加磁场，使得磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；

(4)用合适的缓冲液清洗材料，每次清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；

(5)用碳酸氢铵缓冲液重新混匀材料，并在其中加入去糖链酶PNGaseF充分混合；

(6)外加磁场再次将材料从溶液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。

2.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中的多肽样品浓度为10ng/μL～1000ng/μL，溶于10mM乙酸铵CH₃COONH₄缓冲液中。

3.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中的多肽样品被10mM的高碘酸钠NaIO₄避光氧化1小时，然后加入终浓度为20mM的亚硫酸钠Na₂SO₃混合10分钟以终止氧化反应。

4.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(2)中的磁性纳米材料表面被氨氧基修饰。

5.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(2)中加入的Fe₃O₄ONH₂材料浓度为1mg/mL-10mg/mL。

6.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(2)中氨氧基修饰磁性纳米材料进行样品富集的温度是45-60摄氏度，样品富集的时间是1-4小时。

7.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(4)中用50μL－1mL纯水，80％乙腈水溶液，甲醇和50mM碳酸氢铵NH₄HCO₃水溶液顺序清洗材料各1次。

8.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤(5)中用50μL-1mL50mMNH₄HCO₃水溶液重新混匀材料，按每毫克多肽中加入0.5-1μL去糖链酶PNGaseF并保持在37摄氏度混合12-16小时。